JP2008195635A

JP2008195635A - 馬用乳酸菌製剤

Info

Publication number: JP2008195635A
Application number: JP2007030609A
Authority: JP
Inventors: Hidetoshi Morita; 英利森田; Chiharu Shiratori; 千春白鳥
Original assignee: CROSSFIELD BIO Inc
Current assignee: CROSSFIELD BIO Inc
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2008-08-28

Abstract

【課題】馬のストレスの低減、整腸等のプロバイオティクスに用いることのできる微生物製剤の提供。
【解決手段】馬由来のビフィドバクテリウム・ボーム（Bifidobacterium boum）を有効成分として含有することを特徴とする馬用乳酸菌製剤。更に、馬由来のラクトバチルス属に属する微生物；ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・エクイ（Lactobacillus equi）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）から選ばれる１種または２種以上を含有してもよい。
【選択図】図１

Description

本発明は馬由来の乳酸菌を有効成分として含有する馬用乳酸菌製剤に関し、更に詳細には、ストレス低減、整腸等に有効な馬用乳酸菌製剤に関する。

競走馬（サラブレッド）は早い時期の母馬との離別にはじまり、成長後も調教、輸送、レース等で常に極度のストレスにさらされている。これらのストレスにより疝痛、下痢等の消化器疾患、輸送熱等を生じることがあるためレースで能力を発揮できないことがある。そのため日常飼育の中でのストレスを低減することが望まれている。

ヒトにおいては、ストレス作用やストレス低減効果と、ビフィドバクテリウム属に属する微生物との関係は相関があるといわれている。腸内にビフィドバクテリウム属に属する微生物が多いとストレスを受けにくく、また、ストレスが掛かるとビフィドバクテリウム属に属する微生物が減少すると報告している（非特許文献１）。また、同報告ではラクトバチルス属に属する微生物についても同様の傾向があることを報告している。

これまでは馬からビフィドバクテリウム属に属する微生物の特定の菌種が分離されたという報告はほとんどなく、しかも、これらビフィドバクテリウム属に属する微生物に馬のストレスを低減する効果があることは全く報告されていなかった。

一方、馬から分離されたラクトバチルス属に属する微生物としては、馬の糞便から分離されたラクトバチルス・エクイ（Lactobacillus equi）が知られている。これを馬に投与した結果、下痢の発生予防効果、早期腸内フローラ形成促進効果、各種抗生物質耐性が認められたことが報告（特許文献１および２）されているが、ストレスの低減について記載されていなかった。
特開２００３−２３５５６９号公報特開２００４−３５７５２８号公報須藤信行、「ストレスと腸内フローラ」、腸内細菌学雑誌、１９：２５−２９、２００５

従って、本発明は、馬のストレスの低減、整腸等のプロバイオティクスに用いることのできるビフィドバクテリウム属の微生物を馬から分離し、これを有効成分とした微生物製剤を提供することを課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、現役中のサラブレッドから得た特定のビフィドバクテリウム属に属する微生物が、馬のストレスの低減、整腸等に有用であることを見出した。また、前記ビフィドバクテリウム属に属する微生物は、馬由来のラクトバチルス属に属する微生物と組み合わせることにより、更に上記効果が増強されることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は馬由来のビフィドバクテリウム・ボーム（Bifidobacterium boum）を有効成分として含有することを特徴とする馬用乳酸菌製剤である。

また、本発明は、更に、馬由来のラクトバチルス属に属する微生物を含有するものである上記馬用乳酸菌製剤である。

更に、本発明は馬に、上記馬用乳酸菌製剤を投与することを特徴とする馬のストレス低減方法である。

本発明の馬用乳酸菌製剤は、馬に投与することによりストレスの低減、整腸等の効果を得ることができる。また、本発明の馬用乳酸菌製剤の有効成分はいずれも健常な馬由来のものなので、安全に投与することができる。

本発明の馬用乳酸菌製剤（以下、「本発明製剤」という）の有効成分である馬由来のビフィドバクテリウム・ボーム（Bifidobacterium boum）は、馬の糞便、腸管等から常法により得ることができる。

上記馬由来のビフィドバクテリウム・ボームを得るための方法の好ましい一例を示せば次の通りである。まず、健常なサラブレッドの排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを糞便が凍結しない温度、例えば、７℃以下の冷蔵で運搬する。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＢＳ寒天培地もしくはＢＬ寒天培地（共に栄研化学製）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養する。培養後に得られたコロニーを釣菌し、分離培地と同じ条件で純化確認をする。純化確認した微生物を−８５℃で凍結保存する。保存した微生物の１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列を例えば、以下の２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いてシークエンスし、ＢＬＡＳＴサーチ（ＤＤＢＪホームページ：http://www.ddbj.nig.ac.jp）することにより決定する。決定された塩基配列のうち、約１,５００ｂｐの塩基長で、ビフィドバクテリウム・ボームの標準株（ウシのルーメンからの分離株：ＪＣＭ１２１１Ｔ、アクセッションナンバー：Ｄ８６１９０）の１６ＳｒＤＮＡと９８％以上の相同性を示すものをビフィドバクテリウム・ボームとして得、その後、定法の性状試験（内村泰、岡田早苗、「乳酸菌実験マニュアル」、小崎道雄監修、初版、２９−７２、朝倉書店、１９９２）による同定を行うことにより得られる。

＜１６ＳｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’

上記のようにして得られる馬由来のビフィドバクテリウム・ボームでの一例としては、本発明者らが馬の糞便から分離したビフィドバクテリウム・ボームＨＵが挙げられる。このビフィドバクテリウム・ボームＨＵ７は、平成１９年１月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にＮＩＴＥＰ−３０６として寄託した。

