SE508045C2 - Adhesionsinhibitorer, preparat innehållande desamma och förfarande för framställning därav - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 508 045 L 2 TABELL 1 Stammar som används för att producera produkter vilka inhiberar adhesionen av E. coli-stammar som uttrycker fimbrier Stam Ursprung Lactobacillus fermentum 104r svin, tarm Lactobacillus murinus C39 svin, tarm Lactobacillus fermentum KLD människa, tarm Lactobacillus sp. HBL8 Lactobacillus sp. LMN9 Lactobacillus fermentum 104s Lactobacillus sp. LAB32 människa, tarm människa, tarm svin, tarm svin, tarm Målorganismer är E. coli-stammar som uttrycker ñmbrier. Dessa fimbrier gör det möjligt fór bakterierna att vidhäfta borstranden av små tarmepitelceller och överliggande mukus (25). Exempel på målorganismer ges i Tabell 2 nedan.

TABELL 2 E. coli-stammar som uttrycker olika fimbrier och som används som målorganismer Escherichia coli-stam Ursprung K12 PMK 002 (K88') svin K12 K88ab (1) svin K12 K88ab (2) svin K12 K88ac svin K12 PMK 005 (K88ac) svin 1107 (K88ac) (vildtyp) svin K12 K88ad svin K88ad (vildtyp) svin K99 (vildtyp) svin 987 P (vildtyp) svin F41 (vildtyp) nötkreatur CFA/I människa CFA/II människa CFA/IV människa HB101 (pAZZ 50) (S) människa 10 15 20 25 30 35 508 045 3 Produkterna enligt uppfinningen kan administreras till djur, innefattande människa, på olika sätt. Således kan preparat för oral dosering innefatta den viabla Lactobacillus-stammen som sådan. Preparaten kan emellertid även innefatta den odlingssupernatant som härrör från odlingen av Lactobacillus- stammen eller de renade, eller delvis renade, högmolekylära kolhydratprodukter som produceras av Lactobacillus-stammen, liksom kemiskt modifierade produkter som fortfarande bibehåller de renade produkternas aktivitet.

Kolhydratprodukterna kan framställas genom att man odlar en stam av Lactobacillus av tarmursprung i komplext medium under semi-anaeroba tillväxt- betingelser. Den optimala produktionen sker i sen log-fas och tidig stationär fas av tillväxten. Produkterna utvinns från det tillväxtmedium i vilket de frisätts under odling.

För användning i preparat för oral dosering blandas kolhydratprodukterna företrädesvis med farmaceutiskt godtagbara beståndsdelar.

Den inhibitoriska aktiviteten har detekterats i sen log-fas och tidig stationär fas. Det visade sig att mer av de aktiva produkterna var närvarande efter cellens död, vilket kan indikera att de aktiva produkterna härrör från lyserade celler. Detta underbyggs även av den observationen att celler ej dog i det medium där acetat var utelämnat och någon adhesionsinhiberande aktivitet kunde ej observeras. Trots det faktum att cellväggfragment ej visade sig vara inhiberande, avlägsnade behandling av retentatfraktioner med lysozym den adhesionsinhiberande aktiviteten. Av detta kunde den slutsatsen dras att de aktiva komponenterna är lösliga cellvåggfragment från lyserade celler.

Den inhibitoriska aktiviteten visade sig vara högst vid 37°C. Ehuru aktiviteten kraftigt minskar vid 0°C, är det ej sannolikt att detta orsakas av en inaktivering av enzymaktiviteten eftersom utspädd förbrukad odlingsvätska ej kunde öka den inhibitoriska aktiviteten vid utsträckt inkubation.

Fraktionering genom gelfiltrering visar att en form av den aktiva kompo- nenten har ett Mr-värde av cirka 1700 kDa. Efter pronasbehandling minskas Mr till cirka 1100 kDa, vilket indikerar att den aktiva komponenten kan vara associerad med protein. Det är ej klarlagt huruvida detta är ett 600 kDa protein eller ett mindre protein, som binder samman flera subenheter eller ger den aktiva komponenten en konñrmation med en större Stoke-radie. De ytterligare frak- tioner med adhesionsinhiberande aktivitet som påträffades efter pronasbehand- ling innehöll förmodligen pronas eftersom detta är värmekänsligt och av ungefär samma storlek. 10 15 20 25 30 35 508 045 4 Av det ovan sagda framgår att molekylvikten hos produkterna enligt uppfinningen ej skall begränsas till 1700 kDa utan produkter med både högre och lägre molekylvikter, såsom subenheter och komplex därav, innefattas under förutsättning att de har samma aktivitet.

