CH661868A5 - Ganzzellen- oder zellwandpraeparate fuer die radio- oder chemotherapie von tumoren. - Google Patents
Ganzzellen- oder zellwandpraeparate fuer die radio- oder chemotherapie von tumoren. Download PDFInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Ganzzellen- oder Zellwandpräparate für die Radio- oder Chemotherapie von Tumoren.
Bekannt sind Präparationen anaerober Coryneformen, beispielsweise C-Parvum, CN 6134, die als Antitumormittel beschrieben werden. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass diese Präparationen bei systemischer oder lokaler Therapie zu unerwünschten Nebenwirkungen und Komplikationen führen, so dass in der Literatur empfohlen wird, Dosen von mehr als 7,5 mg/m2 Oberfläche zu vermeiden. Diese Menge entspräche ungefähr einer Menge von 20 mg pro Patient.
Es wurde festgestellt, dass Präparate auf der Grundlage von abgetöteten ganzen Zellen oder Zellwänden von Propio-ni-Bakterien bei der Chemotherapie oder Radiotherapie von Tumoren ausserordentlich wirksam sind. Insbesondere sind diese Präparate zur unterstützenden Therapie geeignet. Die Wirksamkeit ist bei lokaler Verabreichung besonders gross.
So hat sich durch Versuche gezeigt, dass P.acnes, P.gra-nulosum und P.avidum bei intraperitonealer Injektion bei Mäusen in einer Dosis von 1,5 mg pro Maus die Überlebenszeit letal (850 R) bestrahlter Mäuse signifikant verlängern, wobei P.granulosum am wirksamsten ist. Es wurde festgestellt, dass die erfindungsgemässen Präparate zur Stimulierung der CFU-S Proliferation, d.h. zur Stimulierung einer Wanderung von hämatopoetischen Koloniebildenden Einheiten aus dem Knochenmark zum Eintritt in den Zellzyklus und zur Wanderung zum peripheren Blut, geeignet sind. In der klinischen Praxis bedeutet dieser Befund, dass die erfindungsgemässen Präparate als Mittel für die Zusatztherapie bei der Radiotherapie von Tumoren wertvoll sind, da sie die Strahlenverträglichkeit der Patienten wesentlich erhöhen.
Darüber hinaus wurde in Untersuchungen festgestellt, dass die erfindungsgemässen Präparate gegen murine Sarcoma 180 bei Mäusen wirksam sind und zu einer Regression von mehr als 70% der Sarcoma 180-Tumoren führen, wenn intratumoral appliziert wurde.
Es wurde auch festgestellt, dass die erfindungsgemässen Präparate bei systemischer Verabreichung an Patienten mit primären oder sekundären Lungentumoren als Zusatzbehandlung zur Chemotherapie eine der Hauptkomplikationen der Chemotherapie von Tumoren vermeiden helfen, nämlich die Infektionsgefahr. Es hat sich somit ergeben, dass die erfindungsgemässen Präparate als ausgezeichnete antibakteriell wirksame Zusatzbehandlungsmittel bei der Chemotherapie des Krebses eingesetzt werden können.
Die vorstehenden Ergebnisse, die nachfolgend durch Angabe einiger in vivo-Versuche belegt sind, müssen in jeder Hinsicht als unerwartet gewertet werden.
Die erfindungsgemässe Verwendung zur Herstellung von Zellwandpräparationen hat sich als besonders brauchbar erwiesen, da bei dieser Art von Präparaten die Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen besonders gering ist. Zellwandpräparate wurden nach dem Stand der Technik bisher noch nicht klinisch untersucht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Ganzzellen- oder Zellwandpräparate für die Radio- oder Chemotherapie von Tumoren auf der Grundlage von abgetöteten ganzen Zellen oder deren Zellwänden von Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum und/oder Propionibacterium acnes.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Propionibacterium granulosum und Propionibacterium avidum, insbesondere Propionibacterium granulosum-Stamm KP 45 und Propionibacterium avidum-Stamm KP 40 verwendet.
Es ist bevorzugt, dass die erfindungsgemässen Präparate in Form von injizierbaren Suspensionen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung vorliegen. Hierbei ist eine Konzentration von 0,5 bis 50 mg aktives Material pro ml Lösung besonders zweckmässig. Bevorzugt ist eine Konzentration von 2 bis 12 mg/ml Lösung, insbesondere von 5 bis 7,5 mg/ml Lösung.
Besonders geeignet sind intravenöse Infusionslösungen, die in 100 ml Lösung 15 bis 30 mg des erfindungsgemässen Präparats enthalten. Eine derartige Dosismenge hat sich als besonders vorteilhaft zur Verabreichung bei der Behandlung primärer und sekundärer Lungenneoplasmen erwiesen, wobei eine erste Injektion mindestens 10 Tage vor der chemotherapeutischen Behandlung erfolgen sollte.
