DD160179A1

DD160179A1 - Verfahren zur herstellung von zellwandpraeparaten

Info

Publication number: DD160179A1
Authority: DD
Publication date: 1983-05-11

Abstract

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Zellwandpraeparaten aus Propionibakterien. Diese Praeparate koennen bei der Tumorbehandlung sowie bei der Radio- oder Chemotherapie von Tumoren eingesetzt werden. Ziel der Erfindung ist es, die bei Praeparaten aus Coryneformen auftretenden unerwuenschten Nebenwirkungen und Komplikationen zu vermeiden. Erfindungsaufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Zellwandpraeparaten oder Ganzzellpraeparaten von Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum und/oder Propionibacterium acnes, bei dem die Fluessigkeitskultur des jeweiligen Propionibacteriums unter anaeroben Bedingungen nach dem Gas-Pak-Verfahren behandelt wird, die Anzuechtung mit Propionibacterium beimpft, bebruetet, abgetrennt und gewaschen wird, gegebenenfalls das Sediment zerschlagen wird, mit Phosphatpuffer bei pH 7,2 behandelt wird, die autolytischen Enzyme inaktiviert werden, die erhaltenen Zellwaende inkubiert mit Trypsin, abzentrifugiert, gewaschen und gefriergetrocknet werden. Die neuen Praeparate erhoehen die Strahlenvertraeglichkeit von Patienten erheblich.

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Propionibakterien« Sie betrifft insbesondere den Einsatz von Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum und/oder Propionibacterium acnes zur Herstellung von Zellwandpräparaten oder Ganzzellenpräparaten, die in der Tumorbehandlung sowie bei der Radio» oder Chemotherapie von Tumoren brauchbar sind.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bekannt sind Präparationen anaerober Coryneformen, beispielsweise C-Parvuin, CN 6134_} die als Antitumormittel be~ schrieben werden» Es hat sich Jedoch herausgestellt, daß diese Präparationen bei systemischer oder lokaler Therapie zu unerwünschten Nebenwirkungen und Komplikationen führen, so daß in der Literatur empfohlen wird, Dosen von mehr als 7,5 mg/m Oberfläche zu vermeiden· Diese Menge entspräche ungefähr einer Menge von 20 mg pro Patient»

Ziel der Erfindung

Ziel.der Erfindung, ist. es, diese Nachteile auszuräumen»

P-aXlggIfflg-.AeS-.Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Ver~ fahren zur Herstellung von Zellwandpräparaten oder Ganzzellpräparaten der Oo gc Propionibakterien bereitzustellen^

59 018 12

7 J j S H^ ι Jr "" 2 "·

4.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Präparate auf der Grundlage von abgetöteten ganzen Zellen oder Zeilwänden von Propionibakterien bei der Chemotherapie oder Radiotherapie von Tumoren außerordentlich wirksam sind* Insbesondere sind diese Präparate zur unterstützenden Therapie geeignet«, Die Wirksamkeit ist bei lokaler Verabreichung besonders groß«

So hat sich durch Versuche gezeigt_s daß P· acnes, P· granulösem und P« avidum bei intraperitonealer Injektion bei Mäusen in einer Dosis von 1,5 mg pro Maus die Überlebenszeit letal (850 R) bestrahlter Mäuse signifikant verlängern, wobei P« granulosum am wirksamsten ist* Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Präparate zur Stimulierung der CPU-S Proliferation, d« tu zur Stimulierung einer Wanderung von hämatopoetisehen koloniebildenden Einheiten aus dem Knochenmark zum Eintritt in ^e den Zellzyklus und zur Wanderung zum peripheren Blut, geeignet sindo In der klinischen Praxis bedeutet dieser Befund, daß die erfindungsgemäßen Präparate als Zusatztherapie bei der Radiotherapie von Tumoren wertvoll sind, da sie die Strahlenverträglichkeit der Patienten wesentlich erhöhen«,

Darüber hinaus wurde in Untersuchungen festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Präparate gegen.murine Sarcoma 180 bei Mäusen wirksam sind und zu einer Regression von mehr als 70 % der Sarcoma 180-Tumoren führen, -wenn intratumoral. appllziert wurde« ^; ·· · ·

Es'wurde auch festgestellt, daß die erfindungsgemäß herge~ stellten Präparate bei systemischer Verabreichung an Patienten mit primären oder sekundären Lungentumoren als Zusatzbehandlung zur Chemotherapie eine der Hauptkomplikationen

231 193 2

59 018 12 - 3 -

der Chemotherapie von Tumoren vermeiden helfen, nämlich die Infektionsgefahr· Es hat sich somit ergeben, daß die erfindungsgemäß hergestellten Präparate als ausgezeichnete antibakteriell wirksame Zusatzbehandlungsmittel bei der Chemotherapie des Krebses eingesetzt werden können·

Die vorstehenden Ergebnisse, die nachfolgend durch Angabe einiger in vivo-Versuche belegt sind, müssen in jeder Hinsicht als unerwartet gewertet werden»

Bei dieser Art von Präparaten ist die Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen besonders gering. Zellwandpräparate wurden nach dem Stand der Technik bisher noch nicht klinisch untersucht ·

Gegenstand der Erfindung ist somit die Herstellung von Zellwandpräparaten oder Ganzzellpräparaten von Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum und/oder Propionibacterium acnes, die in der Radio- oder Chemotherapie von Tumoren nützlich sein können·

