DE2152112A1 - Antitumor- und Vaccinzubereitungen - Google Patents
Antitumor- und VaccinzubereitungenInfo
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Description
PAlllilAlfWALTB
D-8000 Mönchen ei · arabeuastrasse 4 · telefon (οβπ) 9ΐιο87
EISAI CO., LTD., Tokyo / Japan
Antitumor- und Vaccinzubereitungen
Die Erfindung "betrifft pharmazeutische Zubereitungen, welche
eine Zellwandkomponente vom Pseudomonas aeruginosa und einen pharmazeutisch zulässigen Träger enthalten. Die Erfindung bezieht
sich insbesondere auf pharmazeutische Zubereitungen, die eine Zellwandproteinkomponente von Pseudomonas aeruginosa,
nachstehend als CWP abgekürzt, und einen pharmazeutischen Träger umfassen. Die Zubereitungen sind wirksam, um das Wachstum
von Tumoren in Tieren mit Einschluß von Menschen zu inhibieren und diese gegen eine Infektion von Pseudomonas aeruginosa zu
immunisieren.
Es ist daher ein Ziel der Erfindung, eine Antitumor- und Vaccinzubereitung in Dosierungsform zur Verfügung zu stellen,
welche CWP und einen pharmazeutischen Träger umfaßt.
CWP wurde als erstes von J. Y Homma et al. isoliert. Es stellt ein Proteinantigen dar, das als eine Zellwandkomponente von
Pseudomonas aeruginosa vorliegt. Es wird auch als ursprüngliches Endotoxinprotein bezeichnet (J.Y.Homma, J.Bacteriol.
8J9, S.630-640, 1964; Ann.New York Acad.Sci. 133, S.508-526,
1966; Zeitschrift für Allg.Mikrobiol. 8, S. 227-248, 1968).
Das Feld der Tumortherapie wird in neuer Zeit sehr gut durchforscht.
Es wurden jedoch nur sehr wenige wirksame Antitumor-
°*IGINAL INSPECTBD
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mittel gefunden, die das Tumorwachstum kontrollieren und
dabei keine ernsten Nebenwirkungen auf die Patienten ausüben.
Es wurde nun gefunden, daß durch die parenterale Verabreichung von CWP an Tumor enthaltende Tiere das Wachstum der Tumoren inhibiert
werden kann.
CWP gemäß der Erfindung zeigt eine starke Inhibierungsaktivität gegen Tumoren, die durch Sarcoma 180 ascites (S-180A) und
Ehrlich ascites carcinoma (EAC) bewirkt werden, welche beide als Standard für die Bewertung von Antitumorsubstanzen verwendet
werden.
Da die meisten der bekannten Antikrebsmittel, die derzeit klinisch
verwendet werden, dazu imstande sind, das Wachstum von Tumoren, die von S-180A oder EAC bewirkt werden, zu hemmen,
folgt daraus, daß CWP auch für die therapeutische Behandlung von Krebskranken wirksam ist.
Da Pseudomonas aeruginosa, wie bekannt ist, im allgemeinen gegenüber den üblichen Antibiotica natürlich resistent ist,
sind die meisten der bekannten Antibiotica zur therapeutischen Behandlung oder Prophylaxe von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen
unwirksam.
Unter den bakteriellen Komponenten von Pseudomonas aeruginosa ist die Verwendung eines Lipopolysaccharid-Proteinkomplexes
(LPS) als Vaccin von Pseudomonas aeruginosa bereits bekannt. Der immunisierende Effekt von LPS, wie bekannt ist, ist jedoch
typenspezifisch. LPS-Vaccin zeigt daher eine selektive Schutzaktivität nur gegen Infektionen von Pseudomonas aeruginosa mit
einem besonderen Sero-Typ. Dieser Umstand ist ein entscheidender Nachteil für die Prophylaxe und Behandlung von Pseudomonas
aeruginosa-Infektionen.
