CN109371038A

CN109371038A - 一个控制亚非稻杂种不育的基因s1a4及应用

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Publication number: CN109371038A
Application number: CN201811378142.6A
Authority: CN
Inventors: 陈乐天; 刘耀光; 谢勇尧; 汤金涛; 李小娟; 费越
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2038-11-19
Also published as: CN109371038B

Abstract

本发明属于基因工程技术和作物遗传育种领域，具体公开了一个控制亚洲稻与非洲稻的种间杂种不育的基因S1A4及其应用。本发明克隆了一个亚洲稻与非洲稻的种间杂种不育座位S1相关的非洲稻特异基因S1A4，确定了引起杂种配子不育的S1A4‑S1TPR‑S1A6三因子配子致死系统；对非洲稻S1A4进行定点敲除获得的突变系育性正常，但此突变系与亚洲稻的杂种能够消除杂种不育性，有效地打破S1介导的种间杂种育性障碍。本发明提供了利用基因工程手段敲除S1A4基因，高效地创造杂种亲和型非洲栽培稻品种（系）的方法，为利用远缘杂种优势，提高水稻产量的分子育种上提供了潜在的应用价值。

Description

一个控制亚非稻杂种不育的基因S1A4及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术和作物遗传育种领域，具体涉及一个控制亚洲稻与非洲稻杂交的杂种不育基因S1A4及应用。

背景技术

稻属(Oryza)是人类粮食作物的重要来源。水稻栽培稻种，主要有分布于亚洲的亚洲栽培稻(O.sativa L.)和分布于西非的非洲栽培稻(O.glaberrima)。亚洲栽培稻是一种被广泛种植的粮食作物，而非洲栽培稻虽然种植面积小，但具有耐热、抗旱、抗铝毒、抗病等多种优良的农艺性状，是一种重要的种质资源。亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间遗传差异大，存在明显的杂种优势。但由于这2个稻种的遗传分化导致它们之间产生生殖隔离，主要表现为杂种不育，即其杂种的花育性低和结实率低，从而限制了水稻种间杂种优势在水稻育种中的应用。因此，克服种间杂种不育对于种间杂种优势利用具有重要的意义。

亚洲稻与非洲稻种间杂种(简称亚非稻杂种)的杂种不育主要受S1基因座位的控制，它同时控制杂种的雌性配子不育和雄性配子不育，即杂种产生的携带亚洲稻等位基因S1-s的雌配子和雄性配子发生败育。之前的研究表明，非洲稻等位基因S1-g含有两个非洲稻特异、编码肽酶的基因S1TPR(原命名OgTPR1)与S1A6(原命名SSP)参与了该座位介导的种间杂种不育，但仅有这两个基因又不足以引起杂种的雌雄配子败育(Xie等2017；Koide等2018)。因此，推测S1座位的杂种不育除了需要S1TPR与S1A6，还需要其他基因参与形成完整的配子致死系统。

目前，由于对于亚非稻种间杂种不育的机理尚未探明，严重制约了亚非稻杂交在优良水稻品种中的应用。

发明内容

本发明的首要目的是针对亚非稻种间杂交中存在严重的杂种不育问题，提供一个关键的杂种不育基因S1A4及其在远缘杂种优势中的应用。

本发明的第一个目的是提供S1A4基因在水稻远缘杂交育种中的应用。

本发明的第二个目的是提供S1A4蛋白在远缘杂交育种中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种培育远缘杂种亲和型的非洲稻品系的育种方法及其在远缘杂交育种应用的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

为了探究亚非稻杂种不育关键未知基因，构建了S1TPR和S1A6共转化的双基因转化体和一系列的S1座位的其它非洲稻特异基因的单基因转化体材料。将这些双基因与单基因转化材料配制不同的杂交组合，确定了S1座位的另一个关键基因S1A4也是亚非稻杂种不育必须的，从而明确了在亚非稻杂种不育中，导致雌雄配子不育的S1A4-S1TPR-S1A6三因子配子致死系统。

