DE2043971B2

DE2043971B2 - Antitumorsubstanz aus haemolytischen Streptococcen

Info

Publication number: DE2043971B2
Application number: DE2043971A
Authority: DE
Inventors: Saburo Koshimura; Hajime Okamoto; Susumu Shoin
Original assignee: OKAMOTO HAJIME KANAZAWA (JAPAN)
Current assignee: OKAMOTO HAJIME KANAZAWA (JAPAN)
Priority date: 1969-09-06
Filing date: 1970-09-04
Publication date: 1978-11-23
Also published as: GB1286014A; FR2070674B1; DE2043971A1; FR2070674A1; DE2043971C3; CA928236A; US3810819A; JPS4843841B1

Description

(a) durch Aussalzen eines wäßrigen, zellfreien Extrakts von haemolytischen Streptococcen mit Ammoniumsulfat bei einer 50prozentigen Sättigung, Abtrennen des erhaltenen Niederschlages, Aussalzen der erhaltenen überstehenden Lösung mit Ammoniumsulfat bei einer 80prozentigen Sättigung,

(b) Abtrennen des erhaltenen Niederschlags, Auf- ^1S lösen des Niederschlags in Wasser und Dialyse der Lösung gegen Wasser oder

(ai) durch Aussalzen des wäßrigen zellfreien Extrakts mit Ammoniumsulfat bei einer 80prozentigen Sättigung, Abtrennen des erhaltenen Niederschlags und anschließendes Auflösen in Wasser oder einer Pufferlösung, Aussalzen der Lösung mit Ammoniumsulfat bei einer 50prozentigen Sättigung,

(bi) Abtrennen des erhaltenen Niederschlages und Dialyse der erhaltenen überstehenden Lösung gegen Wasser und gegebenenfalls Gefriertrocknen der gemäß (b) oder (b_t) erhaltenen wäßrigen Lösung (Retentat),

wobei das Aussalzen jeweils bei einem pH-Wert von bis 8,2 durchgeführt wird, hergestellt worden ist

2. Antitumorsubstanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie

(c) durch Behandlung der nach der Dialyse gegen Wasser erhaltenen wäßrigen Lösung (Retentat) mit einem Ionenaustauscher, Gelfiltrationsmittel oder Calciumphosphatgel oder einer Kombination von wenigstens zwei dieser Mittel weiter gereinigt worden ist

3. Verwendung der Antitumorsubstanz nach Anspruch 1 und 2 bei der Bekämpfung maligner Neoplasien.

45

20

25

30

35

40

Es ist bekannt, daß lebende Zellen haemolytischer Streptococcen eine Antitumorakivität besitzen, doch ist diese Antitumorsubstanz in den Zellen gegenüber Temperaturen und anderen physikochemischen Bedingungen sehr instabil. Deshalb ist es schwierig, die Antitumorsubstanz aus den haemolytischen Streptococcen ohne Aktivitätsverminderung zu gewinnen.

Es ist ferner bekannt, eine Antitumorsubstanz aus haemolytischen Streptococcen dadurch zu gewinnen, daß man einen wäßrigen zellfreiien Extrakt der haemolytischen Streptococcen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, versetzt und den erhaltenen Niederschlag abtrennt; vgl JP-AS 1647/63. Diese Substanz enthält große Mengen Proteine und zahlreiche andere Zellsubstanzen. Es besteht daher die Gefahr ungünstiger Nebenwirkungen, und die Heilwirkung gegenüber dem Tumor ist noch nicht zufriedenstellend.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Antitumorsubstanz aus haemolytischen Streptococcen zur unterstützenden Behandlung maligner Tumore in reinerem Zustand ohne Aktivitätsverminderung zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird gemäß dem Kennzeichen der Ansprüche 1 und 2 gelöst