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Zellwandpräparaten oder Ganz-Zellenpräparaten von Propionium«· bacterium granulosum, Propionibacterium avidum und/oder Propionibacterium acnes zur Anwendung in der Radio- oder .Chemotherapie von Tumoren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigkeitskultur des jeweiligen Propionibacteriums unter anaeroben Bedingungen nach Gas-Pak-Verfahren behandelt, diese Massenanzüchtung mit einer dicken Ausschwemmung von · Propionibacterium beimpft, nach Bebrütung die Zellen durch Kühlzentrifugieren abtrennt," das Sediment mit destilliertem Wasser wäscht und gewünschtenfalls anschließend mit. Glasperlen in einer Zellmühle zerschlägt, nach einer mikroskopischen Kontrolle, wonach keine .Ganzzellen mehr vorhanden sind, die Glasperlen mit einer Glasfritte unter Verwen-

dung von Phosphatpuffern bei einem pH-Wert von 7,2 vom Homogenisat abtrennt, die milchige Suspension enthaltend Zellwände und Cytoplasmen abzentrifugiert, das Sediment in Phosphatpüffem bei einem pH-Wert von 7,2 aufnimmt, die automatischen Enzyme durch Kochen inaktiviert, die proteinhaltigen gewonnenen Zellwände durch Inkubation mit einer Trypsinsuspension und Toluol weiter reinigt, die durch triptische Verdauung gereinigten Zellwände abzentrifugiert, mit destilliertem Wasser wäscht und dann gefriertrocknet*

Vorzugsweise wird das Gas-Pak-Verfahren bei 37 C durchgeführt, liegt die Bebrütungszeit bei 72 Stunden und 37 °C und erfolgt die Zerschlagung der Zellen in der Zellmühle mit dem doppelten Volumen Glasperlen während 1 bis 2 Stunaen_e Dabei werden vorteilhaft Glasperlen mit 0,17 bis 0,18 mm Durchmesser eingesetzte

Bs ist weiterhin vorteilhaft, daß die gewonnenen Zellwände einer Inkubation bei 37 ⁰C Temperatur während 24 Stunden unterworfen werden, daß das Trypsin in einer 0,5 mg/ml Suspension verwendet wird und das zugesetzte Toluol 1 ml auf 100 ml Aufschwemmung beträgt, daß das verwendete Propionibacterium ein Propionibacterium granule· sum Stamm 45 ist und daß das verwendete Propionibacterium avidum Stamm kp 40 istc

Vorzugsweise ist das Medium für die Massenanzüchtung eine a-Bpuillon.mit folgender Zusammensetzung: . " .

. bacto casitone '12g .

bacto yeast extract 12g KH₂PO₄ 4g

. .. MgSO₄.7H₂O 1g.

Glukose 4g

Aqua .-dest· ad 1000 ml, pH 7_}2 für a-Agar + 28 g bacto agar«

j- 59 018 12

Der Phosphatpuffer wird mit

M Na₂HPO₄*2H₂O und ¹/15 M KH₂PO₄ je in 1000 ml Aqua dest. gelöst 612 g der sekundären Uatriumphosphatlösung mit 388 g der primären Kaliumphosphatlösung vermischt pH-Wert auf 7,2 eingestellt

vorbereitet«

Uach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Propionibacterium granulosum und Propionibacterium avidum, insbesondere Propionibacterium granulosum-Stamm KP 45 und Propionibacterium avidum~Stamm KP 40, verwendet·

Es ist bevorzugt, injizierbare Suspensionen in phosphat« gepufferter Kochsalzlösung herzustellen. Hierbei ist eine Konzentration von 0,5 bis 50 mg aktives Material pro ml

23,10.1981 ^ £ . VVP A 61 K/231 193/2

1 1 9 3 2- "-^" ^{59 οΐ8}/ΐ2

Lösung besonders zweckmäßig* Bevorzugt ist eine Konzentration von 2 bis 12 mg/ml Lösung, insbesondere von 5 bis 7j,5 mg/ml Lösung_e

Besonders geeignet sind intravenöse Infusionslösungen, die in 100 ml Lösung 15 bis 30 mg des Präparates enthalten« Eine derartige Dosismengo hat sich als besonders vorteilhaft zur Verabreichung bei der Behandlung primärer und sekundärer Lungenneoplasmen erwiesen _t wobei eine erste Injektion mindestens 10 Tage vor der chemotherapeutischen Behandlung erfolgen sollte«

Als Phosphatpuffer verwendet man zweckmäßig einen NaoHPO^/KHpPO^-Phosphatpuffor, der zweckmäßig einen pH von etwa 7,2 aufweist«

Die Erfindung ist nicht auf einen speziellen Propionibacterium-Stamm beschränkt«. In Betracht kommen verschiedene Propionibacterien-»Stämme_# beispielsweise die in FEMS Microbiology Letters, Band 2_t Nr, l_t DuIi 1977, Seiten 5 bis 9* beschriebenen Propionibakterien_{,

Die Stämme P» granulosum KP 45 und P* avidum KP 40 sind besonders bevorzugt,, Sie wurden bei der DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen _t Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH* Grisebachst.raße 8y D-3400 Göttingen, Deutschland mit den DSM-Auf nahmenummern 1773 fur F%., ' .-.-. granulosum KP 45 und 1772 für P₉ avidum KP 40 mit. dem Eingangsdatum vom 11_β03_ο1980 hinterlegt« Beide Stämme sind bei der DSM in Obereinstimmung mit der durch den Hinterleger bei der DSM und beim Deutschen Patentamt vorzulegenden Freigabearklärung (z_e Z_c Formblatt P_e 2750) erhältlich.