进一步地，构建了S1A4的功能敲除载体，对非洲稻S1-g座位的S1A4进行定点编辑，从而获得相应的敲除突变体s1a4。将s1a4突变体与亚洲稻亲本(RP-s)杂交，获得育性恢复正常的相应的突变体杂种F₁(mF₁)。分析mF₁自交后代的S1座位基因系的分离比，确认恢复孟德尔自由分离比，从而获得S1座位非洲稻亲和系。

因此本发明保护以下内容：

S1A4基因在远缘杂种不育中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

S1A4蛋白在远缘杂种不育中的应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述远缘杂种不育为亚非稻间远缘杂种不育。

本发明还要求保护一种克服远缘杂种不育的亲和型非洲稻品系的方法，对非洲稻特异的S1A4基因进行表达抑制或定点敲除。

优选地，以反义基因技术或RNA干扰技术对非洲稻特异的S1A4基因进行表达抑制。

优选地，以基因编辑技术对非洲稻特异的S1A4基因进行定点敲除。

更优选地，利用CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1基因编辑系统对非洲稻特异的S1A4基因进行定点敲除。

更优选地，构建含有针对S1A4基因的1个或多个特异靶点的CRISPR/Cas9载体导入含有S1-g基因的非洲稻中，以表达Cas9/sgRNA核酸酶复合体靶向切割目标靶点，对S1A4基因进行定点敲除。

更优选地，所述特异靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

更优选地，所述特异靶点通过核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示的靶点接头序列变性后连入sgRNA表达盒中间载体，并利用核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示扩增sgRNA表达盒，将其连入CRISPR/Cas9载体，将构建好的CRISPR/Cas9载体转入农杆菌中，侵染至含有非洲稻S1-g的近等基因系水稻品系中。

更优选地，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示的引物筛选定点敲除阳性植株。

最优选地，通过核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示的靶点接头序列变性后连入sgRNA表达盒中间载体pLYsgRNA-OsU6a；并利用核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示扩增表达盒引物将其连入CRISPR/Cas9载体；将构建好的CRISPR/Cas9载体转入农杆菌中，并侵染非洲稻S1-g的近等基因系水稻品系中。

核酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列在对非洲稻特异的S1A4基因进行定点敲除和/或培育远缘杂种亲和型非洲稻品系中的应用，也属于本发明的保护范围。

核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5、SEQ ID NO：6～7或SEQ ID NO：8～9所示的任一对或任一条核苷酸序列在对非洲稻特异的S1A4基因进行定点敲除和/或培育远缘杂种亲和型非洲稻品系中的应用，也属于本发明的保护范围。

其中，靶点接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示；

扩增表达盒引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示；

阳性植株检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示。

一种利用权利要求3和4所述育种方法培育的亲和型非洲稻品系的远缘杂交育种的方法，将利用以上所述育种方法培育的亲和型非洲稻品系与亚洲稻品系杂交，产生可育的杂交种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明得到了一个亚洲稻与非洲稻的种间杂种不育相关的非洲稻特异新基因S1A4，确定了引起配子不育的S1A4-S1TPR-S1A6三因子致死系统；对非洲稻S1A4进行定点敲除获得突变体，有效地打破S1座位介导的种间杂种不育现象。该突变体育性正常不受影响，却能够消除与亚洲稻杂交的杂种不育现象。S1A4基因功能的确定为种间远缘杂种优势的利用提供了有效的保证，对提高作物产量具有重要的应用价值。本发明提供了利用基因工程手段敲除S1A4基因，可以高效地创造具有杂种亲和性的非洲栽培稻品系的技术方法，为利用远缘杂种优势，提高作物产量的分子育种上提供了潜在的应用价值。

附图说明

图1为S1座位杂种不育关键基因S1A4的鉴定；(A)S1座位的亚洲稻等位基因S1-s和非洲稻S1-g的基因组结构。S1-g区含有非洲稻特异的S1A2～S1A6，而亚洲稻等位基因S1-s不含有这些基因；S1TP是S1TPR的同源基因，是由于一个C-A单碱基突变产生提前终止密码而丧失功能。其中S1TPR与S1A6(SSP)已经被证明参与S1控制的种间杂种不育(Xie等2017；Koide等2018)；(B)将S1TPR和S1A6构建双基因转化载体(S1TPR-S1A6-t)，以农杆菌介导转化亚洲栽培稻品系IRAT216，获得的转化体表现正常的花粉育性和小穗育性；(C)将S1A2～S1A5分别构建单基因转化载体(S1A2-t～S1A5-t)，转化IRAT216获得转化体(S1A2-t～S1A5-t)。将S1TPR-S1A6-t双基因转化体与各个单基因转化体杂交，获得4个组合的转基因杂种F₁，其中S1TPR-S1A6-t×S1A4-t的杂种F₁花粉和小穗育性表现为半不育，而其他组合则表现为全可育，从而表明S1A4是一个参与S1座位杂种不育的关键基因，即引起配子不育的致死系统由S1A4-S1TPR-S1A6三因子构成。

