CN112342312B - 一种甘蓝型油菜hau CMS育性恢复基因的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甘蓝型油菜hau CMS育性恢复基因的分子标记及其应用，属于油菜育种技术领域，本发明首次从甘蓝型油菜中定位筛选得到了甘蓝型油菜hau CMS不育系的恢复基因Rfh，并基于该恢复基因设计了相应的分子标记，该分子标记可特异性扩增该恢复基因Rfh，从而将恢复系材料与不育系或保持系材料区分开，即利用本发明所述的分子标记可快速、准确的鉴定得到甘蓝型油菜hau CMS恢复材料，且重复性好。将该分子标记与田间选择相结合，将其应用于甘蓝型油菜hau CMS辅助选择育种中，可大幅提高恢复系的选育效率，扩展恢复系的材料选择范围，进一步挖掘油菜杂种优势利用的潜力。

Description

一种甘蓝型油菜hau CMS育性恢复基因的分子标记及应用

技术领域

本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜hau CMS育性恢复基因的分子标记及其应用。

背景技术

油菜是我国第一大油料作物，年均种植面积超过733.3万公顷，细胞质雄性不育系统是作物杂种优势利用的主要途径之一，在油菜杂交种中占比约60％，以细胞质雄性不育系为基础，配以保持系和恢复系的三系杂交系统仍是目前生产油菜杂交种的重要方式之一。

目前，国内油菜生产上应用的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系统主要是pol CMS、shan2A CMS，二者具有相同的恢保关系，并且在分子水平上二者的不育线粒体基因仅存在个别碱基差异，因此，虽然在油菜中发现并报道了十余种不育胞质类型，但是在我国目前生产中所用到的油菜杂种胞质类型仍然十分单一，长期使用单一不育胞质不仅存在潜在的风险，如上个世纪70年代美国单一利用玉米T胞质导致T型小斑病的大爆发造成了巨大的经济损失(Levings,1993)，而且在生物多样性上亦具有一定的局限性。

本发明中所用到的不育系材料hau CMS最初是由傅廷栋1999年发现的天然的芥菜型油菜细胞质雄性不育类型。后经由不断回交将不育胞质转入甘蓝型油菜及其他十字花科植物中。经由线粒体基因组测序及分子标记鉴定后表明hau CMS是一种全新的胞质类型，其不育性稳定且不受温度影响(Wan Z,Jing B,Tu J,Ma C,Shen J,Yi B,Wen J,Huang T,Wang X,Fu T.Genetic characterization of a new cytoplasmic male sterilitysystem(hau)in Brassica juncea and its transfer to B.napus.Theor Appl Genet,2008,116:355-362)。目前，hau CMS已经在许多十字花科叶用植物中得以利用，例如大白菜、榨菜等，但受制于没有合适的恢复系没能在甘蓝型油菜的生产中得以利用。

现有技术Wei C,Wang HD,Heng SP,Wen J,Yi B,Ma CZ,Tu JX,Shen JX,FuTD.Construction of restorer lines and molecular mapping for restorer gene ofhau cytoplasmic male sterility in Brassica napus.Theor Appl Genet,2019,132:2525-2539公开了hau CMS不育系的恢复材料，其是通过利用不同来源的1303份油菜自交系(绝大多数为甘蓝型，少数为芥菜型)与hau CMS不育系(甘蓝型和芥菜型)广泛测交后得到的恢复材料，其中表现比较突出的是hwc8和hw834，然而现有技术并未公开与甘蓝型油菜hau CMS育性性状相关的恢复基因以及用于筛选恢复基因的相关分子标记。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜hau CMS育性恢复基因的分子标记及其应用，本发明首先是利用恢复系hw834与不育系ganA构建了育性分离群体，结合混池分群分析和基因芯片分型分析技术，成功将该恢复基因定位到了BnChrA09染色体上，并基于所在区域的序列，开发了特异分子标记，从而为恢复基因的精细定位、克隆创造条件，并为恢复基因的分子标记辅助选择(MAS)奠定了基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