Als Phosphatpuffer verwendet man zweckmässig einen Na2HP04/KH2P04-Phosphatpuffer, der zweckmässig einen pH von etwa 7,2 aufweist.
Die Erfindung ist nicht auf einen speziellen Stamm der im Anspruch 1 angegebenen Propioni-Bakterienarten beschränkt. In Betracht kommen verschiedene Propioni-Bakte-rienstämme, beispielsweise die in FEMS Microbiology Letters, Band 2, Nr. 1, Juli 1977, Seiten 5 bis 9 beschriebenen Pr opioni-Bakterien.
' Die Stämme P.granulosum KP45 und P.avidum KP40 sind besonders bevorzugt. Sie wurden bei der DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Grisebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, Deutschland mit den DSM-Aufnahmenummern 1773 für P.granulosum KP45 und 1772 für P.avidum KP40 mit dem Eingangsdatum vom 11.03.1980 hinterlegt. Beide Stämme sind bei der DSM in Übereinstimmung mit der durch den Hinterleger bei der DSM und beim Deutschen Patentamt vorzulegenden Freigabeerklärung (z.Z. Formblatt P 2750) erhältlich.
P.granulosum, P.acnes und P.avidum lassen sich im übrigen aus Abstrichen aus Acne Effluoreszenzen (Acne vulgaris, Acne papulopustulosa und Acnes conclobata) isolieren und züchten. Zur Taxonomie vgl. Hautarzt 30,242 bis 267 (1979).
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3'
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Weitere Stämme der im Anspruch 1 angegebenen Pro- Microbiology, Februar 1973, Seiten 222 bis 229 der Ameri-pioni-Bakterienarten, die für die erfindungsgemässe Verwen- can Society for Microbiology, Band 25, Nr. 2 beschrieben, dung in Betracht kommen, sind beispielsweise in Applied
Charakterisierung der Propioni-Bakterien P. avidum Stamm KP40 und P. granulosum KP45
Biochemische Reaktionen (Lit. 1)
Stamm Herkunft Species Saccha- Mal- Sorbit Mannit Salicin Inosit Äsculin Indol Nitrat Gelatin Dextrin Melizi-Nr. rose tose Hydrolyse tose
KP45 Abstrich P. granu- + + — — — — — — — - + +
von einer losum Wundinfektion
KP40 genommen P. avi- + + — + + — ++ — — + + + aus Präpu- dum tiumraum eines klinisch Gesunden
(Fortsetzung)
Senologie (Lit. 2) Phagenlysotypie
(Lit. 3)
Stamm Nr. Herkunft Species P.acnes. P.granulosum P.avidum Kol Kol 3
KB 95 D34 58 0575 31
KP45 Abstrich P. granu- — + — — — — NT von einer losum Wundinfektion
KP40 genommen P. avidum — — — + — — NT aus Präputi-umraum eines klinisch Gesunden
NT = nicht typisierbar
1) G. Pulverer and H.L. Ko
Fermentative and Serological Studies on Propionibacterium acnes und App. Microb. 25: 222-229: 1973
2) U. Höffler, H.L. Ko and G. Pulverer
Serotyping of Propionibacterium acnes and related microbial species.
Fems Microbiology letters, Vol. 2; 5-9,1977
3) E.C. Jong, H.L. Ko and G. Pulverer Studies on Bacteriophages of P. acnes
Med. Microbiol. Immunol. 161,263-271,1975 Der Hautarzt 30,242-247 (1979)
Differenzierung unterschiedlicher Propionibakterienspezie aus Acne-vulgaris-Effluoreszenzen
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Herstellung von erfindungsgemässen Präparaten.
Beispiel 1
Allgemeine Arbeitsweise zur Gewinnung der Zellwände 55 Die Flüssigkeitskultur des jeweiligen Propioni-Bakteri-ums wurde in 1 Liter (Erlenmeyerkolben) bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen durchgeführt (Gas-Pak Verfahren, BBL).