Einen zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Antitumorsubstanz verwendbaren wäßrigen, zellfreien Extrakt lebender Zellen haemolytischer Streptococcen erhält man durch Waschen der lebenden Zellen mit einer physiologischen Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser, mechanisches Zerkleinern oder Lyophilisieren, Behandeln mit Enzymen und Abzentrifugieren des Niederschlags. Beispielsweise werden bei der mechanischen Zerkleinerung die gewaschenen Zellen in einem Mörser zusammen mit Schmirgelpulver oder Aluminiumoxidpulver vermählen, dann mit destilliertem Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung vermischt und hierauf zentrifugiert Die überstehende Lösung enthält die gewünschte Substanz. Nach einem anderen Verfahren kann man die gewaschenen Zellen in physiologischer Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser suspendieren, dann mit kleinen Glasperlchen vermischen und durch mechanisches Schütteln zerkleinern und schließlich nach dem Abzentrifugieren in der überstehenden Lösung die gewünschte Substanz erhalten. Bei Anwendung einer Enzymbehandlung läßt man ein auf die Zellwände der haemolytischen Streptococcen lösend wirkendes Enzym auf die Zellen einwirken. Nach dem Zentrifugieren enthält die überstehende Lösung die gewünschte Substanz.

Zum Aussalzen wird ein wäßriger, zellfreier Extrakt der lebenden Zellen in einen Zellglasschlauch gebracht und die Lösung gegen eine Ammoniumsulfatlösung dialysiert Man kann auch den wäßrigen, zellfreien Extrakt der lebenden Zellen unmittelbar in Teilmengen mit Ammoniumsulfat versetzen. Bei beiden Verfahren ist der pH-Wert neutral oder schwach alkalisch (pH 7 bis 8,2).

Um eine Fraktion einer 50 bis 80prozentigen Ammoniumsulfatsättigung zu erhalten, wird das nachstehende Verfahren bevorzugt

Der wäßrige, zellfreie Extrakt wird zuerst bei einer 50prozentigen Ammoniumsulfatsättigung ausgesalzt und der entstandene Niederschlag abgetrennt Die erhaltene überstehende Lösung wird anschließend bei einer 80prozentigen Ammoniumsulfatsättigung ausgesalzt und der entstandene Niederschlag gesammelt Gegebenenfalls kann man den wäßrigen, zellfreien Extrakt zuerst bei einer 80prozentigen Aänmoniumsulfatsättigung aussalzen und den entstandenen Niederschlag in destilliertem Wasser oder einer Pufferlösung auflösen und dann diese Lösung bei einer 50prozentigen Ammoniumsulfatlösung weiter aussalzen und den erhaltenen Niederschlag abtrennen. Das Aussalzen kann ferner dadurch erreicht werden, daß man die untere Grenze des Ammoniumsulfatsättigungsgrades auf über 50% erhöht oder die obere Grenze auf unter 80% senkt

Die derart erhaltene Antitumorsubstanz wird dann gegen destilliertes Wasser oder eine Pufferlösung dialysiert um das verbliebene Ammoniumsulfat zu entfernen. Die erhaltene Substanz kann dann im gefrorenen oder lyophilisierten Zustand aufbewahrt werden. Die Substanz kann gegebenenfalls weiter gereinigt werden. Zu diesem Zweck wird sie mit einem Ionenaustauscher, einem Gelfiltrationsmittel oder Calciumphosphatgel behandelt Als Ionenaustauscher eignen sich Kunstharze, Cellulose oder Dextrangele, die unter der Bezeichnung »Sephadex« erhältlich sind. Als Gelfiltrationsmittel eignen sich ebenfalls Dextrangele.