图2为S1A4基因敲除系s1a4不同世代的转基因元件分离分析；(A)S1A4基因敲除系s1a4的10个独立T₀植株的T-DNA转基因元件(含有Cas9基因，向导RNA/sgRNA,抗潮霉素基因HPT)分析，以HPT特异引物进行PCR检测。其中s1a4-1株系用于进一步后代的分离分析；(B)表示在s1a4-1株系的T₁代转基因元件分析,分离到不携带转基因的3号和8号单株(*)，其中s1a4-1-3单株用于进一步确认分析；(C)表示确证s1a4-1-3株系T₂代植株不携带转基因元件。

图3为敲除突变体s1a4及突变体杂种mF₁的花粉和小穗育性表型；(A，B)分别表示携带非洲稻等位基因S1-g的近等基因系(NIL-g)和其s1a4敲除系的正常花粉育性和正常小穗育性；(C，D)分别为NIL-g与亚洲稻轮回亲本RP-s(IRAT216)的杂种F₁的半不育花粉和半不育小穗，和s1a4与RP-s的杂种mF₁的正常花粉育性和正常小穗育性。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法如基因克隆和水稻转化等均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，所使用的试剂或材料均为通过商业途径得到。

实施例1.S1座位杂种不育配子致死系统关键基因S1A4的功能鉴定

亚非稻种间杂种不育S1基因座位是一个同时控制雌性和雄性配子不育的杂种不育座位，S1-g区间内含有6个表达基因(图1A)，其中，S1TPR与S1A6(SSP)为已报道的参与S1座位杂种不育基因(Xie等2017；Koide等2018)。

一、将基因S1TPR与S1A6双基因载体转化亚洲稻亲本

1、实验方法

(1)利用表1中的引物，将S1TPR和S1A6基因从非洲稻基因组扩增，然后利用Giboson assembly连接方法将扩增片段克隆至双元载体pCambia1300的EcoRI和BamHI位点中。

Giboson assembly连接方法为：用10U内切酶将100ng的pCambia1300切成线状，分别加入S1TPR和S1A6基因片段(各50ng)和5μL Giboson assembly反应液(NEB公司)，在50℃连接30min。

(2)将连接产物转化大肠杆菌DH10B，获得S1TPR-S1A6串联转化载体质粒。

(3)将该载体导入农杆菌EHA105中，通过农杆菌介导的方法转入亚洲稻轮回亲本RP-s(IRAT216)中，获得功能互补转基因植株(S1TPR-S1A6-t)，进而观察这个转化体的花粉和小穗育性。

2、实验结果

结果发现，该双基因转化体(S1TPR-S1A6-t)的花粉和小穗育性为全可育(图1B)，这一结果表明，仍有其他因子参与S1座位的杂种不育。

二、非稻特异基因S1A2～S1A5转化体与S1TPR-S1A6-t双基因转化体杂交

为了克隆其他必需因子，构建了5个非稻特异基因S1A2～S1A5的单基因转化体(S1A2-t～S1A5-t)。将这些单基因转化体与S1TPR-S1A6-t双基因转化体杂交获得4种杂种F₁。

1、实验方法

(1)利用表1中的引物，将S1A2至S1A5从非洲稻基因组扩增，然后利用Gibosonassembly连接方法将扩增片段克隆至pCambia1300载体的EcoRI和BamHI位点中。

Giboson assembly连接方法为：用10U内切酶将100ng的pCambia1300切成线状，分别加入S1A2-S1A5基因片段(各50ng)和5μL Giboson反应液(NEB公司)，在50℃连接30min。

