DE3011461A1 - Verwendung von propionibakterien - Google Patents

Verwendung von propionibakterien

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DE3011461A1 DE19803011461 DE3011461A DE3011461A1 DE 3011461 A1 DE3011461 A1 DE 3011461A1 DE 19803011461 DE19803011461 DE 19803011461 DE 3011461 A DE3011461 A DE 3011461A DE 3011461 A1 DE3011461 A1 DE 3011461A1
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Description

301H61
Verwendung von Propionibakterien
130040/0568
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Propionibakterien. Sie betrifft insbesondere die Verwendung von Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum und/oder Propionibacterium acnes zur Herstellung von Zellu/andpräparaten oder Ganzzellenpräparaten, die in der Tumorbehandlung sowie bei der Radio- oder Chemotherapie von Tumoren brauchbar sind.
Bekannt sind Präparationen anaerober Coryneformen, beispielsweise C-Parvum, CN 6134, die als Antitumormittel beschrieben werden. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß diese Präparationen bei systemischer oder lokaler Therapie zu unerwünschten Nebenwirkungen und Komplikationen führen, so daß in der Literatur empfohlen wird, Dosen von mehr als 7,5 mg/m2 Oberfläche zu vermeiden. Diese Menge entspräche ungefähr einer Menge von 20 mg pro Patient.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Präparate auf der Grundlage von abgetöteten ganzen Zellen oder Zellwänden von Propioni-Bakterien bei der Chemotherapie oder Radiotherapie von Tumoren außerordentlich wirksam sind. Insbesondere sind diese Präparate zur unterstützenden Therapie geeignet. Die Wirksamkeit ist bei lokaler Verabreichung besonders groß.
So hat sich durch Versuche gezeigt, daß P.acnes, P.granulosum und P.avidum bei intraperitonealer Injektion bei Mäusen in einer Dosis von 1,5 mg pro Maus die Oberlebenszeit letal (850 R) bestrahlter Mäuse signifikant verlängern, wobei P.granulosum am wirksamsten ist. Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Präparate zur Stimulierung der CFU-S Proliferation, d.h. zur Stimulierung einer Wanderung von hämatopoetischen Koloniebildenden Einheiten aus dem Knochenmark zum Eintritt in den Zeil· zyklus und zur Wanderung zum peripheren Blut, geeignet ist. In der klinischen Praxis bedeutet dieser Befund, daß die erfindungsgemäßen Präparate als Zusatztherapie bei der Radiotherapie von Tumoren wertvoll sind, da sie die Strahlenverträglichkeit der
Patienten wesentlich erhöhen.
i30040/056-g
Darüber hinaus wurde in Untersuchungen festgestellt, daß die erfindungsgemä&en Präparate gegen murine Sarcoma 180 bei Mäusen wirksam sind und zu einer Regression von mehr als 70 % der i
Sarcoma 180-Tumoren führen, wenn intratumoral appliziert wurde.j
Es wurde auch festgestellt, daß die erfindungsgemäf:.en Präparate bei systemischer Verabreichung an Patienten mit primären oder sekundären Lungentumoren als Zusatzbehandlung zur Chemotherapie eine der Hauptkomplikationen der Chemotherapie von Tumoren vermeiden helfen, nämlich die Infektionsgefahr. Es hat sich somit ergeben, daß die erfindungsgemäßen Präparate als ausgezeichnete antibakteriell wirksame Zusatzbehandlungsmittel bei der Chemotherapie des Krebses eingesetzt werden können.
Die vorstehenden Ergebnisse, die nachfolgend durch Angabe einiger in vivo-Versuche belegt sind, müssen in jeder Hinsicht als unerwartet gewertet werden.
Die erfindungsgemäße Verwendung zur Herstellung von Zellwandpräparationen hat sich als besonders brauchbar erwiesen, da •bei dieser Art von Präparaten die Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen besonders gering ist. Zellwandpräparate wurden nach dem Stand der Technik bisher noch nicht klinisch untersucht.
Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung von Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum und/oder Propionibacterium acnes zur Herstellung von Zellu/andpräparaten oder Ganzzellenpräparaten in der Radio- oder Chemotherapie von Tumoren.
Nach einer bevorzugten Ausführungoform der Erfindung werden Propiunibacter i um granulooum und Prop ίο nib a ι; tor ium avid um, insbesondere P j-υ μ im ι j. Ij α c Li. r Ium graiiulüi/Jin- Stamm KP ή? und Propionibacterium avidum-Gtamm KP 40 verwendet.
Es ist bevorugt, injizierbare Guspensionen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung herzustelle. Hierbei ist eine Kon-
13 0 0 4 0/0 5 6
zentration von 0,5 bis 50 mg aktives Material pro ml Lösung besonders zweckmäßig. Bevorzugt ist eine Konzentration von 2 bis 12 mg/ml Lösung, insbesondere von 5 bis 7,5 mg/ml Lösung.
