CN113462696B - 水稻低温敏感叶形基因srnl9及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域，本发明涉及一种利用正向遗传和图位克隆技术克隆到的水稻低温黄化半卷窄叶调控基因SRNL9及其应用。基因SRNL9的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。在水稻中，SRNL9基因功能的缺失导致叶片的大小维管束数目减少，泡状细胞体积变小、数目增多，导致叶片窄卷。

Description

水稻低温敏感叶形基因SRNL9及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种利用正向遗传和图位克隆技术克隆到的水稻低温黄化半卷窄叶调控基因SRNL9及其应用。
背景技术
低温是我国影响植株生长发育的主要非生物胁迫因素之一，水稻在低温胁迫下会产生一系列的生理及代谢变化。在不同的生育时期遇到低温胁迫都能够造成不同影响。提高水稻苗期耐冷性和半卷直立的理想株型是品种改良和分子设计育种的重要目标，叶片形态和叶绿体发育往往受两个相对独立的遗传网络系统调控。
低温敏感突变体影响植株生长和叶绿体发育，主要通过影响植物体内的生理代谢变化来实现。其中包括影响胞膜成分变化、激素变化、碳水化合物变化、转导信号变化、相关酶活性变化等等。在多个不同时期低温胁迫中，苗期低温是到目前关于低温敏感研究较多的一类。苗期低温敏感突变体多伴随着叶色变化，编码的多为低温下叶绿体发育中重要调控蛋白，会对叶绿体发育、光合作用及体内的信号途径等造成影响。低温敏感植株在低温胁迫下，植株的发育会受到较大影响，在苗期会使叶绿体发育缓慢，类囊体片层缺失，最终导致植株叶色变化。
目前已知很多低温胁迫下参与调控叶绿体发育的基因，如WLP1、TCD10、OsV4、ALS3，V1、TCD11和TCD5等。WLP1编码了叶绿体核糖体蛋白，是形成叶绿体核糖体的主要组分。低温条件下时，wlp1突变体叶绿素合成缺陷，幼苗在4叶期前表现为白化叶片，4叶期以后变为绿色，未成熟的穗在抽穗期也会表现为白色，白化表型在低温条件下更强烈，与野生型相比，wlp1开花稍微延迟，株高变高，叶片及其他性状表型正常(Song et al.,2015)。V1编码了一个叶绿体上的蛋白质NUS1，参与了叶绿体RNA的代谢调控过程且促进了早期叶绿体发育冷胁迫下质体遗传系统的建立(Kusumi et al.,1997)。NUS1蛋白特异地在未露出的未成熟叶片中积累，低温处理能增强蛋白的积累；因此，它突变后会使早期叶绿体发育遗传系统的激活障碍，导致叶片萎黄，但叶片形态发育正常。OsV4核基因编码了一个PPR蛋白，PPR蛋白都是由基序串联组成的，多定位于质体中，可以影响基因转录、RNA剪切加工编辑及mRNA的翻译(Gong et al.,2014)。五肽重复序列(PPR)蛋白是植物中最大的蛋白质家族之一。另外，ASL3也编码了PPR，具有8个基序；TCD10具有27个PPR基序，都是低温胁迫下叶绿体发育所必需的，会导致叶片色素变化(Wu et al.,2016)。TCD11编码叶绿体中的核糖体小亚基蛋白S6，影响低温下小亚基核糖体的形成，是低温胁迫下叶绿体生物发生和早期叶绿体发育的重要组分。核糖体生成发生异常时，会抑制叶绿体发育。该突变体tcd11在20℃低温处理后叶片会白化并导致植株死亡，而在32℃环境中叶色和液品形态表型均无差异(Wanget al.,2017)。tcd5作为温度敏感的叶绿素缺陷突变体，在低温下呈现出完全的无法恢复的白化，最终会导致死亡，而在正常温度下，植株叶片发育正常(Wang et al.,2016)。研究表明，这些基因都参与了水稻叶绿体发育，并在不同环境温度或不同时期会表现出白化或黄化的表型，但与水稻植株叶片形态建成没有直接关系。
叶片是植株形态建成的一个重要方面，对作物群体结构和产量具有重要影响。叶片形态建成涉及不同组织结构和多种类型细胞的发育，其复杂的分子机理依赖于对其遗传网络的系统解析。目前，科研人员利用水稻叶形突变体和DH群体、RIL群体和CSSL群体等多种不同遗传群体，分离克隆了超过60个叶形发育相关调控基因及主效QTL，包括30余个叶宽发育相关基因，20余个叶长调控基因，以及将近30个卷叶基因，其中很多基因在调控叶大小的同时，也会影响叶片卷曲度(Wang et al.,2020)。虽然，部分叶宽调控基因存在一因多效的功能，其突变体除了叶宽改变外，还可能伴随叶绿体发育、分蘖、株高及粒型等性状的改变，如突变体nal1、nrl1、nrl2、sg1、arf19等。这些叶形调控基因大部分没有对叶片中叶绿体发育存在直接联系。
迄今为止，关于水稻叶形调控基因响应环境温度的报道不多，需要科学家们挖掘更多的基因资源来解析环境温度与基因响应之间相互作用机制。
参考文献
Jian Song,Xiangjin Wei,Gaoneng Shao,Zhonghua Sheng,Daibo Chen,CongliLiu,Guiai Jiao,Lihong Xie,Shaoqing Tang,Peisong Hu；水稻核基因WLP1编码一个低温条件下水稻叶绿体发育所必需的叶绿体核糖体L13蛋白，Plant Molecular Biology,2014,84(3):301-314；
Kensuke Kusumi,Akiko Mizutani,Mitsuo Nishimura,Koh Iba，水稻叶片发育早期，淡绿色基因V1决定转录/翻译开关的质体基因的表达时间；The Plant Journal,1997,12(6):1241-1250；
Xiaodi Gong,Qianqian Su,Dongzhi Lin,Quan Jiang,Jianlong Xu,JianhuiZhang,Sheng Teng,Yanjun Dong；水稻OsV4编码一种新的低温胁迫下叶绿体发育所必需的五三肽重复蛋白；Journal of Integrative Plant Biology,2014,56(4):400-410；
Quan Jiang,Jie Mei,Xiaodi Gong,Jianlong Xu,Jianhui Zhang,Sheng Teng,Dongzhi Lin,Yanjun Dong；编码伴侣蛋白60α亚基(Cpn60α)的水稻TCD9对早期叶绿体发育的重要性；Plant Science,2014,(215-216):172-179；
Wang Wen-Juan,Zheng Kai-Lun,Gong Xiao-Di,Xu Jian-Long,Huang Ji-Rong,Lin Dong-Zhi,Dong Yan-Jun；水稻TCD11编码低温下叶绿体发育所必需的质体核糖体蛋白S6；Plant Science,2017,259:1-11；