(2)将连接产物转化大肠杆菌DH10B，获得S1A2-S1A5转化载体质粒。

(3)将这些载体导入农杆菌EHA105中，通过农杆菌介导的方法转入亚洲稻轮回亲本RP-s(IRAT216)中，获得4个功能互补转基因植株(S1A2-t～S1A5-t)。将这些功能互补转基因植株分别于S1TPR-S1A6-t杂交获得4中不同的F₁植株。

表1.功能互补转化载体构建的引物

2、实验结果

实验显示，只有S1TPR-S1A6-t×S1A4-t的杂种F₁的花粉和小穗育性为半不育，而其他组合仍未全可育(图1C)，表明S1A4是参与杂种不育的关键基因。

实施例2.利用CRISPR/Cas9技术对S1A4进行基因敲除

一、实验方法

根据S1A4基因的核酸序列(核酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，在S1A4外显子选取一段20bp的序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示TGATAGAGCCCAAGAATCGG)作为S1A4敲除靶点。将该靶点接头序列(U6a-S1A4-F/U6a-S1A4-R，核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示)变性后连入sgRNA表达盒中间载体pLYsgRNA-OsU6a。

利用表2引物对Pps-GGL/Pgs-GGR扩增表达盒引物(核苷酸序列如SEQ ID NO：6～7所示)，并将其连入CRISPR/Cas9载体。将构建好的CRISPR/Cas9载体转入农杆菌EHA105中，并通过农杆菌介导的方法导入至含有非洲稻S1-g的近等基因系NIL-g中，进而利用表2引物对S1A4F/S1A4R(核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示)通过PCR扩增一段含有靶点的片段和测序分析S1A4基因打靶效果，最终筛选获得s1a4突变体(表3)。

表2.S1A4的敲除载体构建及靶点检测引物：

二、实验结果

筛选获得s1a4突变体的靶点编辑分析如表3所示，

表3敲除突变体s1a4的靶点编辑分析：

实施例3得到不携带转基因元件的s1a4突变体

利用转基因潮霉素抗性筛选基因HPT的标记，对敲除载体的转基因元件(含有Cas9基因，向导RNA/sgRNA，抗潮霉素基因HPT)进行多个世代分离，分离得到不携带转基因元件的s1a4突变体。

一、实验方法

抽提s1a4的T₀，T₁和T₂世代的基因组DNA，以此作为模板，利用表4引物对Hpt-F/Hpt-R，扩增HPT基因部分序列，以确定转基因元件存在与否。

表4转基因植株检测引物

二、实验结果

如图2所示，在T₀代中，获得了10个阳性转基因植株，进而对株系1(s1a4-1)的后代分析，鉴定到T₁子代株系中3号和8号株系不携带转基因。最后，进一步确认T₁子代株系3号株系(s1a4-1-3)的T₂后代均不携带转基因。这些数据表明，可以通过多代分离检测到这些不携带转基因元件的突变体s1a4。

实施例4突变体s1a4及其突变体杂种mF₁的花粉小穗育性表型分析

一、S1A4对育性的影响

1、实验方法

从即将开花的单株穗子的中上部枝梗收集颖花，于75％乙醇中保存，挑出花药，用1％I₂-KI溶液染色，在光学显微镜下观察，形态饱满，可染上黑褐为可育花粉，形状不规则且不着色为不育花粉。每株至少观察3朵颖花，每朵至少观察3个视野。当小穗成熟后，统计3个独立株系的主穗结实率情况，从而反映小穗育性。

2、实验结果

与正常的NIL-g(含有非洲稻S1-g)为对照，s1a4突变体的育性同样表现为全可育，说明功能敲除S1A4不会影响雌雄配子的正常发育(图3A和图3B)。与亚洲稻轮回亲本RP-s和含有非洲稻S1-g的近等基因系NIL-g正常杂种F₁的花粉小穗半不育对照(图3C)，s1a4和RP-s杂交获得的突变体杂种mF₁表现为育性恢复，呈现花粉和小穗全可育表型(图3D)。

