DE3685744T2

DE3685744T2 - Fraktion von listeria monocytogenes mit therapeutischer wirkung, verfahren fuer ihre herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzung.

Info

Publication number: DE3685744T2
Application number: DE8686116441T
Authority: DE
Inventors: Pasquale Mastroeni
Original assignee: SIBAR Srl
Current assignee: SIBAR Srl
Priority date: 1985-11-26
Filing date: 1986-11-26
Publication date: 1993-02-04
Anticipated expiration: 2006-11-27
Also published as: KR880700669A; IT1186793B; DE3685744D1; EP0230556A1; IT8522989A0; ATE77240T1; JPS63501875A; WO1987003202A1; EP0230556B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue therapeutisch aktive Fraktion, die aus der Gährungsbouillon von Listeria monocytogenes, Stamm L 79 isoliert wurde, das zugehörige Herstellungsverfahren und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Fraktion als aktiven Bestandteil enthalten.
Das einkernige phagocytische System ist ein wichtiges Element der immunitären Abwehr des Wirts gegen Neoplasien (D.O. Adams und R. Snyderman, J. Natl. Cancer Inst., 1979, 16, 1341; J.B. Hibbs, H.A. Chapman und J.B. Weinberg, J. Reticuloendothel., 1978, 24, 549; P.S. Nelson, E.K. Hopper und M. Nelson, Handbook of Cancer Immunology, Bd. I, H. Waters ed., S. 107, Garland Publishing Inc. New York, 1979).
Die Makrophagen können eine bedeutende cytotoxische Aktivität auf Tumorzellen in vitro ausüben, wenn eine Aktivierung erfolgt, die ihren Ursprung in mehreren biologischen Stimulantien haben kann (R. Keller, Immunobiology of the Macrophage, D.S. Nelson ed., S. 487, Academic Press, New York, 1976; L.P. Ruco und M.S. Meltze, Cell. Immunol., 41, 35, 1978).
Verschiedene Mikroorganismen, darunter Mycobacterium bovis (R.C. Bast, B. Zbar, T. Borsos et al, N. Engl. J. Med., 290- 1413-1420, 1458-1469, 1974), Corynebacterium carvum (G. Mathe, P. Puillart und L. Schwarzenberg., Natl. Cancer Inst. Monogr., 35, 361, 1972; L. Israel und B. Halpern, Nouv. Presse Med., 1, 19, 1972), Corynebacterium granulosum (G.Mathe, ibid) und Listeria monocytogenes (S. Youdim, M. Moser und O. Stutman, J. Natl. Cancer Inst., 52, 193, 1974) zeigen bemerkenswerte Wirkungen der Aktivierung von normalen oder geschwächten Makrophagen.
Außerdem beschrieben R.C. et al (J. Natl. Cancer Inst., 54 (3), 749, 1975), wie verschiedene Mikroorganismen, darunter Listeria monocytogenes, die Immunabwehrreaktion des Wirts stimulieren und das Tumorwachstum hemmen können.
In der Tat wurden Substanzen bakteriellen Ursprungs mit immunostimulierenden Eigenschaften schon früher aus Mikroorganismen der Faminie des Corynebacteriums isoliert, wobei diese Substanzen in wässrigem Medium unlöslich sind und chemisch kaum charakterisiert sind und daher industriell und therapeutisch schwierig einzusetsen sind.
Als Beispiel des Standes der Technik für die vorliegende Erfindung kann angeführt werden:
- A.R. Prevot, B.N. Halpern, F. Biozzi, C. Stiffel, D. Mouton, J.C. Morand, Y. Bouthillier und C. Decreusefond (C.R. Aced. Sci., Paris, 1963, 257, Serie D, 13) beschrieben die immunostimulierenden und Antitumoreigenschaften einiger Mikroorganismen der anaeroben Corynebacterium-Species.
Auf die Isolierung der aktiven Fraktion richtete sich eine Anzahl anschließender Studien, unter denen D. Migliore-Samour und P. Jolles (Febs Letters, 1972, 25 (2), 301) die Isolierung einer wasserlöslichen Fraktion beschrieben, die die Adjuvans- Eigenschaften der Darmmikroorganismen behält.
