DE3011461C2

DE3011461C2 - Verwendung von Propionibakterien

Info

Publication number: DE3011461C2
Application number: DE3011461A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Prof. Dr.med. 5000 Köln Pulverer
Original assignee: Dr Madaus & Co 5000 Koeln; Dr Madaus GmbH and Co
Current assignee: Pulverer Gerhard Prof Dr Drhc 50935 Koeln
Priority date: 1980-03-25
Filing date: 1980-03-25
Publication date: 1986-10-30
Also published as: CA1197798A; AT371714B; FR2505186B1; AU548596B2; NO162079B; GB2098478B; NL8101452A; NO810815L; US4647456A; AU7024281A; NL189947B; BE888770A; GB2098478A; SE8101582L; DE3011461A1; NO162079C; JPH0355448B2; NL189947C; SE450088B; CH661868A5

Description

Bekannt sind Präparationen anaerober Coryneformen, beispielsweise C-Ps?vum, CN 6134, die als Antitumormittel beschrieben werden. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß diese Präparationen bei systemischer oder lokaler Therapie zu unerwünschten Nebenwirkungen und Komplikationen führen, so daß in der Literatur empfohlen wird, Dosen von mehr als 7,5 mg/m² Oberfläche zu vermeiden. Diese Menge entspräche ungefähr einer Menge von 20 mg pro Patient

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß Präparate auf der Grundlage von abgetöteten ganzen Zellen oder Zellwäaden von bestimmten Stämmen von Propioni-Bakterien bei der Chemotherapie oder Radiotherapie von Tumoren außerordentlich wirksam sind (vgl. Patentanspruch 1). Insbesondere sind diese Präparate zur unterstützenden Therapie geeig. et Die Wirksamkeit ist bei lokaler Verabreichung besonders groß.

So hat sich durch Versuche gezeigt, daß bestimmte Stämme von P. acnes, P. granulosum und P. avidum bei intraperitonealer Injektion bei Mäusen in einer Dosis von 1,5 mg pro Maus die Überlebenszeit letal (850R) bestrahlter Mäuse signifikant verlängern, wobei P. granulosum am wirksamsten ist. Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Präparate zur Stimulierung der CFU-S-Proliferation, d. h, zur Stimulierung einer Wanderung von hämatopoetischen, koloniebildenden Einheiten aus dem Knochenmark zum Eintritt in den Zellzyklus und zur Wanderung zum peripheren Blut, geeignet sind. In der klinischen Praxis bedeutet dieser Befund, daß die erfindungsgemäßen Präparate als Zusatztherapie bei der Radiotherapie von Tumoren wertvoll sind, da sie die Strahlenverträglichkeit der Patienten wesentlich erhöhen.

Darüber hinaus wurde in Untersuchungen festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Präparate gegen murine Sarcoma 180 bei Mäusen wirksam sind und zu einer Regression von mehr als 70% der Sarcoma 180-Tumoren führen, wenn intratumoral appliziert wurde.

Es wurde auch festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Präparate bei systemischer Verabreichung an Patienten mit primären oder sekundären Lungentumoren als Zusatzbehandlung zur Chemotherapie eine der Hauptkomplikationen der Chemotherapie von Tumoren vermeiden helfen, nämlicn die Infektionsgefahr. Es hat sich somit ergeben, daß die erfindungsgemäßen Präparate als ausgezeichnete antibakteriell wirksame Zusatzbehandlungsmittel bei der Chemotherapie des Krebses eingesetzt werden können. Zellwandpräparationen haben sich als besonders brauchbar erwiesen, da bei dieser Art von Präparaten die Gefahr unerwünschter Nebenwirkungen besonders gering ist. Zellwandpräparate wurden nach dem Stand der Technik bisher noch nicht klinisch untersucht.
Die vorstehenden Ergebnisse sind nachfolgend anhand von In-vivo-Versuchen belegt.

Gegenstand der Erfindung sind somit Ganzzellen- oder Zellwandpräparate für die Radio- und Chemotherapie von Tumoren auf der Grundlage von abgetöteten ganzen Zellen oder deren Zellwänden von Mikroorganismen der Stämme Propionibacterium granulosum DSM 1773, Propionibacterium avidum DSM 1772 oder Propionibacterium acnes ATCC 6919.
Das Verfahren zur Herstellung von Ganzzellenpräparaten auf der Grundlage von abgetöteten ganzen Zellen oder von Zellwandpräparaten von Mikroorganismen für die Radio- oder Chemotherapie von Tumoren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen die Stämme Propionibacterium granulosum DSM 1773, Propionibacterium avidum DSM 1772 oder Propionibacterium acnes ATCC 6919 einsetzt.