このビフィドバクテリウム・ボームＨＵの１６ＳｒＤＮＡを配列番号１に、菌学的性質を以下に示す。なお、ビフィドバクテリウム・ボームＨＵの１６ＳｒＤＮＡは、ビフィドバクテリウム・ボームの標準株（ＪＣＭ１２１１Ｔ）の１６ＳｒＤＮＡ（アクセッションナンバーＤ８６１９０）と９９.７％（１４４８ｂｐ／１４５２ｂｐ）の相同性を有する。

＜菌学的性質＞
（１）微生物の形態^＊、＊＊
形態：桿菌（分岐あり）
形状：円形
大きさ：０.２〜２.０ｍｍ
隆起：凸円状
周縁：円滑
表面：円滑
構造：均質
色調：褐色
透明度：不透明
硬度：粘稠
運動性：なし
＊微生物を嫌気条件下、ＢＬ培地で３７℃、４８時間培養した場合の形態。
＊＊腸内細菌の世界、叢文社、１９８０年、ｐ１１０、図１８９を参考に記載した。
（２）炭素源の資化性^＊＊＊
Ｄ−アラビノース：−
Ｌ−アラビノース：−
リボース：−
Ｄ−キシロース：−
Ｌ−キシロース：−
ガラクトース：−
グルコース：＋
フルクトース：＋
マンノース：−
ラムノース：−
マンニトール：−
ソルビトール：−
サリシン：−
セロビオース：−
ラクトース：−
メリビオース：＋
トレハロース：−
メレジトース：＋
ラフィノース：＋
スターチ：＋
グルコネート：−
＊＊＊：＋は資化性あり、−は資化性なし。
（３）培養条件
３７℃でよく生育し、１５℃、４５℃で生育しない。
（４）耐塩性
塩化ナトリウム濃度０％で生育、３％以上で生育しない。
（５）カタラーゼ活性
なし

本発明の馬用乳酸菌製剤は、上記ビフィドバクテリウム・ボームを培養可能な培地で１０^５〜１０^１１個／ｍｌ、好ましくは１０^７〜１０^９個／ｍｌ程度まで培養したものを、最終製品中に１０^６〜１０^８個／ｍｌ、好ましくは１０^７個／ｍｌ以上となるように含有させることにより調製される。

ビフィドバクテリウム・ボームが培養可能な培地としては、ＭＲＳ液体培地（Ｏｘｏｉｄ社製）、ＡＢＣＭブイヨン培地（栄研化学社製）、ＢＬ寒天培地（栄研化学社製）等が挙げられる。なお、ビフィドバクテリウム・ボームは、ＹＧＰ液体培地では生育しない。

また、上記培地を用いたビフィドバクテリウム・ボームの培養条件は、ＭＲＳ液体培地およびＡＢＣＭブイヨン培地では、３７℃で２４時間、スチール・ウール法で嫌気培養する。ＢＬ寒天培地では、３７℃で４８時間、スチール・ウール法で嫌気培養する。

本発明製剤は上記した馬由来のビフィドバクテリウム・ボームを含有していれば良く、ビフィドバクテリウム・ボーム自体が凍結されたり、凍結乾燥されたものであっても特に限定されない。また、製剤の剤型も特に限定されず、例えば、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、ペレット、液剤等が挙げられる。更に、本発明製剤には一般に市販されている整腸剤、オリゴ糖類、ビタミン類、賦型剤等を配合することもできる。

また、本発明製剤には、馬由来のビフィドバクテリウム・ボームの効果を増強させるために、馬由来のビフィドバクテリウム属の微生物を配合することができる。このような馬由来のラクトバチルス属に属する微生物としては、例えば、Lactobacillus crispatus（ラクトバチルス・クリスパタス）、Lactobacillus reuteri（ラクトバチルス・ロイテリ）、Lactobacillus salivarius（ラクトバチルス・サーリヴァリウス）、Lactobacillus mucosae（ラクトバチルス・ムコサエ）、Lactobacillus equi（ラクトバチルス・エクイ）、Lactobacillus agilis（ラクトバチルス・アギリス）、Lactobacillus ruminis（ラクトバチルス・ルミニス）、Lactobacillus gastricus（ラクトバチルス・ガストリカス）、Lactobacillus intestinalis（ラクトバチルス・インテスティナリス）、Lactobacillus johnsonii（ラクトバチルス・ジョンソニー）、Lactobacillus oris（ラクトバチルス・オリス）、Lactobacillus vaginalis（ラクトバチルス・ヴァギナリス）、Lactobacillus acidophilus（ラクトバチルス・アシドフィルス）、Lactobacillus colehominis（ラクトバチルス・コレホミニス）、Lactobacillus gallinarum（ラクトバチルス・ガリナラム）、Lactobacillus saerimneri（ラクトバチルス・サエリムネリ）、Lactobacillus vitulinus（ラクトバチルス・ヴィチュリナス）等が挙げられる。これらの菌種は、すべて本発明者らが分離して生菌を保存しているものである。

上記した、馬由来のラクトバチルス属に属する微生物は、馬の糞便、腸管等から常法により得ることができる。

上記馬由来のラクトバチルス属に属する微生物を得るための好ましい一例を示せば次の通りである。まず、健常なサラブレッドの排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを糞便が凍結しない温度、例えば、７℃以下の冷蔵で運搬する。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＬＢＳ寒天培地（ＢＢＬ社製）、ＢＳ寒天培地（栄研化学製）もしくはＢＬ寒天培地（栄研化学製）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養する。培養後に得られたコロニーを釣菌し、分離培地と同じ条件で純化確認をする。純化確認した微生物を−８５℃で凍結保存する。保存した微生物の１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列を上記した２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いて、それぞれ１,５００ｂｐずつをシークエンスし、ＢＬＡＳＴサーチする。決定された塩基配列のうち、ラクトバチルス属の各菌種の標準株と９８％以上の相同性を示すものをその菌種とし、その後、定法の性状試験による同定を行った。なお、ラクトバチルス属の菌種名、標準株名およびアクセッションナンバーを以下に示す。