Besonders geeignet sind intravenöse Infusionslösungen, die in 100 ml Lösung 15 bis 30 mg-des Präparats enthalten. Eine derartige Dosismenge hat sich als besonders vorteilhaft zur Verabreichung bei der Behandlung primärer und sekundärer Lungenneoplasme erwiesen, wobei eine erste Injektion mindestens 10 Tage vor der chemotherapeutischen Behandlung erfolgen sollte.
Als Phosphatpuffer verwendet man zweckmäßig einen Na Phosphatpuffer, der zweckmäßig einen pH von etwa 7,2 aufweist.
Die Erfindung ist nicht auf einen speziellen Propioni-Bakteriumstamm beschränkt. In Betracht kommen verschiedene Propioni-Bakterienstämme , beispielsweise die in FEMS Microbiology Letters, Band 2, Nr. 1, Juli 1977, Seiten 5 bis 9 beschriebenen Propioni-Bakterien.
Die Stämme P.granulosum KP45 und P.avidum KP40 sind besonders bevorzugt. Sie wurden bei der DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH , Grisebachstrasse 8, D-3400 Göttingen,Deutschland mit den DSM-Aufnahmenummern 1773 für P.granulosum K P 4 5 und 1772 für P.avidum KP40 mit dem Eingangsdatum vom 11.03.1980 hinterlegt. Beide Stämme sind bei der DSM in Übereinstimmung mit der durch den Hinterleger bei der DSM und beim Deutschen Pateiitamtvorzulegenden Freigabeerklärung (z.Z. Formblatt P 2750) erhältlich.
P.granulosum, P.acnes und P.avidum lassen sich im übrigen aus Abstrichen aus Acne Effluoreszenzen (Acne vulgaris, Acne ! papulopustulosa und Acnes conclobata) isolieren und züchten. Zur Taxonomie vgl. der Hautarzt 30, 242 bis 267 (1979).
Weitere Propioni-Bakterienstämme, die für die erfindungsge- ! mäße Verwendung in Betracht kommen, sind beispielsweise in
Applied Microbiology, Februar 1973, Seiten 222 bis 229 der American Society for Microbiology, Band 25, Nr. 2 beschrieben.
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Charakterisierung der Propioni-Bakterien P.avidum Stamm KP40 und P.granulosum KP45
i Stamm Herkunft . Species Saccha Mal Biochemische Reaktionen (Lit. Mannit SaIi- Ino Äscu- 1) Nitrat Gela + Dex Melizi- . ■I
Nr. rose tose Sor cin sit lin- In- tin trin tose
bit Hydro- dol
lyse
O
O I
I
j
-P- KP45 Abstrich P.granu- + + - - - - - - + +
O von einer losum - -
O Wundin
OT fektion
σ>
OO KP40 genommen P.avi + + + + ++ + +
aus Prä- dum
putium-
raum
eines kli
nisch Ge
sunden
(Fortsetzung)
cn oo !
Herkunft Species Seriologie (Lit 2) P. acnes P.granulosum . .D34 ■. P.avidum 0575 31 Phagenlysotypie
KB .. . 95.. 58 (Lit. 3)
Stamm Abstrich P. granu + kfn1 tf M 1^
Nr. von einer lös um NO I ..... l\0 1 ο
KP45 Wundin NT
fektion
genommen P.avi- +
aus Prä- dum
KP40 putium- NT
raum
eines kli
nisch Ge
sunden
I ' ■
NT = nicht typisierbar
1) G.Pulverer and H.L.Ko
Fermentative and Serological Studies on Propionibacterium acnes und App. Microb. 25 : 222-229 : 1973
2) U.Hoffler, H.L.Ko and G.Pulverer
Serotyping of Propionibacterium acnes and related microbial species, Ferns Microbiology letters, Vol. 2; 5-9, 1977
3) E.C.Jong, H.L.Kq and G.Pulverer Studies on Bacteriophages of P.acnes Med.Microbiol.Immunol. 161, 263-271, 1975 Der Hautarzt 30, 242 - 247 (1979)
Differenzierung unterschied!icher Propionibakterienspezie aus Acnevulgaris-Effluoreszenzen
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Herstellung erfindungsgemäßer Präparate.
B e i s ρ i e 1
Allgemeine Arbeitsweise zur Gewinnung der Zellwände
Die Flüssigkeitskultur des jeweiligen Propioni-Bakteriums wurde in 1 Liter (ErIenmeyerkolben) bei 370C unter anaeroben Bedingungen durchgeführt (Gas-Pak Verfahren, BBL).