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Es wurde nun gefunden, daß GWP ein ausgezeichnetes Antigen gegenüber Pseudomonas aeruginosa ist. Es ist zu "beachten,
daß CWP fast nicht typenspezifisch ist und daß es unabhängig von dem Sero-Typ des Bacteriums erhebliche Effekte für die
therapeutische Behandlung und die Prophylaxe von Infektionen besitzt, die durch Pseudomonas aeruginosa bewirkt werden.
Ein weiterer Vorteil von OWP bei seiner Verabreichung ist
die niedrige Toxizität und die niedrige Pyrogenese, die ungefähr nur dem zehnten Teil derjenigen entsprechen, die durch
Verabreichung von LPS bewirkt wird. Demgemäß ist CWP als (
Vaccin von Pseudomonas aeruginosa geeignet.
Die chemischen und physikalischen Eigenschaften von CWP variieren bis zu einem gewissen Ausmaß von der Sorte des Bakterienstamms
von Pseudomonas aeruginosa, die zur Produktion verwendet wird.
Im Lichtabsorptionsspektrum zeigt CWP einen ersten Peak bei 275 bis 280 mn. Der zweite Peak liegt bei 410 bis 415 mn und
der dritte Peak bei 550 nm (schwach). CWP enthält 10 bis 16#
Stickstoff, weniger als 5% Zucker, ausgedrückt als Glucose
nach der Anthrone-Methode, 0,03 bis 1,7$ Aminozucker und μ
0,3 bis 2,0$ Phosphor. Die Substanz gehört einem sauren
Protein an, das einen isoelektrischen Punkt bei einem pH von etwa 4,5 besitzt und das in Wasser und in wäßrigen Mineralsäuren
kaum löslich ist, während es in wäßrigem Alkali leicht löslich ist. So sind z.B. 1 mg CWP in 0,1 ml 1/10On NaOH
vollständig löslich.
Bei immunochemisehen Untersuchungen nach dem Agargel-Diffusionstest
wurde bestätigt, daß das CWP kein übliches Antigen zu dem von LPS enthält.
Der therapeutische Effekt des CWP zur Verhinderung des Wachs- ' turns von Tumoren wurde folgendermaßen bestimmt:
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Gruppen von jeweils sechs Mäusen wurden intraperitoneal mit 1 χ 1O^ Zellen von Sarcoma 180 ascites (S-180A) und von
Ehrlich ascites carcinoma (EAC) inokuliert.
Nach 24 Stunden wurden einmal am Tag CWP-Lösungen in verschiedenen
Konzentrationen in physiologischer Kochsalzlösung verabreicht. Die Verabreichungen wurden fünf Tage fortlaufend
weitergeführt. Die Antitumoraktivität wurde bestimmt, indem das gesamte gepackte Zellvolumen (TPCV) in den Asciten gemessen
wurde, die nach sieben Tagen von der Tumorinokulierung
abgenommen worden waren. Die Ergebnisse werden durch das Verhältnis T/C% gezeigt, worin "T" der TPCV-rtert,der bei den
Testproben erhalten wird, und "C" der TPCV-Wert von der Kontrollgruppe,
die nur mit der physiologischen Kochsalzlösung behandelt worden war, ist.
Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Gegen S-180A war die 50$ wirksame Dose (ED50) von CWP
8,5/ug/kg Körpergewicht/Tag und die 90^ wirksame Dose
40/Ug/kg Körpergewicht/Tag.
Gegen EAC war die ED50 von CWP 8,0/ug/kg Körpergewicht/Tag
linri Hi ο ΐίΤί_ _ wm* ^^! .τισ/ΐτσ Κ"ητ·ηοτ·ο·ί:
und die EDg0 war 35/Ug/kg Körpergewicht/Tag.
Nach den 5-tägigen aufeinanderfolgenden Verabreichungen von 5 mg/kg Körpergewicht/Tag von CWP ergab sich eine geringe Verringerung
des Körpergewichts der Mäuse. Es starb jedoch kein Tier. Demgemäß ist die 10% letale Dosis (IiD^0) von CWP größer
als 5 mg/kg Körpergewicht/Tag bei 5-tägigen aufeinanderfolgenden
Verabreichungen. Somit wird dem CWP ein therapeutischer Index (LD.q/EDqq) von mehr als 120 gegeben.