Yufeng Wang,Jianhui Zhang,Xiaoliang Shi,Yu Peng,Ping Li,Dongzhi Lin,Yanjun Dong,Sheng Teng；温度敏感的白化基因TCD5编码一种单加氧酶，在低温下影响叶绿体的发育；Journal of Experimental Botany,2016.67(17):5187-5202；
Wang Jiajia,Xu Jing,Qian Qian,Zhang Guangheng.；水稻叶片发育：组织细胞如何调节叶片极性的建立；Rice science,2020,27(6):468-479。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从水稻低温黄化半卷窄叶突变体中克隆的新基因，该基因编码的功能蛋白，以及该基因的用途：调节叶片宽度和卷曲度。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻叶形控制基因SRNL9(水稻低温敏感叶形基因SRNL9)，所述基因SRNL9的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。
作为本发明的水稻叶形控制基因SRNL9的改进：SRNL9基因的cDNA序列如SEQ IDNO：2所述。
作为本发明的基因的改进：核苷酸序列还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
本发明还同时提供了水稻叶形控制基因SRNL9编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所述。
作为本发明的水稻叶形控制基因SRNL9编码的蛋白质的改进：氨基酸序列还包括在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种中的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
本发明还同时提供了含有上述基因的质粒、植物表达载体。
本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有SEQ ID NO：1所示所述的基因序列。细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
本发明还同时提供了上述水稻叶形控制基因SRNL9的用途：改良禾本科植物(特别是水稻)的叶片形态；增加禾本科植物(特别是水稻)叶片的宽度，降低禾本科植物(特别是水稻)叶片的卷曲度；还提高植株对低温的抗性。
作为本发明的水稻叶形控制基因SRNL9的用途的改进：过表达基因SRNL9增加水稻的叶片宽度。
本发明还同时提供了一种改良水稻叶形的方法：包括用基因SRNL9转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株；所构建的转基因水稻的叶片形态得以改良。转化可采用农杆菌介导法或基因枪法。
本发明利用转基因互补实验确认该基因的功能；同时还涉及利用该基因调控叶片近轴面泡状细胞和维管束发育，影响叶片形态发育，调节叶片水分运输速率，可以塑造水稻理想株型，创建耐冷育种种质材料，提高农作物的产量。
具体而言：本发明所提供的从水稻苗期叶片低温黄化的半卷窄叶突变体中克隆的新基因SRNL9，具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。也包括在取代一个核苷酸而产生的突变体等位基因，还含具有相同功能并能达到本发明目的的基因序列。本发明提供了SEQ IDNo：3所示的蛋白质，还包括其中进行一个或几个氨基酸的替换、插入或缺失氨基酸所获得的功能类似物。本发明所提供了含有SEQ ID No：1所示序列的基因或含部分该基因片段的载体，如图4所示，该载体可以表达由上述核苷酸序列编码的多肽或同源类似物。
本发明通过半卷叶水稻突变体srnl9(semi-rolled and narrow leaf)，利用图位克隆技术分离到的水稻半卷窄叶调控基因，与Jiang等预测编码Cpn60α亚基但未进行基因功能验证的候选基因TCD9等位，其目前已知的主要用途是影响苗期的叶绿体发育(Jianget al.,2014)，但其研究内容并未涉及其对水稻叶片形态发育的功能。本发明经研究发现，基因突变不仅造成水稻苗期低温叶片白化、耐冷性下降，同时还通过减少水稻叶片中维管束、增加泡状细胞数目，影响水稻的叶形中-侧轴向极性发育，从而减少叶片的宽度和增加卷曲度。本发明同时兼顾水稻苗期耐冷和叶形改良，提高植株对低温的抗性，改良植物叶片的卷曲度，增强光合作用效率，加速干物质的积累，在水稻株型改良、抗逆分子设计育种中具有广阔的应用前景。
实现本发明的具体技术步骤如下：
一、水稻半卷窄叶突变体srnl9的分离和遗传分析
本发明所采用的苗期叶片低温黄化的水稻半卷窄叶突变体(semi-rolled andnarrow leaf 9,srnl9)是：将籼稻品种(indica)蜀恢527经1％浓度的化学诱变剂(ethylmethane sulphonate,EMS)处理后，再通过大量筛选而得到的表型稳定的突变体。该突变体自幼苗开始出现窄叶半卷表型，且伴随整个生育期；如图1所示。杂交之后产生的F1代自交产生的F2代群体，F2代群体共422株，其中正常平展叶为324株，半卷窄叶突变体表型植株为98株，经χ2测验，正常叶与半卷窄叶个体的分离比符合3:1(χ2(0.7109)<χ2 0.05(3.84))，表明本发明所得到的是一个符合单基因控制遗传规律的隐性突变体。
二、图位克隆控制水稻叶形的SRNL9基因
1、SRNL9基因的初步定位
为了分离SRNL9基因，本发明利用突变体srnl9与粳稻品种日本晴杂交后自交而得到的F2作为定位群体，构建BSA混池，利用SSR标记进行初定位，将其初步定位于第9染色体长臂上，并介于的B9-14和B9-15两标记之间，见图2。
2、SRNL9基因的精细定位
通过对籼稻品种蜀恢527和粳稻品种日本晴进行序列比对分析，发展新的分子标记，将SRNL9基因精确定位于M13(F：TCCTTCTCTTGGATGTGTGTGT；R：TAGAAAATAAGTGTGGTCGTTGGC)和M9(F：ATCAGGCCGGGGTGAAATTA；R：CCCCACCATCCAACCAAAAT)两个分子标记之间，51.156kb的物理距离范围内，里面共包含6个开放阅读框(ORF)。通过测序分析此区段的开放阅读框(ORF)，将SRNL9基因确定于第9染色体BAC克隆AP005396的123830-127302的位置(图3)。