Für diese Massenanzüchtung wurde das Medium (A- 60 Bouillon* oder Triptic soy broth., Difco) mit einer dicken Aufschwemmung von Propionibakterium beimpft. Die Impf-Aufschwemmung wurde durch Verreiben einer dreitägigen A-Agarkultur von Propionibakterium in 10 ml Bouillon hergestellt. Nach einer Bebrütungszeit von 72 Stunden 65 bei 37 °C wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 10 000 g (20 Min.) in einer Sorval R2-Kühlzentrifuge von der Flüssigkeit abgetrennt. Das Sediment wurde dreimal mit
Aqua dest. gewaschen und anschliessend mit dem doppelten Volumen Glasperlen (0 0,17 —0,18 mm) gemischt und in einer Zellmühle"* 1 — 1 '/2 Stunden lang zerschlagen. Nachdem durch eine mikroskopische Kontrolle (Gram-Präparat) geprüft worden war, dass keine ganzen Zellen mehr vorhanden sind, wurden die Glasperlen mit einer G-l-Fritte unter Verwendung von Phosphatpuffer** (pH7,2) vom Homogenisat abgetrennt.
Die milchige Suspension (enthielt Zellwände und Cyto-plasmen) wurde 20 Min. bei 40 000 g abzentrifugiert und das Sediment wurde in Phosphatpuffer (pH 7,2) aufgenommen. Die autolytischen Enzyme wurden durch 10 Min. Kochen im Wasserbad inaktiviert.
Diese noch Protein-haltigen Zellwände wurden durch Inkubation bei 37 °C 24 Stunden lang mit Trypsin (Merck, 0,5 mg/ml Suspension) und 1 ml Toluol auf 100 ml Aufschwemmung (zur Verhinderung von Bakterienwachstum) weiter gereinigt.
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4
Die durch tryptische Verdauung gereinigten Zellwände wurden schliesslich bei 40 000 g abzentrifugiert (30 Min.) und 3 mal mit Aqua dest. gewaschen; dann gefriergetrocknet.
*) A-Bouillon:
Bacto Casitone 12 g
Bacto yeast extract 12 g
KH2P04 4 g
MgS04-7H20 1 g
Glukose 4 g
Aqua dest. ad 1000 ml, pH 7,2 Für A-Agar+28 g Bacto Agar.
**) Phosphatpuffer:
V15 M Na2HP04-2H20 und
Vis M KH2PO4 wurden je in 1000 ml Aqua dest. gelöst; 612 g der sekundären Natriumphosphatlösung wurden mit 388 g der primären Kaliumphosphatlösung vermischt, und der pH wurde auf 7,2 eingestellt. ***) Zellmühle: Vibrogen-Zellmühle vi 3, Edmund Bühler, 7400 Tübingen.
Beispiel 2
Herstellung von Suspensionen von P.acnes (Stamm ATCC 6919), P.avidum (Stamm 0575, KP 40) und P.granulosum (Stamm KP 45)
Nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 lyophilisierte Zellwände von Propionibakterien der genannten Art werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung der vorstehend genannten Art in einer Konzentration von 5,0 bzw. 7,5 mg/ml suspendiert. Die erhaltene Suspension ist insbesondere zur intraperitonealen Injektion geeignet.
Beispiel 3
Unter Anwendung der Arbeitsweise des Beispiels 2 werden intraperitoneal injizierbare Suspensionen von P. granulosum Stamm KP 45,95.K, P. acnes Stamm ATCC 6919 und P. avidum Stamm 0575, KP 40 aus lyophilisertem Material mit einer Konzentration von 5 bzw. 7,5 mg/ml Zellmaterial hergestellt.
Beispiel 4
Herstellung injizierbarer Suspensionen als Mittel für die
Zusatzbehandlung bei der Chemotherapie P.granulosum Stamm PK 45 wird nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 aufbereitet. Man stellt eine Suspension von 30 mg Zellmaterial in 100 ml Infusionslösung zur intravenösen Verabreichung her.
Die erfindungsgemässen Präparate können übliche Zusatzstoffe enthalten. Die Präparate können in Ampullenform vorliegen oder in sterilen Flaschen mit Durchstechverschluss abgefüllt sein. Auch Konfektionierungen mit getrennter Aufbewahrung der Bestandteile zur Zubereitung im Augenblick der Applikation kommen in Betracht.
Untersuchungen in vivo 1. Hämopoese bei mit Propioni-Bakterien behandelten Mäusen nach letaler Bestrahlung Es wurden drei Stämme von Propioni-Bakterien (P.acnes, P.granulosum und P.avidum) in einer Dosis von jeweils 1,5 mg pro Maus intraperitoneal bei letal bestrahlten Mäusen (850 R) injiziert. Hierbei ergab sich, dass P.granulosum die Uberlebenszeit der bestrahlten Mäuse am meisten verlängerte.
Es wurden erwachsene, 8 Wochen alte männliche Swiss-Mäuse verwendet. Die Tiere wurden mit einer Standarddiät gefüttert. Wasser war ad libidum zur Verfügung. Das Wasser und das Futter wurden sterilisiert. Das Wasser enthielt Oxytetracyclin (1 g pro 1000 ml).