Es ist bislang noch keine Substanz aufgefunden worden, die bereits bei einer so geringen Menge eine wirksame Antitumoraktivität
besitzt oder die einen so großen Unterschied zwischen der wirksamen und der letalen Dosis besitzt, wenn man
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den Vergleich zu der erfindungsgemäßen Substanz CWP zieht.
den Vergleich zu der erfindungsgemäßen Substanz CWP zieht.
Die akute Toxizität (LD,~q) con CWP "bei der Maus war bei intraperitonealer
Verabreichung 37,5 mg/kg Körpergewicht.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können in lomi einer Glasflasche
oder einer Ampulle, welche das CWP in Kombination mit einem pharmazeutisch zulässigen Träger in trockenem Zustand
enthält, zur Verfügung gestellt werden. Als pharmazeutische Träger können Glucose, Mannit, Carboxymethylcelluose und dergl.
verwendet werden.
Die Zubereitungen können zum Gebrauch in destilliertem Wasser oder in physiologischer Kochsalzlösung für die Injektion aufgelöst
werden. Die Lösung kann parenteral auf dem intramuskulären, subkutanen und intraperitonealen Weg verabreicht
werden. CWP kann auch mit Infusionstechniken verabreicht werden.
Zum Zweck der Immunisierung von Menschen gegen Pseudomonas
aeruginosa hat es sich herausgestellt, daß drei bis fünf Verabreichungen auf subkutanem, intramuskulärem oder Intraperitoneal-Injeitionsweg
von 1 bis 100/Ug/Tag von CWP im Intervall von zwei bis drei Tagen zweckmäßig sind. Zur therapeutischen
Behandlung von Patienten, die durch Pseudomonas aeruginosa infiziert sind, kann die Verabreichung der erfindungsgemäßen
CWP-Zubereitungen erforderlichenfalls über mehr als ein Jahr fortgeführt werden, ohne daß ernste Nebenwirkungen auftreten.
Aus den bei Tierversuchen erhaltenen Ergebnissen wird angenommen, daß die parenterale Verabreichung von 5 bis 300/Ug CWP
zur Inhibierung des Tumorwachstums beim Menschen wirksam ist.
Die tirfindung wird in den Beispielen erläutert.
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Beispiel 1
Herstellung von GWP
Ein Pseudomonas aeruginosa-Stamm Typ 1a Nr. 10 wurde in 20 1
eines synthetischen Mediums eingeimpft, welches 0,5$ Glycerin, 2$ Natriumglutamat, 0,56$ Na2HPO4*12H2O, 0,025$ KH2PO4,
0,019$ MgS04'7H20, 0,001$ Ca(NO3)£ und 0,000005$ FeS04*7H20
enthielt.
Die aerobe Kultivierung des Stamms in diesem Medium erfolgte bei 37°C, wobei 0,2 1 sterilisierter Luft je Minute je Liter
des Mediums durchgeleitet wurden. Der pH-rtert des Mediums wurde
automatisch auf 7»4 gehalten. Als die Kultur in eine stationäre Phase eintrat, wurde das Kulturmedium weitere 3 Stunden
inkubiert, worauf die Inkubierung gestoppt wurde.
Es wurde eine Toluolmenge zugegeben, um das Kulturmedium zu autolysieren. Das Autolysat wurde auf einem Filterpapier filtriert.
Zu dem resultierenden Piltrat wurden 400 ml einer wäßrigen 50$igen Zinkchloridlösung gegeben. Der resultierende
Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Zur Auflösung des CWP wurde der Niederschlag mit einer gesättigten
wäßrigen Lösung von Na2HPO4 behandelt und abzentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen Leitungswasser dialysiert. Zu der dialysierten Lösung wurde Natriumacetat mit
einer Endkonzentration von 0,1$ gegeben. Bei einer Temperatur von O0C wurde das sechsfache Volumenverhältnis Aceton zu der
Lösung zugegeben. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und in Wasser aufgelöst. Die wäßrige Lösung wurde einer
Elektrodialyse unterworfen und hierauf lyophilisiert.