Den aktiva komponenten är sannolikt ej proteinartad, eftersom aktiviteten fortfarande kunde påvisas efter pronasbehandling och efter värmebehandling vid 121°C under 20 minuter.

Eftersom lipasbehandling interfererade med adhesionsanalysen, var det ej möjligt att utesluta det faktum att den inhibitoriska komponenten innehöll lipid, under användning av resultaten från lipasstudien. Efter lösningsmedelsextraktion förelåg emellertid aktiviteten i vattenfasen och någon aktivitet kunde ej obser- veras i kloroformfasen. Detta indikerar att den aktiva komponenten ej är hydrofob.

Kemisk analys visade närvaron av glukos, N-acetylglukosamin och galaktos i ett förhållande av 1:3:2.

I syfte att undersöka på vilket sätt den aktiva komponenten interagerar med mukus, behandlades E. coli 1107 med retentat och tvättades. Denna behand- ling påverkade ej adhesionen. Om E. coli 1 107 fick vidhäfta immobiliserad mukus före behandling med retentat, avlägsnades ej cellerna. Detta indikerar att komponenten verkar antingen på ett annat ställe än K88-receptorn eller har en lägre affinitet till receptorn än KSS-fimbrier. Sistnämnda möjlighet är ej trolig eftersom samtidig exponering av immobiliserad mukus för både retentat och E. coli 1107 ger samma adhesionsinhibition som förbehandling av mukus med retentat. Utan att bindas till någon teori kan det antagas att den aktiva kompo- nenten har en högre affinitet till dess verkansställe än KSS-fimbrierna till deras receptorställe. Det kan därför postuleras att E. coli 1107-adhesion inhiberas till följd av steriskt hinder av den aktiva komponenten.

Adhesion till mukusfraktioner, som innehåller detekterbara proteiner, kan inhiberas genom behandling med förbrukat odlingsretentat. Eftersom adhesionen till de neutrala lipiderna från mukus ej kunde inhiberas av retentat, kan det vara så att den aktiva komponenten endast påverkar proteinreceptorn. Alternativt kan komponenten kräva icke-lipidsubstanser för att påverka adhesionen till de neutrala lipiderna och frånvaron av inhibition av retentat till neutrala lipider skulle kunna tillskrivas den använda analysmetoden.

Uppfinningen beskrivs närmare nedan i detalj i form av följande icke- begränsande utfóringsexempel. 10 15 20 25 30 35 508 045 Material och metoder Bakterier och odlingsbetingelser L. fermentum-stammen 104r isolerades från enskiktat skivepitel från svinmage (Henriksson m.fl., 1991). Primära kulturer (från förrådskulturer förvarade vid -80°C i 40% glycerol) fick växa över natten i buljong (Mann, Rogosa och Sharpe; MRS Oxoid) under användning av ett 1% inokulat, 37°C och en "candle jar". Kulturer fick därefter växa i ett "lactobacillus defined medium" (LDM), framställt enligt Kotarski & Savage (1979), med undantag av att "Tween 80" utelämnades, under användning av ett 1% inokulat från den primära kulturen. Kulturer fick även växa i LDM där både "Tween 80" och natriumacetat hade utelämnats. Förbrukade odlingsvätskor tillvaratogs genom centrifugering av 24-timmarskulturerna vid 10.000 x g under 20 minuter och dialys (molekyl- viktsbegränsning 12 till 14 kDa), minst 3 gånger vid 4°C under cirka 6 timmar, mot 5 liter "Milli-Q"-vatten, renat med "Milli-Q plus" (Millipore Corp.). För att bestämma relationen mellan adhesionen av förbrukad odlingsvätska och L. fermentum 104r-växt, uttogs 10 ml prover från en 250 ml kultur vid olika tidsintervall och centrifugerades och dialyserades såsom beskrivits ovan. För- brukade odlingsvätskor och retentat förvarades vid -20°C före användning. Som kontroll dialyserades oympat medium, på samma sätt som den förbrukade odlingsvätskan.