Es ist bevorzugt, injizierbare Suspensionen von Ganzzellen- oder Zellwändeii in phosphatgepufferter Kochsalzlösung herzustellen. Hierbei ist eine Konzentration von 0,5 bis 50 mg aktivem Material pro ml Lösung besonders zweckmäßig. Bevorzugt ist eine Konzentration von 2 bis 12 mg/ml Lösung, insbesondere von 5 bis 7,5 mg/ml Lösung.

Als Phosphatpuffer verwendet man vorzugsweise einen Na2HP04/KH2P04-Phosphatpuffer, der zweckmäßig einen pH von etwa 72 aufweist. Besonders geeignet sind intravenöse Infusionslösungen, die in 100 ml Lösung 15

bis 30 mg des Präparates enthalten. Eine derartige Dosismenge hat sich als besonders vorteilhaft bei der Behandlung primärer und sekundärer Lungenneopiasmen erwiesen, wobei eine erste Injektion mindestens 10 Tage vor der chemotherapeutischen Behandlung erfolgen sollte.

Die erfindungsgemäßen Präparate verwendet man in der Radio- oder Chemotherapie von Tumoren sowie zur Bekämpfung von Infektionen bei der Chemotherapie des Krebses, insbesondere in Suspensionform in phosphat- 5 gepufferter Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 0,5 bis 50 mg aktivem Material pro ml Lösung, wobei vorzugsweise als Phosphatpuffer ein NaiHPCVK^PCVPhosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 eingesetzt wird.

Die Stänane P. granulosum KP 45 und P. avidum KP 40 wurden bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) unter der Nummer DSM 1773 für P. granulosum KP 45 und DSM 1772 für P. avidum KP 40 io hinterlegt P. acnes wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 6919 hinterlegt.

P. granulosum, P. acnes und P. avidum lassen sich aus Abstrichen aus Acne Effluoreszenzen (Acne vulgaris, Acne papulopustulosa und Acnes conclobata) isolieren und züchten. Zur Taxonomie vgl. Der Hautarzt, 30, 242 bis 267 (1979). Die Eigenschaften von P. granulosum KP 45 und P. avidum KP 40 sind nachfolgend zusammengestellt 15

Charakterisierung der Propioni-Bakterien P. avidum Stamm KP 40 und P. granulosum KP 45

Stamm Herkunft Species Biochemische Reaktionen (Lit. I)

Nr. Sac- Mal- Sor- Man- SaIi- Ino- Äscu- In- Nt- OeIa- Dex- Me- 20

cha- tose bit nit ein sit lin- dol trat r'm trin lizirose Hydro- tose

KP 45 Abstrich P.granu- + + — — — — — — — — + + 25 von einer losum
Wundinfektion

KP 40 genom- P.avi- + + — + + — ++— — + + + 30 men dum

aus Präputium-
raum

eines kli- 35

nisch Gesunden

Stamm Herkunft Species Seriologie-JLit. 2) Phagen-

Nr. P. acnes P. granulosum P. avidum lycotypie

KB 95 D34 58 0575 31 (LiL 3)

KÖ1...XÖ13

₍ 45

KP 45 Abstrich P. granulosum — + — — — — NT

von einer
Wundinfektion

KP 40 genommen aus P. avidum — — — + — — NT

Präputiumraum
eines klinisch
Gesunden

55 NT = nicht typisierbar

1) G. Pulverer and H. L Ko

Fermentative and Serological Studies on Propionibacterium acnes und App. Microb, 25,222—229,1973

2) U. Höffler, H. L Ko and G. Pulverer

Serotyping of Propionibacterium acnes and related microbial species. Ferns Microbiology letters, Vol. 2,5—9,1977

3) E. C. Jong, H. L Ko and G. Pulverer 60 Studies on Bacteriophages of P. acnes, Med. Microbiol. Immunol, 161,263—271,1975

Der Hautarzt,30,242-247 (1979)

Differenzierung unterschiedlicher Propionibakterienspezie aus Acne-vulgaris-Effluoreszenzen

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Herstellung erfindungsgemäßer Präparate. 65

Beispiel 1
Allgemeine Arbeitsweise zur Gewinnung der Zellwände

Die Flüssigkeitskultur des jeweiligen Propioni-Bakteriums wurde in 1 Liter (Erlenmeyerkolben) bei 37°C unter anaeroben Bedingungen durchgeführt (Gas-Pak-Verfahren, BBL).