3、SRNL9基因的鉴定和功能分析
利用pCAMBIA1300质粒构建SRNL9互补载体。构建步骤：PCR扩增全长为6636bp的基因组DNA片段，包含SRNL9基因的ATG上游启动区的1994bp，编码区的3473bp，终止子后的1169bp下游序列，将该片段连接到pCAMBIA1300载体多克隆位点KpnⅠ和XbaⅠ之间获得pCAMBIA1300-SRNL9互补载体(图4)。
通过转基因技术，进行功能互补的转基因研究，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常叶片形态的转基因水稻(图5)，证明了本发明正确克隆了SRNL9基因，明确了SRNL9基因的DNA序列(SEQ ID No：1)和cDNA序列(SEQ ID No：2)，氨基酸序列分析表明SRNL9基因编码一个Rubisco亚基结合蛋白(SEQ ID No：3)。
本发明从水稻低温黄化半卷窄叶突变体(semi-rolled and narrow leaf 9,srnl9)中克隆并鉴定了控制水稻叶片卷曲程度及宽度的基因，将其命名为SRNL9，并通过互补实验进行基因功能验证。在水稻中，SRNL9基因功能的缺失导致叶片的大小维管束数目减少，泡状细胞体积变小、数目增多，导致叶片窄卷。图位克隆的结果表明，该基因编码的功能蛋白，通过调控叶片近轴面泡状细胞和维管束发育，影响叶片的宽度及卷曲度。
附图说明
下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。
图1是野生型蜀恢527(SH527)及突变体srnl9植株表型图；
左图为分蘖期野生型蜀恢527以及突变体srnl9的植株表型；右上图为分蘖期野生型蜀恢527以及突变体srnl9叶片的横切图；右下图为分蘖期野生型蜀恢527以及突变体srnl9的部分叶片；
图2是半卷窄叶基因SRNL9在水稻第9染色体上的初定位图；
图3是半卷窄叶基因SRNL9基因的精细定位图；
图4是互补载体pCAMBIA1300-SRNL9质粒图谱；
图5是功能互补实验T0代转基因互补植株表型图；
左图为突变体srnl9以及T0代SRNL9转基因互补植株；右图为突变体srnl9以及T0代SRNL9转基因互补植株的部分叶片；
srnl9代表突变体，SRNL9-COM代表T0代SRNL9转基因互补植株；
图6是SRNL9过表达的转基因植株及叶宽表型图；
左图为日本晴以及SRNL9在日本晴中过表达的转基因植株表型图；右图为日本晴以及过表达SRNL9转基因植株的部分叶片；
NPB代表日本晴，SRNL9-OE代表日本晴中过表达SRNL9的转基因植株。
图7是野生型及SRNL9过表达的转基因植株16℃低温处理后表型图；
NPB代表日本晴、SRNL9-OE-1～SRNL9-OE-3代表日本晴中过表达SRNL9的转基因植株。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：图位克隆
1、水稻材料
水稻(Oryza sativa L.)半卷窄叶突变体(semi-rolled and narrow leaf 9,srnl9)是将籼稻品种(indica)“蜀恢527”经1％浓度的化学诱变剂(ethyl methanesulphonate,EMS)处理后，再通过大量筛选而得到的表型稳定的突变体。该突变体自幼苗开始出现窄叶半卷表型，且伴随整个生育期，如图1所示。突变体上三叶的叶宽较野生型“蜀恢527”分别减少了1.02cm、0.99cm、0.86cm。
2、分析和定位群体
为了精确分离控制该性状的基因，通过将纯合的srnl9突变体与粳稻品种日本晴进行杂交，进一步扩大群体，并经过F1代自交，得到更大的F 2群体，F2代群体共5299株，其中正常叶为3975株，突变体半卷窄叶表型为1324株，选择该1324株低温黄化半卷窄叶突变体作为精细定位群体。在分蘖期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。
3、SSR和STS标记定位SRNL9基因
采用改良的CTAB法提取水稻叶片用于基因定位的基因组DNA。取3-5cm水稻叶片，剪碎放入2.0ml eppendorf离心管中，加入1粒钢珠，700μl提取液，置于TissueLyser IIsystem组织研磨器，研磨2-3min，65℃恒温水浴40-60min，再用氯仿萃取，吸取上清液，加入等量冰冻的异丙醇，离心，用70％酒精洗涤，晾干即可加入150μl超纯水作为DNA样品。每一个PCR反应用2-3μl DNA样品。
SRNL9基因的初步定位：在srnl9与日本晴组合的F2群体中选取98株半卷窄叶植株进行SSR分析，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，利用MJResearch的PTC-200型梯度热循环仪进行PCR扩增，PCR扩增反应总体积为20μl，其中包括50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，50-100ng的基因组DNA，1个单位的Taq聚合酶和0.1μmol/L引物，其余为蒸馏水。扩增程序为94℃预变性4min，进入循环扩增：94℃变性30s，各引物退火温度见表1，退火时间30s，72℃延伸30s，循环40次；72℃延伸10min。经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性。最终将SRNL9初步定位在第9号染色体长臂B9-14和B9-15两标记之间。
SRNL9基因的精细定位：为了分离控制该半卷窄叶的基因SRNL9，进一步扩大群体，在srnl9与日本晴组合的F2群体中共选取1324株，在初定位的基础上继续设计分子标记，通过对籼稻品种蜀恢527和粳稻品种日本晴进行序列比对分析，发展10个新的分子标记(表1)。
利用MJResearch的PTC-200型梯度热循环仪进行PCR扩增，PCR扩增反应总体积为20μl，其中包括50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/LdNTP，50-100ng的基因组DNA，1个单位的Taq聚合酶和0.1μmol/L引物，其余为蒸馏水。扩增程序为94℃预变性5min，进入循环扩增：94℃变性45s，各引物退火温度见表1，退火时间50s，72℃延伸50s，循环35-39次；72℃延伸10min。经4％-5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性。最终将SRNL9基因精确定位于分子标记M13和M9之间51.156kb的物理距离范围内。初定位和精细定位的分子标记序列如表1所示。
