DE2710327C3

DE2710327C3 - Verwendung von Benzaldehyd

Info

Publication number: DE2710327C3
Application number: DE2710327A
Authority: DE
Inventors: Mutsuyuki Matsudo Chiba Kochi; Setsuo Tokio Takeuchi
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1976-03-09
Filing date: 1977-03-09
Publication date: 1981-02-12
Also published as: JPS54962B2; AU2307377A; DE2710327B2; US4983636A; GB1573965A; BE852283A; NL7702535A; FR2343475A1; NL172917B; DE2710327A1; FR2343475B1; AU499475B2; CA1093971A; NL172917C; JPS52108027A

Description

Als Carcinostatica sind bisher Antibiotics, wie Mitomycine und Bleomycin, pflanzliche Substanzen, wie Vincristin und PSK, sowie synthetische Carcinostatica, wie Stickstofflost, 5-Fluoniracil (5-FU), Triaziquon und Futraful, verwendet worden. Die meisten dieser bekannten Carcinostatica wurden als Mittel mit einer selektiven Cytotoxizität entwickelt, d. h. Mittel, durch die Krebs durch direkten Angriff auf maligne Zellen behandelt werden kann. Demzufolge wirken diese Mitte! auch auf normale Zellen, sie sind stark toxisch und rufen unerwünschte und ernste Nebenwirkungen hervor. Das aus Pilzen extrahierte Polysaccharid PSK soll eine erhöhte Immunität bewirken. PSK hat zwar eine beträchtliche Wirkung bei Leukämie, hat aber bei anderen Krebsarten fast keine wesentliche Wirkung.

Somit können herkömmliche Carcinostatica nicht allein zur entscheidenden Behandlung von Krebs verwendet werden, sondern sie können nur zusammen mit anderen Mitteln oder als Hilfsmittel bei chirurgischer Behandlung oder Radiotherapie verwendet werden.

In letzter Zeit wurde der carcinostatischen Wirkung von Methylglyoxal erhöhte Aufmerksamkeit geschenkt. Methylglyoxal ist in Säugetierzelleri weit verbreitet und spielt eine Rolle beim Wachstum und bei der Differenzierung von Zellen. Aufgrund der Tatsache, daß die Konzentration von Methylglyoxal in malignen Zellen abnimmt, wurden Versuche gemacht, maligne Zellen durch eine Kontrolle der Aktivität von Glyoxalasen, die Methylglyoxal inaktivieren, zu normalisieren. Es wurde versucht, Inhibitoren für Olyoxalase zu finden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zur Bekämpfung maligner Neoplasien zu entwickeln, das sich durch eine niedrige Toxität auszeichnet und die Immunitätslage der Patienten günstig beeinflußt. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß Benzaldehyd oder eine Einschlußverbindung von Benzaldehyd in einem Cyclodextrin das Wachstum von Tumorzellen hemmt.

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen I und 2 gekennzeichneten Gegenstand.

Im Verlauf von Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, wurde die Wirkung von. Benzaldehyd auf Zellmembranen und die carcinos'.atische Wirkung von Benzaldehyd untersucht. Dabei wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Benzaldehyd und seine Einschlußverbindung in einem Cyclodextrin eine kontrollierende Wirkung auf Tumorzellen von Mäusen hat.

Der erfindungsgemäß verwendete Wirkstoff greift vermutlich Tumorzellp.i nicht direkt an. Die spezifische carcinostatische Wirkung und ihr therapeutischer Effekt beruhen vermutlich auf einem Mechanismus, der sich vom therapeutischen Mechanismus herkömmlicher Chemotherapeutika stark unterscheidet. Der Mechanismus, nach dem Benzaldehyd seine Wirkung ausübt, ist bisher nicht vollständig aufgeklärt Es ist bekannt, daß bei Tumorzellen charakteristische Veränderungen der Membranstruktur auftreten. Die Tumorzellen an sich

ϊ sind sehr aktiv und bauen rasch verschiedene essentielle Substrate ein. Man nimmt an, daß Benzaldehyd die Zellmembranen beeinflußt

Beispielsweise wird der Einbau von radioaktivem Tryptophan in Escherichia coli in Gegenwart von

in Benzaldehyd gefördert, während der Einbau von Nucleinsäuren und anderen Aminosäuren durch Benzaldehyd gehemmt wird. Somit hat Benzaldehyd einen selektiven Einfluß auf die für Escherichia coii charakteristischen Substrat-Umwandlungssysteme.

is Aus einigen Gründen ist anzunehmen, daß diese ..pezifische Eigenschaft von Benzaldehyd in engem

Zusammenhang mit seiner carcinostatischen Wirkung

steht

Nachstehend sind Ergebnisse von Untersuchungen

wiedergegeben, bei denen der Einfluß von Benzaldehyd auf die Aufnahme von verschiedenen Aminosäuren und

Nucleinsäurebasen in Escherichia coli untersucht

wurden.