本发明还提供了所述分子标记在检测甘蓝型油菜hau CMS育性恢复基因Rfh中的应用。

本发明还提供了所述分子标记在甘蓝型油菜hau CMS辅助选择育种中的应用。

本发明还提供了一种甘蓝型油菜hau CMS恢复系材料的筛选方法，所述方法包括：

步骤1、提取待测植株的DNA；

步骤2、以步骤1得到的DNA作为模板，以上述的分子标记作为引物，进行PCR扩增；

步骤3、将PCR扩增产物进行检测，其中可成功扩增出片段的植株为甘蓝型油菜hauCMS恢复系材料。

进一步的，步骤1中采用CTAB法提取待测植株的基因组DNA。

进一步的，步骤2中PCR扩增的反应体系为20μL，包括：10X Taq Buffer 2μL，0.5U/μL Taq酶2μL，10mM dNTP 1μL，50ng/μL DNA模板2μL，10μM正反向引物各1μL，超纯水11μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明定位筛选得到了恢复系植株中的恢复基因Rfh，并基于该恢复基因设计了相应的分子标记，该分子标记可特异性扩增该恢复基因Rfh而不扩增其等位基因，从而将恢复系材料与不育系或保持系材料区分开，即利用本发明所述的分子标记可快速、准确的鉴定得到甘蓝型油菜hau CMS恢复材料，且重复性好。将该分子标记与田间选择相结合，可大幅提高恢复系的选育效率，扩展恢复系的材料选择范围，进一步挖掘油菜杂种优势利用的潜力。

附图说明

图1为本发明实施例1中分离克隆候选基因区段的连锁图谱，其中A为结合BSA混池与芯片分型分析得到的初定位区间；B为用于精细定位的分子标记的连锁图谱；C为候选区间内存在23个ORF；

图2为本发明实施例1中利用引物B1926在甘蓝型油菜hau CMS不育系‘ganA’和恢复系‘hw834’的基因组DNA中扩增的结果，图中M为DNA Marker，片段大小依次为2000bp，1000bp，750bp、500bp、300bp和200bp，左边rfh为等位基因，其片段大小为1904bp，右边Rfh为预测的候选基因，其片段大小为1926bp；

图3为本发明实施例1中过表达载体的构建图，其中互补片段包含预测基因上游2000bp的启动子和1926bp的编码区以及下游1800bp的3’非翻译区；

图4为本发明实施例1中阳性植株的PCR鉴定结果图；

图5为本发明实施例1中转基因T0代的花器官表型和花粉染色结果图，其中图A和图D为转基因T0代的花器官表型与花粉染色结果；图C和图F为不育系‘ganA’花器官表型与花粉染色结果；图B和图E为恢复系‘hw834’花器官表型与花粉染色结果；

图6位本发明实施例2中与hau CMS恢复基因连锁的分子标记RhM的PCR扩增结果图，其中M为DNA Marker(从上至下大小为2000bp，1000bp，750bp，500bp)；P为阳性对照，即恢复系hw834单株；N为阴性对照，即不育系ganA单株；S为F2群体中的不育单株；F为F2群体中的可育单株。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1甘蓝型油菜hau CMS恢复基因Rfh定位、克隆和验证。

1.分离群体构建

本实验所用的材料为甘蓝型油菜hau CMS不育系‘ganA’和甘蓝型油菜hau CMS恢复系‘hw834’。其中不育系‘ganA’是在芥菜天然雄性不育株中发现后经不断回交转育至甘蓝型油菜中形成的(Wan Z,Jing B,Tu J,Ma C,Shen J,Yi B,Wen J,Huang T,Wang X,FuT.Genetic characterization of a new cytoplasmic male sterility system(hau)inBrassica juncea and its transfer to B.napus.Theor Appl Genet,2008,116:355-362)；恢复系‘hw834’是通过将1303份油菜自交系(绝大多数为甘蓝型，少数为芥菜型)与hau CMS不育系(甘蓝型和芥菜型)广泛测交后筛选得到的恢复材料(Wei C,Wang HD,HengSP,Wen J,Yi B,Ma CZ,Tu JX,Shen JX,Fu TD.Construction of restorer lines andmolecular mapping for restorer gene of hau cytoplasmic male sterility inBrassica napus.Theor Appl Genet,2019,132:2525-2539)。

以恢复系材料hw834为父本，不育系材料ganA为母本进行杂交，其F1杂种表型为完全可育，F1单株套袋自交后获得F2群体1920株，其中可育单株1453株，不育单株467株。卡方检验χ2＝0.469，χ2_0.05,1＝3.84，表明育性的恢复受到单位点显性基因控制。

2.恢复基因Rfh的初步定位和精细定位

为了快速鉴定恢复基因Rfh所在染色体位置，我们利用F2中鉴定的可育单株与不育单株及其亲本构建了4个极端性状(极端可育与极端不育)DNA的混池，并利用Brassica60K Illumina Infinium SNP array芯片进行基因分型分析(质控标准使用callfrequency≥0.8,minor allele frequency(MAF)≥0.05)，经过筛选后得出恢复基因Rfh最可能存在于油菜A09号染色体上。