Auf der anderen Seite fanden P. Lallonette, B. Bizzini und M Raynaud (N.G. M. 1975, 25, 13) unter Benutzung des Verfahrens von Migliore-Samour und Jolles bei der Fraktionierung von Corynebacterium granulosum, daß die Adjuvansaktivität und die Immunostimulansaktivität an eine unlösliche Fraktion (mit der Abkürzung P 40) gebunden war und nicht an die wasserlosliche Fraktion (die die Abkürzung S 70 trug).
Diese unlösliche Fraktion, die von B. Bizzini, B. Maro und J. Lallonette (in Medicine et Maladies infectieuses, 78, n. 9, Bd. VIII, Seiten 408-414) unter chemischen und biologischen Gesichtspunkten charakterisiert wurde, zeigte eine besonders interessante therapeutische Aktivitat in Bezug auf den Tumor P 815 in der Maus.
Außerdem zeigten P. Lallonette, B. Maro, A. Schwartz und B. Bizzini (C.R. Acad. Sci., Paris 1975) noch für die unlösliche Fraktion P 40 die Fähigkeit, durch Injektion von Cyclophosphamid die immunogenen Eigenschaften der Bildung von Antikörpern Ram- Anti-Erythrocyten in der geschwächten Maus wiederherzustellen und zu steigern.
Um das Bild des Standes der Technik zu vervollständigen, fanden T. Metianu und B. Bizzini (Französische Patentanmeldung Nr. 8008976, 1980) später eine neue Fraktion, die aus aeroben Bakterien extrahiert wurde und mit Antitumor-, antibakteriellen und die Interferonproduktion induzierenden Eigenschaften ausgestattet war, sowie das zugehörige Herstellungsverfahren.
Andererseits ist die genannte, aus Corynebacterium catarrhalis erhaltene Fraktion ebenfalls in wassrigem Medium unlöslich.
Im Hinblick auf die schon erlangte Kenntnis des möglichen Einflusses von Listeria monocytogenes bei immunodefensiven Prozessen und auf Basis der Hypothese, daß der gleiche Mikroorganismus die zur Aktivierung des Immunsystems befähigten, aktiven Grundbestandteile enthalten oder deren Bildung auslösen kann, war der Hauptzweck der vorliegenden Erfindung die Nachforschung nach und die Isolierung eines solchen aktiven Grundbestandteils, der gleichzeitig mit gut definierten chemischen und physikalischchemischen Eigenschaften ausgestattet und in industriellem Maßstab reproduzierbar ist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die der Isolierung eines aktiven Grundbestandteils, wie dem in dem vorhergehenden Absetz angegebenen Bestandteil, der in einem wässrigen Medium auch löslich ist mit den damit verbundenen bedeutenden Vorteilen der industriellen und therapeutischen Verwendung.
Wie schon erwähnt, wurde die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildende aktive Fraktion (die nachfolgend einfach als LM84 bezeichnet ist) eus einem Stamm der Listeria monocytogenes L 79 erhalten, der bezüglich des Typs am Institut für Mikrobiologie der Universität von Messina isoliert wurde und den folgenden Spezifikationen entspricht:
Listria monocytogenes, Stamm L 79, isoliert aus pathologischem Material und bezüglich des Typs isoliert am Institut für Mikrobiologie von Messina.
- Grampositive Stäbchen, asporogen, aerobisch oder mikroaerobisch; zeigt bei 20-25ºC, selten bei 37ºC eine stürmische rotatorische Beweglichkeit, die vollkommen charakteristisch ist;
- Katalase +
- metachromatische Granula -
- Hämolyse + (beta)
- Säurebildung aus
Glucose +
Lactose -
Maltose +
Mannit -
Solicin +
Saccharose -
Threolose +
Xylose -
Dulcit -
- UVP +
- Äsculinhydrolyse +
- Nitratreduktion -
- Gelatineverflüssigung -
- Urease -
- Argininhydrolyse -
- Simmons Citrat -
- Phenylalanindesaminase -
- Träger des LM-79-Prophagen
Es wird zuerst das Verfahren zur Herstellung der aktiven Versuchsfraktionen beschrieben.