Primära kulturer av E. coli K88ac-stam 1107 (betecknas i det följande som E. coli 1107) fick växa över natten i tryptonsojabuljong CTSB; Oxoid) vid 37°C under användning av ett 1% inokulat från förrådskulturer förvarade vid -80°C i 40% glycerol. E. coli 1107 märktes radioaktivt genom ympning av 5 ml TSB, innehållande 1 yCi.ml'l av metyl-1,2-3H-tymidin.m1'1 (120 Ci.mmol'l; Amersham International), med 1% av den primära kulturen och denna fick växa vid 37 °C till en absorbans (600 nm) av 0,5 i 0,01. Celler skördades genom centrifugering (ca 3000 x g), tvättades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 10 mM fosfat; pH 7,2) och återsuspenderades i PBS, och absorbansen vid 600 nm inställdes på 0,5. Effekten av närvaron av retentat på adhesionen och effekten av retentat på E. coli 1107 studerades genom återsuspendering av cellerna i retentat (60 min, 37°C) och därpå följande användning av denna suspension direkt vid adhesionsanalysen eller genom tvättning och återsuspendering i PBS.

I n uitro-adhesionsanalys Adhesionen av radioaktivt märkt E. coli 1107 till ileummukus från en 35 10 15 20 25 30 508 045 6 dagar gammal gris studerades under användning av en modifikation av den metod som har angivits av Laux m.fl. (1984), såsom beskrivs av Conway m.fl. (1990). I korthet innebar detta att mukus tillvaratogs från ileum från en 35 dagar gammal spädgris i "Hepes Hanks" buffert (HH; pH 7,4) och förvarades vid -20°C eller -80°C. Den immobiliserades (0,5 mg protein.ml'1) på polystyren-mikrotiter- brunnar (Nunc; polysorp) genom inkubation över natten vid 4°C. Överskottet av mukus avlägsnades genom tvättning två gånger med 0,25 m1 HH. Retentat eller fraktioner från dialys av förbrukad odlingsvätska (0,10 ml per brunn) sattes till den immobiliserade mukus och mikrotiterplattorna inkuberades därefter vid 37 °C under 1 timme. Brunnar, som på liknande sätt hade behandlats med oympat dialyserat medium, tjänade som kontroller. Mukusbelagda celler tvättades därefter två gånger med HH (0,25 ml) och adhesionen av de radioaktivt märkta cellerna studerades såsom beskrivits tidigare (Conway m.fl., 1990). Inhibitionen av adhesionen utvärderades som den procentuella andelen radioaktivitet vid testet i förhållande till kontrollen, vid vilken mukus behandlades med oympat medium. Alla analyser utfördes fyrdubbelt.

Den adhesionsinhiberande komponentens kinetik I syfte att bestämma den inhibitoriska komponentens kinetik, utfördes adhesionsanalys på is (0°C) och vid 37 °C och inkubation skedde med förbrukad odlingsvätska under olika tidsperioder. För att bestämma huruvida enzymatisk aktivitet var involverad, späddes den förbrukade odlingsvätskan 10 gånger med "Milli-Q"-vatten och inkuberades även under olika tidsintervall. Resten av försöket utfördes såsom beskrivits ovan.

Fraktionering av retentat av förbrukad odlingsvätska Förbrukad odlingsvätska från L. fermentum 104r fraktionerades, efter växt i LDM-medium, genom gelfiltrering av kultursupernatantretentat under använd- ning av en preparativ kvalitet av "Superose 6" (Pharmacia). Alikvoter av förbrukad odlingsvätska (100 ml) dialyserades mot "Milli-Q"-vatten och koncent- rerades därefter ca 25 gånger genom ultrañltrering under användning av ett membran med molekylbegränsningen 10 kDA (Millipore). Detta koncentrat frystorkades och återsuspenderades i 2 ml "Milli-Q", vilket således koncentrerade materialet 50 gånger. Ett 1 ml prov av detta koncentrat applicerades på en "XK 16/70"-kolonn, fylld med "Superose 6" av preparativ kvalitet (Pharmacia) och eluerades med PBS vid en flödeshastighet av 13,4 ml.cm'2.h'1. Fraktioneringen 10 15 20 25 30 35 7 508 045 utfördes vid 4°C och eluatet tillvaratogs som 2 ml-fraktioner. Absorbansen (280 nm) registrerades och kolhydrathalten bestämdes med glukos som standard (Dubois m.fl., 1956), omedelbart efter fraktionering. Koncentrerad supernatant behandlades även med pronas (Calbiochem), 0,1 mg.ml'1, och inkuberades under 30 minuter vid 37°C och fraktionerades såsom beskrivits ovan.