Die lyophilisierte Substanz wurde einer Zonenelektrophorese' unterworfen, wobei in einer M/20-Boratpufferlösung vom pH 8,8
ein Polyvinylchloridharz als Trägermaterial verwendet wurde. Als Ergebnis der Trennung wurde gefunden, daß die Substanz
zwei Komponenten mit verochiei^rien Iiobilitäten unter TIV-Ab-
sorptionsmessung bei 280 mn enthielt. Die Fraktion, die einer
Komponente mit der niedrigeren Mobilität entsprach, wurde dialysiert und hierauf lyophilisiert. Die lyophilisierte Substanz
wurde in einer 0,01m Tris-HCl-Pufferlösung vom pH 8,0
aufgelöst und einer Säulenchromatographie auf Sephadex G200 unterworfen. Ein auf diese Weise erhaltenes Hauptband wurde
gesammelt und auf einer Säule von DEAE-Gellulose adsorbiert,
die zuvor mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Die Säule wurde sodann mittels einer Gradientenarbeitsweise
mit wäßrigen Natriumchloridlösungen eluiert.
Die mit 0k2 bis 0,3m Natriumchlorid eluierte Fraktion wurde
dialysiert und lyophilisiert. Auf diese Weise wurde CWP mit einer Ausbeute von 300 mg erhalten.
Die chemischen Eigenschaften von CWP sind wie folgt:
N 13,8 %
P 1,1 %
Zucker 0,01$ nach der Anthrone-Methode
Aminozucker 0,03% nach der Elson-Morgan-
Methode
Protein 85$ nach der Folin-Ciocalteu-
Methode und durch Aminosäurenanalyse
Ein Muster des bei der Erfindung verwendeten Bakterienstamms von Pseudomonas aeruginosa N 10 wurde beim Bureau of American
Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21726 hinterlegt.
Die Antitumoraktivität von CviP wurde an weiblichen Mäusen mit
einem Gewicht von 20 - 2 g des D D N-Stamms im Hinblick auf Sarcoma 180 ascites (S-180A) und von Ehrlich ascites carcinoma
(EAC) untersucht.
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Die Mäuse wurden in Gruppen von jeweils 6 Tieren aufgeteilt. Die Mäuse der Gruppen wurden intraperitoneal mit den obengenannten
Tumorzellen (1 χ 10 Zellen) transplantiert. Nach 24 Stunden wurden intraperitoneal einmal am Tag über fünf Tage
jeder Maus der einzelnen Gruppen CWP-Lösungen verschiedener
Konzentrationen in physiologischer Kochsalzlösung injiziert.
Nach 7 Tagen von der Transplantation wurden von jeder Maus Asciten gesammelt und das darin enthaltene gesamte gepackte
Zellvolumen (TPGV) wurde bestimmt. Das resultierende TPCV wurde in Prozent im Vergleich zu TPCV der Kontrollmäuse angegeben,
denen lediglich die physiologische Kochsalzlösung injiziert worden war (T/C$). Die erhaltenen Ergebnisse sind
in der Fig. 1 graphisch dargestellt.
Die Ordinate der Fig. 1 gibt das Verhältnis T/C% wieder. Die Abszisse
zeigt die logarithmische Dosis von OWP je kg Körpergewicht der Maus je Tag.
Die Figur zeigt eine fast lineare Beziehung zwischen der Tumorwachs
turns inhibierung und der CWP-Dosis. Es wurde gleichfalls
gefunden, daß die IjDq0 und die ED™ von CWP 40/ug/kg Körpergewicht/Tag
und 8,5 /Ug/kg Körpergewicht/Tag waren. Bei Verabreichung von mehr als 100/ug/kg Körpergewicht/Tag zeigten
die Werte das Vorliegen von etwa 10% Zellen. Es wurde auch bestätigt,
daß diese Zellen keine Tumorzellen, sondern polymorphonukleare Leucocyten waren.