Das Calciumphosphatgel kann als solches verwendet werden, jedoch ist es üblich, es in Form von HydroxylapatJt einzusetzen. Eine wäßrige Lösung der Antitumorsubstanz, die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten worden ist, wird dutch eine Säule geführt, die mit dem Ionenaustauscher, Gelfiltrationsmittel oder Calciumphosphatgel beschickt ist Man kann auch die wäßrige Lösung auf einmal in ein Gefäß geben, das diese Mittel enthält, und sie mit diesen Mittehi behändem. Man eluiert mit einer Pufferlösung mit geeignete; Salzkonzentration und geeignetem pH-Wert

Der Ionenaustauscher, das Gelfiltrationsmittel oder das Calciumphosphsigel können auch in einer Kombination von wenigstens zwei dieser Mittel eingesetzt werden. Zum Beispiel kann man die Lösung zuerst mit Dextrangel in Berührung bringen und die daraus eluierte Lösung anschließend mit »DEAE«-Dextrangel behändem. Dadurch kann der Reinigungseffekt noch gesteigert werden.

Die erfindungsgemäße Antitumorsubstanz hat ein hohes Molekulargewicht, wandert nicht durch eine semipermeable Membran und fällt beim Lyophilisieren als weißes Pulver an. Die Substanz ist leicht löslich in Wasser, jedoch unlöslich in organischen Lösungsmitteln. Bevor die Substanz mit Ionenaustauschern, Gelfiltrationsmitteln oder Calciumphosphatgel in Berührung gebracht wird, zeigt sie eine positive Ninhydrin-, Orcinol-, Molish- und Biuret-Reaktion. Ferner zeigt sie ein UV-Absorptionsmaximum bei 260 mu. Jedoch zeigt jo die Substanz, wenn sie mit Ionenaustauschern, Gelfi'trationsmitteln oder Calciumphosphatgel in Berührung gebracht und danach eluiert worden ist, eine sehr schwache Orcinol-Reaktion und ein UV-Absorptionsmaximum bei 280 mu. Weiter ist festzustellen, daß die Substanz vor einer Reinigung mit »DEAE«-Dextrangel IR-Absorptionsbanden bei 1650cm-' und 1520cm-' und außerdem Absorptionsbanden bei 1235 cm-' und 1070 cm-' zeigt, wobei die beiden letztgenannten Absorptionsbanden Nucleinsäuren angehören dürften. Jedoch zeigt die Substanz nach einer Reinigung an »DEAE«-Dextrangel Banden bei 1235 cm-' und 1070 cm-'. Die ähnliche Beobachtung macht man, wenn die Substanz mit einem anderen Ionenaustauscher, Gelfiltrationsmittel oder Calciumphosphatgel behandelt wird.

Die erfindungsgemäße Antitumorsubstanz ist gegen Wärmeeinwirkung sehr instabil. Ihre Aktivität geht vollständig verloren, wenn sie mehr als 10 Minuten auf 70⁰C erhitzt wird. Weiterhin verliert sie fast ihre gesamte Aktivität, wenn sie 1 Stunde auf 37° C erwärmt wird. Jedoch geht ihre Aktivität nicht verloren, wenn sie 1 Stunde bei 23°C aufbewahrt wird. Die erfindungsgemäße Substanz ist auch gegenüber Säuren instabil Eine beträchtliche Inaktivierung findet innerhalb 24 Stunden statt, wenn sie bei 5° C und einem pH-Wert von 5 gehalten wird Jedoch ist die Substanz verhältnismäßig stabil bei einem pH-Wert von 7 bis 8. In diesem Falle kann die Substanz etwa 1 Monat einen gefrorenen Zustand überdauern. Weiterhin ist ein lyophilisiertes t.o Präparat der Antitumorsubstanz bei niedriger Temperatur über einen langen Zeitraum stabil.

Die erfindungsgemäße Antitumorsubstanz hat pro Gewichtseinheit eine beträchtlich erhöhte spezifische Aktivität im Vergleich zu einer bekannten Substanz, die aus wäßrigen, zellfreien Extrakten lebender Zellen gewonnen worden ist Bei einer in-vitro-Antitumoraktivitätsbestimmung nach der Methode von Ayako M ο r i w a k i, »Chemical and Pharmaceutical Bulletin« (Tokyo), Bd. 10 (1062), Seite 462, ist die spezifische Aktivität der Substanz, etwa um das 2- bis 6fache erhöht, bevor sie mit Ionenaustauschern, Gelfiltrationsmilteln oder Calciumphosphat in Berührung gebracht worden ist Nach der Behandlung mit diesen Mitteln wird die Aktivität weiter erhöht, beispielsweise um mehr als das 5fache. Eine Verminderung der Antitumoraktivität der erfindungsgemäßen Substanz während der Gewinnung ist sehr gering. Da die Substanz nur geringe Verunreinigungen enthält, sind ungünstige Nebenwirkungen bei der Verabreichung kaum zu beobachten.