E. coli W 3110 und E coli S wurden nach dem

nachstehend angegebenen Schema gezüchtet Die Wirkung von Benzaldehyd auf die Aufnahme von Aminosäuren und Nucleinsäurebasen (Thymen, Adenin, Glutaminsäure, Alarän und Tryptophan) durch die Zellmembranen wurde untersucht

jo Tabelle I zeigt ein Fließschema der experimentellen Stufen des Verfahrens, bei dem E. coli W 3110 und E. coli S gezüchtet wurden und Zellen einschließlich Substrat und Benzaldehyd gewonnen' wurden. Gemäß dem Verfahren dieser Tabelle wurde Glucose als Energie-

)-, quelle für Zellen, deren Vermehrung beendet worden war, und Chloramphenicol (CM) zur Beendigung des Zeil Wachstums zugesetzt. »14C-Substrat« bedeutet ein mit einer 14C-Verbindung markiertes Substrat. »Ba« bedeutet Benzaldehyd in verschiedenen Konzentratio-

4Ii nen. In einem getrennten Versuch wurden anstelle der vorgenannten Zusätze ein Gemisch aus Glucose, CM, l4C-Substrat und Colistin zugegeben, wobei die Zellen auf ähnliche Weise erhalten wurden. Colistin wurde als Vergleichssystem für das mit Benzaldehyd versetzte

« System verwendet da Colistin ein Permeationsinhibitor für Zellmembranen (Antibioticum) ist.

Tabelle I

Ecoli(W3ll0, S)
37 C über Nacht

in Casaminsäure oder CR-Medium
vorgezüchlete Zellen (0,3 ml)
i 37 C bis zu einer Extinktion von 0,3 in 30 ml
' des gleichen Mediums

geerntet auf einem Membranfilter
gewaschen mit Tris-HCI (pH-Wert 7,35)
geerntete Zellen

suspendiert in V&B oder CR-Medium

Glucose 0,2%

Zusatz CM 30 oder 40 MCG/ml

von l4C-Subslrat 0,1 oder 0,2>*Ci/ml

BA

37 C- 30 min

gesammelt auf einem Membranfilter
gewaschen mit Tris-l'ulTer
Zellen
I Zählen

Der Einfluß von Benzaldehyd auf die Aufnahme der einzelnen Substrate wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle Il zusammengestellt.

In Tabelle 11 bedeuten die Werte im Zähler je weils die in einem Scintillationszähler gemessenen Werte und die Werte im Nenner geben das Verhältnis (Prozent) zum

Kontrollwert (100 Prozent) an.

Aus den Ergebnissen von Tabelle II ist leicht ersichtlich, daß die Anwesenheit von Benzaldehyd spezifisch die Aufnahme von Tryptophan fördert, während bei den anderen Substraten eine hemmende Wirkung festzustellen ist.

Tabelle II Wirkung von Benzaldehyd auf die Aufnahme von Aminosäuren und Basen

Stamm	W 31IO	Substrat	Einbau (cpm	%)	Benzaldehyd	10 ² ppm	IO~³ ppm
			Kontrolle	Colistin	10"' ppm	1566/77	1891/93
	S			5 ppm	1399/69	3684/83	4246/96
	Thymin	2028/100	333/16	3135/71	2779/68	3203/79
	Adenin	4433/100	1066/23	2842/70	5438/90	5838/96
E. coli,	Glutaminsäure	4067/100	670/16	5283/87	915/134	808/119
	Alanin	6072/ίΟΟ	1009/17	1076/158
E. coli.	Tryptophan	680/100	439/65

Die Ergebnisse einer Untersuchung über die Wirkung von Benzaldehyd auf Veränderungen in den eingebauten Nucleinsäurebasen in Abhängigkeit von der Zeit sind in F i g. 1 dargestellt Die Ergebnisse von entsprechenden Untersuchungen über die Wirkung von Benzaldehyd auf Veränderungen im Einbau von Aminosäuren in Abhängigkeit von der Zeit sind in Fig.2 wiedergegeben, woraus hervorgeht, daß die Aufnahme von Tryptophan mit der Zeit zunimmt

In Fig.3 sind die Ergebnisse von Untersuchungen Ober die Wirkung von Benzaldehyd auf die Abgabe von eingebauten Substraten aus den Zellen wiedergegeben. Daraus geht hervor, daß bei Zusatz von Colistin die Zellmembranen zerstört und die Abgabe bzw. das Ausströmen der Substrate sehr stark ist, während bei Zusatz von Benzaldehyd die Substratabgabe merklich vermindert wird und sich von der entsprechenden Substratabgabe im Kontrollsystem nicht unterscheidet. Somit verursacht Benzaldehyd keine Zerstörung der Zellmembranen.

Fig.3 erläutert die Ergebnisse, die bei vorheriger Zugabe eines von Benzaldehyd freien Substrats zu den Zellen erhalten wurden. Die Zellen wurden in einem Nährmedium, das mit Benzaldehyd behandelt worden war, inkubiert. Das aus den Zellen abgegebene Substrat wurde gemessen.

Fig.4 erläutert die carcinostatische Wirkung von Benzaldehyd anhand eines Überlebenstests bei Mäusen.

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß Benzaldehyd spezifisch die Aufnahme von Tryptophan fördert Daraus kann geschlossen werden, daß Benzaldehyd am aktiven Transport der Zellmembranen beteiligt ist.