Bestrahlung: Die Mäuse wurden in einem rotierenden Metacrylatkäfig (10 Mäuse pro Käfig) in einer Entfernung von 50 cm von der THX 250 Medicor-Einheit, die bei 200 kV betrieben wurde und mit einem 0,5 mm Cu-Filter versehen war, mit 650 bzw. 850 R bestrahlt. Die Bestrahlungsrate von ungefähr 75 R pro Minute wurde mit einem CT-1 Thermolumineszenz R-Dosimeter bestimmt.
Für die Experimente wurden P.acnes Stamm ATCC 6919, P.avidum Stamm 0575, KP 40 und P.granulosum Stamm KP 45 in Form abgetöteter Ganzzellen und in Form von Zellwänden verwendet. Man suspendierte die lyophilisierten Propioni-Bakterien in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung in einer Konzentration von 7,5 mg/ml und injizierte 0,2 ml der Suspension intraperitoneal (1,5 mg pro Maus).
Untersuchung exogener Milzkolonien 3,2 bzw. 1 Tag vor der Transplantation von Knochenmark wurden Donor-Mäusen 1,5 mg P.granulosum injiziert. Die Knochenmark-Zellsuspension wurde hergestellt, indem man beide Oberschenkelknochen mit sterilem Parker-Medium spülte. Die Zellen wurden in einem Hämocytometer gezählt. 5 x 105 vermehrungsfähige Zellen in 0,2 ml Parker-Medium wurden jeder Maus in die Schwanzvene injiziert, welche 4 Stunden vor der Knochenmarktransplantation mit 850 R bestrahlt worden war. Den Kontrollmäusen wurden 0,2 ml Medium oder 5 x 105 Knochenmarkzellen von normalen Mäusen (nicht mit P.granulosum behandelt) injiziert. Einer anderen Gruppe von Donor-Mäusen wurde P.granulosum wie zuvor verabreicht, dann wurden die Tiere mit Äther anästhesiert und aus dem retrobulbären Plexus wurde Blut entnommen. Die Blutzellen wurden im Hämocytometer gezählt und aliquote Anteile Blut mit 5 x 105 nucleierten Zellen wurden in die Schwanzvene von mit 850 R bestrahlten Mäusen injiziert. Die Kontrollmäuse erhielten gleiche Volumina Blut, das von normalen Mäusen (nicht mit P.granulosum behandelt) entnommen worden war. Alle Mäuse wurden 9 Tage nach der Transplantation von Blut bzw. Knochenmark getötet und gewogen, die Milz wurde entnommen, es wurde wiederum gewogen und die Anzahl Kolonien pro Milz wurden nach Fixierung in Chloroform:Äthanol (1:3) bestimmt.
Untersuchung der endogenen Milzkolonien 3,2 bzw. 1 oder 0 Tage vor der Bestrahlung mit 650 R wurden Mäuse intraperitoneal mit P.granulosum injiziert. Die Kontrollmäuse erhielten gleiche Volumina an PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung). 9 Tage nach der Bestrahlung wurden die Tiere getötet, die Milzen wurden entfernt, gewogen und die Kolonien wurden wie beim vorstehenden Test zur Bestimmung der exogenen Milzkolonien gezählt.
Überlebenstest Mäuse wurden in 7 Gruppen aufgeteilt, wobei jeweils 15 Mäuse pro Gruppe vorlagen und mit 850 R Röntgenstrahlen bestrahlt wurden. 4 Stunden nach der Bestrahlung wurde den Tieren Propioni-Bakterienzellwände oder ganze Zellen injiziert. Die Kontrollmäuse erhielten gleiche Volumina an PBS. Die Anzahl der überlebenden Tiere in jeder Gruppe wurde ab dem 10. Tag nach der Bestrahlung gezählt.
Für die statistische Analyse wurde der Student t-Test angewendet.
In der anliegenden Figur 1 ist die Wirkung der untersuchten Propioni-Bakterien auf die Überlebensrate der letal bestrahlten Mäuse graphisch dargestellt. Alle drei Stämme von Propioni-Bakterien führten im Vergleich zu den Kontrolltieren zu einer signifikanten Verlängerung der Überlebensspanne. P.granulosum erwies sich in Form des Ganzzel-lenpräparates und in Form des Zellwandpräparates wirksamer als P.acnes und P.avidum.