23,10,1981

VVP A 01 Κ/231 193/2

59 018/12

P. granulosum, Ρ» acnes und P* avidum lassen sich Im übrigen aus Abstrichen aus Acne Ef fluoreszenzen (Acne vulgaris, Acne papulopustulosa und Acne conclobata) isolieren und züchten. Zur Taxonomie vgl. Der Hautarzt, 30, 242 bis 267 (1979),

Weitere Propionbakterien-Stämme, die für die erfindungsgemäße Verwendung in Betracht kommen, sind beispielsweise in Applied Microbiology, Februar 1973, Seiten 222 bis 229, der American Society for Microbiology_r Band 25, Ni% 2, beschriebene

-jr-

Charakterisierung der Propionibakterien

23*10*1981

WP A 61 K/231 193/2 59 018/12

Herkunft

Species

Saccha

Biochemische Reaktionen (Lit

Sor

Mannit

SaIi-

Ino

. D

In-

Ni

Ge

Dex

MeIi-

Stamm

rose

Mal

bit

cin

sit

ÄSC U-

dol

trat

la

trin

zi-

Nr,

tose

lin-

tin

tose

Hydro-

Abstrich

P„g.ranu-

•Mi

mm

4M

lyse

mm

+

KP 45

von einer

Io sum

-5·

Wundin

fektion

genommen

P^avi«

+

KP 40

aus Prä*

dum

*

+ +

putium-

raum

ein'es

klinisch

Gesunden

23,10.1981

WP A 61 K/231 193/2

59 018/12

(Fort	setzung)	Species	P«acnes KB	Seriologie I	nulosun D34	Lit,	2)	Phagenlysotypie (Lit. 3)
Stamm Nr*	Herkunft	P,,granu~ . losum ·		P. gre 95	mm	y ρ 58	„avidur 0575	Köl.♦*,,„; Köl3
KP 45	Abstrich von einer Wundin fektion	P„avi- dunr ·.		+				NT
KP 40	genommen aus Pra- putium- raum eines kli nisch Ge sunden			+		NT

η 31

NT » nicht typisierbar

1) G_e Pulverer and H. L₁. Ko

Fermentative and Serological Studies on Pröpidnibacterium acnes und App„ Microb_#, 25, 222-229, 1973 ""

2) U, Höffler, H_# LV Ko and G, Pulverer

Serotyping of Propionibacterium acnes and related microbial species» Ferns Microbiology letters. Vol. 2_t 5-9, 1977

3) E. C, dong, H, L_? Ko and G₀ Pulverer Studies on Bacteriophages of P, acnes

Med. Microbiol. Immunol. 161, 263-271, 1975

Der Hautarzt, 30, 242-247 (1979)

Differenzierung unterschiedlicher Propionibakterienspezie aus Acnevulgaris-Effluoreszenzen

23,10*1981

9^ «, y/5 ^{wp A} 61 K/231 193/2

«*% *J ·/<£/ Λ £ 59 018/1.2

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Herstellung erfindungsgemäßer Präparate«,

Die Flüssigkeitekultur des Jeweiligen Propionbakteriums wurde in 1 Liter (Erlenmeyerkolben) bei 37 ⁰C unter anat ben Bedingungen durchgeführt (Gas-Pak-Verfahren, B3L)«,

•4·

Für diese Massenanzüchtung wurde das Medium (A~8ouillon oder Triptic soy broth, Difco) mit einer dicken Aufschwemmung von Propionibaktorium beimpft. Die Impf "»Aufschwemmung wurde durch Verreiben einer dreitägigen A-Agarkultur von Propionic bakterium in 10 ml Bouillon hergestellte Nach einer Bebrütungszeit von 72 Stunden bei 37 C wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 10 000 g (20 Min_e) in einer Sorval R2«=I<ühlzentrifuge von der Flüssigkeit abgetrennte Das Sediment wurde dreimal mit Aqua dest* gewaschen und anschließend mit dem doppelten Volumen Glasperlen ($3 0,17 bis 0,18 mm) gemischt und in einer Zellmühle 1 bis 1,5 Stunden lang zerschlagen«, Nachdem durch eine mikroskopische Kontrolle (Gr.am~Präparat) geprüft worden war, daß keine ganzen Zellen mehr vorhanden sind, wurden die Glasperlen mit einer G">1~Fritte unter Verwendung von'.Phosphatpuffer (pH 7^2) vom Homogenisat abgetrennt»

Die milchige Suspension (enthielt Zellwände und Cytoplasmen) wurde 20'Min. bei 40 000 g"-ab'zehtrifugiert, und das Sediment

23,10,1981

- WP A 61 K/231 193/2

· 59 018/12

wurde in Phosphatpuffer (pH 7,2) aufgenommen. Die autolytischen Enzyme wurden durch 10 Min» Kochen im Wasserbad inaktiviert.

Diese noch Protein-haltigen Zellvvände wurden durch Inkubation bei 37 °C 24 Stunden lang mit Trypsin (Merck, 0,5 mg/ml Suspension) und 1 ml Toluol auf.100 ml Aufschwemmung (zur Verhinderung von Bakterienwachstum) weiter gereinigt.

Die durch tryptische Verdauung gereinigten Zellwände wurden schließlich bei 40 000 g abzentrifugiert (30 Min*) und 3mal mit Aqua dest» gewaschen^ dann gefriergetrocknet·

A~Bouillon:	12	4	9
Bacto Casitone	Bacto yeast extract 12	1	g
	KH₂PO₄	4	9
MgSO₄, 7 H₂O	ml,	g
Glukose	3acto	9
Aqua dest, ad 1000		pH 7,2
Für A-Agar + 28 g E		Agar»
Phosphatpuffer:

1/15 M TJa₂HPO₄. 2 H₃O und

1/15 M KH₂PO₄ wurden je in.1000 ml Aqua dest, gelöst; 612 g der sekundären Natriumphosphatlösung wurden mit 388 g der primären Kaliumphosphatlösung vermischt, und der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt,

+++) Zellmühle: Vibrogen-Zellmühle vi 3, .Edmund .Bühler, 7400 Tübingen,

23,3.0*1981

42_ WP A 61 K/231 193/2

£8*- 59 018/12

Herstellung von Suspensionen von Ρ_β acnes (Stamm AiCC 6919), P₀ avidum (Stamm 0575, KP 40) und P₀ qranulosum (Stamm

Nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 lyophilisierte Propionibakterien der genannten Art werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung der vorstehend genannten Art in einer Konzentration von 5,0 bzw_e 7,5 mg/ml suspendiert * Die erhaltene Suspension ist insbesondere zur intraperitonealen Injektion geeignet«