. Im allgemeinen sind Ehrlich-Ascites-Tumoren sehr empfindlieh gegen herkömmliche, cytotoxische Card* nostatika. Solide Ehrlich-Tumoren sind demgegenüber relativ wenig empfindlich gegen die meisten der bekannten Carcinostatika. Im Gegensatz dazu wirken die erfindungsgemäß verwendeten Wirkstoffe stark auf solide Tumoren und itvar mehr als auf Ascites-Tumoren. Wie aus dem nachstehend wiedergegebenen Test 3 hervorgeht, zeigt Benzaldehyd eine starke carcinostatisehe Wirkung gegenüber soliden Ehrlich-Tumoren.

Die Toxität von Benzaldehyd beträgt bei subcutaner Injektion bei Ratten (LPw) 5 g/kg. Da Benzaldehyd ein niedriges Molekulargewicht aufweist, wird er vom lebenden Körper schnell ausgeschieden und gibt keinen Anlaß für Nebenwirkungen. Außerdem werden bei kontinuierlicher Verabfolgung von Benzaldehyd an 10 Tagen bei Tagesdosen bis zu 200 mg/kg keine toxischen Wirkungen beobachtet Weiter ist zu erwähnen, daß Benzaldehyd in einem breiten Dosisbereich wirkungsvoll eingesetzt werden kann.

Durch klinische Untersuchungen konnte bestätigt werden, daß maligne Zellen von adenomattsen Carcinomen, squamösen Zeilcarcinomen, Sarcomen und dergl. insbesondere undifferenzierten Tumoren, sehr empfindlich gegenüber Benzaldehyd sind. Ferner kann Benzaldehyd zur Bekämpfung von Leukämie eingesetzt werden. Somit zeichnen sich die erfindungsgemäß verwendeten Wirkstoffe dadurch aus, daß sie bei sehr unterschiedlichen Krebserkrankungen verwendet werden können.

Nachstehend werden die carcinostatische Wirkung, die akute Toxizität und andere Eigenschaften von Benzaldehyd erläutert

1. Carcinostatische Wirkung
Testl

Als Versuchstiere werden 4 Mäuse der ersten Tochtergeneration von C57BL/6 und DBA/2 verwendet, die 6 bis 7 Wochen alt sind. Den Tieren wird unter Verwendung einer Implantalionsnadel in den Rücken subkutan Adenocarcinom 755 implantiert 24 Stunden nach der Implantation werden 04 bis 1,0 ml einer IO-ppm-Suspension von gereinigtem Benzaldehyd in physiologischer Natriumchloridlösung subkutan injiziert. Diese Behandlung wird 9 Tage lang einmal pro Tag durchgeführt. Am elften Tag nach der Implantation wird das Gewicht der Tumoren bej den einzelnen Gruppen festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

	I umorgewicht	Durchschnittliches (iewichI	rcliitites Gewicht
	Ig)	IiI	(%)
Kontrollgruppe	6.1 5.5	5.8 5,8	100
behandeile Gruppe	4.6 2.6	4.1 3,8	65.5

Test

Gemäß dem Verfahren von Test 1 wird eine 3,5prozentige Suspension von gereinigtem Benzaldehyd in einer 30prozentigen wäßrigen Lösung von Glycerin mit einem Gehalt an Polyoxyäthylensorbilanmonooleatintraperitoneal in einer Menge von 0,1 ml einmal täglich injiziert. Die Behandlung wird 9 Tage fortgesetzt. Am elften Tag nach der Implantation wird das Tumorgewichi bei den einzelnen Gruppen festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

rabelle IV	Tumorgewichi Ig)	5.6 3.4	3,S 4.0	7,2 3.5	Durchschnitt liches Gewicht Ig)	relatives (iewichl Ig)
	7.0 3.3				5.90 3.55	100 60
Kontrollgruppe behandelte Gruppe

Test

10 RFVL-Mäuse mit einem Alter von 4 bis 5 Wochen werden als Versuchstiere verwendet. Etwa 10* Zellen/ 0,2 ml Ehrlich-Carcinom werden den Tieren in die rechte Achselhöhle subkutan implantiert. Nach 24 Stunden werden o,25 ml einer 1000 ppm-Suspension von gereinigtem Benzaldehyd in einer biologischen Natriumchloridlösung (entsprechend einer Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal einmal pro

Tabelle V

Tag verabfolgt. Diese Behandlung wird 9 Tage fortgesetzt. Am elften Tag nach der Tumorimplanlation wird das Tumorgewicht bei den einzelnen Gruppen festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt. Bei den Kontrollgruppen und den behandelten Gruppen beträgt die Körpergewichtszunahme während der Testdauer 3.5 g als Durchschnittswert von 10 Mäusen.