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Einfluss von P.granulosum auf endogene Milzkolonien (Stamm KP 45)
Tabelle I
Anzahl endogener Milzkolonien bei Mäusen die mit Propioni-Bakterium granulosum behandelt wurden (Stamm KP45) (Mittelwert + Standardabweichung)
relatives Milz- Anzahl endoge-
gewicht
ner Milzkolonien
Kontrolle/650 R/
1,82 ±
0,45
1,24 ± 0,67
P. granulosum - 3 Tage vor
Bestrahlung
1,66 +
0,24
10,6 ± 4,45x
P. granulosum - 2 Tage vor
Bestrahlung
1,73 ±
0,21
8,17 + 3,49"
P. granulosum - 1 Tag vor
Bestrahlung
2,18 ±
0,42
11,2 ± 5,30"
P. granulosum - 4 Std. nach
Bestrahlung
2,32 ±
0,38
14,1 + 4,70x x-p < 0,01
25
Das relative Milzgewicht der bestrahlten Mäuse nahm nahm die Anzahl exogener Milzkolonien bei sämtlichen Be-nur dann zu, wenn P.granulosum 1 Tag vor oder 4 Stunden handlungen signifikant zu.
nach der Bestrahlung mit 650 R verabreicht wurde. Jedoch
30
Wirkung von P.granulosum auf die Bildung exogener Milzkolonien (Stamm KP 45)
Tabelle II
Anzahl exogener Kolonien nach Transfusion von Knochenmark von mit P. granulosum behandelten Mäusen (Stamm KP45) (Mittelwerte + Standardabweichung)
Transfusion relatives Milz- Anzahl exogener CFU-S pro 106 nu-
gewicht Milzkolonien cleierte Knochen markzellen
Kontrolle (0,5 ml Parker-Medium)
0,99
±
0,19
1,12 + 0,32
11,2
+
3,2
Knochenmark von normalen Mäusen
1,52
+
0,31
20,4 + 2,14
204,0
+
21,4
Knochenmark von Mäusen, diè 3 Tage vor der
1,51
+
0,49
10,3 + 1,87"
103,0
+
18,7'
Transfusion mit P. granulosum behandelt worden
waren
Knochenmark von Mäusen, die 2 Tage vor der
1,75
±
0,44
11,6 ± 4,4X
116,0
±
44,2
Transfusion mit P. granulosum behandelt worden
waren
Knochenmark von Mäusen, die 1 Tag vor der
1,69
±
0,27
10,7 + 4,3*
107,0
±
43,3!
Transfusion mit P. granulosum behandelt worden waren x-p < 0,01
Es wurden keine Unterschiede beim relativen Milzgewicht zwischen Mäusen, welche mit normalem Knochenmark transplantiert waren und Mäusen, die mit Knochenmark von mit P.granulosum 2, 3 oder 1 Tage vor der Transplantation behandelten Donor-Tieren, festgestellt. Diese Behandlung führte zu einer signifikanten Abnahme der Anzahl exogener Milzkolonien bei mit 850 R bestrahlten Tieren, im Vergleich zu Tieren, denen Knochenmark von unbehandelten Donor-Tieren gegeben worden war. Dieser Befund zeigt eine Abnahme der Anzahl von CFU-S im Knochenmark von mit P.granulosum behandelten Mäusen an. Andererseits führte eine Injektion von Blut von Mäusen, welche mit P.granulosum behandelt worden waren, an letal bestrahlte Versuchstiere zu einer signifikanten Zunahme der Werte der relativen Milzgewichte und der Anzahl Milzkolonien im Vergleich zur Injektion von Blut aus unbehandelten Donor-Tieren, wie der nachstehenden Tabelle III zu entnehmen ist:
60
65
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6
Tabelle III
Anzahl exogener Milzkolonien nach Transfusion von Blut von mit P. granulosum behandelten Mäusen (Stamm KP45) (Mittelwerte + Standardabweichung)
Transfusion Leukocytose beim relatives Anzahl exogener CFU-S pro l'O6
transfundierten Milzgewicht Milzkolonien nucleierte Knochen-
Blut markzellen
Blut von normalen Mäusen 6480 Blut von Mäusen, die 3 Tage 9960 vor der Transfusion mit P. granulosum behandelt waren Blut von Mäusen, die 2 Tage 10120 vor der Transfusion mit P. granulosum behandelt waren Blut von Mäusen, die 1 Tag 9650 vor der Transfusion mit P. granulosum behandelt waren x-p < 0,01 xx-p < 0,05
1,41 ± 0,23 3,8 ± 2,2 1,17 ± 0,28
2,62 ± 0,88x 9,16 ± 1,4X 1,84 ± 0,3 lx
3,45 ± l,81x 10,2 ± 2,6X 2,01 ± 0,34x
3,23 ± l,48x 7,4 ± 1,8X
1,54 + 0,23xx
Am wirksamsten bei der Stimulierung der Milzkoloniebildung war Blut, das von Donor-Mäusen entnommen war, die zwei oder drei Tage vor der Bluttransplantation mit P.granulosum injiziert worden waren. Die Leukocytose bei transplantiertem Blut wurde jedoch nach der Behandlung mit P.granulosum 3,2 oder 1 Tag vor der Blutentnahme erhöht.