På en "Con A-Sepharose 4B"(Pharmacia)-kolonn, bäddvolym 18,5 ml, applicerades 10 ml retentat, flödeshastighet 13 ml.cm'2.h'1. Kolonnen tvättades därefter med 20 ml buffert (Tris-HCI, 0,02 M; NaCl 0,5 M, pH 7,4). Slutligen eluerades kolonnen med buffert (såsom nämnts ovan), innehållande 0,5 M a-D- metylmannos, eller med en boratbuffert (0,1 M, pH 6,5). Fraktioneringen utfördes vid 4°C och eluatet tillvaratogs som 2 ml-fraktioner.

Karaktärisering av den adhesionsinhiberande komponenten Före tillsatsen av retentat av förbrukad odlingsvätska eller mediumkon- trollen till den immobiliserade mukus, i syfte att påvisa närvaron av adhesions- inhiberande aktivitet, förbehandlades retentatet på olika sätt. (i) Retentat och medium autoklaverades vid 121°C under 20 minuter innan de testades vid adhesionsanalysen. (ii) Behandling med lipas (Calbiochem) utfördes under användning av 4 mg.ml'1 och inkubation under 1 timme vid 37°C, därefter kokades provet under 10 minuter och centrifugerades vid ca 13.000 x g under 5 minuter. (iii) En lipidextraktion utfördes enligt Bligh & Deyer (1959). Ett 5 ml prov av dialyserad förbrukad odlingsvätska sattes droppvis till en blandning av 5 ml kloroform och 10 ml metanol. Blandningen omrördes under 30 minuter.

Efter denna period tillsattes 5 ml kloroform och 5 ml "Milli-Q"-vatten och blandningen omrördes under 5 minuter. Blandningen centrifugerades under 5 minuter vid ca 3000 x g. Efter separation avdrevs kloroformen under en kväve- ström och vattenfasen frystorkades. Båda fraktionerna återupplöstes i 5 ml "Milli- Q"-vatten. Lipidfraktionen sonikerades för att förstärka upplösningen. (iv) Lysozym(Serva)-behandling utfördes med 2 mg.ml'1 och inkubation under 1 timme vid 37°C, därefter kokades proverna och centrifugerades såsom beskrivits ovan för lipas. (v) Cellväggfragment erhölls under användning av L. fermentum-celler, som fått växa i LDM. Cellerna skördades i mid log-fas genom centrifugering (20 minuter vid 4°C, 10.000 x g) och tvättades två gånger med HH. Cellerna homo- geniserades under 1 timme vid 2°C i en "Vibrogen-Zellmühle". Homogenatet centrifugerades vid 25.000 x g, 20 minuter vid 4°C. Pelleten tvättades två gånger och återsuspenderades i HH till en åttondel av den ursprungliga odlingsvolymen 10 15 20 25 30 35 508 045 8 och frystes därefter (-20°C) fram till användning. (vi) För kolhydratanalys koncentrerades retentat av förbrukad odlingsvätska 100 x och 900 ,ul applicerades på en "Sepharose CL 4B"-kolonn efter eluering med PBS, och aktiva fraktioner sammanfördes. Monosackaridanalys utfördes på sammanförda fraktioner, såsom beskrivits av Hardy m.fl. (1988). (vii) Glukos-oxidas(Boehringer Mannheim)- behandling utfördes med 5,0 mg.ml'1 och inkubation under 1 timme vid 37°C, därefter behandlades proverna med lipas. (viii) Endo-ß-galaktosidasßoehrínger Mannheim)-behandling utfördes med 0,05 mg.ml'1 och inkubation under 1 timme vid 37°C, därefter behandlades proverna såsom beskrivits för lipas.