Kultur und Medium

Bacto-Nutrient-Bouillon, entwässert (Difco) 8 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Der pH wird auf 7,2 eingestellt, und das Medium wird 15 Minuten bei 120ºC sterilisiert. Es wird die 30%-ige (Gewicht/Volumen) Glucoselösung, steril, bis auf eineEndkonzentration von 0,2 % zugesetzt.

Kultur

Der lyophile Stamm von Listria monocytogenes L 79 wird in 2 ml Kulturmedium aufgenommen. Die bakterielle Suspension wird in 4 Röhrchen übertragen, die 20 ml Kulturmedium (0,5 ml/Röhrchen) enthalten.
Als die Bakterien die aktive Vermehrung begannen, wurde der Inhalt jedes Röhrchens in einen Erlenmeyer-Kolben übertragen, der 500 ml Kulturmedium enthielt.
Die in jedem Kolben entwickelte Kultur diente zur Bekeimung eines 5 l großen Kolbens (gewöhnlich dient eine 15-stündige Kultur als Impfmittel).
Die Kultur wird nach 48 Stunden unterbrochen. Zu dieser Zeit haben sich die Bakterien an dem Boden des großen Kolbens abgesetzt.
Die überstehenden Flüssigkeit wird abgehebert. Die Bakterien werden durch Zentrifugieren gesammelt und dann wieder in destilliertem Wasser suspendiert, wieder dekantiert und ein zweites Mal immer mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend zentrifugiert.

Herstellung der Fraktion LM 84

Die gewaschenen Bakterien (etwa 1,9 g/l Kultur) werden in einem Soxhelt-Apparat durch die abwechselnden folgenden Behandlungen entlipidiert:
a) 12 Stunden mit Äther-Äthanol (1:1), dann 12 Stunden mit Chloroform und dann weitere 12 Stunden immer mit Chloroform in Mischung mit Methanol (2:2);
b) drei anschließende Behandlungen mit Aceton, wobei jede eine Dauer von 12 Stunden hat.
Die entlipidierten Bakterien werden in einer mechanischen Potter- Homogenisiervorrichtung desintegriert (zehnmal 1 Minute lang mit maximaler Geschwindigkeit; Kühlung in Eis).
Die Suspension der desintegrierten Bakterien wird 5 Stunden bei Raumtemperatur konstant gerührt, bevor sie mit 2000 x g zentrifugiert wird, um die intakten Bakterien zu eliminieren.
Das Überstehende wird auf 80 ºC erwärmt, bevor es durch die Zugabe einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (oder alternativ mit Mono- und Dikaliumphosphat-Puffer, 1,24 M) auf die 40%-ige Sättigungskonzentration eingestellt wird.
Nach einer Nacht bei 4 ºC wird der so gebildete Niederschlag durch Zentrifugieren mit 1000 x g gesammelt.
Der Niederschlag wird wieder in destilliertem Wasser suspendiert und gegen destilliertes Wasser dialysiert, bis die Anwesenheit von Ammoniumsulfat (oder alternativ Kaliumphosphat) nicht mehr feststellbar ist.
Die erhalteneFraktion (etwa 6 mg/g entlipidierte Bakterien), die einer in wässrigen Medien unlöslichen Fraktion entspricht, wird lyophilisiert.
Nach der Lyophilisierung wird sie in Gegenwart von Harstoff in 6M Konzentration (oder alternativ in Gegenwart von Natriumhydrogencarbonat) löslich gemacht.
Wenn das Löslichmachen mit Harnstoff erfolgt, wird eine anschließende Dialyse gegen destilliertes Wasser durchgeführt, bis alle Harnstoffspuren vollständig entfernt sind.
Die Fraktion bleibt selbst nach der Entfernung des löslichmachenden Mediums in einem wässrigen Medium löslich.
Dann wird dieReinigung der aktiven Substanz durch Chromatographie in einer Säule gegen Tris-Puffer auf Sepharose 6 B oder alternativ auf Ultragel Ac A 34 durchgeführt.
Die weiter unten angegebenen Analyseergebnisse stellen Mittelwerte aus einer Gesamtzahl von 10 Chargen dar, die mit dem oben beschriebenen Verfahren der Extraktion und Reinigung erhalten wurden.