Beispiel 3

to iH'lfci^ ni'^ffcii Il ι in ί atm- ~"Ff ι Γι ι f ' » Wl

Unter Anwendung der Arbeitsweise des Beispiels 2 werden intraperitoneal injizierbare Suspensionen von P* granulosum-Stamra KP 45« 95 K_f P₃ acnes-Sfamm ATCC 6919 und P_ß avidum-Stamm 0575_# KP 40 aus lyophilisiertem Material mit einer Konzentration von 5 bzw* 7,5 mg/ml Zellmaterial hergestellt,

Herstellunq iniizierbarer Suspensionen zur Zusatzbehandlunq

Ρ»'granulosum-Stamm KP 45 wird nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 aufbereitet« Man stellt eine Suspension von 30 mg Zellmaterial· in 100 ml Irif us ion si ö sung zur intravenösen Verabreichung her_e

Die erfindungsgemäßen Präparate können übliche Zusatzstoffe enthalten« Die Präparate können in Ampullenform vorliegen

23,10,1981 WP A 61 K/231 193/2 11Q*3 7 - jüf - - 59 018/12

oder in sterilen Flaschen mit Durchstechverschluß abgefüllt sein. Auch Konfektionierungen mit getrennter Aufbewahrung der Bestandteile zur Zubereitung im Augenblick der Applikation kommen in Betracht,

Untersuchungen in vivo

1, H§moppese,bei mit Propionibakterien behandelten Mäusen letaler Bestrahlung

Es wurden drei Stämme von Propionibakterien (P, acnes,_; P, granulosum und P. avidum) in einer Dosis von jeweils 1,5 mg pro Maus intraperitoneal bei letal bestrahlten Mäusen (850 R) injiziert. Hierbei ergab sich, daß P, granulosum die Überlebenszeit der bestrahlten Mäuse am meisten verlängerte*

Es Vv'urden erwachsene, 8 Wochen alte männliche Swiss-Mäuse verwendet* Die Tiere wurden mit einer Standarddiät gefüttert, Wasser war ad libidum zur Verfügung, Das Wasser und das Futter wurdon sterilisiert. Das Wasser enthielt Oxytetracyclin (1 g pro 1000 ml),

Bestrahluncj: Die Mäuse wurden in einem rotierenden Metacrylatkäfig (10 Mäuse pro.Käfig) in einer Entfernung von 50 cm von der THX 250 Medicor-Einheit, die bei 200 kV betrieben wurde und mit einem 0,5 mnr Cu^Filter versehen war, mit 650 bzw₉ 850 R bestrahlt. Die ße~ Strahlungsrate von ungefähr 75 R pro Minute wurde mit einem CT-I Thermolumineszenz R-Dosimeter.bestimmt*

23.10,1981

WP A 61 K/231 193/2

Für die Experimente wurden Ρ« acnes~Stamm ATCC 6919, P* avid um·» St a mm 0575, KP 40 und P_e granulosum«Stamm KP 45 in Form abgetöteter Ganzzellen und in Form von Zellwänden verwendet« Man suspendierte die lyophilisierten Propioni~ bakterien in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung in einer Konzentration von 7,5 mg/ml und injizierte 0,2 ml der Suspension intraperitoneal (1,5 mg pro Maus)»

Z_t 2 bzw* 1 Tag vor der Transplantation von Knochenmark wurden Donor-Mäusen 1,5 mg P_e granulosum injiziert« Die Knochenmark-Zellsuspension wurde hergestellt, indem man beide Oberschenkelknochen mit sterilem Parken-Medium spülte»

5 Die Zellen wurden in einem Hämocytometer gezählt * 5 χ 10 vermehrungsfähige Zellen in 0_#2 ml Parker-Medium wurden jeder Maus in die Schwanzvene injiziert» welche 4 Stunden vor der Knochenmarktransplantation mit 850 R bestrahlt worden war„Den Kontrollmäusen wurden 0,2 ml Medium oder

5 κ 10 Knochenmarkzellen von normalen Mäusen (nicht mit P« granulosum behandelt) injiziert₀ Einer anderen Gruppe von Donor-Mäusen wurde Ρ_Φ granulosum wie zuvor verabreicht, dann wurden die Tiere mit Äther anästhesiert, und aus dein retrobulbaren Plexus wurde Blut entnommen« Die Blutzellen wurden im Hämocytometer gezählt, und aliquote Anteile Blut mit 5 χ 10 nucleierten Zellen wurden in die Schwanzvene von mit 850 R bestrahlten Mäusen injizierte Die Kon-, trollmäuse erhielten gleiche Volumina Blut, "das' von normalen Mäusen (nicht mit P« granulosum behandelt) entnommen worden. war* Alle Mäuse wurden 9 Tage nach der Transplantation von Blut bzw* Knochenmark getötet und gewogen, die Milz wurde entnommen _e es wurde wiederum, gewogen _t und die Anzahl

23,10,1981

A jjr WP A 61 K/231 193/2

I I M *l jP μ 1<^ — RQ 01R/1P

Kolonien pro Milz wurde nach Fixierung in Chloroform : Äthanol (1 : 3) bestimmt.

Untersuchung der endogenen Milzkolonien

3, 2 bzw« 1 oder 0 Tage vor der Bestrahlung mit 650 R wurden Mäuse intraperitoneal mit P, granulosum injiziert. Die Kontrollmäuse erhielten gleiche Volumina an PBS (Pbosphat-gepufferte Kochsalzlösung), 9 Tage nach der Bestrahlung wurden die Tiere getötet, die Milzen wurden entfernt und gewogen_e und die Kolonien wurden wie beim vorstehenden Test zur Bestimmung der exogenen Milzkolonien gezählt,

0be riebeηst est

Mäuse wurden in 7 Gruppen aufgeteilt, wobei jeweils 15 Mäuse pro Gruppe vorlagen und mit 850 R Röntgenstrahlen bestrahlt wurden« 4 Stunden nach der Bestrahlung wurdm den Tieren Propionibakterienzellwände oder ganze Zellen injiziert. Die Kontrollmäuse erhielten gleiche Volumina an PBS, Die Anzahl aer überlebenden Tiere in jeder Gruppe wurde ab dem 10» Tag nach der Bestrahlung gezählt©