In den vorstehenden Experimenten erwies sich P.granulosum als wirksamstes Agens bei letal bestrahlten Ratten. Der tödliche Effekt der letalen Dosis von Röntgenstrahlen ist das Ergebnis der Inhibierung der proliferativen Fähigkeit der hämopoetischen Stammzellen und der Schädigung der Epithelzellen der inneren Organe mit anschliessender Entwicklung generalisierter Infektionen durch saprophytische Bakterien. Allerdings zeigt es sich beim vorstehenden Experiment, dass die mit Propionibakterien behandelten Mäuse keine Symptome von Diarrhoe und/oder Blutungen aus dem Verdauungstrakt aufwiesen. Daher lässt sich die Schutzwirkung der Propionibakterien einer verstärkten Erholung der hämopoetischen Stammzellen des Knochenmarks nach der Bestrahlung zuschreiben.
2. Wirksamkeit von P.granulosum, P.acnes und P.avidum bei experimentellem Murine Sarcoma 180-Tumor bei Mäusen
Alle drei zuvor genannten Propionibakterien wurden intraperitoneal oder intratumoral in mehreren Dosen zu jeweils 1 mg pro Maus appliziert und erwiesen sich als wirksam bei der Retardation des Wachstums und der Stimulierung der Regression von Sarcoma 180 bei CFW-Mäusen. Darüber hinaus ergab die Applikation von Propionibakterien eine Verlängerung des Überlebens von Mäusen mit Sarcoma 180.
Eingesetzte Propionibakterien
Für die Experimente wurde Propioni-Bakterium granulosum Stamm KP 45 (aus Wundinfektion im Hygiene-Institut der Universität Köln isoliert), Propioni-Bakterium acnes Stamm 6919 (ATCC) Propionibakterium avidum Stamm 0575 (C.S. Cummins, Anaerobe Labs, Virginia Polytechnic Inst, and State University, Blackburg), KP 40 verwendet. Die genannten Propionibakterien wurden lyophilisiert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einer Konzentration von 5 mg/ml suspendiert. 0,2 ml der Suspension wurde den Tumor tragenden Mäusen intraperitoneal oder intratumoral verabreicht.
25
Tumor tragende Mäuse
Bei diesem Tumorsystem wurden erwachsene männliche CFW-Mäuse eingesetzt. Die Tumore wurden wie in Radio Sei. 12 (1978), Seiten 185 bis 189 beschrieben induziert. Hierzu wurden Sarcoma 180-Tumore von Donor-Mäusen seziert, Tumorgewebe wurde zerhackt, trypsinisiert (0,25% Trypsin, 15 Minuten bei 37 °C) und filtriert. Die Anzahl Zel-30 len wurden gezählt und pro 1 ml Kochsalzlösung auf 108 vermehrungsfähige Zellen eingestellt. 0,1 ml der Suspension wurde subkutan intraskapular injiziert. Diese Arbeitsweise führte zur Entwicklung fühlbarer Tumore nach ungefähr 4 bis 5 Tagen. Ein schnelles Wachstum der Tumore erfolgte 35 zwischen dem 4. und dem 14. Tag nach der Transplantation, wobei der letale Effekt zwischen dem 20. und 28. Tag auftrat.
Insgesamt 225 männliche CFW-Mäuse wurden bei den Untersuchungen verwendet. Bei den Überlebenstests wurden 40 105 Mäuse in sieben Grupppen (15 Mäuse je Gruppe) aufgeteilt, und die Tiere der experimentellen Gruppen (I bis VI) wurden an den Tagen 0,4, 8,12 und 16 nach der Implantation der Tumorzellen mit Propioni-Bakterien injiziert. Man injizierte P.granulosum, P.avidum oder P.acnes intraperitoneal (3 Gruppen) oder intratumoral (3 Gruppen) in einer Dosis von 1 mg/Maus. Die Kontrollmäuse erhielten intrape-ritoneale oder intratumorale Injektionen von PBS. Die Anzahl der überlebenden Tiere wurde am 16. bzw. 20. Tag nach der Implantation der Tumorzellen und dann jeden zweiten Tag bis zum 44. Tag nach der Implantation aufgezeichnet. Die verbleibenden 120 Tiere wurden in 8 Gruppen aufgeteilt und Mäuse der experimentellen Gruppen (I bis VI) wurden mit Propioni-Bakterien wie zuvor injiziert und die Kontrollmäuse (Gruppen VII und VIII) wurden mit PBS injiziert. 55 Am 20. Tag nach der Implantation der Tumorzellen wurden sämtliche Mäuse getötet und die Tumore seziert und gewogen. Das arithmetische Mittel und die Standardabweichungen wurden für jede Gruppe bestimmt und sämtliche Tumoren der Experimentalgruppen, die mehr als zwei Standardabweichungen unterhalb des Kontrollmittelwertes lagen, wurden als regressiv aufgezeichnet. Die Ergebnisse wurden statistisch durch den Student t-Test (Tumormasse) oder die Chi-Quadrat-Analyse mit Yates Korrektion (Regression der Tumoren und Überleben der Mäuse) analysiert.