Proteingehalt

Die nach der Lowry-Methode durchgeführte Dosierung ergab einen Proteingehalt von 0,75 ± 0,1 mg/mg der aktiven Fraktion LM 84.

Feuchtigkeitsgehalt

Bis zu 10%

Aschen

0,05 bis 0,08 mg Aschen/mg LM 84 (getrocknetes Gewicht).

Neutralzucker (Anthron-Methode)

0,05 bis 2 % neutrale Zucker/mg LM 84.

Hexosamine (Elson-Morgan-Methode)

0,6 bis 1,8 % Hexosamine/mg LM 84.

Molekulargewicht

Das Molekulargewicht wurde bestimmt durch Säulenchromatographie auf Ultragel AcA 34, eingestellt mit den folgenden Bezugssubstanzen: IgG, Rinder-Serumalbumin, Eieralbumin, Myoglobin (Ausrüstung von Pharmacia).
Die Fraktion wird in Form eines einzigen, auf der abwärts laufenden Seite leicht asymmetrischen Peaks eluiert.
Das Molekulargewicht liegt zwischen 290 000 und 330 000 Dalton (Mittelwert: 300 000 Dalton) Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung durch einen Aminosäureanalysator Aminosäure Anzahl der Aminosäurereste je Molekül Summe Cys&spplus; wurde in Form einer CM-Cys bestimmt.
Die Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung wurde in einer dreifachen Weise mittels eines automatischen Beckman-Analysators, Modell Multichrom B 4255, nach der Methode von Spackman (Anal. Chem. 1958, 1190) an einem 24-Stündigen Säurehydrolysat durchgeführt.
Das Methionin wurde nach der Methode von Moore bestimmt (J. Biol. Chem. 1963, 238, 235).
Tryptophan wurde nach der kolorimetrischen Methode von Gaitonde und Dovey (Biochem. J., 1970, 117, 907) bestimmt.

Analyse der pharmakologischen und biologischen Eigenschaften der Fraktion LM 84

Bestimmung der Toxizitätseigenschaften

Die Verarbreichung der Substanz an die Maus auf subkutanem, intramuskulärem und intravenösem Weg bis zu einer Dosierung von 1 mg/Maus (entsprechend 50 mg/kg Körpergewicht) induziert keinerlei toxische Erscheinung.

Analyse der Wirkungen auf das Wachstum der Tumormasse und die Hemmung der Metastasenbildung

T8 von Guerin, ein atypisches transplantierbares Epitheliom wurde benutzt. Der Tumor wurde auf Ratten, Stamm Norvegicus, alle 20 Tage in den subkutanen Rückenbereich transplantiert. In einem zweiten Versuch für die Kontrolle des Einflusses auf die Metastasenbildung wurde die Transplantation in dem gleichen Bereich täglich durchgeführt.
Die Fraktion LM 84 wurde in einer Einzeldosis intravenös (200 ug/Ratte) drei Tage nach der Transplantation des Tumors verabreicht. Wie durch die Wachstumskurve des Tumors T8 Guerin in der Ratte (behandelt und unbehandelt) gezeigt wurde, wird das Wachstum des Tumors T8 durch eine einzige intravenöse Verarbreichung der Verbindung bedeutend gehemmt.
Die Metastasenentwicklung wurde durch die Behandlung mit der Verbindung vollständig gehemmt. Das mittlere Gewicht der Metastase in den unbehandelten Tieren betrug 20 Tage nach der Transplantation 3.196 ± 164 mg.