Für diese Massenanzüchtung wurde das Medium [Α-Bouillon*) oder Triptic soy broth, Difco] mit einer dicken Aufschwemmung von Propionibakterium beimpft. Die Impf-Aufschwemmung wurde durch Verreiben einer dreitägigen A-Agarkultur von Propionibakterium in 10 ml Bouillon hergestellt. Nach einer Bebrütungszeit von 72 Stunden bei 37°C wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 10 000 g (20 Min.) in einer Sorval R2-Kühlzentrifuge von der Flüssigkeit abgetrennt. Das Sediment wurde dreimal mit Aqua dest. gewaschen und anschließend mit dem doppelten Volumen Glasperlen (0 0,17 — 0,18 mm) gemischt und in einer Zellmühle***) 1 — 1 ¹Zt Stunden lang zerschlagen. Nachdem durch eine mikroskopische Kontrolle (Gram-Präparat) geprüft worden war, daß keine ganzen Zellen mehr vorhanden sind, wurden die Glasperlen mit einer G-1-Fritte unter Verwendung von Phosphatpuffer*·) (pH 7,2) vom Homogenisat abgetrennt.

Die miiichige Suspension (enthielt Zellwände und Cytoplasmen) wurde 20 Min. bei 40 000 g abzentrifugiert, und das Sediment wurde in Phosphatpuffer (pH 7,2) aufgenommen. Die autolytischen Enzyme wurden durch 10 Min. Kochen im Wasserbad inaktiviert.

Diese noch Protein-haltigen Zellwände wurden durch Inkubation bei 37° C 24 Stunden lang mit Trypsin (Merck, 03 mg/ml Suspension) und 1 ml Toluol auf 100 ml Aufschwemmung (zur Verhinderung von Bakterienwachstum) weiter gereinigt.

Die durch tryptische Verdauung gereinigten Zellwände wurden schließlich bei 40 000 g abzentrifugiert (30 Min.) und 3mal mit Aqua dest. gewaschen, dann gefriergetrocknet.

» *) A-Bouillon:

Bacto Casitone 12 g Bacto yeast extract 12 g

KHjPO₄ 4 g

MgSC)₄ · 7 H₂O Ig

3Q Glukose 4 g

Aqua desL ad 1000 ml, pH 7.2 Für A-Agar + 28 g Bacto Agar.

") Phosphatpuffer:

1/15MNa₂HPO₄ -2 H₂O und

!/!5 M KHiPQ.; wurden in je IQQO m! Aqua dest. gelöst; 6!2 g der sekundären Nairiumphosphatlösung wurden mit 388 g der primären Kaliumphosphatlösung vermischt, und der pH wurde auf 7,2 eingestellt

·") ZeIImDhIe:

Vibrogen-Zellmühle vi 3. Edmund Bühler, 7400 Tübingen. Beispiel 2

Herstellung von Suspensionen von P. acnes (Stamm ATCC 6919), P. avidum
(Stamm 0575, KP 40 = DSM 1772) und P. granulosum (Stamm KP 45= DSM 1773)

Nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 lyophilisierte Propionibakterien der genannten Art werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung der vorstehend genannten Art in einer Konzentration von 5,0 bzw. 73 mg/ml suspendiert. Die erhaltene Suspension ist insbesondere zur intraperitonealen Injektion geeignet

Beispiel 3

Unter Anwendung der Arbeitsweise des Beispiels 2 werden intraperitoneal injizierbare Suspensionen von P. granulosum Stamm KP 45,95 K, P. acnes Stamm ATCC 6919 und P. avidum Stamm 0575, KP 40 aus lyophilisiertem Material mit einer Konzentration von 5 bzw. 73 mg/ml Zellmaterial hergestellt

Beispiel 4

Herstellung injizierbarer Suspensionen zur Zusatzbehandlung bei der Chemotherapie

P. granulosum Stamm KP 45 wird nach der allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 1 aufbereitet Man stellt eine Suspension von 30 mg Zelimaterial in 100 mi Infusionslösung zur intravenösen Verabreichung her.
Die erfindungsgemäßen Präparate können selbstverständlich übliche Zusatzstoffe enthalten. Die Präparate können in Ampullenform vorliegen oder in sterilen Flaschen mit Durchstechverschluß abgefüllt sein. Auch Konfektionierungen mit getrennter Aufbewahrung der Bestandteile zur Zubereitung im Augenblick der Applikation kommen in Betracht

Untersuchungen in vivo 1. Hämopoese bei mit Propioni-Bakterien behandelten Mäusen nach letaler Bestrahlung

Es wurden drei Stämme von Propioni-Bakterien (P. acnes, P. granulosum und P. avidum) in einer Dosis von jeweils 1,5 mg pro Maus intraperitoneal bei letal bestrahlten Mäusen (850 R) injiziert. Hierbei ergab sich, daß P. granulosum die Überlebenszeit der bestrahlten Mäuse am meisten verlängert.