Karaktärisering av inhibitionsmekanismen Ellipsometrimätningar utfördes i en "Rudo1ph Research model 436" med vertikal provorientering, i syfte att påvisa förändringar i mukus genom behand- ling med retentat. Denna teknik mäter ändringar i polarisationen av ljus då detta reflekteras på en yta. Dessa ändringar påverkas kraftigt av närvaron av tunna filmer som har adsorberats till ytan. Principen för ellipsometri beskrivs av Welin (1992). Med ledning av de ellipsornetriska vinklarna, polarisator och analysator, beräknas tjockleken hos den adsorberade filmen. Mukus immobiliserades på en hydrofob silikonyta och behandlades med retentat eller medium såsom vid adhesionsanalysen. Retentat märktes även radioaktivt genom reduktiv metyle- ring under användning av den metod som har angivits av Jentoff & Dearborn (1979). En alikvot av retentat (6 ml) blandades med 1 ,ul 3H-formaldehyd (37%), NaCNBH3 (7,6 mg) och Hepes (15,6 mg), pH 7,5, och inkuberades över natten vid 22°C. Reaktionen avbröts genom dialys mot "Milli-Q"-vatten. Det märkta retentatet testades med avseende på adhesionsinhiberande aktivitet. Immobili- serad mukus inkuberades med det märkta retentatet. Efter 1 timme vid 37°C överfördes retentatet till scintillationsampuller och aktiviteten bestämdes.

Brunnarna tvättades två gånger med 250 pl HH och aktiviteten i tvättvätskorna bestämdes genom scintillation. Brunnarna inkuberades därefter med 250 pl av 1% SDS vid 60°C. Efter 1 timme överfördes innehållet till scintillationsampuller och aktiviteten bestämdes. Komplementära kontaktvinklar hos immobiliserad mukus bestämdes med en N RL-kontaktvinkelgoniometer. Mukus immobiliserades såsom vid adhesionsanalysen och stödytan nedsänktes i HH med den mukusbe- lagda ytan nedåt. Luftbubblor frisattes under denna yta och deras komplementära kontaktvinklar bestämdes. Adhesion och inhibition av E. coli 1107-adhesion till neutrala lipider studerades i syfte att bestämma vilken receptor som påverkas av 10 15 20 25 30 9 508 045 retentatet. Neutrala lipider (0,5 mg.ml'1 i metanol) från mukus, framställda såsom beskrivs av Blomberg m.fl. (1993b), immobiliserades genom avdrivning av lösningsmedlet. Efter avdrivning tillsattes BSA (0,5 mg.ml'1) och resten av försöket utfördes såsom beskrivits ovan för mukus.

Ett 2 ml prov (4,5 mg.ml'1 protein) av nyframställd ileummukus från svin fraktionerades under användning av en "XK 16/70"-kolonn, fylld med "Sepharose CL 4B" (Pharmacia) och eluerades med HH vid en flödeshastighet av 15 ml.cm'2.h'1. Eluatet tillvaratogs som fraktioner (2 ml vardera) och övervakades genom mätning av absorbansen (280 nm). Fraktioner immobiliserades såsom beskrivits ovan för in vitro-adhesionsanalysen, i syfte att blockera eventuella otäckta ställen, och brunnarna inkuberades under 1 timme vid 37°C med 0,5 mg.m1'1 BSA, efter avlägsnande av fraktionerna. Resten av adhesionsanalysen utfördes såsom beskrivits ovan.

Resultat Relation mellan tillvåxtfas av L. fermentum 104r och inhibition av E. coli 1107- adhesion Den adhesionsinhiberande effekten är först påvisbari sen log-fas och tidig stationär fas av L. fermentum 104r. Når ett prov, uttaget efter 24 timrnras växt, späddes 10 gånger kunde någon adhesionsinhiberande effekt ej observeras (94,5% SD 15,21, n=4); för ett prov uttaget efter 86 timmars växt och spätt 10 gånger observerades emellertid en adhesion av 54,2% SD 2,3 (n=4). När L. fermentum 104r fick växa i LDM utan "Tween 80" och natriumacetat, kunde någon adhe- sionsinhiberande aktivitet ej påvisas i förbrukad odlingsvätska och ej heller dog cellerna så snabbt som i LDM där endast "Tween 80" hade utelämnats, resultat visas ej.