Phagocytose und intracelluläre Tötung von Candida albicans

Zur Prüfung der Phagocytose und der Tötung von Candida albicans durch die Peritonealmakrophagen wurde die Mikromethode von Smith und Rommel benutzt (J. Immunol. Methods, 1977, 17, 241).
Die phagocytische Aktivität der Peritonealmakrophagen der unbehandelten, tumortragenden Ratten wurde im Vergleich zu den Kontrolltieren bedeutend geschwächt. Die intracelluläre Tötung von C. albicans in den genannten Tieren war unverändert.
Demgegenüber wird in der folgenden Tabelle 1 gezeigt, daß die phagocytische Aktivität der Makrophagen tumortragender Ratten, die mit der Fraktion LM 84 behandelt wurden, auf Werte zurückgestellt wurde, die höher als die der Kontrollmakrophagen waren.
Aus der gleichen Tabelle ist zu ersehen, daß die Aktivität der intracellulären Tötung wesentlich durch die Behandlung mit der Fraktion LM 84 beeinflußt wird, jedoch in einem geringeren Maße als die phagocytische Aktivität (p< 0,001). Wirkung der intravenösen Verarbreichung (nur eine Dosis von 200 ug/ Ratte) der Fraktion LM 84 auf die Phagocytose und die intracelluläre Tötung von Candida albicans in der tumortragenden Ratte Phagocytose % Tötung % Kontrollratte Tumortragende Ratte, unbehandelt Tumortragende Ratte, behandelt mit LM 84 Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Mittelwert von 5 Versuchen, ± Standardfehler. a = bedeutende Differenz (p< 0,0001) gegenüber den unbehandelten tumortragenden Ratten. b = bedeutende Differenz (p< 0,001) gegenüber den unbehandelten, tumortragenden Ratten.

Wirkung der Behandlung mit der Fraktion LM 84 auf die chemotaktische Reaktion der Peritonealmakrophagen.

Das mit Endotoxin aktivierte Rattenserum wurde hergestellt durch Inkubation von normalem Serum mit 1 mg/ml Endotoxin aus Escherichia coli. Die benutzte Methode war die, welche von Maderazo und Waronick beschrieben wurde (eine modifizierte Mikroporenfilter- Untersuchung der Chemotaxis menschlicher Granulocyten, in Quie PG Gallin JL eds., Leukocyte chemotaxis, Raven Press, New York, 1978, S. 43).
Alle Versuche wurden in dreifacher Weise durchgeführt, und der mittlere chemotaktische Index (CI) und die Wanderungsentfernung wurden berechnet.
Die chemotaktische Reaktion der Peritonealzellen tumortragender Ratten wurde im Vergleich zu den Kontrollmakrophagen deutlich geschwächt.
Der chemotaktische Index und die mittlere Wanderungsentfernung der Zellen in u wurden bei den tumortragenden Tieren im Vergleich zu den Kontrollwerten deutlich verringert.
Die Tabelle 2 zeigt, daß die chemotaktische Reaktion der Peritonealzellen, die man in den mit der Fraktion LM 84 behandelten Tieren erhält, deutlich entwickelt ist (p< 0,0001). TABELLE 2 Wirkung der intravenösen Verabreichung (200 ug/Ratte) der Fraktion LM 84 auf die chemotaktische Reaktion der Peritonealmakrophagen in den tumortragenden Ratten Chemotaktischer Index Wanderungsfront Kontrollratten Tumortragende Ratte, unbehandelt Tumortragende Ratte, mit LM 84 behandelt a = bedeutende Differenz (p< 0,001) gegenüber unbehandelten, tumortragenden Ratten; b = bedeutende Differenz (p< 0,0001) gegenüber den unbehandelten, tumortragenden Ratten.

Wirkung der Behandlung mit der Fraktion LM 84 auf die Eigenaktivität anti-HSV-1 der peritonealen Makrophagen

Die Wirkung wurde mit der von Bonina et al beschriebenen Methode (Infect. Immun., 1983, 39, 575) geprüft.
Die anti-HSV-I-Eigenaktivität der peritonealen Makrophagen wurde an mehreren Rattengruppen durch Analyse der Entwicklungskurven des HSV-I bestimmt.
Die folgende Tabelle III bestätigt, daß die Bildung von HSV-I nach 24-stündiger Inkubation in den aus tumortragenden Ratten (p< 0,002) erhaltenen Makrophagen höher war als in den Makrophagen, die aus denKontrollratten oder aus den tumortragenden, jedoch mit der Fraktion LM 84 behandelten Ratten kamen.
Demgegenüber besteht keine statistische Differenz zwischen dem HSV-I-Gehalt der Makrophagen der mit LM 84 behandelten, tumortragenden Ratten im Vergleich zu den Kontrollmakrophagen. TABELLE III anti-HSV-I-Eigenaktivität der Makrophagen von tumortragenden Ratten, die intravenös mit nur einer Dosis LM 84 behandelt wurden (200 ug/Ratte) Bildung von HSV-I in 24 Stunden (PFU/ml) Kontrollratten unbehandelte, tumortragende Ratten Tumortragende Ratten, mit LM 84 behandelt Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Durchschnitt der Werte von 5 Versuchen. a = p< 0,002 im Vergleich zu den unbehandelten, tumortragenden Ratten.