Es wurden erwachsene, 8 Wochen alte männliche Swiss-Mäuse verwendet. Die Tiere wurden mit einer Standarddiät gefüttert. Wasser war ad libidum zur Verfügung. Das Wasser und das Futter wurden sterilisiert. Das Wasser enthielt Oxytetracyclin (1 g pro 1000 ml). ι ο

Bestrahlung:

Die Mäuse wurden in einem rotierenden Metacrylatkäfig (10 Mäuse pro Käfig) in einer Entfernung von 50 cm von der THX 250 Medicor-Einheit, die bei 200 kV betrieben wurde und mit einem 0,5 mm-Cu-Filter versehen war, mit 650 bzw. 850 R bestrahlt. Die Bestrahlungsrate von ungefähr 75 R pro Minute wurde mit einem CT-I Thermolumineszenz R-Dosimeter bestimmt.

Für die Experimente wurden P. acnes Stamm ATCC 6919, P. avidum Stamm 0575, KP 40 und P. granulosum Stamm KP 45 in Form abgetöteter Ganzzeiien und in Form von Zeiiwänden verwendet. Man suspendierte die lyophilisierten Propioni-Bakterien in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung in einer Konzentration von 7,5 mg/ml und injizierte 0,2 ml der Suspension intraperitoneal (1,5 mg pro Maus).

Untersuchung exogener Milzkolonien

3, 2 bzw. 1 Tag vor der Transplantation von Knochenmark wurden Donor-Mäusen 1,5 mg P. granulosum injiziert. Die Knochenmark-Zellsuspension wurde hergestellt, indem man beide Oberschenkelknochen mit sterilern Parker-Medium spülte. Die Zellen wurden in einem Hämocytometer gezählt. 5 χ 10⁵ vermehrungsfähige Zellen in 0,2 ml Parker-Medium wurden jeder Maus in die Schwanzvene injiziert, welche 4 Stunden vor der Knochenmarktransplantation mit 850 R bestrahlt worden war. Den Kontrollmäusen wurden 0,2 ml Medium oder 5 χ 10⁵ Knochenmarkszellen von normalen Mäusen (nicht mit P. granulosum behandelt) injiziert. Einer anderen Gruppe von Donor-Mäusen wurde P. granulosum wie zuvor verabreicht, dann wurden die Tiere mit Äther anästhesiert, und aus dem retrobulbaren Plexus wurde Blut entnommen. Die Blutzellen wurden im Hämocytometer gezählt, und aliquote Anteile Blut mit 5 χ 10⁵ nucleierten Zellen wurden in die Schwanzvene von mit 850 R bestrahlten Mäusen injiziert. Die Kontrollmäuse erhielten gleiche Volumina Blut, das von normalen Mäusen (nicht mit P. granulosum behandelt) entnommen worden war. Alle Mäuse wurden 9 Tage nach der Transplantation von Blut bzw. Knochenmark getötet und gewogen, die Milz wurde entnommen, es wurde wiederum gewogen, und die Anzahl Kolonien pro Milz wurden nach Fixierung in Chloroform : Äthanol (1:3) bestimmt.

Untersuchung der endogenen Milzkolonien

3, 2 bzw. 1 oder 0 Tage vor der Bestrahlung mit 650 R wurden Mäuse intraperitoneal mit P. granulosum injiziert. Die Kontrollmäuse erhielten gleiche Volumina an PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung). 9 Tage nach der Bestrahlung ν urden die Tiere getötet, die Milzen wurden entfernt, gewogen; und die Kolonien wurden wie beim vorstehenden Test zur Bestimmung der exogenen Milzkolonien gezählt

Uberlebenstest

Mäuse wurden in 7 Gruppen aufgeteilt, wobei jeweils 15 Mäuse pro Gruppe vorlagen und mit 850 R Röntgenstrahlen bestrahlt wurden. 4 Stunden nach der Bestrahlung wurde den Tieren erfindungsgemäße Propioni-Bakterienzellwände oder ganze Zellen injiziert Die Kontrollmäuse erhielten gleiche Volumina an PBS. Die Anzahl der überlebenden Tiere in jeder Gruppe wurde ab dem 10. Tag nach der Bestrahlung gezählt Für die statistische Analyse wurde der Student t-Test angewendet

In der F i g. 1 ist die Wirkung der untersuchten Propioni-Bakterien auf die Überlebensrate der letal bestrahlten Mäuse graphisch dargestellt. Alle drei Stämme von Propioni-Bakterien führten im Vergleich zu den Kontrolltieren zu einer signifikanten Verlängerung der Überlebensspanne. P. granulosum erwies sich in Form des Ganzzellenpräparates und in Form des Zellwandpräparates wirksamer als P. acnes und P. avidum.