表1、用于基因定位的分子标记序列
Figure BDA0003190531070000071
Figure BDA0003190531070000081
注：**为用于初定位标记；*为用于精细定位标记。
4、SRNL9基因预测、cDNA全长基因的获得与功能的预测：
根据精细定位的结果，在51.156kb范围内根据Rice Automated AnnotationSystem(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测，发现在此区间内含有6个开放阅读框(ORF)，对这些ORF进行测序分析后发现，在第2个ORF(LOC_Os09g38980)的第八个外显子上有一个单碱基替换(由C变成T)，导致其编码的氨基酸也由亮氨酸变成了苯丙氨酸(图3)，因此推测LOC_Os09g38980即为SRNL9的候选基因。RAP-DB数据库显示现该基因编码一个Rubisco亚基结合蛋白，含8个外显子和7个内含子，CDS全长为1755bp(SEQ ID No：2)。
该水稻半卷窄叶基因SRNL9编码的蛋白质具有SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。SEQ ID No：3末尾为“*”，表示终止密码子(TAG)。
实施例2：SRNL9基因功能互补验证
植物转化
PCR扩增全长为6636bp的基因组DNA片段，包含SRNL9基因的ATG上游启动区的1994bp，编码区的3473bp，终止子后的1169bp下游序列，引物序列为5'-ACGAATTCGAGCTCGGTACCCATCCTCTGTTCTCCGACCA-3'和5'-GCCTGCAGGTCGACTCTAGAAGCGCGATGTGTCGGCGGGT-3'，将该片段连接到pCAMBIA1300载体上，获得了转化载体pCAMBIA1300-SRNL9。
然后利用突变体srnl9成熟胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养2周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有质粒pCAMBIA1300-SRNL9的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有50mg/L Hygromycin的筛选培养基上光照培养14天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，发现植株叶片恢复了正常的形态，与同一生长阶段的突变体比较，叶色正常，叶片卷曲表型恢复平展，叶片变宽。由此，认为SRNL9基因即为调控突变体srnl9水稻苗期低温叶色敏感的叶形调控基因SRNL9(图5)。
实施例3：SRNL9基因改良水稻叶形的方法
以粳稻品种“日本晴”cDNA为模板，用引物SRNL9-OE-F：5'-CCGGGGATCCTCTAGAATGTCTTTGACCACCGTTTCTT-3'和SRNL9-OE-R：5'-GCAGGTCGACTCTAGACTAAGCATTTTGATTTATCTGC-3'扩增获得1755bp的SRNL9基因全长的cDNA片段，通过利用XbaⅠ酶切到pCAMBIA1300s载体，然后通过同源重组的方式将扩增的含1755bp的SRNL9基因全长的cDNA片段连接到酶切过的pCAMBIA1300s载体，然后通过转化大肠杆菌DH5α中，通过菌落PCR鉴定阳性质粒，并通过阳性质粒的测序得到含1755bp的SRNL9基因全长cDNA片段的遗传转化载体pCAMBIA1300s-SRNL9。
然后将包含1755bp SRNL9基因全长cDNA片段的遗传转化载体pCAMBIA1300s-SRNL9质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中。利用粳稻品种“日本晴”成熟胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养2周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化。用含有质粒pCAMBIA1300s-SRNL9的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有50mg/L Hygromycin的筛选培养基上光照培养14天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株，表达量极显著升高。对植株进行鉴定和连续的观察发现，与同一生长阶段的野生型植株相比，过表达植株低温叶色表现浓绿，叶片宽度显著增加(过表达植株叶片宽度约为野生型植株的1.2倍)；其他性状均表现正常(图6)。
实施例4：SRNL9基因过表达植株苗期耐冷性验证
为了探究SRNL9基因在低温响应中的作用，将3个SRNL9过表达株系植株SRNL9-OE-1、SRNL9-OE-2、SRNL9-OE-3及其野生型NPB进行苗期的耐冷处理，将材料放入黑色的育苗盘中培养，每个材料培养30粒种子，在水稻培养室中培养。先用清水没过种子，使种子萌发，在露白后减少水量，让萌芽光合作用，快速成长。种子萌发4天后，改用低浓度培养液培养，3天后，改用全营养液培养。在种子萌发9天后，将培育着幼苗的育苗盘放入4℃低温下处理72小时，再在常温下恢复72小时，以叶片存活率(叶片绿色的面积占总叶片面积的百分比)作为苗期耐冷性的评价标准来调查幼苗的耐冷性。苗期耐冷性鉴定参照Han(Han et al.,2004)。调查结果发现，低温处理后过表达植株表现出更强的耐冷性，叶片存活率显著高于野生型。NPB及其3个不同的过表达株系SRNL9-OE-1、SRNL9-OE-2、SRNL9-OE-3叶片存活率分别为46.7％、83.7％、71.6％和75.3％。另外，本发明还将3个SRNL9过表达植株及其野生型分蘖期的植株进行耐冷试验，在16℃的培养箱中处理7天，发现过表达植株的叶片存活率也同样高于野生型，NPB、SRNL9-OE-1、SRNL9-OE-2和SRNL9-OE-3叶片存活率分别为31％、68％、48％和57％(图7)。说明增加SRNL9基因的表达量，可以提高幼苗低温环境下的耐冷性。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水稻研究所