Ig)

liches Gewicht Gewicht
IgI Ig)

Kontrollgruppe
behandelte Gruppe

9,0 4,2 3.4 2,6 2.5 2,4 1.2 1,1 1,0 0.5 2.79

3,8 2,4 2,2 0.8 0.8 0.6 0.6 0,5 0.4 0.3 1.24

100
44

Test 4

10 RFVL-Mäuse mit einem Alter von 4 bis 5 Wochen werden als Versuchstiere verwendeL Etwa 10⁶ Zellen/ 0.2 ml Ehrlich-Carcinom werden intraperitoneal implantiert. Nach 24 Stunden wird eine Suspension von gereinigtem Benzaldehyd in 0,85prozentiger biologischer Natriumchloridlösung verabfolgt. Die Behandlung wird !0 Tage fortgesetzt, um festzustellen, wie viele Tiere überleben. Wie sich aus F i g. 4 ergibt, beträgt die Überlebensrate 15,4 Prozent bei intraperitonealer Injektion der Suspension in einer Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht pro Tag und 26,9 Prozent bei einer intraperitonealen Injektion der Suspension in einer Dosis von 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag.

Bei den in F i g. 4 wiedergegebenen Versuchen wird

die Suspension in Dosen von 2530 und 10V. <ng/kg/Tag bei den behandelten Gruppen verabfolgt. Die Kontrolln gruppen erhalten die 0,85prozentige biologische Natriumchloridlösung allein. Die in Klammern angegebenen Werte für die einzelnen Gruppen sind Mittelwerte für die Oberlebensdauer in Tagen und das Oberlebensverhältnis.

TestS
(Klinische Beobachtungen am Menschen)

Hartgelatinekapseln werden unter Verwendung einer Einschlußverbindung von Benzaldehyd in ß-Cyclodex-Irin gemäß dem nachstehenden Beispiel 4 hergestellt Diese Kapseln werden auf oralem Wege einem männlichen Patienten (79 Jahre) verabfolgt, der ar einem Riesentumor im rechten Lungenhilus leidet. Dei

Patient ist shirk geschwächt, hat keinen Appetit und leidet an starken Schmerzen im Brustbereich und an Übelkeit. Ferner scheidet er große Mengen an blutigem Schleim aus

5 Kapseln (jeweils mit 100 g der Einschlußverbindung von Benzaldehyd) werden auf einmal verabfolgt. Diese Behandlu:'t wird viermal täglich durchgeführt. 3 Tage nach der eisten Verabreichung tritt eine Besserung im Allgemeinzustand des Patienten ein. 10 Tage nach Behandlungsbeginn haben sich die vorgenannten Symptome weitgehend verringert. Die Schmerzen des Patienten in der Brust und die Übelkeit haben abgenommen. Die Ausscheidung von blutigem Schleim ist stiirk zurückgegangen. Gleichzeitig hat sich der Appetit gebessert und andere klinische Besserungen lassen sich feststellen.

1 Monat nach der ersten Verabfolgung wird eine

RnnlopntintpruiijjiiihiT ilürch^cfÜhr«. Ej Itjßi *iich C!mC

merkliche Abnahme der Größe des Tumors feststellen.

2. Akute Toxizität

Die akute Toxizität von gereinigtem Benzaldehyd (LDw) beträgt 5 g/kg bei Ratten. Aufgrund seines niedrigen Molekulargewichts wird es vom Körper rasch ausgeschieden. Bei einer intrapcritonealen Injektion von Benzaldehyd über 10 Tage bei einer Tagesdosis bis 200 mg/kg lassen sich keine toxischen Wirkungen feststellen.

Test 6

Triaziquon. welcher ein cytostatischer Wirkstoff in Handelspräparatcn ist, wie beispielsweise aus B. Helwig, Moderne Arzneimittel. Stuttgart. 1972, S. 1099. hervorgeht, und Benzaldehyd wurden an durch SV-40 induzierten proliferierten Nierenzellen der Maus (vgl. P. H. Black und W. P. Rowe. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.. Bd. 114 (1963). S. 721 bis 727) untersucht. Die Wirkung eines Arzneistoffs auf die proliferierten Zellen kann auf der Basis der prozentualen Hemmung bewertet werden, die

Λ U -7..

einem Kulturmedium der Krebszellen erhalten wird, die durch Umwandlung von Nierenzellen der Maus mittels SV-40 zu Krebszellen transformiert worden sind.

Vers.uchsmethodik

Als Zellen werden W2K11-Zellen verwendet, die durch Transformierung von Mäusenierenzellen des Stammes C3H durch SV-40 erhalten wurden. Die Testzellen werden folgendermaßen kultiviert.

(1) 9.4 g Eagle-MEM-Medium werden in 900 Liter destilliertem Wasser gelöst und 15 Minuten bei 120°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden 100 ml Kälberserum sowie 3 bis 5 ml einer 15 Minuten bei 115° C sterilisierten Natriumbicarbonatlösung zugesetzt Der pH-Wert der Lösung beträgt dann 7,1 bis 7.2. Unmittelbar vor der Verwendung des Kulturmediums werden 10 ml einer L-Glutaminlösung (2,92 g/100 ml) zugesetzt, die durch Filtration durch ein mikroporöses Filter sterilisiert worden ist.

Zur Konservierung des Kulturmediums wird Dimethylsulfoxid bis zu einer Endkonzentration von 10% zugesetzt.