ラクトバチルス・クリスパタス：ＪＣＭ１１８５Ｔ：Ｙ１７３６２
ラクトバチルス・ロイテリ：ＪＣＭ１１１２Ｔ：Ｘ７６３２８
ラクトバチルス・サーリヴァリウス：ＪＣＭ１２３１Ｔ：ＤＱ９０１７３３
ラクトバチルス・ムコサエ：ＪＣＭ１２５１５Ｔ：ＡＢ２８９２０４
ラクトバチルス・エクイ：ＪＣＭ１０９９１Ｔ：ＡＢ０４８８３３
ラクトバチルス・アギリス：ＪＣＭ１１８７Ｔ：Ｍ５８８０３
ラクトバチルス・ルミニス：ＪＣＭ１１５２Ｔ：Ｍ５８８２８
ラクトバチルス・ガストリカス：ＤＳＭ１６０４５：ＡＹ２５３６５８
ラクトバチルス・インテスティナリス：ＪＣＭ７５４８Ｔ：ＡＢ２８９１７０
ラクトバチルス・ジョンソニー：ＪＣＭ２０１２Ｔ：ＡＪ００２５１５
ラクトバチルス・オリス：ＪＣＭ１１０２８Ｔ：ＡＢ２８９２０７
ラクトバチルス・ヴァギナリス：ＪＣＭ９５０５Ｔ：ＡＢ２８９３１１
ラクトバチルス・アシドフィルスＪＣＭ１１３２Ｔ：Ｍ５８８０２
ラクトバチルス・コレホミニス：ＪＣＭ１１５５０Ｔ：ＡＪ２９２５３０
ラクトバチルス・ガリナラム：ＪＣＭ２０１１Ｔ：ＡＢ２８９１２２
ラクトバチルス・サエリムネリ：ＤＳＭ１６０４９：ＡＹ２５５８０２
ラクトバチルス・ヴィチュリナス：ＪＣＭ１１４３：ＡＢ２１０８２５

本発明製剤においては、上記のようにして得られる馬由来のラクトバチルス属に属する微生物を特に制限なく使用することができるが、これらの中でも、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・エクイ、ラクトバチルス・ジョンソニーおよびラクトバチルス・ルミニスから選ばれる１種または２種以上を組み合わせて含有させることが好ましい。これらラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・エクイ、ラクトバチルス・ジョンソニーおよびラクトバチルス・ルミニスの一例としては、本発明者らが馬の糞便から分離したラクトバチルス・ロイテリＫＫ１８、ラクトバチルス・エクイＫＫ１５、ラクトバチルス・ジョンソニーＫＫ２１およびラクトバチルス・ルミニスＫＫ１４が挙げられる。

上記のうち、ラクトバチルス・ロイテリＫＫ１８は、平成１９年１月１９日付付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にＮＩＴＥＰ−３０４として寄託した。

このラクトバチルス・ロイテリＫＫ１８の１６ＳｒＤＮＡを配列番号２に、菌学的性質を以下に示す。なお、ラクトバチルス・ロイテリＫＫ１８の１６ＳｒＤＮＡは、ラクトバチルス・ロイテリの標準株（ＪＣＭ１１１２Ｔ）の１６ＳｒＤＮＡ（アクセッションナンバーＸ７６３２８）と９９.７％（１４９３ｂｐ／１４９８ｂｐ）の相同性を有する。

＜菌学的性質＞^＊、＊＊
形態：桿菌
形状：円形
大きさ：０.８〜１.０ｍｍ
隆起：凸円状
周縁：円滑
表面：円滑
構造：均質
色調：褐色
透明度：半透明
硬度：粘稠
運動性：なし
＊微生物を嫌気条件下、ＢＬ寒天培地で３７℃、４８時間培養した場合の形態（ＭＲＳ液体培地（Oxoid製）を用いる場合には、静置培養であれば、嫌気にはしなくても良い）。
＊＊腸内細菌の世界、叢文社、１９８０年、ｐ１１０、図１８９を参考に記載した。
（２）炭素源の資化性^＊＊＊
グリセロール：−
エリスリトール：−
Ｄ−アラビノース：−
Ｌ−アラビノース：＋
リボース：＋
Ｄ−キシロース：＋
Ｌ−キシロース：−
アドニトール：−
メチル−βＤ−キシロピロノシド：−
ガラクトース：＋
グルコース：＋
フルクトース：−
マンノース：−
ソルボース：−
ラムノース：−
ダルシトール：−
イノシトール：−
マンニトール：−
ソルビトール：−
メチル−αＤ−マンノピラノシド：−
メチル−αＤ−グルコピラノシド：−
Ｎ−アセチルグリコサミン：−
アミダリン：−
アルブチン：−
エスクリン：−
サリシン：−
セロビオース：−
マルトース：＋
ラクトース：＋
メリビオース：＋
スクロース：＋
トレハロース：−
イヌリン：−
メレジトース：−
ラフィノース：＋
スターチ：−
グリコーゲン：−
キシリトール：−
ゲンチオビオース：−
Ｄ−ツラノース：−
Ｄ−リキソース：−
Ｄ−タガトース：−
Ｄ−フコース：−
Ｌ−フコース：−
Ｄ−アラビトール：−
Ｌ−アラビトール：−
グルコネート：＋／−
２−ケトグルコネート：−
５−ケトグルコネート：−
＊＊＊：＋は資化性あり、−は資化性なし。
（３）培養条件
４５℃で生育し、１５℃で生育しない。嫌気にしても生育する。
（４）耐塩性
塩化ナトリウム濃度０％〜４％で生育、６.５％以上で生育しない。
（５）カタラーゼ活性
なし