Den adhesionsinhiberande aktivitetens kinetik Den maximala inhíberande aktiviteten erhölls efter ca 15 minuter, när analysen utfördes på is eller vid 37°C; adhesionen av E. coli 1107 reducerades emellertid till ca 70% och 15% vid 0° respektive 37°C inkubation. När förbrukad odlingsvätska späddes 10 gånger reducerades adhesionen till ca 90% och förblev på denna nivå vid förlängd inkubation.

Fraktionering av kultursugernatantretentat När koncentrerade retentat av kulturer, som fått växa i LDM-buljong, 10 15 20 25 30 sus 045 10 fraktionerades genom gelfiltrering återfanns den adhesionsinhiberande aktivi- teten i de fraktioner som motsvarade en relativ molekylvikt (Mr) av ca 1700 kDa.

Når retentatet behandlades med pronas, påvisades aktiviteten i de fraktioner som motsvarade en Mr av ca 1100 kDa. Dessa fraktioner innehöll praktiskt taget ej något protein men avsevärda mängder av kolhydrat. Efter pronasbehandling kunde ytterligare fraktioner med adhesionsinhiberande aktivitet observeras.

Denna aktivitet var känslig fór värmebehandling och har en Mr som motsvarar den fór pronas.

Vid affinitetskromatografi med "Concanavaline-A" kunde någon aktivitet ej återvinnas från kolonnen, varken vid eluering med 0,5 M a-D-metylmannos eller vid eluering med 0,1 M boratbuffert.

Karaktärisering av den adhesionsinhiberande komponenten Autoklavering av retentatet av förbrukad odlingsvätska påverkade ej den adhesionsinhiberande effekten (autokl averad adhesi on 6,78% SD 0,04 jämfört med obehandlad adhesion 7,23% SD 1,46, n=3). Resultat från behandlingar med lipas kunde ej tolkas eftersom dessa enzymbehandlingar interfererade med adhesions- analysen då både behandlat medium och retentat orsakade en 1,5- till 3-faldig ökning i adhesion jämfört med brunnar som hade exponerats fór obehandlat medium. Efter lipidextraktion återfanns mycket ringa inhibitorisk aktivitet i kloroformfasen (94,50% adhesion SD 10,35, n=3) med det mesta av aktiviteten närvarande i vatten-metanol-fasen (34,7 6% adhesion SD 24,02, n=3). Behandling med lysozym avlägsnade aktiviteten totalt (100,46% SD 1,42, n=3). I motsats hårtill hade cellväggfragment en stimulerande effekt på adhesionen i koncentra- tioner som var högre än den ursprungliga kulturkoncentrationen och ingen effekt vid spâdning till den ursprungliga koncentrationen. Kolhydratanalys av retentat- fraktioner av förbrukad kultur avslöjade närvaron av N-acetylglukosamin, galaktos och glykos i ett förhållande av 1:3:2 i de mest aktiva fraktionerna.

Baserat på dessa resultat behandlades retentat med glukosoxidas och endo-ß- galaktosidas. Glukosoxidas avlägsnade det mesta av aktiviteten (81,90% SD 9,37, n=4), medan endo-ß-galaktosidas ej påverkade den adhesionsinhiberande aktivi- teten (27,51% SD 9,38, n=3).

Karaktärisering av inhibitionsmekanismen Under användning av ellipsometri kunde någon ändring ej påvisas i -2 tj ockleken av den absorberade mukusñlmen (4,3 ng.mm immobiliserat material). 10 15 20 508 045 11 Retentat märktes radioaktivti syfte att fastställa huruvida material i retentatet blev kvar på mukus efter tvättning. Av den totala radioaktiviteten i retentatet som hade satts till mukus, fanns 92,61% SD 0,38 (n=3) kvar i retentatet när det återvanns från brunnarna och 4,90% SD 0,37 (n=3) av aktiviteten fanns i tvåttvätskorna. Endast 2,40% SD 0,15 (n=3) av den applicerade radioaktiviteten var direkt associerad med mukusskiktet och återvanns efter solubilisering med 1% SDS. Som kontroll fastställdes att märkning av retentatet ej påverkade den adhesionsinhiberande aktiviteten (märkt retentat medgav 54,26% SD 4,35 adhesíon jämfört med 45,37 % SD 5,98 för omärkt retentat, n=2). Det förelåg ej någon påvisbar skillnad i kontaktvinkeln hos mukus, behandlad med retentat, i förhållande till den obehandlade kontrollen. Immobíliserad mukus hade en komplementär kontaktvinkel av 20,22° SD 5,71 (n = 68), medan mukus behandlad med retentat hade en komplementär kontaktvinkel av 15,83° SD 5,52 (n= 52). E. coli 1107-celler, som vidhäftade mukus ej behandlad med retentat, avlägsnades ej genom efterföljande tillsats av retentat (adhesíon 99,l5% SD 0,78, n=2).