(2) Gefrorene Testzellen, die in einer Tiefkühltruhe (-80⁰C) aufbewahrt worden sind, werden bei Raumtemperatur aufgetaut und 5 Minuten bei b70 χ g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und die sedimentierten Zellen werden in 50 ml des Mediums (1) suspendiert. Sodann wird das Kulturmedium in eine Roux-Flasche überführt und bei 37°C kultiviert. Die Zellen vermehren sich und setzen sich am Boden der Roux-Flasche an. Innerhalb 3 bis 4 Tagen ist ein Zellrascn entstanden. Die Kulturlösung wird dekantiert. Sodann werden 10 ml einer Trypsinlösung zugesetzt, die durch Auflösen von 4.7 g Eagle-MEM-Nährmedium. 0,6 g

NäiriüiViuiCiii büi'iäi üi'iu 1 g Trypsin in 500 mi

destilliertem Wasser und Sterilfiltration durch ein mikroporöses Filter hergestellt worden ist. Nach 2-bis 3minütiger Trypsinbehandlung bei Raumtemperatur wird der Überstand dekantiert. Sodann werden weitere 50ml des Nährmediums (I) zugesetzt, und die am Kolben anhaftenden Zellen werden mit einer Pipette ausgewaschen. Es wird eine Zellsuspension erhalten. Ein Teil der Zellsuspension wird in einer Roux-Flasche zur Herstellung einer Vorratskultur gezüchtet.

(3) Zellkultur und Zusatz der zu untersuchenden Verbindung

1.8 ml der Zellsuspension werden in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 mm überführt und 24 Stunden bei 37°C unter einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid und 95% Luft kultiviert.
Sodann wird das Kulturmedium mit 0,2 ml einer 2% Lösung der zu untersuchenden Verbindung versetzt, und die Züchtung wird fortgesetzt.
Der Zustand des Zellwachstums wird täglich unter dem Mikroskop beobachtet. Die Zahl der lebenden Zeiicn wird 4ö Stunden nach Zusatz der I estverbindung gezählt. Die Testverbindung wird in destilliertem Wasser oder Äthanol in einer Konzentration von 2% gelöst und durch ein mikroporöses Filter steril filtriert.

(4) Methode der Zählung der Zellen

48 Stunden nach Zusatz der Testverbindung wird der Überstand der Kulturlösung in der Petrischale verworfen. Die am Boden der Petrischale anhaftenden Zellen werden mit 1,0 ml einer 0,2prozentigen Trypsinlösung behandelt Durch diese Behandlung werden Einzelzellen erhalten. Hierauf wird die Trypsinlösung dekantiert Sodann wird in die Petrischale physiologische Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 1OmM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) versetzt um die Zellen zu suspendieren. Ein oder zwei Tropfen der Zellsuspension werden in eine Erythrocytenzählkammer gegeben. Ein Deckglas wird auf die Zählkammer aufgelegt, und die Zahl der Zellen wird unter dem' Mikroskop bestimmt. Das Hemmungsverhältnis der Testverbindung wird nach folgender Gleichung berechnet:

Hemmungsverhältnis (%) = I

Zahl der Zellen in Gegenwart der Testverbindung
Zahl der Zellen ohne Testverbindune

χ 100

Unter den vorstehenden Bedingungen wurden weiterhin die bekannten Antimetaboliten 6-Mercaptopurin und 8-Azaguanin untersucht.

(5) Versuchsergebnisse

Die Versuchsergebnisse sind in Tabellen Vl und VII zusammengefaßt.

Tabelle VI

Benzaldehyd	Triaziquon	Hemmung
Konzen- Hemmung	Konzen
trution	tration	%
■ig/ml %	_:,g/ml	80
1000 100	50	75
600 85	10	81
300 59	5	81
100 16	I	78
	0,5	70
	0,1	75
	0,05	56
	0,01
Tabelle VII		Hemmung
Testverbindung	Konzen	%
	tration

6-Mercaptopurin	400	56
8-Azaguanin	400	45
	100	15

(6) Zusammenfassung

Triaziquon ist ein Cytostatikum, das die Zellproliferation durch Alkylierung der DNA steuert und oral oder parenteral oder auch unmittelbar in den Tumor gegeben wird. Bei intravenöser Gabe von I riaziquon werden 200 μg täglich gegeDen. Wenn Tumoren unmittelbar behandelt werden, werden 200 bis 300 μκ in den Tumor injiziert.
Benzaldehyd wird parenteral in Tagesdosen im Bereich von 1000 bis 1(X^g/kg gegeben. Dies entspricht einer Tagesdosis von 0,05 bis 500 mg pro Patient (bei Erwachsenen).

Triaziquon wird in einer Menge von 0,2 mg pro Patient gegeben, während Benzaldehyd vorzugsweise in einer Menge von weniger als 200 mg pro Patient verabfolgt wird. Die maximale Tagesdosis für Benzaldehyd beträgt 500 mg pro Patient Die Dosis für Triaziquon entspricht Viooo der Menge von Benzaldehyd.