<120> 水稻低温敏感叶形基因SRNL9及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3473
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 1
atgtctttga ccaccgtttc tttctcatac cccgccaagc cgcttcccaa atggccgtgc 60
acgctgccta agccgccgcc gagggctcgc tgccgttttg tggtgcgggc ggacgtcaag 120
gtgatctctt ccggtgaggc ctgccgccgt gggctcgccg ccggcatcga caagctcgcc 180
gacgccgtcg cggtcactct aggccccaaa ggtcagccta ctgttttttt ttggtgctct 240
tgagtaccaa ttcttgctgt ccaacttcta atttcttgca atttcagtgc ttatatggat 300
gattcgatgt aagatatgaa tctagtgaat gcacagaaaa tgagccatca ggagcctaaa 360
aggatttcaa tttttttttt cttgctaaag cctaaagatg ttgggtttgg tatatccatc 420
agtttagttt gttgttcatg ttgttgggtt ctcatgagcc tggattacct gtttaattgt 480
cttgtaatgc tacggaatgt tgagagctca aaaatttact gcaggcagga atgttgttat 540
tgaccaagac gatgttccta aagtaatcaa tgatggtatc acaattgcca aggctataga 600
gctcccaaat gctgttgagc acgcaggtgc catgttactt caagaggttg ggtgccgaat 660
gtcttcatat tctttaaatt ggtcaatatc gacaccgctg tttattttac tgatagcatg 720
ttaaccagat agcatccaag acgaatagtt ctgttggcga tggaacaaca actgctatta 780
ttttggcaag agaaattatc aatcttgggt tgttggcagt agccactggt gctaacccag 840
ttgccctgag aaagggtatt gacaaagctg ttcatgaact tattgggatc ttgaagacta 900
aatgtatccc tgtaagtaca aaggaggaca taaaaggtaa ttttgtcacc tgggaagcat 960
acatcacgag cacagaaata cggaataata aaccataccc actagactag taacctttcc 1020
tttttatttt agaaagcata tagtcgatat agcatgaagc atatcatgat ttgtctgtga 1080
atgcaccgaa attattctgt ggtcagatta taaaatgttg taaatctcta aatttcattt 1140
tcagctgttg cttcaatatc agctggcaat gatgaatatg ttggcgatct cattgctgat 1200
gcattggaga agataggtcc tgatggaata attaaaattg agtcctcatc ttcaatatat 1260
acttcagttg aggtgcaaga aggaatgaag gtatgtttat gtggatatga aatttctccc 1320
tacaatatgc tacctgtatg caaagaactt cccttttgca acaaaatgca gctatgtctc 1380
agggtgtgtc aaacaaaatc attccattga accactaatc aacatttagt gcagaaagta 1440
gctggtgtaa atttatagta ctatggttca tgattctccg tctggtcgtt gcagatagac 1500
aaaggttata tctctccaca tttcatcaca aatcaagaca aagcaattgt tgaatttgaa 1560
aatgctaggg tacttttaac tgatcagcgg gtggatgatg tccaagagat acttcctttg 1620
ctagagaaga ccacacagtt gagtgtccct ttgttgatta ttgcggagga tgtttcacat 1680
acggtgtatt caactcttgt tcttaacaaa ctgaatggac tgctaaatgt tgctgttgtt 1740
aaatgtcctg gtttgggaga tgaaaagaag gctattctcc aagatattgc tattatgaca 1800
ggtgaagaat tagtacacta gaactatgta ccttgaaatt taatgttaga attattccat 1860
acatcaaagt acatgatttt atcttgtagt acatgcttac aggatatagg ccatatccta 1920
atagtctttt aaaacatatt tagcagttcc ttagtatttg tcttgtcaga tgacattatg 1980
ctatttccct ctaccgtgtt gccgagacca gcattttcat atttggcttt caccatcttt 2040
catgtgcatg gtgaattgct ttaaacttat ctgtctagct ccgttaggct ctgagttttt 2100
gtttctcctt caatttacag gtgcagattt ctttgctagt gaccttggct ggtgtcttca 2160
aggtgctact tctgatcagc taggtatggc tcagaagatc actataacaa gtgatactac 2220
tactatcatt gcacatcctt cgatgagacc agaaattgag gccagaattc agcaacttaa 2280