Wirkung der Behandlung mit der Fraktion LM 84 auf die äußere anti-HSV-I-Aktivität peritonealer Makrophagen

Mit der äußeren Aktivität ist der Mechanismus gemeint, durch den die Makrophagen die Virusvermehrung durch Zulassung von Nachbarzellen hemmen können.
Diese Aktivität wurde nach der Methode geprüft, die von Wildy et al (Infect Immun. 1982, 37, 40) beschrieben wurde.
Die äußere anti-HSV-I-Aktivität wurde ausgedrückt als Verringerung des Viruswachstums bei der verwendeten Argininkonzentration (Bonina et al, Virus Res., 1984, 1, 501).
Wie in der folgenden Tabelle IV gezeigt ist, war das auf Vero- Zellen erhaltene HSV-I-Wachstum statistisch nicht verschieden von Zellen, die mit Peritonealzellen von tumortragenden Ratten oder von Kontrollratten inkubiert waren. Dagegen war das HSV-I-Wachstum auf Verozellen, die zusammen mit unterschiedlichen Konzentrationen peritonealer Zellen von mit der Fraktion LM 84 behandelten, tumortragenden Ratten gezüchtet wurden, deutlich verscheiden (p< 0,002; p< 0,001) von den Werten, die man mit Makrophagen unbehandelter, tumortragender Ratten und mit Makrophagen der Kontrollratten erhielt. TABELLE IV Äußere anti-HSV-I-Aktivität der Makrophagen von mit LM 84 behandelten, tumortragenden Ratten Verhältnis Makrophagen/Vero-Zellen Äußere Aktivität Kontrollratten Unbehandelte, tumortragende Ratten Tumortragende Ratten, mit LM 84 behandelt Vero-Zellen a = die Ergebnisse sind ausgedrückt als Wachstum des Virus nach 24-stündiger Inkubation; Mittelwert von 4 Versuchen; b = bedeutender Unterschied (p< 0,002) gegenüber unbehandeltem Träger c = bedeutender Unterschied (p< 0,001) gegenüber den Werten von unbehandelten Trägern.

Reaktion der intravenösen LM-84-Behandlung (200 ug/kg je Tag 7 Tage lang) auf die Verarbreichung von RAM-Erythrocyten (GRM)

Die Hämmoagglutinine wurden in der Schweizer Maus nach dem Verfahren von Biozzi et al (Ann. Inst. Pasteur, 1966, 110, Erg. 3, 7-32) dosiert. Die Ablesung erfolgte nach der Methode auf Mikroplatte (Raynaud et al. Ann. Inst. Pasteur, 1972, 122, 695).
Die Ram-Erythrocyten wurden in einer Dosis von 5 x 10&sup6; Zellen verarbreicht. Aus der Veränderung der die Blutgerinnung herbeiführenden Konzentration als Funktion der Zeit kann im langen Versuchslauf festgestellt werden, daß die die Blutgerinnung herbeiführende Konzentration bei den Kontrolltierten auf sehr niedrigen Werten gehalten wird. Demgegenüber steigt bei den mit der Fraktion LM 84 behandelten Tieren die Konzentration schnell an, und die erreicht den Maximalwert etwa 1 Woche nach der GRM-Injektion.