Gemäß Tabelle VI wird bei einer Maximaldosis von 1000 μg/ml Benzaldehyd ein Hemmungsverhältnis von 100% erhalten. Demgegenüber wird bei der äquivalenten Menge Triaziquon zu 1000 μ§/πιΙ, d. h. 1 μg Benzaldehyd, ein Hemmungsverhältnis von 81% erhalten.

Benzaldehyd zeigt somit eine überlegene Wirkung gegenüber Triaziquon.

Aus Tabelle VII ist ersichtlich, daß Benzaldehyd auch gegenüber den bekannten Antimetaboüten überlegen ist.

(7) Die akute Toxizität (LDw) für Benzaldehyd ist in der Litera'ur wie folgt angegeben:

Ratte, oral, 1300 mg/kg·),³)
". Ratte, subcutan, 5000 mg/kg^J)

Meerschweinchen, oral, 1000 mg/kg

(8) Für Triaziquon ist eine akute Toxizität in der Literatur nicht angegeben. Eigene Untersuchungen

in haben ergeben, daß die LDw für Triaziquon

0,5 mg/kg bei 5 Wochen alten Mäusen des ICR-JCL-Stammes mit einem Körpergewicht von 20 bis 24 g bei intraperitonealer Verabfolgung beträgt. Unter den gleichen Bedingungen beträgt

ι -. die LD_W für Benzaldehyd 300 mg/kg.

Aus den Werten ist ersichtlich, daß Benzaldehyd als sicherer Arzneistoff angesehen werden kann.

Nachstehend werden die Ergebnisse der Bestimmung v» der akuten Toxizität der Einschliißverbiridun⁰ von Benzaldehyd in jS-Cyclodextrin mitgeteilt.

Versuchsmethodik

Die Versuchsmethodik ist die gleiche wie bei der >ί Bestimmung der akuten Toxidität von Benzaldehyd und Triaziquon.

Die Ergebnisse, die LDw der EinschluBverbindung

von Benzaldehyd in ^-Cyclodextrin beträgt 632 mg/kg bei intraperitonealer Injektion an 5 Wochen alte Mäuse

in des ICR-JCL-Stamms mit einem Körpergewicht von 20 bis 24 g.

Hemmungsverhältnis
Versuchsmethodik

Die Versuchsmethodik ist die gleiche wie bei Benzaldehyd und Triaziquon.

Versuchsergebnisse
Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt.

Tabelle VIII	Hemmungsverhältnis
Benzaldehyd-^-Cyclodexirin	Hemmung
Einschlußverbindung
Konzentration	%
μ g/ml	100
600	98
400	37
200	6
100	10
50	0
25

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Toxizität der* Einschlußverbindung noch geringer ist als die von Benzaldehyd. Die Aktivität der Einschlußverbindung ist höher als die von Benzaldehyd. Es wird eine lOOprozentige Hemmung bei einer Konzentration von 600 μg/ml erreicht

') J. M. Taylor et al, Toxicol. Appl. Pharmacou Bd. 6

(1964). S. 378
² D. I. Macht, Arch. Intern. Pharmacodyn, Bd. 27 (1922).

S. 163-174
») P. M. Jenner et a!, Fd. Cosmes. ToxicoL, Bd 2 (1964),

S. 327 bis 328.332

Test 7

Bestimmung der Wirkung von Benzaldehyd auf Hiihnerleukämie(Erythroblastenleukose)

Versuchsmethodik

Für die Versuche werden 78 Tage alte Leghorn-Hühner (Stamm 15) verwendet. Jede Versuchsgruppe besteht aus 7 Tieren. Die Tiere werden mit einer Tagesdosis von IO mg/kg der Einschlußverbindung von Benzaldehyd in ^-Cyclodextrin, entsprechend

Tabelle IX

0,83 mg/kg Körpergewicht Benzaldehyd, behandelt. Eine Kontrollgruppe enthält lediglich 10 mg/kg ^-Cyclodextrin. Die Verbindungen werden dem Futier zugesetzt.

Die Tiere werden mit dem Virus der HiihiK-iieükose in einer Dosis (Infektionseinheileii) von 2 r. 10TCID' 0,2 μI intravenös infiziert (TCID = Tissue Culture Infectious Dose). Gleichzeitig wird mit der Behandlung begonnen.

In Tabelle IX sind die Ergebnisse /usammengefafit:

Ubcrlchcns/cit nach der Infektion. Tilge

X Tage

11 Tage I i Tilge

Durchschnittliche
Übcrlebcni/ell

Tage

behandelte Gruppe
Kontrollgruppe

Der Unterschied in der durchschnittlichen Überlebenszeit (1,1 Tage) für die behandelte Gruppe ist signifikant. Es war bisher kein Krebsmittt! bekannt, das eine derartige Wirkung bei der Hühnerleukämie zeigte.

Nachstehend wird die Dosierung und Verabfolgung von Benzaldehyd erläutert.