Für diese Massenanzüchtung wurde das Medium (Α-Bouillon oder j
Triptic soy broth, Difco) mit einer dicken Aufschwemmung von j Propionibakterium beimpft. Die Impf-Aufschwemmung wurde durch Verreiben einer dreitägigen A-Agarkultur von Propionibakterium in 10 ml Bouillon hergestellt. Nach einer Bebrütungszeit von 72 Stunden bei 370C wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 10 000 g (20 Min.) in einer Sorval R2-KUh1 zentrifuge von der Flüssigkeit abgetrennt. Das Sediment wurde dreimal mit Aqua dest gewaschen und anschließend mit dem doppelten Volumen Glasperlen (0 0,17 - 0,18 mm) gemischt und in einer Zellmühle +++ 1-1 1/2 Stunden lang zerschlagen. Nachdem durch eine mikroskopische Kontrolle (Gram-Präparat) geprüft worden war, daß keine ganzen Zellen mehr vorhanden sind, wurden die Glasperlen mit einer G-1-Fritte unter Verwendung von Phosphatpuffer++ (pH 7,2) von, Homogenisat abgetrennt.
Die milchige Suspension (enthielt Zellwände und Cytoplasmen) wurde 20 Min. bei 40 000 g abzentrifugiert und das Sediment wurde in Phosphatpuffer (pH 7,2) aufgenommen. Die autoiyti sehen Enzyme wurden durch 10 Min. Kochen im Wasserbad inaktiviert.
Diese noch Protein-haltigen Zellwände wurden durch Inkubation bei 37°C 24 Stunden lang mit Trypsin (Merck, 0,5 mg/ml Suspen-
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sion) und 1 ml Toluol auf 100 ml Aufschwemmung (zur Verhinderung von Bakterienwachstum) weiter gereinigt.
Die durch tryptische Verdauung gereinigten Zellwände wurden schließlich bei 40 000 g abzentrifugiert (30 Min.) und 3mal mit; Aqua dest. gewaschen, dann gefriergetrocknet.
A-Bout1 lon • 1 2 g
Bacto Casi tone 1 2 g
Bacto yeas t extract 4 g
KH2PO4 1 g
MgS04-7H20 4 g
Glukose
Aqua dest. ad 1000 ml, pH 7,2 j Für A-Agar + 28 g Bacto Agar.
++) Phosphatpuffer:
1/15 M Na2HP04'2H20 und
1/15 M KH2PO4 wurden je in 1000 ml Aqua dost, gelöst; ϊ 612 g der sekundären Natriumphosphatlösung wurden mit j 388 g der primären Kaiiumphosphatlösung.vermischt, und der pH wurde auf 7,2 eingestellt.
+++) Zellmühle: Vibrogen-Zellmühle vi 3, Edmund Bühler, 7400 Tübingen.
Beispiel
Herstellung von Suspensionen von P.acnes (Stamm ATCC 6919), P.avidum (Stamm 0375, KP 40) und P . q r_a n_u_l o_sum „Jjjbamrn KP 45 )_
Nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 lyophilisierte Prop ion!bakterien der genannten Art werden in phosphatgepuffer -
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ter Kochsalzlösung der vorstehend genannten Art in einer Konzentration von 5,0 bzw. 7,5 mg/m1 suspendiert. Die erhaltene Suspension ist insbesondere zur intraperitonealen Injektion geeignet.
Beispiel 3
Unter Anwendung der Arbeitsweise des Beispiels 2 werden intraperitoneal injizierbare Suspensionen von P. granulosurn Stamm KP Wj , '?5 K, P. rioncB Stamm AIfC 0919 und I5. .-ividum Stamm üy/r>, KP 40 aus lyophilisiertem Material mit einer Konzentration von 5 bzw. 7»5 mg/m1 Zellmaterial hergestellt.
B e i s ρ i el
Herstellung injizierbarer Suspensionen zur Zusatzbehandlung bei
der Chemotherapie
P.granulosum Stamm KP 45 wird nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 aufbereitet. Man stellt eine Suspension von 30 mg Zellmaterial in 100 ml Infusionslösung zur intravenösen Verabreichung her.
Die erfindungsgemäßen Präparate können übliche Zusatzstoffe enthalten. Die Präparate können in Ampullenform vorliegen oder in sterilen Flaschen mit Durchstechverschluß abgefüllt sein. Auch Konfektionierungen mit getrennter Aufbewahrung der Bestandteile zur Zubereitung im Augenblick der Applikation kommen in Betracht.
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Untersuchungen in vivo
1. Hämopoese bei mit Propioni-Bakterien behandelten Mäusen nach letaler Bestrahlung
Es wurden drei Stämme von Propioni-Bakterien (P.acnes, P.granulosum und P.avidum) in einer Dosis von jeweils 1,5 mg pro Maus intraperitoneal bei letal bestrahlten Mäusen (850 R) injiziert. Hierbei ergab sich, daß P.granulosum die Überlebenszeit der bestrahlten Mäuse am meisten verlängerte.
Es wurden erwachsene, 8 Wochen alte männliche Swiss-Mäuse verwendet. Die Tiere wurden mit einer Standarddiät gefüttert Wasser war ad Iibidum zur Verfugung. Das Wasser und das Futter wurden sterilisiert. Das Wasser e-nthielt Oxytetracyclin (1 g pro 1000 ml).