Einfluß von P. granulosum auf endogene Milzkolonie λ (Stamm KP 45)
Tabelle I

Anzahl endogener Milzkolonien bei Mäusen, die mit Propioni-Bakterium
granulosum behandelt wurden (Stamm KP 45)
(Mittelwert ± Standardabweichung)

Kontrolle/650 R

P. granulosum — 3 Tage vor Bestrahlung P. granulosum — 2 Tage vor Bestrahlung P. granulosum — 1 Tag vor Bestrahlung P. granulosum — 4 Std. nach Bestrahlung

·) -p<0,01

Das relative Milzgewicht der bestrahlten Mäuse nahmen nur dann zu, wenn P. granulosum 1 Tag vor oder 4 Stunden nach der Bestrahlung mit 650 R verabreicht wurde. Jedoch nahm die Anzahl exogener Milzkolonien bei sämtlichen Behandlungen signifikant zu.

relatives Milzgewicht	Anzahl endogener
	Milzkolonien
1,82 ±0,45	1,24 ±0,67
1,66 ±0,24	10,6 ±4,45*)
1,73 ±0,21	8,17 ±3,49»)
2,18 ±0,42	11,2 ±5,30»)
2,32 ±0,38	14,1 ±4,70*)

Wirkung von P. granulosum auf die Bildung exogener Milzkolonien (Stamm KP 45)

Tabelle II

Anzahl exogener Kolonien nach Transfusion von Knochenmark von mit P. granulosum
behandelten Mäusen (Stamm KP 45) (Mittelwerte ± Standardabweichung)

Transfusion

relatives
Milzgewicht

Anzahl exogener
Milzkoloriien

CFU-S pro 10⁶ nucleierte Knochenmarkzellen

0,99 ±0,19 1,52 ±0,31 1,51 ±0,49	1,12 ±0,32 20,4 ±2,14 iO3±l.S7*)	11,2±3,2 204,0 ±21,4 103,0±18,7*)
1,75 ±0,44	11,6±4,4·)	116,0 ±44,2·)
1,69 ±0,27	10,7 ±4,3*)	107,0 ±43,3*)

35 Kontrolle (04 ml Parker-Medium) Knochenmark von normalen Mäusen Knochenmark von Mäusen, die 3 Tage vor der Transfusion mit P. granulosum behandelt

worden waren 40 Knochenmark von Mäusen, die 2 Tage vor der Transfusion mit P. eranulosum behandelt worden waren Knochenmark von Mäusen, die 1 Tag vor

der Transfusion mit P. granulosum behandelt 45 worden waren

*) -p<0,01

Es wurden keine Unterschiede beim relativen Milzgewicht zwischen Mäusen, welche mit normalem Knochenmark transplantiert waren und Mäusen, die mit dem Knochenmark von mit P. granulosum 2,3 oder 1 Tage vor der Transplantation behandelten Donor-Tieren festgestellt Diese Behandlung führte zu einer signifikanten Abnahme der Anzahl exogener Milzkoionien bei mit 850 R bestrahlten Tieren, im Vergleich zu Tieren, denen Knochenmark von unbehandelten Donor-Tieren gegeben worden war. Dieser Befund zeigt eine Abnahme der Anzahl von CFU-S im Knochenmark von mit P. granulosum behandelten Mäusen an. Andererseits führte eine Injektion von Blut von Mäusen, welche mit P. granulosum behandelt worden waren, an letal bestrahlte Versuchstiere zu einer signifikanten Zunahme der Werte der relativen Milzgewichte und der Anzahl Milzkolonien im Vergleich zur Injektion von Blut aus unbehandelten Donor-Tieren, wie der nachstehenden Tabelle III zu entnehmen ist

Tabelle HI

Anzahl exogener Milzkolonien nach Transfusion von Blut von mit
P. granulosum behandelten Mäusen (Stamm RLP 45)
(Mittelwerte ± Standardabweichungen)

Transfusion	Leukocytose	relatives	Anzahl exogener	CFU-S pro i O⁶
	beim trans	Milzgewicht	Milzkolonien	nucleierte Kno
	fundierten			chenmarkzellen
	Blut

Blut von normalen Mäusen	6 480	1,41 ±0,23	3,8 ±2,2
Blut von Mäusen, die 3 Tage vor der	9 960	2,62 ±0,88*)	9,16±1,4·)
Transfusion mit P. granulosum
behandelt waren
Blut von Mäusen, die 2 Tage vor der	10 120	3,45 ±1,81*)	10,2 ±2,6·)
Transfusion mit P. granulosum
behandelt waren
Blut von Mäusen, die 1 Tag vor der	9 650	3,23 ±1,48*)	7,4 ±1,8*·)
Transfusion mit P. granulosum
behandelt waren
*) -p<0,01
**) -p<0,05

l,17±0,28 l,84±0,3l·)

2,01 ±0,34*)

1,54 ±0,23**)

Am wirksamsten bei der Stimulierung der Milzkoloniebildung war Blut, das von Donor-Mäusen entnommen war, die zwei oder drei Tage vor der Bluttransplantation mit P. granulosum injiziert worden waren. Die Leukocytose bei transplantiertem Blut wurde jedoch nach der Behandlung mit P. granulosum 3, 2 oder 1 Tag vor der Blutentnahme erhöht.