Adhesionen inhiberades emellertid när E. coli 1107-celler återsuspenderades i retentat och applicerades på den immobiliserade mukus (15,00% SD 2,22, n=2).

Denna inhibition avlägsnades genom tvättning av retentatet från cellerna före adhesionsanalysen (85,01% SD 8,51, n=2). Adhesion till neutrala mukuslipider kunde ej inhiberas av retentat (99,1% SD 6,1, n=2). Antalet celler som vidhäftade neutrala lipider var ca 58% av de som vidhäftade mukus. E. coli 1107-celler vidhäftar de flesta av mukusfraktionerna. 10 15 20 25 30 508 045 12 Sammanfattning av egenskaper hos ett exempel på adhesionsinhibitorn Storlek Värmestabilitet Kemisk sammansättning peljodat resistens mot enzymatisk aktivitet: lipas pronas lysozym endo-ß-galaktosidas glukosoxidas Concanavalin A Anjonbytare absorption på aktivt kol absorption till 104r vid lågt pH solubilisering med detergenter Precipitation: ammoniumsulfat PEG-GOOO PEG-4OO kall aceton Lipidextraktion Produktion medium ca 1 700 000 Da (gelfiltrering) 20 min vid 121°C N-acetylglukosamin:galaktoszglukos (1:3:2) Ingen inhibition av 104r cellväggar ofullständiga resultat okänt, interfererar med adhesionsanalys ja nej ja reducerad aktivitet, mukus förstör aktivitet ingen aktivitet att återvinna ingen aktivitet att återvinna ringa återvunnen aktivitet nej detergenter (SDS, Na-desoxicholat, Brij 58) interfererar med adhesionsanalys ingen precipiterad aktivitet ingen precipiterad aktivitet ingen precipiterad aktivitet ingen precipiterad aktivitet aktivitet i vattenfas sen log-/tidig stationär fas flera LAB av tarmursprung hög acetatkoncentration krävs ingen produktion vid växt i mukus produktion vid växt på flera C-källor (glukos, arabinos, galaktos) beroende på biomassabildning Mekanism 5 10 15 Aktivitet 508 045 13 ingen inhibition av adhesion till neutrala mukuslipider (lipidreceptor) ingen bindning av radioaktivt märkt super- natant ingen bindning av HRF-märkt mukus till immobiliserad supernatant ingen reduktion av HPR-aktivitet från HPR- märkt mukus ingen ändringi immobiliserad skikttjocklek (ellipsometri) påverkar endast specifik proteintopp i frak- tionerad mukus aktiv vid 37°C, ej O°C ingen frisättning av vidhäftade E. coli 1107- celler adhesions-inhibition med både immobiliserad och löslig mukus mot KSSab/ac/ad- och S-ñmbrier. 10 15 20 25 30 85 508 045 14 Referenser: Bligh, E. G. & Dyer, W. J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and puriñcation, Canadian Journal of Biochemistxy and Physiology, 37:911-917.

Blomberg, L., Henriksson, A. & Conway, P. L. (1993a) Inhibition of adhesion of Escherichia coli K88 to piglet ileal mucus by Lactobacillus spp., Applied and Environmental Microbiology, 59:34-39.

Blomberg, L., Krivan, H. C., Cohen, P. S. & Conway, P. L. (1993b) Piglet ileal mucus contains protein and glycolipid (galactosylceramide) receptors specific for Escherichía coli K88 fimbriae, Infection and Immunity, 612526-2531.