Bestrahlung: Die Mäuse wurden in einem rotierenden Metacrylatkäfig (10 Mäuse pro Käfig) in einer Entfernung von 50 cm von der THX 250 Medicor-Einheit, die bei 200 kV betrieben wurde und mit einem 0,5 mm Cu-Filter versehen war, mit bzw. 850 R bestrahlt. Die Bestrahlungsrate von ungefähr 75 R pro Minute wurde mit einem CT-1 Thermolumineszenz R-Dosirneter bestimmt.
Für die Experimente wurden P.acnes Stamm ATCC 6919, P.avidum Stamm 0575, KP'40 und P.granulosum Stamm KP 45 in Form abge-
töteter Ganzzellen und in Form von Zellwänden verwendet. ! Man suspendierte die lyophi1isierten Propioni-Bakterien in
einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung in einer Konzentraj tion von 7,5 mg/ml und injizierte 0,2 ml der Suspension ; intraperitoneal (1,5 mg pro Maus).
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301HSI
Untersuch υ ηg eχ ο g eη e r M i1 ζ kο1 on ie η
3, 2 bzw. 1 Tag vor der Transplantation von Knochenmark wurden j Donor-Mäusen 1,5 mg P.granulosum injiziert. Die Knochenmark- | Zellsuspension wurde hergestellt, indem man beide Oberschenkelknochen mit sterilem Parker-Medium spülte. Die Zellen wurden in einem Hämocytometer gezählt. 5 χ 10 vermehrungsfähige Zellen in 0,2 ml Parker-Medium wurden jeder Maus in die Schwanzjvene injiziert, welche 4 Stunden vor der Knochenmarktransplan- j tation mit 850 R bestrahlt worden war. Den Kontrollmäusen wurden 0,2 ml Medium oder 5 χ 10 Knockenmarkszellen von normalen Mäusen (nicht mit P. granulosum behandelt) injiziert. Einer anderen Gruppe von Donor-Mäusen wurde P. granulosum wie zuvor verabreicht, dann wurden die Tiere mit Äther anästhesiert und aus dem retrobulbaren Plexus wurde Blut entnommen. Die Blutzellen wurden im Hämocytometer gezählt und aliquote Anteile Blut mit 5 χ 10 nucleierten Zellen wurden in die Schwanzvene von mit 850 R bestrahlten Mäusen injiziert. Die Kontrollmäuse erhielten gleiche Volumina Blut, das von normalen Mäusen (nicht mit P.granulosum behandelt) entnommen worden war. Alle Mäuse wurden 9 Tage nach der Transplantation von Blut bzw. Knochenmark getötet und gewogen, die Milz wurde entnommen, es wurde wiederum gewogen und die Anzahl Kolonien pro Milz wurden nach Fixierung in ChI orofornr.Äthanol (1:3) bestimmt,
Untersuchung der endogenen Milzkolonien
3, 2 bzw. 1 oder 0 Tage vor der Bestrahlung mit 650 R wurden Mäuse intraperitoneal mit P.granulosum injiziert. Die Kontroll mause erhielten gleiche Volumina an PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung). 9 Tage nach der Bestrahlung wurden die Tiere getötet, die Milzen wurden entfernt, gewogen und die Kolonien wurden wie beim vorstehenden Test zur Bestimmung der exogenen Milzkolonien aezählt.
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!1461
Überlebenstest
Mäuse wurden in 7 Gruppen aufgeteilt, wobei jeweils 15 Mäuse pro Gruppe vorlagen und mit 850 R Röntgenstrahlen bestrahl t wurdei 4 Stunden nach der Bestrahlung wurde den Tieren Propioni-Bakterienzellwände oder ganze Zellen injiziert. Die Kontrollmäuse erhielten gleiche Volumina an PBS. Die Anzahl der überlebenden Tiere in jeder Gruppe wurde ab dem 10.Tag nach der Bestrahlung gezählt.
Für die statistische Analyse wurde der Student t-Test angewendet.
In der anliegenden figur 1 ist die Wirkung der untersuchten Propioni-Bakterien auf die Oberlebensrate der letal bestrahlten Mäuse graphisch dargestellt. Alle drei Stämme von Propioni-Bakterien führten im Vergleich zu den Kontrolltieren zu einer signifikanten Verlängerung der Überlebensspanne. P.granulosum erwies sich in Form des Ganzzellenpräparates und in Form des ZeI1wandpräparats wirksamer als P.acnes und P.avidum.