また、ラクトバチルス・エクイＫＫ１５は、平成１９年１月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にＮＩＴＥＰ−３０３として寄託した。

このラクトバチルス・エクイＫＫ１５の１６ＳｒＤＮＡを配列番号３に、菌学的性質を以下に示す。なお、ラクトバチルス・エクイＫＫ１５の１６ＳｒＤＮＡは、ラクトバチルス・エクイの標準株（ＪＣＭ１０９９１Ｔ）の１６ＳｒＤＮＡ（アクセッションナンバーＡＢ０４８８３３）と９９.９％（１４３１ｂｐ／１４３２ｂｐ）の相同性を有する。

＜菌学的性質＞^＊、＊＊
形態：桿菌
形状：円形
大きさ：０.８〜１.６ｍｍ
隆起：中凸状
周縁：波状
表面：円滑
構造：均質
色調：褐色
透明度：不透明
硬度：粘稠
運動性：なし
＊微生物を嫌気条件下、ＢＬ寒天培地で３７℃、４８時間培養した場合の形態（ＭＲＳ液体培地（Oxoid製）を用いる場合には、静置培養であれば、嫌気にはしなくても良い）。
＊＊腸内細菌の世界、叢文社、１９８０年、ｐ１１０、図１８９を参考に記載した。
（２）炭素源の資化性^＊＊＊
グリセロール：−
エリスリトール：−
Ｄ−アラビノース：−
Ｌ−アラビノース：＋
リボース：＋／−
Ｄ−キシロース：−
Ｌ−キシロース：−
アドニトール：−
メチル−βＤ−キシロピロノシド：−
ガラクトース：＋
グルコース：＋
フルクトース：＋
マンノース：−
ソルボース：−
ラムノース：＋／−
ダルシトール：−
イノシトール：−
マンニトール：＋
ソルビトール：＋
メチル−αＤ−マンノピラノシド：−
メチル−αＤ−グルコピラノシド：−
Ｎ−アセチルグリコサミン：＋
アミダリン：−
アルブチン：−
エスクリン：−
サリシン：−
セロビオース：−
マルトース：＋
ラクトース：＋
メリビオース：＋
スクロース：＋
トレハロース：−
イヌリン：＋
メレジトース：−
ラフィノース：＋
スターチ：−
グリコーゲン：−
キシリトール：−
ゲンチオビオース：−
Ｄ−ツラノース：−
Ｄ−リキソース：−
Ｄ−タガトース：−
Ｄ−フコース：−
Ｌ−フコース：−
Ｄ−アラビトール：−
Ｌ−アラビトール：−
グルコネート：−
２−ケトグルコネート：−
５−ケトグルコネート：−
＊＊＊：＋は資化性あり、−は資化性なし。
（３）培養条件
４５℃で生育し、１５℃で生育しない。
（４）耐塩性
塩化ナトリウム濃度０％〜４％で生育、６.５％以上で生育しない。
（５）カタラーゼ活性
なし

更に、ラクトバチルス・ジョンソニーＫＫ２１は、平成１９年１月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にＮＩＴＥＰ−３０５として寄託した。

このラクトバチルス・ジョンソニーＫＫ２１の１６ＳｒＤＮＡを配列番号４に、菌学的性質を以下に示す。なお、ラクトバチルス・ジョンソニーＫＫ２１の１６ＳｒＤＮＡは、ラクトバチルス・ジョンソニーの標準株（ＪＣＭ２０１２Ｔ）の１６ＳｒＤＮＡ（アクセッションナンバーＡＪ００２５１５）と９９.７％（１４５８ｂｐ／１４６３ｂｐ）の相同性を有する。

＜菌学的性質＞^＊、＊＊
形態：桿菌
形状：不定形
大きさ：３〜５ｍｍ
隆起：台状
周縁：葉状
表面：粗い
構造：顆粒状
色調：褐色
透明度：不透明
硬度：膜状
運動性：なし
＊微生物を嫌気条件下、ＢＬ培地で３７℃、４８時間培養した場合の形態（ＭＲＳ液体培地（Oxoid製）を用いる場合には、静置培養であれば、嫌気にはしなくても良い）。
＊＊腸内細菌の世界、叢文社、１９８０年、ｐ１１０、図１８９を参考に記載した。
（２）炭素源の資化性^＊＊＊
グリセロール：−
エリスリトール：−
Ｄ−アラビノース：−
Ｌ−アラビノース：−
リボース：−
Ｄ−キシロース：−
Ｌ−キシロース：−
アドニトール：−
メチル−βＤ−キシロピロノシド：−
ガラクトース：＋／−
グルコース：＋
フルクトース：＋
マンノース：＋／−
ソルボース：−
ラムノース：−
ダルシトール：−
イノシトール：−
マンニトール：−
ソルビトール：−
メチル−αＤ−マンノピラノシド：−
メチル−αＤ−グルコピラノシド：−
Ｎ−アセチルグリコサミン：＋
アミダリン：＋／−
アルブチン：＋／−
エスクリン：＋
サリシン：＋／−
セロビオース：＋
マルトース：＋
ラクトース：−
メリビオース：−
スクロース：＋
トレハロース：＋
イヌリン：−
メレジトース：−
ラフィノース：−
スターチ：＋／−
グリコーゲン：−
キシリトール：−
ゲンチオビオース：＋
Ｄ−ツラノース：−
Ｄ−リキソース：−
Ｄ−タガトース：＋／−
Ｄ−フコース：−
Ｌ−フコース：−
Ｄ−アラビトール：−
Ｌ−アラビトール：−
グルコネート：−
２−ケトグルコネート：−
５−ケトグルコネート：−
＊＊＊：＋は資化性あり、−は資化性なし。
（３）培養条件
３７℃で生育し、１５℃、４５℃で生育しない。
（４）耐塩性
塩化ナトリウム濃度０％〜３％で生育、４％以上で生育しない。
（５）カタラーゼ活性
なし