进一步基于油菜参考基因组Darmor-bzh开发分子标记进行精细定位，发现左侧标记S83与右侧标记S89具有不同的交换单株，因此将基因初步确定在chrA09的360kb物理区间内，接着将基因缩小至标记H7和标记Q33之间，即物理区间82.2kb内，将该物理区段进行开放阅读框(open reading frame，ORF)的预测，并用拟南芥的同源基因进行注释分析，进一步分析发现其中一个候选基因ORF14编码PPR蛋白。

连锁图谱如附图1所示，其中A为结合BSA混池与芯片分型分析得到的初定位区间；B为用于精细定位的分子标记的连锁图谱；C为候选区间内存在23个ORF。

3.候选基因的获得及分析

为了获得上述候选基因的编码区序列，并用于后续基因功能的验证及比较分析，设计引物B1926，分别以甘蓝型油菜hau CMS不育系‘ganA’和恢复系‘hw834’的基因组DNA为模板，采用常规的高保真PCR方法进行扩增，得到候选基因的编码区序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3的第60-1985位所示，同时还得到了该候选基因的等位基因的编码区序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4的第60-1963位所示。

本实施例所用到的引物B1926的序列如下：

B1926L：ATGATTCATCTGAAGAAGAAGA

B1926R：TCAATCCAACGATGATGATGATTTG

PCR检测结果如图2所示，图中M为DNA Marker，片段大小依次为2000bp，1000bp，750bp、500bp、300bp和200bp，左边rfh为等位基因，其片段大小为1904bp，右边Rfh为预测的候选基因，其片段大小为1926bp。

通过对候选基因及其等位基因的编码区序列的比较分析发现，候选基因相较于其等位基因的编码区核苷酸序列上发生了2处11个核苷酸序列的插入，以及11处单位点的核苷酸序列突变，这些核苷酸位置上的突变影响了二者编码的蛋白序列的不同，从而导致二者所翻译的蛋白对线粒体不育转录本的序列识别上的不同，进一步表明候选区间内编码PPR蛋白的基因可能是恢复基因Rfh。

3.候选基因的功能验证

为了验证该候选基因的功能，根据参考基因组序列，开发相应引物在恢复系和不育系中分别扩增出ORF14的基因组序列(包含上游2000bp的启动子和1926bp的编码区以及下游1800bp的3’非翻译区)，利用高保真PCR聚合酶扩增得到5.8kb大小的片段，其中所采用的引物的序列为：

UB2KL：TCCCCCGGGGTGTGTGTGTGTTAACAGCTCTGCAGG

DB2KR：GCTCTAGATATCTGATGCAGTTGTGGACGCACCTCAAGC

将扩增片段回收并双酶切后，克隆到植物表达载体pCAMBIA2300上，转化大肠杆菌DH5α中(购自全式金公司)，挑取单克隆进行检测并测序，成功获得含有候选基因(包含上游2000bp的启动子和1926bp的编码区以及下游1800bp的3’非翻译区)的植物表达载体，表达载体的构建图如附图3所示。

正确的重组质粒通过常规冻融法导入农杆菌菌株GV3101，并采用常规的油菜遗传转化方法，将重组质粒转化至甘蓝型油菜hau CMS不育系ganA中并培养得到幼苗。对已生根的小苗进行炼苗，然后按常规方法移栽到温室里，进行土培生长。

从获得的阳性植株上按照常规方法提取叶片总DNA，用通用引物M13-48和片段中间引物BMR进行常规PCR扩增，所用的引物序列如下：

M13-48:AGCGGATAACAATTTCACACAGGA

BMR:TCCTTTTTCCTTAAGGCATTATACG

然后用1.0％琼脂凝胶检测扩增产物。检测结果如附图4所示，该结果说明阳性植株中包含候选基因。

并且在转基因T0代观察花器官表型以及花药发育情况，并将其与‘hw834’和‘ganA’进行比较，以验证导入的候选基因的功能，结果如附图5所示。其中图A和图D为转基因T0代的花器官表型与花粉染色结果；图C和图F为不育系‘ganA’花器官表型与花粉染色结果；图B和图E为恢复系‘hw834’花器官表型与花粉染色结果。结果显示在转基因阳性的T0代植株中，8株表型为花丝伸长，花药外部发育完整，将花药取出使用1％醋酸洋红染色液染色，发现花药可被染成红色，即该候选基因可使不育系‘ganA’恢复育性，最终可确定该候选基因即为甘蓝型油菜hau CMS的育性恢复基因Rfh。