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60
65
In der nachstehenden Tabelle IV sind die erzielten Ergebnisse zusammengestellt.
7 66i 868
Tabelle IV
Überleben von Sarcoma 180 tragenden CFW-Mäusen unter Behandlung von Propioni-Bakterien (1 mg/Maus) am Tage 0,4, 8,12 und 16 nach der Implantation von Tumorzellen
Tage nach der Implantation der Tumorzellen
16
20
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
42
44
Kontrolle
15
13
10
7
3
0
P. granulosum
15
15
15
15
12
12
10
9
9
7
6
5
3
3
intraperitoneal
P. acnes intra
15
15
15
15
15
14
12
8
8
8
5
5
2
1
peritoneal
P. avidum intra
15
15
15
14
14
13
11
10
8
5
4
4
0
peritoneal
P. granulosum
15
15
15
15
15
15
13
12
11
9
7
7
6
3
intratumoral
P. acnes intra
15
15
15
15
15
14
12
11
9
7
7
7
5
2
tumoral
P. avidum intra
15
15
15
15
15
15
14
13
10
8
8
6
4
3
tumoral
Die nachstehende Tabelle V zeigt den Einfluss der Propioni-Bakterien auf das Wachstum und die Regression von Sarcoma 180 bei CFW-Mäusen.
Tabelle V
Tumormasse und Anzahl regredierter Tumoren bei Sarcoma 180 tragenden Mäusen, die mit Propioni-Bakterien (1 mg/Maus) am 0., 4., 8., 12. und 16. Tag nach der Implantation von Tumorzellen behandelt waren
Intraperitoneale Injektion Intratumorale Injektion
Tumormasse Anzahl Prozent Re- Tumormasse Anzahl Prozent
(g) regredierter gression (g) regredierter Regression
Tumore Tumore
Kontrolle
2631
±
321
0/15
0
2631 ± 321
0/15
0
Propioni-Bakterium
granulosum
842
±
312
8/15
53,3
538 +212
11/15
73,3
Propioni-Bakterium
1032
±
381
6/15
40,0
842 + 246
10/15
66,6
avidum
Propioni-Bakterium
1126
±
412
5/15
33,3
731 + 218
9/15
60,0
acnes
Bei intraperitonealer Verabreichung in einer einzelnen Dosis von 1 mg/Maus ergab sich bei allen drei getesteten Stämmen von Propionibakterien eine signifikante Vergrösse-rung der Milz am 4. Tag nach der Injektion mit weiterer Ver-grösserung der Milzmasse an den Tagen 6 bis 14. Diese Milzvergrösserung spiegelt die Stimulierung des retikuloen-dothelischen Systems wieder und läuft parallel zur Antitu-morwirksamkeit dieser Immunostimulatoren.
P.granulosum führte zu einer Regression von mehr als 70% bei den untersuchten Sarcoma 180-Tumoren, wenn es intratumoral verabreicht worden war.
3. In vivo cytostatische Wirksamkeit bei Murine Tumorzellen durch Propionibakterium granulosum
In einer weiteren Untersuchung wurde die cytostatische Wirkung von Propionibakterium granulosum Stamm KP 45 bei Sarcoma L-l bei BALB/c-Mäusen (Lunge) untersucht. Auch hier ergab sich eine signifikante Wirksamkeit im Vergleich zu unbehandelten Tieren.
4. Antibakterielle Wirkung als zusätzliche Erscheinung bei der Chemotherapie primärer oder sekundärer Lungentu-more
30 Patienten mit primären oder sekundären metastatischen Lungentumoren wurden für diesen Test gewählt. 10
der Patienten erhielten intravenöse Infusionen von 30 mg 45 P.granulosum in 100 ml intravenöser Infusionslösung. Die anderen 20 Patienten dienten zur Kontrolle.