また更に、ラクトバチルス・ルミニスＫＫ１４は、平成１９年１月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）にＮＩＴＥＰ−３０２として寄託した。

このラクトバチルス・ルミニスＫＫ１４の１６ＳｒＤＮＡを配列番号５に、菌学的性質を以下に示す。なお、ラクトバチルス・ルミニスＫＫ１４の１６ＳｒＤＮＡは、ラクトバチルス・ルミニスの標準株（ＪＣＭ１１５２Ｔ）の１６ＳｒＤＮＡ（アクセッションナンバーＭ５８８２８）と９９.５％（１４６９ｂｐ／１４７７ｂｐ）の相同性を有する。

＜菌学的性質＞^＊、＊＊
形態：桿菌
形状：円形
大きさ：０.８〜２.０ｍｍ
隆起：中凸状
周縁：鋸歯状
表面：円滑
構造：顆粒状
色調：褐色
透明度：半透明
硬度：膜状
運動性：なし
＊微生物を嫌気条件下、ＢＬ培地で３７℃、４８時間培養した場合の形態（ＭＲＳ液体培地（Oxoid製）を用いる場合には、静置培養であれば、嫌気にはしなくても良い）。
＊＊腸内細菌の世界、叢文社、１９８０年、ｐ１１０、図１８９を参考に記載した。
（２）炭素源の資化性^＊＊＊
グリセロール：−
エリスリトール：−
Ｄ−アラビノース：−
Ｌ−アラビノース：−
リボース：−
Ｄ−キシロース：−
Ｌ−キシロース：−
アドニトール：−
メチル−βＤ−キシロピロノシド：−
ガラクトース：＋
グルコース：＋
フルクトース：−
マンノース：＋
ソルボース：−
ラムノース：−
ダルシトール：−
イノシトール：−
マンニトール：−
ソルビトール：−
メチル−αＤ−マンノピラノシド：−
メチル−αＤ−グルコピラノシド：−
Ｎ−アセチルグリコサミン：＋
アミダリン：−
アルブチン：−
エスクリン：−
サリシン：−
セロビオース：＋
マルトース：＋
ラクトース：−
メリビオース：＋
スクロース：＋
トレハロース：−
イヌリン：−
メレジトース：−
ラフィノース：＋
スターチ：−
グリコーゲン：−
キシリトール：−
ゲンチオビオース：−
Ｄ−ツラノース：＋
Ｄ−リキソース：−
Ｄ−タガトース：−
Ｄ−フコース：−
Ｌ−フコース：−
Ｄ−アラビトール：−
Ｌ−アラビトール：−
グルコネート：−
２−ケトグルコネート：−
５−ケトグルコネート：−
＊＊＊：＋は資化性あり、−は資化性なし。
（３）培養条件
３７℃、４５℃で生育し、１５℃で生育しない。
（４）耐塩性
塩化ナトリウム濃度０％で生育、３％以上で生育しない。
（５）カタラーゼ活性
なし

これらラクトバチルス属に属する微生物は本発明製剤に、上記ラクトバチルス属に属する微生物を培養可能な培地、好ましくはラクトバチルス属に属する微生物とビフィドバクテリウム属に属する微生物の両方を培養可能な培地でそれぞれ１０^５〜１０^１１個／ｍｌ、好ましくは１０^７〜１０^９個／ｍｌ程度まで培養したものを、最終製品中に１０^６〜１０^８個／ｍｌ、好ましくは１０^７個／ｍｌ以上となるように配合すればよい。

ラクトバチルス属に属する微生物を培養可能な培地としては、ＭＲＳ液体培地、変法ＭＲＳ液体培地、ＡＢＣＭブイヨン培地、ＰＹＧ液体培地等が挙げられ、ラクトバチルス属に属する微生物とビフィドバクテリウム属に属する微生物の両方を培養可能な培地としては、ＭＲＳ液体培地、変法ＭＲＳ液体培地、ＡＢＣＭブイヨン培地等が挙げられる。これらの培地のうち、ＭＲＳ液体培地はＯｘｉｏｉｄ社から市販されているものを利用することもできる。変法ＭＲＳ液体培地は、蒸留水中に、ペプトン（ＰＰ９０Ｍ：オリエンタル酵母製）１.０％、酵母エキス（ＢＳＰ：オリエンタル酵母製）１.５％、グルコース（ナカライテスク製）２.０％、Tween80（ナカライテスク製）０.１％、クエン酸二アンモニウム（ナカライテスク製）０.２％、リン酸水素二カリウム（ナカライテスク製）０.２％、硫酸マグネシウム７水和物（ナカライテスク製）０.０１％、硫酸マンガン５水和物（ナカライテスク製）０.０１％を溶解させたものである。なお、この培地にｐＨ調整の必要はない。