Die spezifische Aktivität pro Gewichtseinheit eines bekannten acetongetrockneten Pulvers, das aus dem wäßrigen, zellfreien Extrakt gewonnen worden ist, wird im Vergleich zur spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes praktisch überhaupt nicht erhöht Demgegenüber erhöht sich die spezifische Aktivität der Antitumorsubstanz der Erfindung um das 2- bis öfache gegenüber derjenigen des wäßrigen, zellfreien Extraktes.

In den Zeichnungen sind in F i g. 1 das Infrarotabsorptionsspektrum der Antitumorsubstanz und in F i g. 2 die UV-Absorptionskurven aus dem Säulenchromatogramm gemäß Beispiel 3 gezeigt

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Die Angabe »% Ammoniumsulfatsättigungsgrad« wird berechnet nach Hofmeister, in »Methods in Enzymology« Band 1, Seite 76 (herausgegeben von S. P. Colowick und N. O. Kaplan, Academic Press Inc, 1955).

Beispiel 1

Streptococcus haemolytus Su ATCC Nr. 21060 wird 20 Stunden in 500 ml Fleischbrühe gezüchtet. Die erhaltene Kulturbrühe wird in 10 Liter eines frisch zubereiteten, 3% Hefeextrakt enthaltenden Mediums (hergestellt durch Auflösen von Hefeextrakt in Wasser, Einstellen des pH-Werts auf 7,4, einstündiges Erhitzen der erhaltenen Lösung auf 100⁰C, Entfernen des Niederschlags nach dem Abkühlen und lOminütigem Sterilisieren der Lösung unter einem Druck von 1 kg/cm²) überimpft und 20 Stunden bei 37° C kultiviert. Sodann wird die erhaltene Kulturbrühe eisgekühlt und zentrifugiert. Der Zellenniederschlag wird zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, hierauf mit 20 g Schmirgelpulver vermischt und in einem Mörser etwa 20 Minuten gemahlen. Dann werden 50 ml kaltes destilliertes Wasser zugegeben, und das Gemisch wird 5 Minuten gerührt und 20 Minuten bei 9000UpM zentrifugiert Der erhaltene Niederschlag wird danach mit 50 ml kaltem destilliertem Wasser versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten gerührt und in gleicher Weise zentrifugiert Die Gesamtmenge beider überstehenden Lösungen beträgt 90 ml. Die überstehende Lösung wird in einen Zellglasschlauch gegeben und etwa 15 Stunden unter Eiskühlung gegen eine 80% gesättigte Ammoniumsulfatlösung, die mit 30prozentigem wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt worden ist, dialysiert Die dialysierte Lösung wird 20 Minuten bei 9000UpM zentrifugiert Der erhaltene Niederschlag wird in 50 ml destilliertem Wasser gelöst und wiederum etwa 15 Stunden gegen eine kalte 50% gesättigte Ammoniumsulfatlösung, die mit 30prozentigem wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt worden ist, dialysiert. Die dialysierte Lösung wird 20 Minuten bei 9000 UpM zentrifugiert und die erhaltene Oberstehende Lösung anschließend etwa 15 Stunden gegen eine kalte 60%

gesättigte Ammoniumsulfatlösung die mit 30prozentigem wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt worden ist, dialysiert Die dialysierte Lösung wird 20 Minuten bei 900OUpM zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird in 30 ml kaltem destillier- s tem Wasser gelöst und etwa 3 Stunden gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert Es werden 0,18 g eines weißen Pulvers erhalten.