Für die statistische Analyse wurde der Student t-Test angewendet«

Γη der anliegenden Figur 1 ist die Wirkung deruntersuch- ' ten Propionibakterien auf die Oberlebensrate der letal bestrahlten Mäuse graphisch dargestellt. Alle drei Stämme von Propionibakterien führten im Vergleich zu den Kontrolltieren zu einer signifikanten Verlängerung der Überlebensspanne, P» granulosum erwies sich in Form des Ganzzellen-

23« 10 <, 1981 WP A 61 Κ/231 193/2 S L· ~ I* ~ ⁵⁹ 018/12

Präparates und in Form des Zellvvandpräparates wirksamer als P₉ acnes und P« avidum«

Einfluß von P_e qranulosura auf endogene Milzkolonien (Stamm KP 45)

23.10.1981

VVP A 61 K/231 193/2

59 018/12

TABELLE I

Anzahl endogenor Milzkolonien bei Mäusen, die mit. Propionic bacterium granulosum behandelt wurden (Stamm KP 45) (Mittelwert + Standardabvveichung)

	R/	Tage	vor	relatives Milzgevvicht	Anzahl endo gener Milz~ kolonien	* 0,67 .
Kontrolle/650	" ³	Tage	vor	1,82 + 0,45	1,24	+ 4,45^X
P₄, granulosum Bestrahlung	- 2	Tag	vor	1,66 + 0,24	10,6	£ 3,49^X
P, granulosum Bestrahlung	- 1	Std,	nach	1,73 + 0,21	8,17	t 5,30^X
P«, granulosum Bestrahlung	- 4		2,18 + 0,42	11,2	i 4,70^X
P. granulosum Bestrahlung			2,32 * 0,38	14,1

0,01

Das relative Milzgevvicht der bestrahlten Mäuse nahm nur dann zu, wenn P« granulosum 1 Tag vor oder 4 Stunden nach der Bestrahlung mit 650 R verabreicht wurde. Oedoch nahm die Anzahl exogener Milzkolonien bei sämtlichen Behandlungen signifikant zu. .

Wirkung von P_n granulosum,. auf die BiIdUnCi₁ exogener Milz-, kolonien (Stamm KP 45)

23*10,1981

WP A 51 K/231 193/2

59 018/12

Anzahl'exooener Kolonien nach Transfusion von Knochenmark von

mit' P« qränulosum behandelten Mäusen (Stamm.KP 45)	(Mitteller	die 3 Tage P^granulosunj	te	* Standardab't	,99 + 0,19	velchung)	0,32	CFU-S pro 10° nucleierte Knochen·» markzellen
		die 2 Tage P^granulosum	relatives Milzgewicht	,52 + 0,31		2,14	11,2 +3,2
Transfusion '	Kontrolle (O₅5 ml Parker-Medium)	die 1 Tag P^granulosum	0,	,52 + 0,49		1,87^X	204,0 * 21,4
Knochenmark von normalen Mäusen	1,	,75 + 0,44	Anzahl exogener Milzkolonien	4,4^K	103^0 + 18,7^X
Knochenmark von Mäusen, vor der Transfusion mit behandelt worden-.waren	J-J	_f69 + 0,27	1,12 +	4,3^X	116,0 + 44,2^X
Knochenmark von Mäusen, vor der Transfusion mit behandelt worden ,waren	I₁	20,4 +		107,0 + 43,3^X
Knochenmark von Mäusen, vor der Transfusion mit behandelt worden waren	1	10,3 +
11,6 +
10,7 +

ρ < 0_#01

23,'1O«1981

2_y/> WP A 61 Κ/231 193/2

2 4$

- ^r- 59 Ο18/12

Es wurden keine Unterschiede beim relativen Milzgewicht zwischen Mäusen, welche mit normalem Knochenmark transplantiert waren, und Mäusen, die mit dem Knochenmark von mit P_e granulosum 2, 3 oder 1 Tage vor der Transplantation behandelten Donor-Tieren transplantiert waren, festgestellt. Diese Behandlung führte zu einer signifikanten Abnahme der Anzahl exogener Milzkolonien bei mit 850 R bestrahlten Tieren, im Vergleich zu Tieren, denen Knochenmark von unbehandelten Donor-Tieren gegeben worden war» Dieser Befund zeigt eine Abnahme der Anzahl von CFU-S im Knochenmark von mit P» granulosum hehandelten Mäusen an» Andererseits führte eine Injektion von Blut von Mäusen, welche mit P„ granulosum behandelt worden waren, an letal bestrahlte Versuchstiere zu einer signifikanten Zunahme der Werte der relativen Milzgewichte und der Anzahl Milzkolonien im Vergleich zur Injektion von Blut aus unbehandelten Donor-Tieren, wie der nachstehenden Tabelle III zu entnehmen ist:

VVP A 61 Κ/231 193/2

59 018/12

TABELLE III

Anzahl exociener Milzkolonien nach Transfusion von Blut von mit

Hl mi TlHJiIlI I1ITTII Π' " 'ι »1 Il ' Γ*—IIHl IIIl I I —ΤΤΓ— [ »

^^ (Stamm KP

	(Mittelwerte * Standardabweichungen)	relatives Milz gewicht	Anzahl exoge ner Milz kolonien	CFU-S pro 10⁵ nucle- ierte Kno chenmark zellen
Transfusion	Leukocytose beim transfundierten Blut	1,41 + 0,23	3,8 + 2,2	1,17 + 0,28
Blut von normalen Mäusen	6480	2,62 + 0,88*		1,84 + 0,3l^X
Blut von Mäusen,, die¹ 3 Tage vor der Transfusion mit P_egranulosum behandelt waren	9960	3,45 + 1,81^X	10_a2 + 2₄6^X	2,01 + 0,34^X
Blut von Mäusen, die 2 Tage vor derTransfusion mit, P»granulosurn behandelt waren	10120	3,23 + 1,4S^X	7,4 + 1,-8^XX	1,54 + 0,2^^X
Blut von Mäusen,, die-.'l Tag vor der Transfusion mit P_egranulosum behandelt waren	9650