Bestimmung der Interferon induzierenden Aktivität

Die Versuche wurden an der Schweizer Maus mit einem Gewicht von 20 g durchgeführt. Das Produkt wurde in einer Dosis von 200 ug und einem Volumen von 0,5 ml verarbreicht, während den Kontrolltieren ein gleiches Volumen physiologischer Lösung verarbreicht wurde.
Die Blutabnahme zur Konzentrationsbestimmung erfolgte 1, 2, 4, 8, 24 und 48 Stunden nach der Verarbreichung der Verbindung.
Die Interferonbestimmung erfolgte nach der Methode der Inhibierung der cytopathischen Wirkung unter Benutzung der Zellen- Stämme L929 und des Virus der vesikularen Stomatitis als konkurrierender Virus (Metianu et al, Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 1981, 4, 24).
Die Interferonkonzentration wurde einheitsmäßig unter Bezugnahme auf ein Standardserum eingestellt.
Die Ergebnisse sind in der folgende Tabelle V angegeben: TABELLE V Interferon induzierende Aktivität der intravenösen Behandlung mit LM 84 Interferon in internationalen Einheiten Stunden Träger
Aus den obigen Versuchen mit spezifischer Zielsetzung und Gültigkeit, die nicht gattungstypisch sind, ist zu schließen, daß die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildende Fraktion mit der Abkürzung LM 84 befähigt ist zur
- Inhibierung des Wachstums der Tumormasse und der Metastasenbildung,
- immunostimulierenden Wirkung (Stimulierung der phagocytischen Aktivität); Steigerung der Tötung (Aktivierung der mikrobentötenden Aktivität des Makrophagen); Wiederherstellung der antiviralen Aktivität der Makrophagen;
- Induzierung der Interferonbildung:
- Verstärkung der Antikörperbildung.
Demzufolge kann sie in den onkogenen Formen, bei Infektionen und generell bei allen pathologischen Formen therapeutisch eingesetzt werden, die eine Gefährdung des Immunabwehrsystems umfassen.
Auf Grund der Versuchsbedingung und der Substanzeigenschaften ist es auch möglich, die Verabreichungswege (intramuskulär und intravenös) und die Dosierungen (von 5 x 10&supmin;&sup5; bis 10&sup4; g (50 bis 400 γ) bei nur einer Verabreichung oder periodische Zyklen von 1 bis 3 wöchentlichen Verarbreichungen gemäß dem spezifischen Krankheitsbild) bei dem klinischen Einsatz der Substanz selbst zu benutzen.

Claims

1. Wirksame Fraktion, erhalten aus einer Kultur von Listeria monocytogenes, Stamm L 79, durch Entlipidieren der Bakterien, deren Aufschluß bzw. Desintegration, Fällen mit einem Mittel, das aus Ammoniumsulfat und Phosphatpuffer augewählt ist, Dialysieren gegen destilliertes Wasser, Lyophilisieren der unlöslichen Fraktion, Löslichmachen in Gegenwart einer Verbindung, die aus Harnstoff und Natriumhydrogencarbonat ausgewählt ist, und schließlich Reinigen durch Chromatographie.

2. Wirksame Fraktion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgenden analytischen Eigenschaften hat:

- Proteingehalt nach Lowry: 0,75 ± 0,1 mg/mg der wirksamen Fraktion;

- Feuchtigkeitsgehalt: bis zu 10 %;

- Asche: 0,05 bis 0,08 mg/mg der Trockenmasse der Fraktion;

- Neutrale Zucker (Anthronmethode): 0,5 bis 2 % neutrale Zukker/mg der wirksamen Fraktion;

- Hexosamin (Elson-Morgan-Methode): 0,6 bis 1 % Hexosamin/mg der wirksamen Fraktion;

- Molekulargewicht: zwischen 290,000 und 330,000 Dalton, mit einem Mittelwert von 300,000;

3. Wirksame Fraktion nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende, auf ein nach 24 h erhaltenes Hydrolysat bezogene Aminosäurezusammensetzung hat: Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung mit einem Aminosäureanalysiergerät Aminosäure Zahl der Aminosäurereste je Molekül Aminosäure Zahl der Aminosäurereste je Molekül Gesamt

4. Verfahren zur Herstellung der wirksamen Fraktion nach den vorhergehenden Ansprüchen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Kultivieren von Listeria monocytogenes, Stamm L 79, in einem Nährmedium;

- Sammeln der erhaltenen Bakterien;

- Entlipidieren der Bakterien;

- Aufschluß bzw. Desintegration der Bakterien;