Einfluß von P.granulosum auf endogene Mi 1 zkol onien (stamm KP'· 45)
13 0-040/0-5
TABELLE I
Anzahl endogener Milzkolonien bei M'ausen die mit Pro- j
pi oni -Bakterium granulosum behandelt wurden (stHmm KP 45) |
(Mittelwert + Standardabweichung) !
relatives MiIzaewicht
Anzahl endogener Milzkolonien
Kontrolle/650 R/
1,82 + 0,45
1,24
P.granulosum - 3 Tage vor Bestrahlung
1,66 + 0,24
10,6 + 4,45'
P.granulosum - 2 Tage vor Bestrahlung
1,73 + 0,21
B,17 + 3,49'
P.granulosum - 1 Tag vor Bestrahlung
2,18 + 0,42
11,2 + 5,30J
P.granulosum - 4 Std. nach Bestrahlung
2,32 + 0,38
14,1 + 4,70'
- ρ <0,01
Das relative Milzgewicht der bestrahlten Mäuse nahmen nur dann zu, wenn P.granulosum 1 Tag vor oder 4 Stunden nach der Bestrah lung mit 650 R verabreicht wurde. Jedoch nahm die Anzahl exogener Milzkolonien bei sämtlichen Behandlungen signifikant zu.
Wirkung von P.granulosum auf die Bildung exogener Milzkolonien (Stamm KP 45) '
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TABELLE II
to ο CD
O Ol CD OO
Anzahl exogener Kolonien nach Transfusion von Knochenmark von mit P»granulosum behandelten Mäusen (stamm KP 45) (Mittelwerte J1 Standardabweichung)
Transfusion relatives
MiIzgewicht		 Anzahl exogener
Mi Izkolonien		 CFU-S pro 106
nucleierte Kno-
chenmarkzel "len
Kontrolle (0,5 ml Parker-Medium) 0,99 + 0,19 1 ,12 + 0,32 11,2 + 3,2
Knochenmark von normalen Mäusen 1 ,52 + 0,31 20,4 + 2,14 204,0 ± 21 ,4
Knochenmark von Mäusen, die 3 Tage vor
der Transfusion mit P.granulosum behan
delt worden waren		 1,51 + 0,49 10,3 +1 ,87X 103,0 +_ 18,7X
Knochenmark von Mäusen, die 2 Tage vor
der Transfusion mit P.granulosum be
handelt worden waren 		1 ,75 + 0,44 11 ,6 + 4,4X 116,0 + 44,2X '
Knochenmark von Mäusen, die 1 Tag vor
der Transfusion mit P.Granulosum be
handelt worden waren.		 1 ,69 +_ 0,27 10,7 + 4,3X 107,0 J1 43,3X
ι I
- ρ < 0 ,01
GT>
t£ wurden keine Unterschiede beim relativen Milzgewicht zwiichen Mäusen, welche mit normalem Knochenmark transplantiert waren und Mäusen, die mit dem Knochenmark von mit P.granulosum 2» 3 oder 1 Tage vor der Transplantation behandelten Donor-Tieren, festgestellt. Diese Behandlung führte zu einer signifikanten Abnahme der Anzahl exogener Milzkolonien bei mit 850 R bestrahlten Tieren, im Vergleich zu Tieren, denen Knochenmark von unbehandelten Donor-Tieren gegeben worden war. Dieser Befund zeigt eine Abnahme der Anzahl von CFU-S im. Knochenmark von mit P.granulosum behandelten Mäusen an. Andererseits führte eine Injektion von Blut von Mäusen, welche mit P.granulosum behandelt worden waren, an letal bestrahlte Versuchstiere zu einer signifikanten Zunahme der Werte der relativen Mi1zgewicfite und der Anzahl Milzkolonien im Vergleich zur Injektion von Blut aus unbehandelten Donor-Tieren, wie der nachstehenden Tabelle III zu entnehmen ist:
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TABELLE III
Anzahl exogener Milzkolonien nach Transfusion von Blut von mit P.granulosum behandelten Mäusen (Stamm KP 45)
(Mittelwerte + Standardabweichungen)
to O CJ •Ο-O "^. CD OT σ> oo
Transfusion , die 3 Tage vor der
P.granulosum behan-		 Leukocytose beim
transfundierten
Blut		 relatives
gewicht		 + 0, MiIz- Anzahl exogener
Milzkolonien		 CFU-S pro 106
nucleierte Kno
chenmarkzellen
, die 2 Tage vor der
P.granulosum behan-		 6480 1,41 ±°> 23 3,8 J1 2,2 1,17 π
Blut von normalen Mäusen , die 1 Tag vor der
P.granulosum behan-		 9960 2,62 t !» 88X 9,16 + 1,4X 1,84 :
Blut von Mäusen
Transfusion mit
delt waren		 - ρ < 0 ,01
- ρ < 0 ,05		 10120 3,45 ± 1> 81X 10,2 + 2,6X 2,01 _
Blut von Mäusen
Transfusion mit
delt waren		 9650 3,23 48X 7,4 + 1,8XX 1,54 _
Blut von Mäusen
Transfusion mit
delt waren
X
XX 		I 0,28
h 0,31X
I 0,34X
f 0,23XX
I '
ι. ι. :
O; cn
j Am wirksamsten bei der Stimulierung der Milzkoloniebildung war Blut, das von Donor-Mäusen entnommen war, die zwei oder drei Tage vor der Bluttransplantation mit P.granulosum injiziert worden j waren. Die Leukocytose bei transplantiertem Blut wurde jedoch : nach der Behandlung mit P.granulosum 3, 2 oder 1 Tag vor der Blut entnahme erhöht.