In den vorstehenden Experimenten erwies sich P. granulosum als wirksamstes Agens bei letal bestrahlten Ratten. Der tödliche Effekt der letalen Dosis von Röntgenstrahlen ist das Ergebnis der Inhibierung der proliferativen Fähigkeit der hämopoetischen Stammzellen und der Schädigung der Epithelzellen der inneren Organe mit anschließender Entwicklung generalisierter Infektionen durch saprophytische Bakterien. Allerding? zeigt es sich beim vorstehenden Experiment, daß die mit Propionibakterien behandelten Mäuse keine Symptome von Diarrhöe und/oder Blutungen aus dem Verdauungstrakt aufwiesen. Daher läßt sich die Schutzwirkung der Propionibakterien einer verstärkten Erholung der hämopoetischen Stammzellen des Knochenmarks nach der Bestrahlung zuschreiben.

2. Wirksamkeit von P. granulosum, P. acnes und P. avidum bei experimentellem

Murine Sarcoma 180-Tumor bei Mäusen

Alle drei zuvor genannten Propionibakterien wurden intraperitoneal oder intratumoral in mehreren D-tsen zu jeweils 1 mg pro Maus appliziert und erwiesen sich als wirksam bei der Retardation des Wachstums und der Stimulierung der Regression von Sarcoma 180 bei CFW-Mäusen. Darüber hinaus ergab die Applikation von Propionibakterien eine Verlängerung des Überlebens von Mäusen mit Sarcoma 180.

Eingesetzte Propionibakterien

Für die Experimente wurde Propionibakterium granulosum Stamm KP 45 (aus Wundinfektion im Hygiene-Institut der Universität Köln isoliert), Propionibakterium acnes Stamm 6919 (ATCC), Propionibakterium avidum Stamm 0575 (C. S. Cummins, Anaerobe Labs, Virginia Polytechnic Inst and State University, Blackburg) KP 40 verwendet Die genannten Propionibakterien wurden lyophilisiert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einer Konzenti ation von 5 mg/ml suspendiert 0,2 ml der Suspension wurde den Tumor tragenden Mäusen intraperitoneal oder intratumoral verabreicht

55 Tumor tragende Mäuse

Bei diesem Tumorsystem wurden erwachsene männliche CFW-Mäuse eingesetzt Die Tumore wurden wie in Radio Sei. 12 (1978), Seiten 185 bis 189, beschrieben induziert Hierzu wurden Sarcoma 180-Turnore von Donor-Mäusen seziert, Tumorgewebe wurde zerhackt trypsinisiert (0,25% Trypsin, 15 Minuten bei 37°C) und filtriert Die Anzahl Zellen wurde gezählt und pro 1 ml Kochsalzlösung auf 10⁸ vermehrungsfähige Zellen eingestellt 0,1 ml der Suspension wurde subkutan intraskapular injiziert Diese Arbeitsweise führte zur Entwicklung fühlbarer Tumore nach ungefähr 4 bis 5 Tagen. Ein schnelles Wachstum der Tumore erfolgte zwischen dem 4. und dem 14. Tag nach der Transplantation, wobei der letale Effekt zwischen dem 20. und 28. Tag auftrat

Insgesamt 225 männliche CFW-Mäuse wurden bei den Untersuchungen verwendet Bei den Überlebenstests wurden 105 Mäuse in sieben Gruppen (15 Mäuse je Gruppe) aufgeteilt, und die Tiere der experimentellen Gruppen (I bis VI) wurden an den Tagen 0, 4, 8, 12 und 16 nach der Implantation der Tumorzellen mit Propionibakterien injiziert Man injizierte P. granc.osum, P. avidum oder P. acnes intraDeritoneal i3 Grnnnpi^

oder intratumoral (3 Gruppen) in einer Dosis von 1 mg/Maus. Die Kontrollmäuse erhielten intraperitoneale oder intratumorale Injektionen von PBS. Die Anzahl der überlebenden Tiere wurde am 16. bzw. 20. Tag nach der Implantation der Tumorzellen und dann jeden zweiten Tag bis zum 44. Tag nach der Implantation aufgezeichnet Die verbleibenden 120 Tiere wurden in 8 Gruppen aufgeteilt, und Mäuse der experimentellen Gruppen (I bis VI) wurden mit Propionibakterien wie zuvor injiziert, und die Kontrollmäuse (Gruppen VII und VIII) wurden mit PBS injiziert Am 20. Tag nach der Implantation der Tumorzellen wurden sämtliche Mäuse getötet und die Tumore seziert und gewogen. Das arithmetische Mittel und die Standardabweichungen wurden für jede Gruppe bestimmt, und sämtliche Tumore der Experimentalgruppeh, die mehr als zwei Standardabweichungen unterhalb des Kontrollmittelwertes lagen, wurden als regressiv aufgezeichnet Die Ergebnisse wurden statistisch durch den Student t-Test (Tumormasse) oder die Chi-Quadrat-Analyse mit Yates Korrektion (Regression der Tumore und Oberleben der Mäuse) analysiert In der nachstehenden Tabelle IV sind die erzielten Ergebnisse zusammengestellt