Das erhaltene lyophilisierte Pulver wird in kaltem destilliertem Wasser gelöst 1 ml dieser Lösung wird mit 2 ml Bernheimers Basalmedium, d. h. einer Lösung von 66 ml destilliertem Wasser, 675 mg Maltose, 6 ml einer 20prozentigen K.H2PO4-Lösung und 12 ml einer 2prozentigen MgSO₄ ■ 7H₂O-LoSUHg, mit NaOH auf einen pH-Wert von 6,9 eingestellt (im folgenden BBM genannt), und 1 ml einer Suspension gewaschener Ehrlich-ascites-Carcinomzellen in BBm (6 χ 10' Zellen/ml) vermischt und 60 Minuten bei 37° C bebrütet Dann werden jeweils 0,5 ml dieser Lösung ddY-Mäusen intraperitoneal injiziert Zur Kontrolle wird die gleiche Menge destillierten Wassers anstelle der Antitumorsubstanz-Lösung verwendet und in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, behandelt Es wird die Anzahl der überlebenden Tiere nach 60 Tagen seit der Injektion beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammen- 2s gefaßt

Tabelle I

Versuch	Konzen	10,0	)	Anzahl der
	tration	5,0	Beispiel 2	überlebenden
			Mäuse/
		Anzahl der
		getesteten
	(mg/ml)	Mäuse
Antitumorsubstanz nach 20,0	10/10
der Erfindung
desgl.	10/10
desgl.	0/10
Kontrolle	0/10
(destilliertes Wasser

Streptococcus haemolyticus Su-Stamm wird in 160 ml des gleichen, 3% Hefeextrakt enthaltenden Mediums wie in Beispiel 1,20 Stunden gezüchtet Die Kulturflüssigkeit wird bei 10 000 UpM zentrifugiert, und die Zellen werden gesammelt Die erhaltenen Zellen werden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 1000 ml kalter 0,01 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 suspendiert Die Suspension wird mit 750 g kleinen Glasperlchen einer durchschnittlichen Größe von 0,11 mm vermischt Die Zellen werden in mehreren Ansitzen mittels eines Homogenisatori 6 Minuten bei 4000 UpM unter Kühlen zerkleinert Die erhaltene Suspension wird 10 Minuten bei 7000 UpM zentrifugiert Die überstehende Losung wird durch ein Membranfilter filtriert, um die unzentörten Zellen abzutrennen. Von 900 ml des erhaltenen Filtrats werden MO ml unter Rühren und Eiikühhing mit 312 g pulverisierten Ammoniumsulfatkristallen nach

30

35

40

45

50 und nach während etwa 30 Minuten versetzt und anschließend weitere 30 Minuten unter ständigem Rühren gekühlt Dann wird die Lösung 10 Minuten bei 10000 UpM zentrifugiert Die überstehende Lösung wird anschließend durch Zugabe von 114 g feinpulverisiertem Ammoniumsulfat ausgesalzen und zentrifugiert Der erhaltene Niederschlag wird in 70 ml kaltem destilliertem Wasser suspendiert und 3 Stunden gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert Es werden 80 ml Dialysat erhalten. 17 ml der erhaltenen Lösung werden lyophilisiert. Es werden 600 mg eines weißen Pulvers erhalten.

Das lyophilisierte Pulver wird in 0,01 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Diese Lösung wird zur Bestimmung der Wachstumshemmung von Yoshida-Sarcomzellen entsprechend den Angaben in Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo), Bd. 10 (1962), Seite 462, verwendet Der reziproke Wert der Probenkonzentration bei einer 50prozentigen Hemmung wird definiert als »in-vitro-Antitumoraktivität«. Es wurde festgestellt, daß die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit (in-vitro-Antitumoraktivität/Gewicht der lyophilisierten Probe) l,8mal höher ist als die spezifische Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes.