gaaagatcta gaggagacaa caagtgccta tctaaaagaa aggttttcat ctcgtatcgc 2340
taaactctca agaggtattg cagttatcaa ggtgcgttgc tatgacatta tgtcaacaaa 2400
cctatattcc cattgtttaa tgaatatgtg ctttctgtat acaattttac cggaaagctt 2460
tctttgtgtc aaaaagattt tcaggacata atgcagaaat cactttagtt gtggtataaa 2520
actgttagtt tgtgtctggg gatttgataa gagtggactt ttttcaggtt ggtgcagcta 2580
ctgaagctga actcgaggat aggaaactga gagcggagga tgcaaaaaat gcaacctttg 2640
cagccattag cgaaggcata actcctggag gtggtgtgac gtatgttcaa ttatcaaagt 2700
atattcccag tatcatggat cttgtagatg actctgaaga gaagattggt gtaaatatag 2760
ttgggaaggt ttgtttctct attcactgac aaccatcact ttttttttgg catatttgca 2820
ttacactgct gctgctgtat tacacacttg gtttgtttct ccattcacta acaaccatca 2880
cctttttttt tctttttttt ttcatatttt cttacactgc tgcagctgta ttacacacta 2940
ggtttgaaga ataatctaca ttttgaacct aagcatcaaa tactcaatat ggcaaatatg 3000
tcaattcctt tagtgactaa caagtgcaaa gacgcatcaa tttaaattta aggcgttcac 3060
tgtattaaca cattctcaga agatattttt tcttgcaaaa ataattaaat cagttgcata 3120
acatcctaat tctgaaatct gtccaatgac caatgttgct ctaggcactt ctcgtccctg 3180
ctatgacgat agctcgcaat gctggggcag atggtccagc tgttgtagag aagcttcttg 3240
cgagtgaatg gcgagttgga tacaatgcaa tgactgacaa atttgaagac cttgttgatg 3300
ctggtgtggt agacccatgc agggttgcaa gatgtgtgct tcaaaactct gcctctattg 3360
caggacttat tttaatgacg caagctatga tgttcgacaa aataaagaag aaaaagtcca 3420
ccattcctca aattcctggc atcccaccat tgcagataaa tcaaaatgct tag 3473
<210> 2
<211> 1755
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 2
atgtctttga ccaccgtttc tttctcatac cccgccaagc cgcttcccaa atggccgtgc 60
acgctgccta agccgccgcc gagggctcgc tgccgttttg tggtgcgggc ggacgtcaag 120
gtgatctctt ccggtgaggc ctgccgccgt gggctcgccg ccggcatcga caagctcgcc 180
gacgccgtcg cggtcactct aggccccaaa ggcaggaatg ttgttattga ccaagacgat 240
gttcctaaag taatcaatga tggtatcaca attgccaagg ctatagagct cccaaatgct 300
gttgagcacg caggtgccat gttacttcaa gagatagcat ccaagacgaa tagttctgtt 360
ggcgatggaa caacaactgc tattattttg gcaagagaaa ttatcaatct tgggttgttg 420
gcagtagcca ctggtgctaa cccagttgcc ctgagaaagg gtattgacaa agctgttcat 480
gaacttattg ggatcttgaa gactaaatgt atccctgtaa gtacaaagga ggacataaaa 540
gctgttgctt caatatcagc tggcaatgat gaatatgttg gcgatctcat tgctgatgca 600
ttggagaaga taggtcctga tggaataatt aaaattgagt cctcatcttc aatatatact 660
tcagttgagg tgcaagaagg aatgaagata gacaaaggtt atatctctcc acatttcatc 720
acaaatcaag acaaagcaat tgttgaattt gaaaatgcta gggtactttt aactgatcag 780
cgggtggatg atgtccaaga gatacttcct ttgctagaga agaccacaca gttgagtgtc 840
cctttgttga ttattgcgga ggatgtttca catacggtgt attcaactct tgttcttaac 900
aaactgaatg gactgctaaa tgttgctgtt gttaaatgtc ctggtttggg agatgaaaag 960
aaggctattc tccaagatat tgctattatg acaggtgcag atttctttgc tagtgacctt 1020
ggctggtgtc ttcaaggtgc tacttctgat cagctaggta tggctcagaa gatcactata 1080
acaagtgata ctactactat cattgcacat ccttcgatga gaccagaaat tgaggccaga 1140
attcagcaac ttaagaaaga tctagaggag acaacaagtg cctatctaaa agaaaggttt 1200