また、上記培地を用いたラクトバチルス属に属する微生物の培養条件は、３７℃で嫌気条件である。

斯くして得られる本発明製剤は、馬に投与することによりストレスの低減ができ、特に調教、レースおよび輸送などによるストレスを低減させることができる。なお、本発明においてストレスの低減とは、本発明製剤の投与前後で血清アルブミンのフリーのＳＨ基割合が例えば、対照群３頭の平均から、試験群の平均が１.５倍程度か、それ以上増加することをいう。また、この製剤の有効成分はいずれも馬の常在乳酸菌であるので下痢防止等の整腸作用も期待できる。

本発明製剤の馬への投与は通常１０^６個／ｍｌのものを２ｍｌ／１日程度行えばよい。また、この製剤の投与方法は特に限定されないが、経口投与が好ましい。経口投与は、例えば、菌体を１０％スキムミルクに懸濁させたものをそのまま、あるいは、凍結菌体を融解させたものを口からシリンジ、チューブ等を用いて投与したり、飼葉等の飼料と菌体を混合し、それを飼料ごと摂取させることにより行われる。

また、特に本発明製剤が凍結乾燥品の場合には、その状態のまま飼料と混合するか、りんごやニンジンの中央部をくり貫き、その中に乾燥状態の製剤を入れて、りんごやニンジンと一緒に経口摂取させることもできる。

更に、本発明製剤は、馬由来のビフィドバクテリウム・ボームや、馬由来のラクトバチルス属の微生物、市販の合成培地、スキムミルク等で構成されるので、安全性が高いため、レース直前での経口投与も可能である。

以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制限されるものではない。

実施例１
微生物の取得（１）：
サラブレッド２３頭の新鮮な糞便から以下の方法により微生物を得た。

（１）選択培地を用いた微生物のスクリーニング
各サラブレッドの排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを７℃以下の冷蔵で運搬した。この糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部を以下の選択培地（ＬＢ寒天培地、ＬＢＳ寒天培地、ＢＳ寒天培地）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養後に得られたコロニーを釣菌し、分離培地と同じ条件で純化確認をした。これらの２３頭のサラブレッドの糞便から純化確認した４００株の微生物を得た。

＜選択培地＞
（ＬＢ寒天培地）
精製水１０００ｍｌにＢＬ寒天培地（栄研化学製）６０ｇを溶解し、これを１２１℃で１５分間高圧滅菌した。次にこれを５０℃まで冷却した後、無菌的に馬脱繊維血（日本バイオテスト研究所製）を５０ｍｌ加え、混合した後シャーレに分注した。その後、シャーレをビニール袋中に密封して乾燥を防ぎ、使用するまで４℃で保存した。
（ＬＢＳ寒天培地）
精製水１０００ｍｌにＬＢＳ^ＴＭＡｇａｒ（Becton Dickinson and company製）８４ｇ、Ｌａｂ−ｌｅｍｃｏｐｏｗｄｅｒ（Oxioid製）８ｇ、酢酸ナトリウム・３水和物１５ｇを、電子レンジを用いてこまめに混和させながら加熱溶解した。これに無菌的に酢酸（ナカライテクス）３.７ｍｌを添加後、シャーレに分注し、ビニール袋に入れて密封し、乾燥を防いで４℃で保存した。
（ＢＳ寒天培地）
滅菌ビーカーにプロピオン酸ナトリウム塩を３０ｇ秤量し、約８０ｍｌの精製水に溶解する。次いで、硫酸パロモマイシンを１００ｍｇ、硫酸フラジオマイシンを４００ｍｇ、塩化リチウム（無水）を６ｇ、前記溶液に溶解させ、総量を１００ｍｌとする。その後、フィルター滅菌したもとをＢＳ添加液とする。精製水１０００ｍｌにＢＬ寒天培地（栄研化学製）６０ｇを溶解し、これを１２１℃で１５分間高圧滅菌した。次にこれを５０℃まで冷却した後、無菌的に馬脱繊維血（日本バイオテスト研究所製）とＢＳ添加液を各５０ｍｌ加え、混合した後シャーレに分注した。その後、シャーレをビニール袋中に密封して乾燥を防ぎ、使用するまで４℃で保存した。

（２）スクリーニングにより得られた微生物の１６ＳｒＤＮＡの決定
上記（１）のスクリーニングにより得られた４００株の微生物の１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列をＰＣＲを用いた常法により決定した。なお、ＰＣＲには以下のプライマーおよび条件を用いた。また、このＰＣＲでは１６ＳｒＤＮＡの約１,５００ｂｐずつがシークエンスされた。

＜ＰＣＲ条件＞
９４℃：１分、９４℃：１分、５５℃：１分、７２℃：２分を１サイクルとし、これを３０サイクル後、７２℃：１０分を１サイクル行った。

（３）ＢＬＡＳＴによる菌種同定
上記（２）で決定された各微生物の１６ＳｒＤＮＡの配列を用いてＢＬＡＳＴサーチ（ＤＤＢＪホームページ：http://www.ddbj.nig.ac.jp）した。このＢＬＡＳＴサーチでは標準株の１６ＳｒＤＮＡと９８％以上のものを同一菌種として判定した。２３頭の馬の糞便から、ラクトバチルス属に属する微生物として、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サーリヴァリウス、ラクトバチルス・ムコサエ、ラクトバチルス・エクイ、ラクトバチルス・アギリス、ラクトバチルス・ルミニス、ラクトバチルス・ガストリカス、ラクトバチルス・インテスティナリス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・オリス、ラクトバチルス・ヴァギナリス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・コレホミニス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・サエリムネリ、ラクトバチルス・ヴィチュリナスが分離された。また、ビフィバクテリウム属に属する微生物としては、種々の馬から分離したにも拘らずビフィドバクテリウム・ボームのみしか分離されなかった。これらビフィドバクテリウム・ボームの中でも馬にプロバイオティクスとして効果のある菌種として特に現役中のサラブレッド（牝：６歳）からビフィドバクテリウム・ボームＨＵを得た。このビフィドバクテリウム・ボームＨＵの１６ＳｒＤＮＡの配列を配列表の配列番号１に示した。