- Fällen einer unlöslichen Fraktion mit einem Mittel, das aus Ammoniumsulfat und Phosphatpuffer ausgewählt ist;

- Dialysieren gegen destilliertes Wasser;

- Lyophilisieren der unlöslichen Fraktion;

- Löslichmachen des Lyophilisats in Gegenwart eines Mittels, das aus Harnstoff und Natriumhydrogencarbonat ausgewählt ist, so daß eine Fraktion erhalten wird, die in einem wäßrigen Medium löslich ist;

- Reinigen durch Chromatographie.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Listeria monocytogenes, Stamm L 79, die folgenden Eigenschaften hat:

- kurzes, grampositives Stäbchen, asporogen, aerob oder mikroaerob; zeigt bei 20 bis 25 ºC, selten bei 37 ºC, eine ganz eigenartige, turbulente rotatorische Beweglichkeit;

- Katalase +

- metachromatische Granula -

- Hämolyse + (beta)

- Säureproduktion aus

Glucose +

Lactose -

Maltose +

Mannit -

Solicin +

Saccharose -

Threolose +

Xylose -

Dulcit -

UVP +

- Aesculinydrolyse +

- Nitratreduktion -

- Gelatineverflüssigung -

- Urease -

- Simmons Citrat -

- Phenylalanindesaminase -

- Träger des LM-79-Prophagen

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Entlipidieren in einem Soxhelt-Apparat durch abwechselnde Behandlungen

a) mit Ether-Ethanol (1:1) für eine Dauer von 12 h,

b) mit Chloroform für eine Dauer von 12 h,

c) mit Chloroform in Form einer Mischung mit Methanol (2:1) für eine Dauer von 12 h,

d) dreimal hintereinander mit Aceton für eine Dauer von jeweils 12 h durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufschluß bzw. die Desintegration in einer mechanischen Homogenisiervorrichtung mit gleichzeitigem Kühlen durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension der aufgeschlossenen bzw. desintegrierten Bakterien zentrifugiert wird, um die intakten Bakterien zu entfernen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die überstehende Schicht des Zentrifugierschrittes auf 80 ºC erhitzt, durch Zustans einer gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat auf 40 % der Sättigungskonzentration eingestellt und eine Nacht lang bei 4 ºC gehalten wird, wobei der Niederschlag danach durch Zentrifugieren gewonnen wird.

10. Verfahren nach Anspruche 9, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von Ammoniumsulfat ein 1,25 m Puffer aus Kaliumdihydrogen- und Dikaliumhydrogenphosphat verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der gewonnene Niederschlag in destilliertem Wasser suspendiert und von dem Ammoniumsulfat oder dem Phosphatpuffer gereinigt wird, wobei eine Fraktion erhalten wird, die in wäßrigem Medium unlöslich ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung durch Dialyse gegen destilliertes Wasser durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die unlösliche Fraktion lyophilisiert wird.

14. Verfahren nach Ansprüchen 4 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Lyophilisat in Gegenwart von 6 m Harnstoff oder von Natriumhydrogencarbonat löslich gemacht wird, wobei danach im Fall des Löslichmachens in Gegenwart von Harnstoff eine Dialyse gegen destilliertes Wasser durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Ansprüchen 4 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die löslich gemachte Fraktion durch Säulenchromatographie gereinigt wird.

16. Arzneimittel nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer Form vorliegt, die wasserlöslich ist und nach Auflösen des lyophilisierten Produkts in destilliertem Wasser für die Verabreichung auf intramuskulärem und intravenösem Wege geeignet ist.

17. Arzneimittel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es 5 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;&sup4; g (50 bis 100 γ) der wirksamen Fraktion enthält.

18. Arzneimittel nach Ansprüchen 16 und 17 für die Verwendung bei der Behandlung der onkogenetischen Formen.

19. Arzneimittel nach jedem der Ansprüche 16 bis 18 für die Verwendung bei der Behandlung von infektiösen pathologischen Zuständen mikrobiellen und viralen Ursprungs.

20. Arzneimittel nach jedem der Ansprüche 16 bis 18 für die Verwendung bei der Behandlung der pathologischen Zustände, bei denen das immunodefensive System angegriffen ist.