二、对mF₁自交产生的mF₂植株进行S1基因型的分离比分析

1、实验方法

摘取mF₂样品幼苗叶片置于96孔深板内，加入150μL无菌水，每个孔加入1粒4mm钢珠，覆盖上硅胶垫，在涡旋振荡器上震动至叶片被钢珠打成碎片。吊篮转子离心机离心10s，所得样品即为标记PCR扩增模板。利用96复制器将制备好的模板加入配置好的PCR体系中，利用表5的引物2170-F/2170-R进行PCR扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，从而对mF₂的群体的S1位点进行分型分析。

表5 S1位点分离检测引物：

2、实验结果

结果表明：相对于正常F₂群体的偏态分离，mF₂群体的S1基因型分离比恢复到1:2:1的自由分离比(表6)。这些结果表明，S1A4的功能敲除系能够用于构建亚非稻种间亲和系。

表6突变体s1a4与RP-s杂交的mF₂后代分离分析：

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一个控制亚非稻杂种不育的基因S1A4及应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5015

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

gctcctcggt catacatgtg atttccactg atgcgcgagg gaggaggcga tttggtcgat 60

gggcgatttc atcggcgcgg cggctggtgg agtggattcc ttcgtcggag agatccccga 120

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tgagttgttg ctgtacattg gagtagcata atatcttctc aactagtagc tcttggcctt 3180

aaccttttct tttatgatac tcttggcctt aatttgaatc tgcatgtgta atccaatata 3240

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cgcacgttca tgcgagttcc gctcaaccat agtacaaccc ggtttgtgtt cacttatacc 3660

agtagtaggt cggttgagtc gtacccagtt gaaactccaa atcatgcagt accaaattca 3720

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atcattttgc aggattgtcg ccctgcaaca ggttgttcag gtgctgaatt taaagttgca 3900