tcatctcgta tcgctaaact ctcaagaggt attgcagtta tcaaggttgg tgcagctact 1260
gaagctgaac tcgaggatag gaaactgaga gcggaggatg caaaaaatgc aacctttgca 1320
gccattagcg aaggcataac tcctggaggt ggtgtgacgt atgttcaatt atcaaagtat 1380
attcccagta tcatggatct tgtagatgac tctgaagaga agattggtgt aaatatagtt 1440
gggaaggcac ttctcgtccc tgctatgacg atagctcgca atgctggggc agatggtcca 1500
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aaatttgaag accttgttga tgctggtgtg gtagacccat gcagggttgc aagatgtgtg 1620
cttcaaaact ctgcctctat tgcaggactt attttaatga cgcaagctat gatgttcgac 1680
aaaataaaga agaaaaagtc caccattcct caaattcctg gcatcccacc attgcagata 1740
aatcaaaatg cttag 1755
<210> 3
<211> 584
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 3
Met Ser Leu Thr Thr Val Ser Phe Ser Tyr Pro Ala Lys Pro Leu Pro
1               5                   10                  15
Lys Trp Pro Cys Thr Leu Pro Lys Pro Pro Pro Arg Ala Arg Cys Arg
            20                  25                  30
Phe Val Val Arg Ala Asp Val Lys Val Ile Ser Ser Gly Glu Ala Cys
        35                  40                  45
Arg Arg Gly Leu Ala Ala Gly Ile Asp Lys Leu Ala Asp Ala Val Ala
    50                  55                  60
Val Thr Leu Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Ile Asp Gln Asp Asp
65                  70                  75                  80
Val Pro Lys Val Ile Asn Asp Gly Ile Thr Ile Ala Lys Ala Ile Glu
                85                  90                  95
Leu Pro Asn Ala Val Glu His Ala Gly Ala Met Leu Leu Gln Glu Ile
            100                 105                 110
Ala Ser Lys Thr Asn Ser Ser Val Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Ile
        115                 120                 125
Ile Leu Ala Arg Glu Ile Ile Asn Leu Gly Leu Leu Ala Val Ala Thr
    130                 135                 140
Gly Ala Asn Pro Val Ala Leu Arg Lys Gly Ile Asp Lys Ala Val His
145                 150                 155                 160
Glu Leu Ile Gly Ile Leu Lys Thr Lys Cys Ile Pro Val Ser Thr Lys
                165                 170                 175
Glu Asp Ile Lys Ala Val Ala Ser Ile Ser Ala Gly Asn Asp Glu Tyr
            180                 185                 190
Val Gly Asp Leu Ile Ala Asp Ala Leu Glu Lys Ile Gly Pro Asp Gly
        195                 200                 205
Ile Ile Lys Ile Glu Ser Ser Ser Ser Ile Tyr Thr Ser Val Glu Val
    210                 215                 220
Gln Glu Gly Met Lys Ile Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Pro His Phe Ile
225                 230                 235                 240
Thr Asn Gln Asp Lys Ala Ile Val Glu Phe Glu Asn Ala Arg Val Leu
                245                 250                 255
Leu Thr Asp Gln Arg Val Asp Asp Val Gln Glu Ile Leu Pro Leu Leu
            260                 265                 270