Bei diesem Test wurde CWP verwendet, das von dem Typ 1a von Pseudomonas aeruginosa N 10 herrührte. 15/Ug CWP wurden subkutan
männlichen Mäusen des D D N-Stamms mit einem durchschnittlichen Gewicht von 25 g injiziert. Nach dem siebten
Tag nach der Injektion wurden die Mäuse mit Suspensionen von Pseudomonas aeruginosa N 10 in einem 5%igen Schweinemagenmucin
getestet.
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Ähnliche Tests wurden mit Pseudomonas aeruginosa 703 durchgeführt,
das sich von der ersteren Art im Hinblick auf den LPS-Serο-Typ unterscheidet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen
I und II zusammengestellt. Darin finden sich die Zahlen der getesteten Mäuse im Nenner und die Zahlen der toten
Mäuse im Zähler
Zum Test verwendeter Stamm:
Pseudomonas aeruginosa N 10 (Sero-Typ 5)
Anzahl der Bakterienzellen in 0,5 ml einer 0,5#igen Mucin-Lösung, die IP den immunisierten
Mäusen verabreicht worden war
1,5x1O71,5x1061,5x1O51,5x1O41,5x1O5
| Immunisier te Gruppen |
0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
| Kontroll gruppen |
5/5 | 4/5 | 3/5 | 0/5 | 0/5 |
| Tabelle | II |
Zum Test verwendeter Stamm:
Pseudomonas aeruginosa N 10 (Sero-Typ 5)
Anzahl der Bakterienzellen in 0,5 ml einer 0»5%igen Mucin-Lösung, die IP den immunisierten
Mäusen verabreicht worden war
Immunisierte Gruppen Kontrollgruppen
7,5x10' 4/4
7,5x10*
4/4
2/2
4/4
2/2
7,5x10 1/4 4/4
7,5x10 0/4 4/4
7,5x10 0/4 0/3
Aus den obigen Tabellen wird ersichtlich, daß durch Immunisierung mit CWP, das von Pseudomonas aeruginosa N 10 erhalten
worden war, es möglich ist, die Tiere von dem Angriff von Pseudomonas aeruginosa 703 zu schützen, sowie vor einem solchen,
welches einen LPS-Sero-Typ besitzt, der von demjenigen des vorstehenden N 10-Stamms unterschiedlich ist.
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Claims (2)
1. Antitumor- und Yaccinzubereitungen, dadurch gekennzeichnet,
daß sie die Zeilwandproteinkomponente, die von einem Stamm von Pseudomonas aeruginosa isoliert worden ist,
und einen pharmazeutisch zulässigen Träger enthalten.
und einen pharmazeutisch zulässigen Träger enthalten.
2. Antitumor- und Vaccinzubereitungen nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm ein Stamm von Pseudomonas aeruginosa N 10 ist.
209818/1 1 1 1
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2610426A1 (de) * | 1975-03-12 | 1976-11-25 | Univ Tokyo | Therapeutisches mittel zur behandlung der haemorrhagischen pneumonie von nerzen und der rindermastitis, hervorgerufen durch pseudomonas aeruginosa |
| DE2610540A1 (de) * | 1975-03-12 | 1976-11-25 | Univ Tokyo | Prophylaktisches mittel gegen die infektion von nerzen durch pseudomonas aeruginosa |
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-
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- 1971-10-19 DE DE2152112A patent/DE2152112C3/de not_active Expired
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- 1971-10-19 FR FR7137445A patent/FR2111719B1/fr not_active Expired
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| DE2610426A1 (de) * | 1975-03-12 | 1976-11-25 | Univ Tokyo | Therapeutisches mittel zur behandlung der haemorrhagischen pneumonie von nerzen und der rindermastitis, hervorgerufen durch pseudomonas aeruginosa |
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| DE2152112C3 (de) | 1979-10-11 |
| CA993357A (en) | 1976-07-20 |
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| GB1365950A (en) | 1974-09-04 |
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