実施例２
微生物の取得（２）：
競走能力に優れた現役中のサラブレッド（牡：３歳）の糞便から以下の方法により微生物を得た。

（１）選択培地を用いたスクリーニング
上記のサラブレッドの排泄後すぐの新鮮な糞便を、実施例１と同様の方法でスクリーニングした結果、３２株の微生物を得た。

（２）スクリーニングにより得られた微生物の１６ＳｒＤＮＡの決定
上記（１）のスクリーニングにより得られた３２株の微生物の１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列を実施例１と同様にして決定した。なお、このＰＣＲでは１６ＳｒＤＮＡの約１,５００ｂｐずつがシークエンスされた。

（３）ＢＬＡＳＴによる菌種同定
上記（２）で決定された各微生物の１６ＳｒＤＮＡの配列を用いて実施例１と同様にしてＢＬＡＳＴサーチし、菌種を判定した。その結果、ラクトバチルス属に属する微生物として、ラクトバチルス・ロイテリが８株、ラクトバチルス・ルミニスが５株、ラクトバチルス・エクイが１株およびラクトバチルス・ジョンソニーが９株分離された。このうち馬にプロバイオティクスとして効果のある菌種としてラクトバチルス・ロイテリＫＫ１８、ラクトバチルス・ルミニスＫＫ５３、ラクトバチルス・エクイＫＫ５７、ラクトバチルス・ジョンソニーＫＫ３２を得た。これらの１６ＳｒＤＮＡの配列を配列表の配列番号２〜５に示した。残りの９株については、ラクトバチルス属以外の微生物であった。

実施例３
凍結乾燥製剤の製造：
実施例１で得られたビフィドバクテリウム・ボームＨＵおよび実施例２で得られたラクトバチルス・ロイテリＫＫ１８、ラクトバチルス・ルミニスＫＫ１４、ラクトバチルス・エクイＫＫ１５およびラクトバチルス・ジョンソニーＫＫ２１のそれぞれをＭＲＳ液体培地（Oxoid製）１０ｍｌを用いて静置条件で生菌数が１ｍｌあたり１０^９個程度になるように培養した。次にこの培養液をＶｏｌｔｅｘにより攪拌した後、容器に入れ、５,０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨てた残りを別の容器の３００ｍｌのスキムミルクに溶解した。最後にこれを１０００ｍｌの三角フラスコに８００ｍｌ分注し、これを−８０℃で凍結乾燥して凍結乾燥製剤を製造した。この製剤を７日間凍結した後、自然融解したものをＢＬ寒天培地上で培養した。凍結乾燥前後の生菌数を測定した結果を表に示した。また、同様にこれらを組み合わせたものについても同一培地で培養し、凍結乾燥前後の生菌数を測定した結果も表１に示した。

表１に記載の通り、何れの菌株単独またはそれらの組み合わせにおいても凍結乾燥前と比較して凍結乾燥後の方が生菌数は減少しているものの、その減少幅は小さく十分な生菌数を維持していた。従って、ビフィドバクテリウム・ボームＨＵ等を含有する馬用乳酸菌製剤は、凍結乾燥後も生菌数を維持することができるため、これを凍結乾燥製剤としても利用できることが分かった。

実施例４
馬用乳酸菌製剤の馬への投与：
まず、サラブレッドを、レースに向けての調教を行う調教群（３頭）と、放牧群（３頭）とに分けた。その後、以下の表２に示す馬用乳酸菌製剤を実施例３と同様に調製し、それらを凍結させたものを融解後に、１０^７個／ｍｌで各群のサラブレッド３頭ずつに、シリンジにより１日に１回、２ｍｌを経口投与した。それを、５日間連続投与した。また、馬用乳酸菌製剤の代わりに同量のスキムミルクのみを投与したものを対照区とした。各サンプルとして、馬用乳酸菌製剤投与５日間の５日目、その５日間の投与終了の１日目、投与終了９日後、投与終了１５日後、投与終了２２日後及び投与終了３０日後の血液及び唾液を採取した。また、馬用乳酸菌製剤の安全性を検討するために、馬用乳酸菌製剤投与５日間の５日目、その５日間の投与終了の１日目、投与終了９日後、投与終了１５日後、投与終了２２日後及び投与終了３０日後に採取した血液および唾液についてＢ−ＴＰ、ＧＯＴ、γ−ＧＴＰ、Ｔ−ＣＨＯ、Ｆ−ＣＨＯ、Ｅ−ＣＨＯ、エステル比、ＮＥＦＡ、ＣＡ、Ｐ、マグネシウム、ＵＮ、血糖、ＡＬＢ、溶血、乳び、Ｗ、Ｒ、ＨＢ、ＨＴ、ＳＴ、ＳＥＧ、ＭＯＮ、ＬＹＭ、血小板、馬ＩｇＧを測定した。