Beispiel 3

Die in Beispiel 2 erhaltene Ammoniumsulfatfraktion wird gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert 54 ml von 80 ml der derart erhaltenen Lösung wird an einer »DEAE-Sephadex-A-50«-Säule mit den Abmessungen 33 x 80 cm, die zuvor mittels einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 äquilibriert worden ist, absorbiert Zum Eluieren werden 15 Liter 0,01 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 kontinuierlich mit 1 m Natriumchloridlösung versetzt so daß die Natriumchloridkonzentration in der Phosphatpufferlösung linear ansteigt Die Eluierungsgeschwindigkeit beträgt 1 ml/Minute. Es werden 10-ml-Fraktionen aufgefangen. In jeder Fraktion wird die in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie für das Produkt in Beispiel 2 bestimmt 128 ml der Fraktionen (Fraktionen Nr. 127 bis 139) werden gesammelt Das Säulenchromatogramm ist aus Fig.2 ersichtlich. Die derart erhaltenen Fraktionen werden etwa 3 Stunden gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert Es werden 206 mg eines weißen Pulvers erhalten.

Analyse: gefunden: C 46,05%, H 7,40%, N 1432%.

Die Substanz wird in einer Phosphatpufferlösung

vom pH 7,2 gelöst Von dieser Lösung wird die in-vitro-Antitumoraktivitlt in der gleichen Weise wie in

Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 5ßmal höher gegenüber der

spezifischen Aktivität eines wäßrigen, zeDfreien Extrak tes und 2£mal höher gegenüber der spezifischen

Aktivität der Ammoniumsulfatfraktionen vor der Reinigung an »DEAE-Sephadex«.

Die nach den Beispielen 2 und 3 erhaltenen Substanzen werden in einer 0,01 molaren Phosphatpuffertöfung vom pH 72 gelöst Die Antitumoraktivitaten der Lösungen werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle Π zusammengefaßt

Tabelle II Beispiel 5

Versuch	Konzen	Anzahl der über
	tration	lebenden Mäuse
		30 Tage nach der Injektion/Anzahl
		der getesteten
	(mg/ml)	Mäuse

Antitumorsubstanz 13,4 8/10

nach Beispiel 3

desgl. 6,7 2/10

desgl. 3,4 0/10

Antitumorsubstanz 36,0 10/10

nach Beispiel 2

desgl. 18,0 6/10

desgl. 9,0 4/10

Wäßriger zellfreier 74,0 10/10

Extrakt

desgL 37,0 8/10

desgl. 18,5 6/10

desgl. 9,3 2/10

Kontrolle (0,01 molare 0 0/10

Phosphatpufferlösung

pH 7,2)

Beispiel 4

In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 120 ml eines wäßrigen, zellfreien Extraktes aus 20 Litern Kulturflüssigkeit erhalten. In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 46,8 g Ammoniumsulfat zu der Lösung zum Aussalzen gegeben. Zu der erhaltenen überstehenden Lösung werden zur Wiederholung der Aussalzung 17,2 g Ammoniumsulfat zugefügt Der derart erhaltene Niederschlag wird in kalter 0,005molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst und gegen eine eine 0,005molare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysieit Es werden 40 ml Dialysat erhalten. 10 ml dieser Lösung werden an einer Säule (2 χ 50 cm) adsorbiert, die mit »TEAE-Cellulose« beschickt war. Die Cellulose wurde zuvor mittels einer 0,005molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert Zum Eluieren werden 125 Liter 0,005molare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 kontinuierlich mit 1 m Natriumchloridlösung vermischt, so daß die Natriumchloridkonzentration in der Phosphatpufferlösung linear ansteigt Es wird mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/Minute eluiert Es werden 10-ml-Fraktionen aufgefangen. In jeder Fraktion wird die in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Es werden 50 ml der Fraktionen mit Aktivitäten (Fraktionen Nr. 68 bis 72) gesammelt Die derart erhaltene Lösung wird etwa 3 Stunden gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert Es werden 23 mg eines weißen Pulvers erhalten. Die derart erhaltene Substanz wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Es wird die in-vitro-Antitumoraktivitlt der Lösung in der gleichen Weise wie beim Produkt des Beispiels 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 20,0mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 2,7mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »TEAE-Cellulose«.