Tabelle IV

Oberleben von Sarcoma 180 tragenden CFW-Mäusen unter Behandlung von Propionibakterien (1 mg/M aus) am Tage 0,4,8,12 und 16nachder Implantation von Tumorzellen

Taee nach der Implantation der Tumorzellen

16~ 20 22 " 24 26 28 30 32

34 36

33

40 42

Kontrolle

P. granulosum intraperitoneal

P.acnes

intraperitoneal

'?. avidum

intraperitoneal P. granulosum

intratumoral

P. acnes

intratumoral

P. avidum intratumoral

Die nachstehende Tabelle V zeigt den Einfluß der Propionibakterien auf das Wachstum und die Regression von Sarcoma 180 bei CFW-Mäusen.

Tabelle V

Tumormasse und Anzahl regredierter Tumore bei Sarcoma 180 tragenden Mäusen, die mit Propionibakterien (1 mg/Maus) am 0, 4, 8, 12. und 16. Tag nach der Implantation von Tumorzellen behandelt waren

15 15	13 15	10 15	7 15	3 12	0 12	10	9	9	7	6	5	3	3
15	15	15	15	15	14	12	8	8	8	5	5	2	1
15	15	15	14	14	13	11	10	8	5	4	4	0
15	15	15	15	15	15	13	12	11	9	7	7	6	3
15	15	15	15	15	Ϊ4	12	11	9	7	7	7	5	2
15	15	15	15	15	15	14	13	10	8	8	6	4	3

	Kontrolle	Intraperitoneale Injektion	Anzahl	Prozent	Intratumorale Injektion	Anzahl	Prozent
	Propionibakterium	TumcTinasse	regredierter	Regression	Tumormasse	regredierter	Regression
	granulosum	(g)	Tumore		(g)	Tumore
	Propioni-bakterium		0/15	0		0/15	0
50	avidum	2631 ±321	8/15	533	2631 ±321	11/15	733
	Propionibakterium	842±312			538 ±212
	acnes		6/15	40,0		10/15	66,6
	1032 ±381			842 ±246
55		5/15	333		9/15	60,0
	1126±412			731+218

Bei intraperitoneaier Verabreichung in einer einzelnen Dosis von 1 mg/Maus ergab sich bei allen drei

getesteten Stämmen von Propionibakterien eine signifikante Vergrößerung der Milz am 4. Tag nach der

Injektion mit weiterer Vergrößerung der Milzmasse an den Tagen 6 bis 14. Diese Milzvergrößerung spiegelt die Stimulierung des retikuloendothelischen Systems wieder und läuft parallel zur Antitumorwirksamkeit dieser Immunostimulatoren.

P. granulosum führte zu einer Regression von mehr als 70% bei den untersuchten Sarcoma 180-Tiimoren, wenn es intratumoral verabreicht worden war.

3. In vivo cytostatische Wirksamkeit bei Murin Tumorzellen durch Propionibakterium granulosum

In einer weiteren Untersuchung wurde die cytostatische Wirkung von Propionibakterium granulosum Stamm KP 45 bei Sarcoma L-I bei BALB/c-Mäusen (Lunge) untersucht Auch hier ergab sich eine signifikante Wirksamkeit im Vergleich zu unbehandelten Tieren.

4. Antibakterielle Wirkung als Zusatzbehandlung bei der Chemotherapie primärer oder sekundärer Lungentumore

30 Patienten mit primären oder sekundären metastatischen Lungentumoren wurden für diesen Test gewählt. 10 der Patienten erhielten intravenöse Infusionen von 30 mg P. granulosum in 100 ml intravenöser Infusionslösung. Die anderen 20 Patienten dienten zur Kontrolle.