Sämtliche Patienten wurden chemotherapeutisch zur Synchronisierung der Proliferation neoplastischer Zellen behandelt. Jeder Kurs dauerte 3 Tage: 1. Tag: Vincristine so 1,5 mg intravenös um 8 Uhr und um 20 Uhr, 2. Tag: Me-thotrexate 25 mg intramuskulär um 20 Uhr, 3. Tag: Metho-trexate 25 mg intramuskulär um 8 Uhr, gefolgt von Metho-trexate intravenös zu 25 mg um 14 Uhr und Infusion von 30 mg/kg Cyclophosphamid zur selben Zeit.
55 Diese chemotherapeutische Behandlung wurde dreimal alle 21 Tage wiederholt.
Die gesamte Chemotherapie bestand aus den drei obigen Zyklen, die jeweils am 1., 22. und 43. Tag der Beobachtung begannen.
6o Während des 3., 10., 31. und 52. Beobachtungstags wurde P.granulosum in einer Dosis von 30 mg/100 ml intravenöser Infusionslösung im Verlauf von 15 Minuten verabreicht (am letzten Tag des ersten chemotherapeutischen Zyklus und dann 1 Woche nach Beendigung eines jeden Zyklus). 65 Bei den nur chemotherapeutisch behandelten Patienten traten fünf Fälle bakterieller Infektionen auf (drei Pneumo-niaen, eine Sepsis und 1 Fall von Angina Tonsillaris) während einer 60-tägigen Beobachtungszeit, während bei den 10
661868
mit Chemotherapie und intravenösen Infusionen von P.granulosum behandelten Patienten keine Symptome bakterieller Infektionen auftraten. Dieser Unterschied ist als statistisch signifikant zu bezeichnen.
Die Toleranz der Patienten gegenüber intravenösen Infusionen von P.granulosum Stamm KP 45 war gut. Während der Infusion in einer Menge von 30 mg P.granulosum traten zwar Kältegefühle und anschliessend Fieber bis zu 39 °C (2 bis 12 Stunden nach der Infusion) auf, am nachfolgenden Tag waren jedoch diese Nebenwirkungen nicht mehr festzustellen. Wiederholte Infusionen von P.granulosum führten nicht zur Entwicklung einer verzögerten Hypersensitivität während der 60-tägigen Beobachtung. Daraus wird der Schluss gezogen, dass die intravenöse Infusion von 30 bis 240 mg P.granulosum Stamm KP 45 ohne Risiko ernster Nebenwirkungen oder Komplikationen bei Patienten vorgenommen werden kann.
5. Allgemeine Anweisung zur lokalen Verabreichung (Ma-gen- und Darmkrebs)
Man suspendiert 10 mg lyophilisiertes Produkt in 1 ml 1% Xylocain in Kochsalzlösung und injiziert intratumoral durch die Haut (Durchmesser 1 mm), wobei eine 80 cm lange, steife Polyäthylenableitung mit fest angeordneter intramuskulärer Nadel (18 Gauge) ohne Epiphyse verwendet wird. Die Ableitung wird durch einen bioptischen Kanal in einem Endoskop (Gastrofiberoskop oder Colonoskop) eingeführt, wobei der unter visueller Kontrolle befindliche neoplastische Tumor punktiert und die Nadel 0,5 bis 1 cm in das Tumorgewebe eingeführt wird. Das Produkt wird durch die Ableitung injiziert, und man spült mit 1 bis 2 ml 1%-igem Xylocain in Kochsalzlösung.
Die intratumoralen Injektionen (jeweils 10 mg Produkt) werden beispielsweise während der ersten drei Tage, dann am 10. und am 17. Tag der Beobachtung verabreicht.
8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
S
1 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
1. Ganzzellen- oder Zellwandpräparate für die Radiooder Chemotherapie von Tumoren auf der Grundlage von abgetöteten ganzen Zellen oder deren Zellwänden von Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum und/oder Propionibacterium acnes.
2. Ganzzellen- oder Zellwandpräparate nach Anspruch 1, für die Radio- oder Chemotherapie von Tumoren auf der Grundlage von abgetöteten ganzen Zellen oder deren Zellwänden von Mikroorganismen der Stämme Propionibacterium granulosum DSM 1773, Propionibacterium avidum DSM 1772 oder Propionibacterium acnes ATCC 6919.
3. Ganzzellen- oder Zellwandpräparate nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparate in Form von Suspensionen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 0,5 bis 50 mg aktivem Material pro ml Lösung vorliegen.
4. Ganzzellen- oder Zellwandpräparate nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Phosphatpuffer ein Na2HP04/KH2PC>4-Phosphatpuffer mit pH 7,2 ist.
5. Ganzzellen- oder Zellwandpräparate nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparate in Form von injizierbaren Suspensionen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, insbesondere intraperitoneal, intravenös oder intratumoral applizierbaren Suspensionen, vorliegen.
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