また、血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を文献記載の方法（J.P.Fabsiak, A. Sedelov and V. E. Kagon Quantificaion of Oxidative/Nitrosative Modification of CYS34 in Human serumAlbumin Using a Fluorescence-based SDS-PAGE assay Antioxidants & Redox signaling vol.4 No.5 p855-865 (2002)）に準じて測定した。具体的には、馬用乳酸菌製剤投与５日間の５日目、その５日間の投与終了の１日目、投与終了９日後、投与終了１５日後、投与終了２２日後及び投与終了３０日後の血液を採取し、それから得られた馬血清を１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.４）により１００倍に希釈したものをサンプルとした。次に、このサンプルの２５０μｌに２４０μＭのＴｈｉｏ−Ｇｌｏ１（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ製）を２５μｌ（終濃度２０μＭ）と、３６０ｍＭのＳＤＳ（終濃度３０ｍＭ）またはＰＢＳの２５μｌを加え、分注器で混合した。これとは別にスタンダードとしてＤＴＴで還元したＢＳＡの５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌを同様に用意した後、６０℃で４５分間反応させる。続いて室温にて１５分間インキュベートし、これを３５５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの蛍光波長で蛍光強度を測定した。また、サンプルの６０μｌに（−）ＢＰＢの４×サンプルバッファー２０μｌを添加しＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。
このサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。電気泳動後のゲルのバンドをトランスイルミネーター（フナコシ社製）で写真を撮り、強度を数値化した。続いてＣＢＢＲにて染色し写真撮影後、アルブミンとしてのタンパク量もＮＩＨ−Ｉｍａｇｅで求めた。この蛍光強度を、ｓｔａｎｄａｒｄＢＳＡの蛍光強度に換算した血清量／通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白定量から、血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を求めた。通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白量は、ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）で求めた。馬に馬用乳酸菌製剤を投与後のサラブレッドの血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率の変化を図１に示した。

馬に馬用乳酸菌製剤を投与した結果、何れの群もＢ−ＴＰ、ＧＯＴ、γ−ＧＴＰ、Ｔ−ＣＨＯ、Ｆ−ＣＨＯ、Ｅ−ＣＨＯ、エステル比、ＮＥＦＡ、ＣＡ、Ｐ、マグネシウム、ＵＮ、血糖、ＡＬＢ、溶血、乳び、Ｗ、Ｒ、ＨＢ、ＨＴ、ＳＴ、ＳＥＧ、ＭＯＮ、ＬＹＭ、血小板、馬ＩｇＧの測定値に問題がなかった。このことから、本発明の馬用乳酸菌製剤は安全であることが分かった。また、ストレスの指標となる血清アルブミンの抗酸化（フリーのＳＨ基保有率）が、馬用乳酸菌製剤を５日間投与終了の１日後から対照区に比べて有意に高く、ストレスを低減することが分かった。特にビフィドバクテリウム・ボームとラクトバチルス属に属する微生物とを組み合わせた製剤２を投与した場合には、特に優れたストレス低減効果が認められた。また、調教後に下痢を発症するものがあるが、今回の実験では、生菌無投与群で１頭の下痢が確認され、生菌投与群では、下痢を発症したものはいなかった。統計学的に有意差はないが、生菌剤投与群では、下痢の発症が起こりにくいものと考えられた。

実施例５
馬用乳酸菌製剤の効果：
海外輸送は、国内輸送に比べ、長時間の閉鎖環境、到着時の気候や時差の違いなど、ストレスの度合いは比べものにならない。そのため、海外への遠征は、体調を崩したり、ストレスから競走能力を出し切れない馬も多い。海外遠征した２頭（共に、牡馬・５才）に、実施例４で製造した馬用乳酸菌製剤３（凍結乾燥品）を、２.５ｇ（乾燥重量）ずつ、遠征の前後１週間ずつ連続で投与した。この牡馬２頭は、輸送等によるストレスが低減されたため、海外で行われた国際Ｇ１レース（同レースに出走）の１着と２着となった。

本発明の馬用乳酸菌製剤は、馬のストレスの低減が認められ、しかも、この製剤の有効成分はいずれも馬の常在乳酸菌であるので下痢防止等の整腸作用も期待できるし、安全なものでもある。

血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率の変化を示す図面である。

Claims

馬由来のビフィドバクテリウム・ボーム（Bifidobacterium boum）を有効成分として含有することを特徴とする馬用乳酸菌製剤。
ビフィドバクテリウム・ボームが、ビフィドバクテリウム・ボームＨＵ（ＮＩＴＥＰ−３０６）である請求項第１項記載の馬用乳酸菌製剤。
更に、馬由来のラクトバチルス属に属する微生物を含有するものである請求項第１項または第２項記載の馬用乳酸菌製剤。
馬由来のラクトバチルス属に属する微生物が、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・エクイ（Lactobacillus equi）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・ルミニス（Lactobacillus ruminis）から選ばれる１種または２種以上である請求項第３項記載の馬用乳酸菌製剤。
ラクトバチルス・ロイテリが、ラクトバチルス・ロイテリＫＫ１８（ＮＩＴＥＰ−３０４）である請求項４記載の馬用乳酸菌製剤。
ラクトバチルス・エクイが、ラクトバチルス・エクイＫＫ１５（ＮＩＴＥＰ−３０３）である請求項４記載の馬用乳酸菌製剤。
ラクトバチルス・ジョンソニーが、ラクトバチルス・ジョンソニーＫＫ２１（ＮＩＴＥＰ−３０５）である請求項４記載の馬用乳酸菌製剤。
ラクトバチルス・ルミニスが、ラクトバチルス・ルミニスＫＫ１４（ＮＩＴＥＰ−３０２）である請求項４記載の馬用乳酸菌製剤。
ストレス低減用である請求項第１項ないし第８項の何れかに記載の馬用乳酸菌製剤。
馬に、請求項第１項ないし第９項の何れかに記載の馬用乳酸菌製剤を投与することを特徴とする馬のストレス低減方法。