^x - ρ < O,Ol

^XX. - p< O₈ 05

23*10.1981

^{wp A 61K/231193/2}

59 018/12

Am wirksamsten bei der Stimulierung der Milzkoloniebildung war Blut, das von Donor-Mäusen entnommen war, die zwei oder drei Tage vor der Bluttransfusion mit P, granulosurn injiziert worden waren. Die Leukocytose bei transplantiertem Blut wurde jedoch nach der Behandlung mit P. granulosum 3, 2 oder 1 Tag vor der Blutentnahme erhöht»

In den vorstehenden Experimenten erwies sich P« granulosum als wirksamstes Agens bei letal bestrahlten Ratten« Der tödliche Effekt der letalen Dosis von Röntgenstrahlen ist das Ergebnis der Inhibierung der proliferativen Fähigkeit der hämopoetischen Stammzellen und der Schädigung der Epithelzellen der inneren Organe mit anschließender Entwicklung generalisierter Infektionen durch saprophytische Bakterien_e Allerdings zeigt es sich beim vorstehenden Experiment, daß die mit Propionibakterien behandelten Mäuse keine Symptome von Diarrhöe und/oder Blutungen aus dem Verdauungstrakt aufwiesen* Daher läßt sich die Schutzwirkung der Propionibakterien einer verstärkten Erholung uer hämopoetischen Stammzellen des Knochenmarks nach der Bestrahlung zuschreiben,

2, Wirksamkeit ..von P« cjranuloeum,_ P _a aenes und P, avidum experimentellem Murine Sarcoma 180-Tumor bei Hausen

Alle drei zuvor genannten Propionibakterien wurden intra- ·". peritoneal oderfintratumoral -in mehreren Dosen zu jeweils : 1 mg pro .Maus appliziert und erwiesen sich als wirksam bei der Retardation des Wachstums und der Stimulierung der Regression von Sarcoma 180 bei CFIV-Mäusen, Darüber hinaus ergab die Applikation von Propionibakterien eine Verlängerung des Oberlebens von Mäusen mit Sarcoma 180,

23,10,1981

WP A 61 K/231 193/2

59 018/12

Eingesetzte Propionibakterien

Für die Experimente wurde Propionibacterium granuloGum-Stamm KP 45 (aus Wundinfektion im Hygiene-Institut der Universität Köln isoliert), Propionibacterium acnes-Stamm 6919 (ATCC), Propionibacterium avidum-Stamm 0575 (C, S₀ Cummins^ Anaerobe Labs, Virginia Polytechnic Inst, and State University, Blackburg), KP 40 verwendet. Die genannten Propionibakterien wurden lyophilisiert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einer Konzentration von 5 mg/ml suspendierte 0_t2 ml der Suspension wurden den Tumor tragenden Mäusen intraperitoneal oder intratumoral verabreichte

Tumor traqende Mäuse

Bei diesem Tumor sys tem wurden erwachsene männliche CFVt'-Mäuss eingesetzt» Die Tumoren wurden wie in Radio Sei«,, 12, (1978)t Seiten 185 bis 189, beschrieben induziert» Hierzu wurden Sarcoma 180-Tumoren von Donor-Mäusen seziert, Tumorgewebe wurde zerhackt _t trypsinisiert (0_s25 % Trypsin, 15 Minuten bei 37 C) und filtrierte Die Anzahl Zellen wurde gezählt und pro 1 ml Kochsalzlösung auf 10 vermehrungsfähige Zellen eingestellt« 0^1 ml der Suspension wurde •subkutan intraskapular injiziert« Diese Arbeitsweise führte zur Entwicklung fühlbarer Tumoren nach ungefähr 4 bis 5· Tagen., Ein schnelles Wachsirum der Tumoren, erfolgte'. zvvi- ; .. sehen dem 4» und dem 14«, Tag nach der Transplantation, wobei/der letale Effekt zwischen dem 20«, und 28_e Tag auftrats

23,10.1981 WP A 61 K/231 193/2 119 3 2 ~2Z * 59 018/12

Insgesamt 225 männliche CFW-Mäuse wurden bei den Untersuchungen verwendet» Bei den Oberlebenstests wurden 105 Mäuse in sieben Gruppen (15 Mäuse je Gruppe) aufgeteilt, und dio Tiere der experimentellen Gruppen (I bis VI) wurden an den Tagen O, 4, 8, 12 und 16 nach der Implantation der Tumorzellen mit Propionibakterien injiziert* Man injizierte P, granulosum, P. avidum oder P, acnes intraperitoneal (3 Gruppen) oder intratumoral (3 Gruppen) in einer Dosis von 1 mg/Maus, Die Kontrollmäuse erhielten intraperitoneale oder intratumorale Injektionen von PBS₄, Die Anzahl der überlebenden Tiere wurde am 16» bzw„ 20, Tag nach der Implantation der Tumorzellen und dann jeden zweiten Tag bis zum 44, Tag nach der Implantation aufgezeichnet» Die verbleibenden 120 Tiere wurden in 8 Gruppen aufgeteilt, und die Mäuse der experimentellen Gruppen (I bis VI) wurden mit Propionibakterien wie zuvor injiziert, und die Kontrollmäuse (Gruppen VII und VIII) wurden mit PBS injiziert. Am 20, Tag nach der Implantation der Tumorzellen wurden sämtliche Mäuse getötet und die Tumoren seziert und gewogen« Das arithmetische Mittel und die Standardabweichungen wurden für jede Gruppe bestimmt, und sämtliche Tumoren der Experimentalgruppen, die mehr als zwei Standardabweichungen unterhalb des Kontrollmittelwertes lagen, wurden als regressiv aufgezeichnet» Die Ergebnisse wurden statistisch durch den Student t-Test (Tumormasse) oder die Chi-Quadrat-Analyse mit Yates Korrektion (Regression der Tumoren und Überleben der Mäuse) analysierte · ,

In der nachstehenden Tabelle IV sind die erzielten Ergebnisse zusammengestellt.