Conway, P. L., Welin, A. & Cohen, P. S. (1990) Presence of K88 specific receptors in porcine ileal mucus is age dependent, Infection and Immunity, 583178-3182.

Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J.K., Rebers, P. A. & Smith, F. (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Analy- tical Chemistry, 281350-3556.

Gaastra, W. & de Graaf, F. W. (1982) Host-specific fimbrial adhesins of noninva- sive enterotoxigenic Escherichia coli strains, Microbiological Reviews, 46: 129-161.

Henriksson, A., Szewzyk, R. & Conway, P. L. (1991) Characteristics of the adhesive determinants of Lactobacillus fermentum 104, Applied and Environ- mental Microbiology, 57:499-502.

J entoft, N. & Dearborn, D. G. (1979) Labelling of proteins by reductive methyla- tion using sodium cyanoborohydride, Journal of Biological Chemistry, 11:4359- 4365.

Jonsson, E. 8: Conway, P. L. (1992) Development of probiotics for pigs, sid. 260- 316. I R. Fuller (red.), probiotics. Chapman & Hall, Ltd., London.

Kotarski, S. F. & Savage D. C. (1979) Models for study of the specificity by which indigenous lactobacilli adhere to murine gastric epithelia, Infection and Immu- nity, 26:966-975.

Laux, D.C., McSweegan, E. F., Williams, T. J., Wadolkowski, E. A. & Cohen, P. S. (1986) Identification and characterization of mouse small intestine mucosal receptors for Escherichía coli K-12(K88), Infection and Immunity, 52:18-25.

Lindgren, S. E. & Dobrogosz, W. J. (1990) Antagonistic activities of lactic acid bacteria in food and feed fermentations, FEMS Microbiology Reviews, 87 :149-164.

Welin Klíntström, S. (1992) PhD. thesis. Linköping University, Linköping, Sverige.

Claims (7)

10 15 20 25 30 508 045 1 5 PATENTKRAV

1. Produkter för inhibition av adhesionen av patogener till gastrointestinal epitelmukosa hos djur, innefattande människa, kännetecknade därav, att de utgörs av högmolekylära kolhydrater producerade av Lactobacillus-stammar av tarmursprung och derivat därav.

2. Produkter enligt krav 1, kännetecknade därav, att de har producerats av Lactobacillus-stammar som härrör från magtarmkanalen hos den värd till vilken produkterna skall administreras.

3. Produkter enligt krav 1 eller 2, kännetecknade därav, att de har en molekylvikt- av ca 200-1700 kDa och en sammansättning av N-acetylglykosamin:- galaktoszglukos i ett förhållande av 1:3:2.

4. Preparat fór inhibition av adhesionen av patogener till gastrointestinal epitelmukosa hos djur, innefattande människa, kännetecknat därav, att den aktiva beståndsdelen är vald från den grupp som består av viabla Lactobacillus- stammar av tarmursprung, som producerar högmolekylära kolhydratprodukter, varvid odlingssupernatanten härrör från odling av Lactobacillus-stammar av tarmursprung, vilka producerar högmolekylära kolhydratprodukter, och renade, delvis renade eller kemiskt modifierade former av, eller subenheter eller komplex med bibehållen biologisk aktivitet av högmolekylära kolhydratprodukter, producerade av Lactobacillus-stammar av tarmursprung.

5. Preparat enligt krav 4, kånnetecknat därav, att Lactobacillus-stammarna härrör från magtarmkanalen hos den värd till vilken preparatet skall admini- streras.

6. Preparat enligt krav 4 eller 5, kännetecknat därav, att de högmolekylära kolhydratprodukterna har en molekylvikt av cirka 200-17 00 kDa och innefattar N-acetylglukosaminzgalaktoszglukos i ett förhållande av 11322.

7. Sätt att framställa produkter fór inhibition av adhesionen av patogener till gastrointestinal epitelmukosa hos djur, innefattande människa, vilka produkter är högmolekylära kolhydrater, kännetecknat därav, att en stam av Lactoba- cillus odlas i komplext medium under semi-anaeroba tillväxtbetingelser, varvid sos 045 16 den optimala produktionen av produkterna sker i sen log-fas och tidig stationär fas av växten, och de önskade produkterna utvinns från det tillväxtmedium i vilket de frisätts under odlingen.