In den vorstehenden Experimeaten erwies sich P.granulosum als wirksamstes Agens bei letal bestrahlten Ratten. Der tödliche Effekt der letalen Dosis von Röntgenstrahlen ist das Ergebnis der Inhibierung der pro! i f erati ven Fähigkeit der härnopoetischen Stammzellen und der Schädigung der Epithelzellen der inneren Organe mit anschließender Entwicklung generalisierter Infektionerj durch saprophytische Bakterien. Allerdings zeigt es sich beim vorstehenden Experiment, daß die mit Propionibakterien behandelten Mäuse keine Symptome von Diarrhöe und/oder Blutungen aus dem Verdauungstrakt aufwiesen. Daher läßt sich die Schutzwirkung der Pr op ion !bakterien einer verstärkten Erholung der hämopoetischen Stammzellen des Knochenmarks nach der Bestrahlung zuschreibung.
2.Wirksamkeit von P.qranulosum, P.acnes und P.avidum bei experi-
l
mentellem Murine Sarcoma 180-Tumor bei Mäusen
Alle drei zuvor genannten Propion !bakterien wurden intraperitoneal oder intratumoral in mehreren Dosen zu jeweils 1 mg pro Maus appliziert und erwiesen sich als wirksam bei der Retardation des Wachstums und der Stimulierung der Regression von Sarcoma 180 bei CFW-Mäusen. Darüber hinaus ergab die Applikation von Propion!bakterien eine Verlängerung des Überlebens von Mäusen mit Sarcoma 180.
j Eingesetzte Propionibakterien
j Für die Experimente wurde Propioni-Bakterium granulosum Stamm
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KP 45 (aus Wundinfektion im Hygiene-Institut der Universität Köln isoliert), Propioni-Bakterium acnes Stamm 6919 (ATCC) ' ; Propionibakterium avidum Stamm 0575 (C.S.Cummins , Anaerobe j Labs, Virginia Polytechnic Inst, and State Uni versi ty, Blackburg), KP 40 verwendet. Die genannten Propionibakterien wurden lyophilisiert j und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einer Konzentration1 von 5 mg/ml suspendiert. 0,2 ml der Suspension wurde den Tumor tragenden Mäusen intraperitoneal oder intratumoral verabreicht.
Tumor tragende Mäuse
Bei diesem Tumorsystem wurden erwachsene männliche CFW-Mäuse eingesetzt. Die Tumore wurden wie in Radio Sei. 12 (1978), Seiten 185 bis 189 beschrieben induziert. Hierzu wurden Sarcoma 180 Tumore von Donor-Mäusen seziert, Tumorgewebe wurde zerhackt, trypsinisiert (0,25 % Trypsin, 15 Minuten bei 37°C) und filtriert. Die Anzahl Zellen wurden gezählt und pro 1 ml Kochsalzlösung auf 108 vermehrungsfähige Zellen eingestellt. 0,1 ml der Suspension wurde subkutan intraskapular injiziert. Diese Arbeitsweise führte zur Entwicklung fühlbarer Tumore nach ungefähr 4 bis 5 Tagen. Ein schnelles Wachstum der Tumore erfolgte zwischen dem 4. und dem 14. Tag nach der Transplantation, wobei der letale Effekt zwischen dem 20. und 28. Tag auftrat.
Insgesamt 225 männliche CFW-Mäuse wurden bei den Untersuchungen verwendet. Bei den Oberlebenstests wurden 105 Mäuse in sieben Gruppen (15 Mäuse je Gruppe) aufgeteilt, und die Tiere der experimentellen Gruppen (I bis VI) wurden an den Tagen 0, 4, 8, 12 und 16 nach der Implantation der Tumorzellen mit Propioni-Bakterien injiziert. Man injizierte P.granulosum, P.avidum oder P.acnes intraperitoneal (3 Gruppen) oder intratumoral (3Gruppen) in einer Dosis von 1 mg/Maus. Die Kontrollmäuse erhielten intraperitoneale oder intratumorale Injektionen von PBS. Die Anzahl der überlebenden Tiere wurde am 16. bzw. 20. Tag nach der Implan tation der Tumorzellen und dann jeden zweiten Tag bis zum 44.Tag
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- 241—=·
■ΙΑ-
nach der Implantation aufgezeichnet. Die verbleibenden 120 Tiere wurden in 8 Gruppen aufgeteilt und Mäuse der experimen-i teilen Gruppen (I bis VI) wurden mit Propioni-Bakterien wie zuvor injiziert und die Kontrollmäuse (Gruppen VII und VIII) wurden mit PBS injiziert. Am 20. Tag nach der Implantation der Tumorzellen wurden sämtliche Mäuse getötet und die Tumore seziert und gewogen. Das arithmetische Mittel und die Standardabweichungen wurden für jede Gruppe bestimmt und sämtlich Tumoren der Experimental gruppen, die mehr als zwei Standardabweichungen unterhalb des Kontrollmittelwertes lagen, wurden als regressiv aufgezeichnet. Die Ergebnisse wurden statistisc durch den Student t-Test (Tumormasse) oder die Chi-Quadrat-Analyse mit Yates Korrektion (Regression der Tumoren und überleben der Mäuse) analysiert.