ctcaatgcaa gccatctcca gaaggtgcta tcgattcttg atccaccaga tccaccacaa 3960

aagaggaacc acaaccttag cgggggtaag aagaggaagg ctacaggaag tgggggagga 4020

agaggaaggc ggcaaagagt ctaggttgtt gttagagaaa agttctgatg agaggtgggg 4080

tgacaagaat gtctgtcatt ttgttgctgt atcccaacta ttacaattca tctcttagtc 4140

tataatgcac tatgtatccg ttctatcatt ataacttatc aatttgcggg cttagtcttt 4200

aatgccaaac tatcgctatg atccttcttt tttatcagta acttatcaac tagtttattg 4260

cttaatacac ctgtttgctg cttctctttt ttaatcaatg ggggtggagc ttgctactct 4320

tccaaacctt catcgagtga tacctgccat gttgctctca taatcgaaca tcattttatt 4380

ataaaccctc atcatgcata cgcctgttaa atcatgatag cagtatatgt taggggcata 4440

actttatatt tacttcctcc gtgtctagat atattaacat caatatgaat atgagaaatg 4500

ctagaatgac ttagattatg aaacggagga agtagcaatt agtaaaagat agtttcacta 4560

acttgatgga atatagtgct atgtgaatat gataagttct gatggaaaat actagttctc 4620

atccgaggac ctctgtgtat ggtttcttga ttgttgctgg ataaatatac tatatgcgct 4680

gagggaagag cagcttgggt caggtttgaa gacttataaa agccctaaag ctactgtttt 4740

tctcatattt ttgatttttt tttcttctcg ggttggcaga gctctgcatc ctcagtgttt 4800

attgcaaaac taggtagtaa ggtgggccca tatcaggtgg taataagagg ttggagagac 4860

accacaatgt atatatgtgt aaagtgggta ataaggtggg acccatctta aaaagtattc 4920

aaacatgagc catgacacaa ctaaaaaaat agatgaggcc caccataaag tgctaatact 4980

tggtagtaag cttatactct gatagtagtt gttta 5015

<210> 2

<211> 261

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2

Met Ala Ser Asn Ile Gln Ser Glu Ala Glu Ser Ala Arg Asp Arg Ala

1 5 10 15

Gln Glu Ser Val Val Ile Val Arg Val Asn Thr Asp Pro Asn Glu Tyr

20 25 30

Cys Cys Gly Cys Val Val Arg Ser Lys Phe Val Gly Gly Ser Gly Asn

35 40 45

Arg Thr Thr Leu Val Ile Thr Ser Ser Lys Phe Val Gln Gly Arg Glu

50 55 60

Asn Asp Leu Thr Val Val Phe Trp Asn Lys Lys Glu Leu Lys Ala Thr

65 70 75 80

Phe Leu Arg Thr His Gly Ala Phe Cys Leu Leu Ala Thr Asp Phe Tyr

85 90 95

Leu Trp Cys Gln Pro Ile His Leu Leu Glu Gly Asn Ala Gly Leu Glu

100 105 110

Asn Ser Arg Thr Phe Met Arg Val Pro Leu Asn His Ser Thr Thr Arg

115 120 125

Phe Val Phe Thr Tyr Thr Ser Ser Arg Ser Val Glu Ser Tyr Pro Val

130 135 140

Glu Thr Pro Asn His Ala Val Pro Asn Ser His Glu Tyr Phe Met Val

145 150 155 160

Ser Cys Ser Tyr Phe Gln Lys Thr Ser Lys Gly Val Ser Arg Leu Thr

165 170 175

Gly Ala Pro Val Phe Cys Thr Gly Asp Ala Gly Thr Ala Gly Arg Thr

180 185 190

Ile Gly Ile Ile Leu Gln Asp Cys Arg Pro Ala Thr Gly Cys Ser Gly

195 200 205

Ala Glu Phe Lys Val Ala Leu Asn Ala Ser His Leu Gln Lys Val Leu

210 215 220

Ser Ile Leu Asp Pro Pro Asp Pro Pro Gln Lys Arg Asn His Asn Leu

225 230 235 240

Ser Gly Gly Lys Lys Arg Lys Ala Thr Gly Ser Gly Gly Gly Arg Gly

245 250 255

Arg Arg Gln Arg Val

260

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

tgatagagcc caagaatcgg 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 4

gccgtgatag agcccaagaa tcgg 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 5

aaacccgatt cttgggctct atca 24

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 6

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 7

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtatccatc cactccaagc tc 42

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 8

gaatctgcat gtgtaatcca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 9

ctagactctt tgccgccttc 20

Claims

1.S1A4基因在水稻远缘杂交育种中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

2.S1A4蛋白在水稻远缘杂交育种中的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

3.一种培育远缘杂种亲和型非洲稻品系的育种方法，其特征在于，对非洲稻特异的S1A4基因进行表达抑制或定点敲除。

4.权利要求3所述的育种方法，其特征在于，以反义基因技术或RNA干扰技术对非洲稻特异的S1A4基因进行表达抑制；或以基因编辑技术对非洲稻特异的S1A4基因进行定点敲除。

5.权利要求4所述的育种方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1基因编辑系统对非洲稻特异的S1A4基因进行定点敲除；构建含有针对S1A4基因的特异靶点的CRISPR/Cas9载体导入非洲稻中，对S1A4基因进行定点敲除。

6.权利要求5所述的育种方法，其特征在于，所述特异靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

7.权利要求6所述的育种方法，其特征在于，所述特异靶点通过核苷酸序列如SEQ IDNO：4～5所示的靶点接头序列变性后连入sgRNA表达盒中间载体，并利用核苷酸序列如SEQID NO：6～7所示扩增sgRNA表达盒，将其连入CRISPR/Cas9载体，将构建好的CRISPR/Cas9载体转入农杆菌中，侵染至含有非洲稻S1-g的近等基因系水稻品系中；

优选地，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示的引物筛选定点敲除阳性植株。

8.核酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列在对非洲稻特异的S1A4基因进行定点敲除和/或培育远缘杂种亲和型非洲稻品系中的应用。

9.核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5、SEQ ID NO：6～7或SEQ ID NO：8～9所示的任一对或任一条核苷酸序列在对非洲稻特异的S1A4基因进行定点敲除和/或培育远缘杂种亲和型非洲稻品系中的应用。

10.一种利用权利要求3和4所述育种方法培育的亲和型非洲稻品系的远缘杂交育种的方法，其特征在于，将利用权利要求3和4所述育种方法培育的亲和型非洲稻品系与亚洲稻品系杂交，产生可育的杂交种。