Sämtliche Patienten wurden chemotherapeutisch zur Synchronisierung der Proliferation neoplasüscher Zellen behandelt Jeder Kurs dauerte 3 Tage: 1. Tag: Vincristine 1,5 mg intravenös um 8 Uhr und um 20 Uhr, 2. Tag: Methotrexate 25 mg intramuskulär um 20 Uhr, 3. Tag: Methotrexate 25 mg intramuskulär um 8 Uhr, gefolgt von Methotrexate intravenös zu 25 mg um 14 Uhr und Infusion von 30 mg/kg Cyclophosphamid zur selben Zeit Diese chemotherapeutische Behandlung wurde dreimal alle 21 Tage wiederholt Die gesamte Chemotherapie bestand aus den drei obigen Zyklen, die jeweils am 1, 22. und 43. Tag der

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Während des 3., 10, 31. und 52. Beobachtungstages wurde P. ganulosum in einer Dosis von 30 mg/100 ml intravenöser Infusionslösung im Verlauf von 15 Minuten verabreicht (am letzten Tag des ersten chemotherapeutischen Zyklus und dann 1 Woche nach Beendigung eines jeden Zyklus).

Bei den nur chemotherapeutisch behandelten Patienten traten fünf Fälle bakterieller Infektionen auf (drei Pneumoniaen, eine Sepsis und 1 Fall von Angina Tonsillaris) während einer 60tägigen Beobachtungszeit, während bei den 10 mit Chemotherapie und intravenösen Infusionen von P. granulosum behandelten Patienten keine Symptome bakterieller Infektionen auftraten. Dieser Unterschied ist als statistisch signifikant zu bezeichnen.

Die Toleranz der Patienten gegenüber intravenösen Infusionen von P. granulosum Stamm KP 45 war gut Während der Infusion in einer Menge von 30 mg P. granulosum traten zwar Kältegefühle und anschließend Fieber bis zu 39° C (2 bis 12 Stunden nach der Infusion) auf, am nachfolgenden Tag waren jedoch diese Nebenwirkungen nicht mehr festzustellen. Wiederholte Infusionen von P. granulosum führten nicht zur Entwicklung einer verzögerten Hypersensitivität während der 60tägigen Beobachtung. Daraus wird der Schluß gezogen, daß die intravenöse Infusion von 30 bis 240 mg P. granulosum Stamm KP 45 ohne Risiko ernster Nebenwirkungen oder Komplikationen bei Patienten vorgenommen werden kann. _

5. Allgemeine Anweisung zur lokalen Verabreichung (Magen- und Darmkrebs)

Man suspendiert 10 mg lyophilisiertes Produkt in 1 ml 1% Xylocain in Kochsalzlösung und injiziert intratumoral durch die Haut (Durchmesser 1 mm), wobei eine 80 cm lange, steife Polyäthylenableitung mit fest angeordneter intramuskulärer Nadei (18 Gauge) ohne Epiphyse verwendet wird. Die Ableitung wird durch einen bioptischen Kanal in einem Endoskop (Gastrofiberoskop oder Colonoskop) eingeführt, wobei der unter visueller Kontrolle befindliche neoplastische Tumor punktiert und die Nadel 0,5 bis 1 cm in das Tumorgewebe eingeführt wird. Das Produkt wird durch die Ableitung injiziert, und man spült mit 1 bis 2 ml l°/oigem Xylocain in Kochsalzlösung.

Die intratumoralen Injektionen (jeweils 10 mg Produkt) werden beispielsweise während der ersten drei Tage, dann am 10. und am 17. Tag der Beobachtung verabreicht.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen 50

Claims

Patentansprüche:

1. Ganzzellen- oder Zellwandpräparate für die Radio- und Chemotherapie von Tumoren auf der Grundlage von abgetöteten ganzen Zellen oder deren Zellwänden von Mikroorganismen der Stämme Propionibacterium granulosum DSM 1773, Propionibacterium avidum DSM 1772 oder Propionibacterium acnes ATCC 6919.

2. Verfahren zur Herstellung von Ganzzellenpräparaten auf der Grundlage von abgetöteten ganzen Zellen oder von Zellwandpräparaten von Mikroorganismen für die Radio- oder Chemotherapie von Ti moren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen die Stämme Propionibacterium

ίο granulosum DSM 1173, Propionibacterium avidum DSM 1772 oder Propionibacterium acnes ATCC 6919 einsetzt

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Suspensionen von Ganzzellen oder Zellwänden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 0,5 bis 50 mg aktivem Material pro ml Lösung herstellt

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet daß man als Phosphatpuffer einen

Na₂HP(VKH2PO4-Priosphatpurfer mit pH 7,2 einsetzt

5. Verwendung der Präparate nach Anspruch 1 in der Radio- oder Chemotherapie von Tumoren sowie zur

Bekämpfung von Infektionen bei der Chemotherapie des Krebses, insbesondere in Suspensionsform in

phosphs*gepufferter Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 0,5 bis 50 mg aktivem Material pro ml μ Lösung, wobei vorzugsweise als Phosphatpuffer ein NaaHPOVK^POi-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 eingesetzt wird.