Es kann handelsüblicher, gereimter Benzaldehyd als Wirkstoff verwendet werden. Der Benzaldehyd kann durch intravenöse oder subkutane Injektion oder auf oralem Wege in Form von Kapseln oder Tabletten verabfolgt werden. Die Dosierung hängt bei Erwachsenen in gewissem Umfang vom Verfolgungsweg und der Häufigkeit der Verabfolgung ab. Im allgemeinen sind tägliche Dosen von etwa 0.001 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht im Fall von wäßrigen Präparaten und etwa 0,005 bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht im Fall von oralen Präparaten bevorzugt.

Wird Benzaldehyd zu flüssigen Injektions- oder Infusiorspräparaten verarbeitet, so wird er gegebenenfalls zusammen mit anderen pharmakologischen Zusatzstoffen zu Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern verarbeitet. Als Zusätze kommen Suspensionsmittel, Stabilisatoren und Dispergiermittel in Frage. Beispiele für Suspendiermittel sind Glucose, Gelatine und Aluminiumstearagel. Beispiele für Stabilisatoren sind Lecithin, Linolsäure und SorbitanmonooleaL Ferner können nicht wäßrige Trägerstoffe, wie Mandelöl, Kokosöl, raffiniertes Sesamöl und ölester, sowie Antiseptika, wie p-Hydroxybenzoesäuremethylester und Sorbinsäure verwendet werden.

Im allgemeinen enthalten die Präparate etwa 10 bis 100 mg Benzaldehyd in ! 000 ml physiologischer Kochsalzlösung.

Bei oraler Verabfolgung von Benzaldehyd werden vorzugsweise solche Formen verwendet, die leicht im Intestinaltrakt absorbierbar sind, beispielsweise Kapseln.

' Zur Herstellung von Kapseln für die orale Verabfolgung können Bindemittel, wie Gelatine und Sorbit, Frägerstoffe, wie Lactose, Saccharose, Stärke und Glycin, Stabilisatoren, wie Magnesiumstearat und Ascorbinsäure, und Sprengmittel, wie Kartoffelstärke, verwendet werden. Im allgemeinen enthalten die Kapseln etwa 5 bis 50 mg Benzaldehyd.

Benzaldehyd kann in Form eines Pulvers, nämlich einer Einschlußverbindung von Benzaldehyd in einem

9.7
8.6

Cyclodextrin, verwendet werden. Diese Einschlußverbindungen können in enterischen Kapseln und Tabletten enthalten sein.

^■Cyclodextrin und y-Cyclodextrin sind Beispiele für entsprechende Cyclodextrine. Die Einschlußverbindungen können unter Verwendung von gesättigten wäßrigen Lösungen oder durch Kneten hergestellt werden.

Bei dem Verfahren jnter Verwendung von gesättigten wäßrigen Lösungen wird beispielsweise zunächst eine gesättigte wäßrige Lösung von ^-Cyclodextrin hergestellt. Diese Lösung wird mit gereinigtem Benzaldehyd versetzt. Das Gemisch wird im allgemeinen 4 bis 8 Stunden gerührt, wobei sich die Einschlußverbindung als Niederschlag bildet. Beim Knetverfahren wird eine geringe Menge an Wasser zu ^-Cyclodextrin gegeben, so laß sich ein Brei bildet. Dieser Brei wi:d mit gereinigtem Benzaldehyd versetzt. Das Gemisch wird ausreichend lang in einem Mörser nrtpr pinpm Miwhoprät (jplcnptPt wnhei sich eine wasserhaltige Einschlußverbindung bildet.

Die so hergestellten Einschlußverbindungen von Benzaldehyd können direkt verwendet werden. Um diese Einschlußverbindungen zu stabilisieren, können sie mit einem entsprechenden Lösungsmittel, wie Aceton oder Äthanol, gewaschen werden. Durch diese Waschbehandlung wird nicht eingeschlossener Benzaldehyd entfernt, so daß man eine stabile Einschlußverbtndun.g von Benzaldehyd einer bestimmten Zusammensetzung mit einem geringen Wassergehalt erhält. Ferner kann man stabile, im wesentlichen wasserfreie Einschlußverbindungen erhalten, indem man die auf die vorstehende Weise hergestellten Einschlußverbindungen an der Luft oder unter vermindertem Druck trocknet

Enterische Kapseln werden hergestellt, indem man die Einschlußverbindung von Benzaldehyd mit einem eine enterische Kapsel bildenden Material überzieht. Im allgemeinen enthalten die enterischen Kapseln etwa 50 bis 200 mg der EinschluBverbindung. Tabletten lassen sich herstellen, indem man die Einschlußverbindung von Benzaldehyd mit entsprechenden Mengen eines Trägerstoff!., wie Lactose, raffinieiter Saccharose. Glucose oder Stärke, einem Bindemittel, wie-flüssige Stärke, Gummi arabicum, flüssige Gelatine, flüssige Glucose. flüssige raffinierte Saccharose, oder flüssiges CMC: und

einem Sprengmittel oder anderen geeigneten Zusätzen zu einem homogenen Gemisch verarbeitet, das Gemisch granuliert, ejn Aufhellungsmittel, wie fviagnesiumstearat oder Stearinsäure, zusetzt und das erhaltene granulierte Gemisch mit Hilfe einer Tablettiermaschine oder dgl. verpreßt. Ferner lassen sich Tabletten direkt herstellen, indem man Eiaschlußverbindungen von Benzaldehyd direkt verpreßt. Sei Verwendung von entsprechenden Beschichtungsmaterialien lassen sich enterische Tabletten daraus herstellen. Im allgemeinen wird zur Herstellung von enterischen Tabletten ein Film aus einem enterischen Material, wie Celluloseacetophthalat (CAP) oder Cellulosemethacrylat nach einem herkömmlichen Verfahren aufgebracht. Im allgemeinen enthalten die enterischen Tabletten etwa 50 bis 200 mg der Einschlußverbindungen.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Herstellung von Arzneimitteln.