In der nachstehenden Tabelle IV sind die erzielten Ergebnisse zusammengestel1t.
1 30040/0568
überleben von Sarcoma Kontrolle 16 TABELLE IV Tage nach der 24 26 0, 4 usen unter Behandlung von nach der 32 34 • 36 38 40 42 • 44
Propioni-Bakterien (1 P.granulosum
intraperitoneal		 15 22 7 3 ,8,12 und 16
Implantation von P.acnes
intraperitoneal		 15 180 tragenden CFW-Ma 10 15 12 Impl antation der Tumorzellen 9 9 7 6 5 3 * *
3 ';
P.avidum
intraperitoneal		 15 mg/Maus) am Tage 15 15 15 28 30 8 8 8 5 5 2 1 .'
P.granulös um
intratumoral		 15 Tumorzellen 15 14 14 0 10 8 5 4 4 0
P.acnes
intratumoral		 15 15 15 15 12 10 12 11 9 7 7 6 3'
P.avidum
intratumoral		 15 15 15 15 14 12 11 9 7 7 7 5 2
130040/056 15 20 15 15 15 13 11 13 10 8 8 6 4 3
co 13 15 15 13
15 14 12
15 15 14
15
15
15
15
301U61
Die nachstehende Tabelle V zeigt den Einfluß der Propioni-Bakterien auf das Wachstum und die Regression von Sarcoma 180 bei CFW-Mäusen.
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TABELLE V
Tumormasse und Anzahl regredierter Tumoren bei Sarcoma tragenden Mäusen, die mit Propioni-Bakterien (1 mg/Maus) am 0., 4« ,'8., 12. und 16. Tag nach der Implantation von Tumorzellen behandelt waren
Intraperitoneale Injektion Anzahl re
gredierter
fumore		 Prozent
Regres
sion		 Intratumorale Injektion Anzahl regre
dierter Tumo-
re		 Prozent
Regres
sion '.',
KontrolIe Tumormasse
(g)		 0/15 0 Tumormasse
(g)		 0/15 0 '
Propioni-Bakterium
granulosum .		 2631 + 321 8/15 53,3 2631 + 321 11/15 73,3
Propioni-Bakterium
avidum		 842 + 312 6/15 40,0 538 +_ 212 10/15 66,6
Propioni-Bakterium
acnes		 1032 + 381 5/15 33,3 842 +_ 246 9/15 60,0
1126 J1 412 731 J1 218
■IS-
Bei intraperitonealer Verabreichung in einer einzelnen Dosis von 1 mg/Maus ergab sich bei allen drei getesteten Stämmen von Propionibakterien eine signifikante Vergrößerung der Milz am' 4. Tag nach der Injektion mit weiterer Vergrößerung der Milzmasse an den Tagen 6 bis 14. Diese Milzvergrößerung spiegelt die Stimulierung des retikuloendothelischen Systems wieder und läuft parallel zur Antituniorwirksamkeit dieser Immunostimulato-j ren.
P.granulosum führte zu einer Regression von mehr als 70 % bei den untersuchten Sarcoma 180-Tumoren, wenn es intrttumoral verab reicht worden war.
i3. In vivo cytostatische Wirksamkeit bei Murine Tumorzellen durch ; Propionibakterium granulosum
In einer weiteren Untersuchung wurde die cytastatische Wirkung von Propionibakteriura granulosum Stamm KP 45 bei Sarcoma L-1 bei BALB/c-Mäusen (Lunge) untersucht. Auch hier ergab sich eine signifikante Wirksamkeit im Vergleich zu unbehandelten Tieren,,
Antibakteriell Wirkung als Zusatzbehandlung bei der Chemotherapie primärer oder sekundärer Lungentumore
30 Patienten mit primären oder sekundären metastatischen Lungentumoren wurden für diesen Test gewählt. 10 der Patienten erhielten intravenöse Infusionen von 30 mg P.granulosum in 100 ml intravenöser Infusionslösung. Die anderen 20 Patienten dienten zur Kontrolle.
Sämtliche Patienten wurden chemotherapeutisch zur Synchronisierung der Proliferation neoplastischer Zellen behandelt. Jeder Kurs dauerte 3 Tage: 1. Tag: Vincristine 1,5 mg intravenös um
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8 Uhr und um 20 Uhr, 2.Tag: Methotrexate 25 mg intramuskulär um 20 Uhr, 3. Tag: Methotrexate 25 mg intramuskulär um 8 Uhr, gefolgt von Methotrexate intravenös zu 25 mg um 14 Uhr und Infusion von 30 mg/kg Cyclophosphamid zur selben Zeit.