Glu Lys Thr Thr Gln Leu Ser Val Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp
        275                 280                 285
Val Ser His Thr Val Tyr Ser Thr Leu Val Leu Asn Lys Leu Asn Gly
    290                 295                 300
Leu Leu Asn Val Ala Val Val Lys Cys Pro Gly Leu Gly Asp Glu Lys
305                 310                 315                 320
Lys Ala Ile Leu Gln Asp Ile Ala Ile Met Thr Gly Ala Asp Phe Phe
                325                 330                 335
Ala Ser Asp Leu Gly Trp Cys Leu Gln Gly Ala Thr Ser Asp Gln Leu
            340                 345                 350
Gly Met Ala Gln Lys Ile Thr Ile Thr Ser Asp Thr Thr Thr Ile Ile
        355                 360                 365
Ala His Pro Ser Met Arg Pro Glu Ile Glu Ala Arg Ile Gln Gln Leu
    370                 375                 380
Lys Lys Asp Leu Glu Glu Thr Thr Ser Ala Tyr Leu Lys Glu Arg Phe
385                 390                 395                 400
Ser Ser Arg Ile Ala Lys Leu Ser Arg Gly Ile Ala Val Ile Lys Val
                405                 410                 415
Gly Ala Ala Thr Glu Ala Glu Leu Glu Asp Arg Lys Leu Arg Ala Glu
            420                 425                 430
Asp Ala Lys Asn Ala Thr Phe Ala Ala Ile Ser Glu Gly Ile Thr Pro
        435                 440                 445
Gly Gly Gly Val Thr Tyr Val Gln Leu Ser Lys Tyr Ile Pro Ser Ile
    450                 455                 460
Met Asp Leu Val Asp Asp Ser Glu Glu Lys Ile Gly Val Asn Ile Val
465                 470                 475                 480
Gly Lys Ala Leu Leu Val Pro Ala Met Thr Ile Ala Arg Asn Ala Gly
                485                 490                 495
Ala Asp Gly Pro Ala Val Val Glu Lys Leu Leu Ala Ser Glu Trp Arg
            500                 505                 510
Val Gly Tyr Asn Ala Met Thr Asp Lys Phe Glu Asp Leu Val Asp Ala
        515                 520                 525
Gly Val Val Asp Pro Cys Arg Val Ala Arg Cys Val Leu Gln Asn Ser
    530                 535                 540
Ala Ser Ile Ala Gly Leu Ile Leu Met Thr Gln Ala Met Met Phe Asp
545                 550                 555                 560
Lys Ile Lys Lys Lys Lys Ser Thr Ile Pro Gln Ile Pro Gly Ile Pro
                565                 570                 575
Pro Leu Gln Ile Asn Gln Asn Ala
            580

Claims (3)

1.水稻低温敏感叶形基因SRNL9在改善水稻叶片形态中的用途，其特征在于：所述水稻低温敏感叶形基因SRNL9的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示，基因SRNL9的cDNA序列如SEQID NO：2所述；水稻低温敏感叶形基因SRNL9编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所述。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：过表达基因SRNL9增加水稻的叶片宽度，降低水稻叶片的卷曲度。
3.改良水稻叶形的方法，其特征在于：包括用SEQ ID NO： 1所示的水稻低温敏感叶形基因SRNL9转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株；所构建的转基因水稻的叶片形态得以改良。
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