TABELLE IV

23.10*1981

WP A 61 K/231 193/2

59 018/12

von-Propionibakterien (1 mq/Maus) am Tage O> 4, B_f 12 und 16 nach-cjer Implantation von Tumorzellen .

	Tage nach dor Implantation der Tumorzellen	16	20	22	24	26	28	30	32	34	36	38	40	42	44
	15	13	10	7	3	0
Kontrolle . ·	15	15	15	15	12	12	10	9	9	7	6	5	3	3
Ρ_β granulosuin int raperitoneal'' '	15	15	15 u~~~_«	15	15	14	12	3	S	8	5	5	2	1
Ρ_φ acnes . ' intraperitoneal	15	15	15	14	14	13	11	10	8	5	4	4	0
Ρ_β avidum int raperitoneal	15	15	15	15	15	15	13	12	11	9	7	7	δ	3
Pj granulosum int rat urnoral	' ·"""""" 15	15 15	15	15	15	14	12	11	9	7	7	7	5	2
P_e acnes intratumoral	15	15	15	15	15	14	13	10	8	8	6	4	3
P, avidum intratumoral

23,10.1981 WP A 61 K/231 193/2 1 I α j £ - ²^ " 59 018/12

Die nachstehende Tabelle V zeigt den Einfluß der Propionibakterien auf das Wachstum und die Regression von Sarcoma 180 bei CFW-Mäusoru

TABELLE V

23.10.1981

WP A 61 K/231 193/2

59 018/12

ZiPS!^ Tumoren_{ bei Sa£coma_jJL80_i

tragenden ^"Se πjdieü 1 £fLriffii*:PJ2:kk^ ^aπ

Tumorzellen behandelt waren

	Intraperi'toneale Injektion .	Anzahl re~ gredierter Tumoren	Prozent Regres sion	Intraturnorale Injektion	Anzahl re- gredierter Tumoren	Prozent Regres sion
	'Tumormasse (g)	0/15 '	0	Tumormasse (9)	0/15	0
Kontrolle	2631 + 321	8/15	53,3	2631 + 321	11/15	73,3
Propionibacterium, granulosum .· .	842 + 312	6/15	40,0	538 + 212	10/15	66,6
Propionibacterium. avid um ' :.'	1032 + 381	5/15	33,3	842 + 246	9/15	60,0
Propionibacterium acnes .	1126 + 412	731 + 218

23,10.1981 WP A 61 K/231 193/2 - 23*- 59 018/12

Bei intraperitonealer Verabreichung in einer einzelnen Dosis von 1 mg/Maus ergab sich bei allen drei getesteten Stämmen von Propionibakterien eine signifikante Vergrößerung der Milz am 4» Tag nach der Injektion mit weiterer Vergrößerung der Milzmasse an den Tagen 6 bis 14„ Diese MiIzvergrößerung spiegelt die Stimulierung des retikuloendothelischen Systems wider und läuft parallel zur Antitumor-Wirksamkeit dieser Immunostimulatoren,

P, granulosum führte zu einer Regression von mehr als 70 % bei den untersuchten Sarcoma 180-Tumoren, wenn es intratumoral verabreicht worden war»

3^₁ In vivo cytpstatische_i Wirksamkeit bei MUrJnB₁ Tumorzellen durch Prop ion ibacteriurn granulosum

In einer weiteren Untersuchung wurde die cytostatische Wirkung von Propionibacterium granulosum-Stamm KP 45 bei Sarcoma L-I bei BALß/c-Mäusen (Lunge) untersucht» Auch hier ergab sich eine signifikante Wirksamkeit im Vergleich zu unbehandelten Tieren«

^--^Q^^^A^A^lQ^^^CJS^g, ^a,3·,⁵, Zusatzbehandlung bei der Chemotherapie primärer oder sekundärer Lungentumo.ren

30 Patienten mit primären oder sekundären metastatischen Lurigentumoren wurden für diesen Test .gewählt·.10 der Patienten erhielten intravenöse Infusionen von 30 mg P₆ granulosum in 100 ml intravenöser Infusionslösung, Die anderen 20 Patienten dienten zur Kontrolle»

23_e10_fl1981

WP A 61 K/231 193/2

59 018/12

Sämtliche Patienten wurden chemotherapeutisch zur Synchronisierung der Proliferation neoplastischer Zellen behandelt* Deder Kurs dauerte 3 Tage: 1» Tag: Vincristine 1,5 mg intravenös um 8 Uhr und um 20 Uhr, 2, Tag: Methotrexate 25 mg intramuskulär um 20 Uhr, 3« Tag: Methotrexate 25 mg intramuskulär um 8 Uhr, gefolgt von Methotrexate intravenös zu 25 mg um 14 Uhr und Infusion von 30 mg/kg Cyclophosphamid zur selben Zeit»

Diese chemotherapeutische Behandlung wurde dreimal alle 21 Tage wiederholt»

Die gesamte Chemotherapie bestand aus den drei obigen Zyklen,' die jeweils am 1«, 22» und 43₉ Tag der Beobachtung begannen«

irend des 3_6i 10_ei 31_O und 52<> Beobachtungstages wurde P₉ granulosum in einer Dosis von 30 mg/100 ml intravenöser Infusionslösung im Verlauf von 15 Minuten verabreicht (am letzten Tag des ersten chemotherapeutischen Zyklus und dann eine Woche nach Beendigung eines jeden Zyklus) _t