Diese chemotherapeutische Behandlung wurde dreimal alle 21 Tage wiederholt.
Die gesamte Chemotherapie bestand aus den drei obigen Zyklen, die jeweils am 1., 22. und 43. Tag der Beobachtung begannen.
Während des 3., 10., 31. und 52. Beobachtungstag wurde P.granulosum in einer Dosis von 30 mg/100 ml intravenöser Infusionslösung im Verlauf von 15 Minuten verabreicht (am letzten Tag des ersten chemotherapeutischen Zyklus und dann 1 Woche nach Beendigung eines jeden Zyklus).
Bei den nur chemotherapeutisch behandelten Patienten traten fünf Fälle bakterieller Infektionen auf (drei Pneumoniaen, eine Sepsis und 1 Fall von Angina Tonsillaris) während einer 60-tägigen Beobachtungszeit, während bei den 10 mit Chemotherapie und intravenösen Infusionen von P.granulosum behandel ten Patienten keine Symptome bakterieller Infektionen auftraten. Dieser Unterschied ist als statistisch signifikant zu bezeichnen.
Die Toleranz der Patienten gegenüber intravenösen Infusionen von P.granulosum Stamm KP 45 war gut. Während der Infusion in einer Menge von 30 mg P.granulosum traten zwar Kältegefühle und anschließend Fieber bis zu 390C (2 bis 12 Stunden nach der Infusion) auf, am nachfolgenden Tag waren jedoch diese Nebenwirkungen nicht mehr festzustellen. Wiederholte Infusionet von P.granulosum führten nicht zur Entwicklung einer verzögerten Hypersensitivitat während der 60-tägigen Beobachtung. Daraus wird der Schluß gezogen, daß die intravenöse
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301H61
Infusion von 30 bis 240 mg P.granulosum Stamm KP 45 ohne i Risiko ernster Nebenwirkungen oder Komplikationen bei Patienten vorgenommen werden kann.
5. Al!gemeine Anweisung zur lokalen Verabreichung (Magen- und
Darmkrebs)
Man suspendiert 10 mg lyophilisiertes Produkt in 1 ml 1 % \ Xylocain in Kochsalzlösung und injiziert intratumoral durch \ die Haut (Durchmesser 1 mm), wobei eine 80 cm lange, steife : Polyäthylenableitung mit fest angeordneter intramuskulärer \ Nadel (18 Gauge) ohne Epiphyse verwendet wird. Die Ableitung j wird durch einen bioptischen Kanal in einem Endoskop (Gastrofiberoskop oder Colonoskop) eingeführt, wobei der unter
visueller Kontrolle befindliche neoplastische Tumor punktiert und die Nadel 0,5 bis 1 cm in das Tumorgewebe eingeführt wird. Das Produkt wird durch die Ableitung injiziert, und man i spült mit 1 bis 2 ml 1 %-igem Xylocain in Kochsalzlösung. j
Die intratumorale Injektionen (jeweils 10 mg Produkt) werden! beispielsweise während der ersten drei Tage, dann am 10. und ! am 17. Tag der Beobachtung verabreicht, i
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■It-
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Claims (12)

Patentansprüche
1. Veru/endung von Propionibacterium granulosum» Propionibacterium avidum und/oder Propionibacterium acnes zur Herstellung ι von Zellwandpräparaten oder Ganzzellenpräparaten in der ί Radio- oder Chemotherapie von Tumoren.
2. Verwendung nach Anspruch 1 von Propionibacterium granulosum.
3. Verwendung nach Anspruch 1 von Propionibacterium avidum.
4. Verwendung von Prop jonibacterium granulosum Stamm KP 45.
5. Verwendung von Propionibacterium avidum Stamm KP 40.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung von injizierbaren Suspensionen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung von Suspensionen von Ganzzellen oder Zellwänden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 0,5 bis 50 mg aktivem Material pro ml Lösung.
8. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung von intraperitoneal, intravenös odor intratumoral applizierbaren Suspension (3 η von Ganzzellen oder Zellwänden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in der Therapie von Tumoren.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Zellmaterial 0,5 bis 50 mg/ml Lösung ausmacht.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung antibakteriell wirksamer Zellwandpräparate oder Ganzzellenprärate als Zusatzbehandlung bei der Radio- oder Chemotherapie von Tumoren.
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-Z-
301H61
11. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Na2HP04/KH2P04-Phosphatpuf fer mit pH 7,2 verwendet.
12. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine injizierbare Suspension von abgetöteten Ganzzellen oder Zellwänden in einer Menge von 0,5 bis 50 mg/ml Lösung an Zellmaterial in einer Kochsalzlösung mit Na2HP04/KH2P04-Puffer mit pH 7,2 herstellt.
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