Beispiel 1
lnjektions- und Infusionspräparat

Ein Gemisch aus 5 g pulverförmiger Glucose und 50 mg handelsüblichem, gereinigtem Benzaldehyd wird steril in Ampullen gegeben und verschlossen. Anschließend wird ein Inertgas, wie Stickstoff oder Helium, in die Ampullen eingeführt, die kühl und dunkel aufbewahrt werden. Unmittelbar vor der Verabreichung werden 500 ml einer 0,85prozentigen physiologischen Natriumchloridlösung zu dem Pulver gegeben, um ein flüssiges Präparat zur intravenösen Injektion herzustellen. Dieses Präparat wird durch intravenöse Injektion oder Infusion in einer Menge von 10 bis 500 ml pro Tag verabfolgt Die genaue Menge hängt vom jeweiligen Krankheitszustand ab.

Beispiel 2
Präparat zur Injektion und Infusion

Gemäß Beispiel 1 wird ein flüssiges Präparat zur intravenösen Injektion für leichte Fälle hergestellt, wobei die Menge an handelsüblichem gereinigtem Benzaldehyd 5 mg beträgt. Das Präparat wird durch intravenöse Injektion oder Transfusion in einer Menge von 10 bis 500 ml pro Tag verabfolgt, wobei die genaue Menge vom Krankheitszustand abhängt.

Beispiel 3
Injektionspräparat und Kapseln

Eine Lösung von 30 mg handelsüblichem, gereinigtem Benzaldehyd in 1 g raffiniertem Sesamöl und 100 mg

Aluminiumstearatgel wird in ein Gefäß gegeben un

verschlossen. Anschließend wird ein Inertgas, wi

Stickstoff oder Helium, in das Gefäß geleitet Das Gefä

wird kühl und dunkel aufbewahrt Dieses Präparat wir

~> entsprechend aufgeteilt und subkutan in Mengen von bis 10 ml/Tag, je nach dem Krankheitszustand, injiziert

Ferner wird das vorstehende Präparat in enterisch Kapseln abgefüllt, die jeweils 0,2 ml dieses Präparat

enthalten. Das eingekapselte Präparat wird auf orajer

in Wege in Mengen von 1 bis 10 Kapseln ein bis zehnnia täglich verabfolgt, wobei die genaue Dosis vor

Krankheitszustand abhängt Beispiel 4

^1Ί Enterische Hartkapseln einer Benzaldehyd-

Einschlußverbindung

Eine gesättigte wäßrige Lösung von 100 g handelsüb lichem ^-Cyclodextrin wird mit 1 g handelsüblichen

in gereinigtem Benzaldehyd versetzt Das Gemisch wird ' Stunden gerührt, wobei man 80 g einer Einschlußverbin dung von Benzaldehyd erhält. Nach dem Trocknei dieser Einschlußverbindung erhält man ein stabiles, in wesentlichen wasserfreies Produkt in Pulverform

Γι Anschließend werden 100 mg dieser Einschlußverbin dung in enterische Hartkapseln zur oralen Verabfol gung gefüllt Im allgemeinen werden I bis 10 Kapselr auf oralem Wege ein bis zehnmal täglich verabfolgt, wobei die genaue Dosis von den Krankheitssymptomen

JH abhängt.

Beispiel 5

Enterische Tabletten mit einem Gehalt an einer Benzaldehyd-Einschlußverbindung

Ein homogenes Gemisch aus 49 Teilen der gemäß Beispiel 4 hergestellten Benzaldehyd· Einschlußverbindung mit 49 Gewichtsteilen Lactose und 2 Gewichtsteile Magnesiumstearat wird hergestellt. Dieses Gemisch wird zu Tabletten von 100 mg verpreßt. Diese Tabletten werden mit einer Überzugslösung der nachstehenden Zusammensetzung beschichtet:

Macrogol 6000	8%
Celluloseacetophthalat	4%
Aceton	50%
Essigsäureälhylcster	20%
Äthanol	18%

Im allgemeinen werden 1 bis 20 dieser Tabletten auf -,» oralem Wege ein bis zehnmal täglich verabfolgt, wobei die genaue Dosis von den Krankheiissympiomen abhängt.

Claims

Patentansprüche:

!. Verwendung von Benzaldehyd bei der Bekämpfung maligner Neoplasien.
2. Verwendung der Einschluüverbindung von Benzaldehyd in einem Cyclodextrin bei der Bekämpfung maligner Neoplasien.