Bei den nur chemotherapeutisch behandelten Patienten traten fünf Fälle bakterieller Inf-ektionen auf (drei Pn.eumoniaen, eine Sepsis und 1 Fall von Angina Tonsillaris) während einer SDtägigen Beobachtungszeit_f.während bei den 10 mit Chemotherapie und intravenösen Infusionen von P_e-granulosum behandelten Patienten keine Symptome bakterieller Infektioner» auftraten« Dieser Unterschied ist als statistisch signifikant zu bezeichnen_β

23 ,10.198I WP A 61 K/231 193/2 j L ~ &" - 59 018/12

Die Toleranz der Patienten gegenüber intravenösen Infusionen von P. granulosum-Stamm KP 45 war gut. Während der Infusion in einer Menge von 30 mg P, granulosum traten zwar Kältegefühle und anschließend Fieber bis zu 39 ⁰C (2 bis 12 Stunden nach der Infusion) auf, am nachfolgenden Tag waren jedoch diese Nebenwirkungen nicht mehr festzustellen» Wiederholte Infusionen von P, granulosum führten nicht zur Entwicklung einer verzögerten Hypersensitivität während der 60tägigen Beobachtung« Daraus wird der Schluß gezogen, daß die intravenöse Infusion von 30 bis 240 mg P, granulosum-Stamm KP 45 ohne Risiko ernster Nebenwirkungen oder Komplikationen bei Patienten vorgenommen werden kann«

5, Allgemeine Anweisung zur lokaler^ Verabreichung (Magen- und

Man suspendiert 10 mg lyophilisiertes Produkt in 1 ml 1 % Xylocain in Kcdisalzlösung und injiziert intratumoral durch die Haut (Durchmesser 1 mm), wobei eine SO cm lange, steife Polyäthylenableitung mit fest angeordneter intramuskulärer Nadel (18 Gauge) ohne Epiphyse verwendet wird, Die Ableitung wird durch einen bioptischen Kanal in einem Endoskop (Gastrofiberoskop oder Colonoskop) eingeführt, wobei der unter visueller Kontrolle befindliche neoplastische Tumor punktiert und die Nadel 0,5 bis 1 cm in das Tumorgewebe eingeführt wird. Das Produkt wird durch .die Ableitung injiziert, und man spült mit 1 bis 2 ml l%igem-Xylocain in . . Kochsalzlösung, ·

Die intratumoralen Injektionen (jeweils 10 mg Produkt) wer-? den beispielsweise während der ersten drei Tage, dann am 10, und am 17, Tag der Beobachtung verabreicht.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Zellwandpräparaten oder Ganz"Zellenpräparaten von Propioniumbacterium granulosum, Propionibacterium avidum und/oder Prophnibacterium acnes zur Anwendung in der Radio- oder Chemotherapie von Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Flüssigkeitskultur des .jeweiligen Propionibacteriums unter anaeroben Bedingungen nach Gs,s~Pak Verfahren behandelt, diese Massenanzüchtung mit einer dicken Ausschwemmung von Propionibacterium beimpft, nach Bebrütung die Zellen durch Kühlzentrifugieren abtrennt, das Sediment mit destilliertem Wasser v/äscht und gewünschtenfalls anschlie· ßend mit Glasperlen in einer Zellmühle zerschlägt, nach einer mikroskopischen Kontrolle, wonach keine Ganzzellen mehr vorhanden sind, die Glasperlen mit einer Glasfritte unter Verwendung von Phosphatpuffern bei einem pH-Wert vor. 7j2 vorn Homogenisat abtrennt} die milchige Suspension enthaltend Zellwände und Cytoplasmen abzentrifugiert, das Sediment in Phosphatpuffern bei einem pH-Wert von 7,2 aufnimmt, die autolytischen Enzyme durch Kochen inaktiviert, die protein-haltigen gewonnenen Zellwände durch Inkubation mit einer Trypsinsuspension und Toluol weiter reinigt, die durch triptische Verdauung gereinigten Zellwände abzentrifugiert mit destilliertem V/asser v/äscht und dann gefriertrocknete

Verfahren, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

das ( wird

das Gas-Pak-Verfahren bei 37 ⁰O Temperatur durchgeführt

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch .gekennzeichnet, daß die Bebrütungs zeit 72 Stunden bei einer Temperatur von 37 ⁰C beträgt«.

59 018 12

4· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zerschlagung der Zellen in der Zellmühle mit dem doppelten Volumen von Glasperlen während 1 bis 2 Stunden durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,daß die verwendeten Glasperlen einen Durchmesser von 0,17 bis 0,18 mm aufweisen·

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnenen Zellwände einer Inkubation bei 37 °C Temperatur während 24 Stunden unterworfen werden.

7· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trypsin in einer 0,5 mg/ml Suspension verwendet wird und das zugesetzte Toluol 1 ml auf 100 ml Aufschwemmung beträgt ο

8· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Propionibacterium ein Propionibacterium granulosum Stamm 45 ist©

9« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Propionibacterium avidum Stamm kp 40 ist.

ΊΌ. Verfahren nach Anspruch .1, dadurch .gekennzeichnet:, daß das Medium für die Massenanzüchtung eine a-Bouillon mit folgender Zusammensetzung ist:

bacto casitone 12g

bacto yeast extract' 12 g '

KH₂PO₄ 4g

IfeSO407HgO Ig

Glukose 4g ·

59 018 12

Aqua deste ad 1000 ml, pH 7»2 für a-Agar + 28 g bacto agar·

* Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Phosphatpuffer mit

1/15. M .Na₂HPO₄.2H₂O und

1/15 M KHpPO, wurden je in 1000 ml Aqua dest« gelöste

612 g der sekundären Natriumphosphatlösung wurden mit 388 g der primären Kaliumphosphatlösung vermischt, und der pH wurde auf 7*2 eingestellt vorbereitet wird·

12o Verfahren nach Anspruch 1_S dadurch gekennzeichnet,

daß die lyophilisierten Propionibakterien der genannten Art in phosphatgepufferter. Kochsalzlösung in einer Konzentration von 5_s0 bzw* 7?5 mg/ml für ihre Verwendung suspendiert werden_e