实施例2与恢复基因共分离的分子标记的开发及应用

本实施例基于实施例1验证得到的恢复基因Rfh(如SEQ ID NO.3所示，其中包含上游59bp和编码区的序列)及其等位基因(如SEQ ID NO.4所示，其中包含上游59bp和编码区的序列)的序列，设计开发了与该恢复基因Rfh共分离的分子标记RhM，所述分子标记RhM的核苷酸序列如下(如序列表SEQ ID NO.1-2所示)：

RhMF:AGATAGACGCAGAGAAAGGGAAAGCTGCCTTC

RhMR:GATGAGATTTGGAACAACCTTCATTTCCACC

利用实施例1中构建的分离群体，随机选取10个单株，以及恢复系hw834和不育系ganA单株，利用上述的分子标记对其进行基因型鉴定，鉴定过程如下：

1.采用CTAB法提取油菜叶片DNA

(1)取各植株的幼嫩叶片1cm²置入2毫升离心管中，加入钢珠，加入250μL2％的CTAB，在磨样机上研磨5min，再加入500μL的CTAB到离心管中；

(2)将离心管中的植物组织匀浆装到离心管盒里，然后放到65℃的水浴锅里水浴60min，每隔15min摇晃一次；

(3)水浴后的匀浆放置冷却至室温，并向离心管中加入体积比为24:1的氯仿：异戊醇混合溶液，轻轻上下颠倒混匀15min，然后12000rpm离心10min；

(4)将离心好的离心管按顺序摆放在操作板上，吸取上清液至新的1.5mL离心管中，吸取量为500μL；

(5)向上清液中加入50μL的KAc溶液，然后加入500μL的冰乙醇，盖上离心管盖子，轻轻摇晃几下，使冰乙醇与上清液充分混匀，再放入-20℃的冰箱中静置20-30min使基因组DNA析出；

(6)静置后的离心管在12000rpm下离心6min，倒掉上清液，加入500μL 75％的乙醇后再静置5min，倒掉上清液(有时可离心2min再倒上清)，重复一次，沉淀即为基因组DNA；

(7)将含有DNA的离心管倒置，并于通风橱中晾干,即得到各植株的基因组DNA；

(8)加入200μL ddH₂O到晾干的含有DNA的离心管中进行DNA溶解，溶解后于-20℃保存。

2.与hau CMS恢复基因连锁的分子标记的PCR扩增

以上述的分子标记RhM作为引物，以上述采用CTAB法提取得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增为20μl反应体系，每个反应体系中具体包括：

各物质混合后用矿物油覆盖，PCR反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min，1个循环；最后4℃保存。

3.扩增产物的电泳分析

以恢复系材料hw834和不育系材料ganA分别作为扩增阳性对照和扩增阴性对照，所有待测扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，使用EB(溴化乙锭)染色后，在紫外光下成像后，获得待测样品的基因型信息。检测结果如图6所示，其中M为DNA Marker(从上至下大小为2000bp，1000bp，750bp，500bp)；P为阳性对照，即恢复系hw834单株；N为阴性对照，即不育系ganA单株；S为F2群体中的不育单株；F为F2群体中的可育单株。

根据检测结果可知，扩增结果中仅有恢复系材料，即含有所述恢复基因Rfh的单株，可扩增出条带大小约600bp的条带，而不育系材料，即不含有所述恢复基因Rfh的单株则无法扩增出条带。因此利用该分子标记可快速、准确地将恢复系材料与不育系或保持系材料区分开，以鉴定得到甘蓝型油菜hau CMS恢复材料，且重复性好。将其应用于甘蓝型油菜hau CMS辅助选择育种中，可大幅提高恢复系的选育效率。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种甘蓝型油菜hau CMS恢复系材料的筛选方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1、提取待测植株的DNA；

步骤2、以步骤1得到的DNA作为模板，以下列引物进行PCR扩增：

RhMF:AGATAGACGCAGAGAAAGGGAAAGCTGCCTTC

RhMR:GATGAGATTTGGAACAACCTTCATTTCCACC；

步骤3、将PCR扩增产物进行检测，其中可成功扩增出片段的植株为甘蓝型油菜hau CMS恢复系材料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中采用CTAB法提取待测植株的基因组DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中PCR扩增的反应体系为20μL，包括：10X Taq Buffer 2μL，0.5U/μL Taq酶2μL，10mM dNTP 1μL，50ng/μL DNA模板2μL，10μMRhMF、RhMR引物各1μL，超纯水11μL。

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