In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 42,5 ml eines wäßrigen, zellfreien Extraktes aus 120 Litern Kulturflüssigkeit erhalten. In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 350 ml dieser Lösung mit 136 g Ammoniumsulfat zum Aussalzen vermischt Zu der erhaltenen überstehenden Lösung werden zur Wiederholung des Aussalzens 50 g Ammoniumsulfat zugegeben. Die erhaltenen Niederschläge werden in einer kalten 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst und gegen eine 0,01 molare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 dialysiert Es werden 50 ml dialysierte Lösung erhalten. 10 ml dieser Lösung werden gesammelt und lyophilisiert Man erhält 200 mg eines weißen Pulvers. 10 ml der verbliebenen Lösung werden an einer Säule (3 χ 50 cm) adsorbiert, die mit »Sephadex G-200« beschickt war, das zuvor mittels 0,1 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 äquilibriert worden war. Die Eluierung wird mittels 0,1 molarer Phosphatpufferlösung und mit einer Geschwindigkeit von 03 ml/Minute durchgeführt Es werden 5-ml-Fraktionen aufgefangen. Die in-vitro-Antitumoraktivität jeder Fraktion wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt 40 ml der Fraktionen mit einer Aktivität (Fraktionen Nr. 33 bis 40) werden gesammelt, etwa 3 Stunden gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert Es werden 24 mg eines weißen Pulvers erhalten.

Das derart erhaltene weiße Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Die in-vitro-Antitumoraktivität der Lösung wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit lie'gt 31,8mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 5,4mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »Sephadex«.

Beispiel 6

10 ml des durch die Ammoniumsulfatbehandlung des Beispiels 5 erhaltenen Dialysats werden an einer Säule (4,5 χ 50 cm) an Hydroxylapatit adsorbiert, der zuvor mittels einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,9 äquilibriert worden war (die Säule wurde aus Calciumphosphatgel nach LJvins Methode in »Methods in Enzymology«, Band 5 [1962J Seite 17 hergestellt). Die Eluierung erfolgt stufenweise mit 1,1 Litern jeweils einer 0,01 molaren, 0,05molaren, 0,!molaren und 0,4molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 63- Die derart erhaltenen Elüate werden in 30-ml-Fraktionen unterteilt Die in-vitro-Aktivität der Fraktionen wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 gemessen. 390 ml der aktiven Fraktionen (Fraktionen

Nr. 142 bis 154; die Konzentration der Phosphatpufferlösung war 0,1 molar) werden gesammelt Die Fraktio nen werden etwa 3 Stunden gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophilisiert Es werden 31 mg eines weißen Pulvers erhalten.

Das derart erhaltene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlosung vom pH-Wert 7,2 gelöst Dann wird die in-vitro-Anu'tumoraktivität der Lösung in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 26,0mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 5,1 mal höher gegenüber der Ammoniumsulfatfnktion vor der Reinigung an Hydroxylapatit

Beispiel 7

In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 410 mg lyophilisiertes Pulver als intracellulare Substanz aus lebenden Zellen von Streptococcus haemolyticus 203 S-Stamm ATCC Nr. 21 546 erhalten. Das erhaltene trockene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7'2 gelöst Bei einem Teil der Lösung wird die in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit (in-vitro-Antitumoraktivität/Gewicht der lyophilisierten Probe) liegt l,8mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes.

Tabelle III Beispiel 8

In der gleichen Weise wie in Beispiel 2 werden 540 mg lyophilisiertes Pulver als intracellulare Substanz aus lebenden Zellen von Streptococcus haemolyticus ATCC 21 548 (»Blackmore«-Stamm) erhalten. Das erhaltene trockene Pulver wird in einer 0,001 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Bei einem Teil der Lösung wird die in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt l,4mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes.

Beispiel 9

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus 203 S-Stamm ATCC Nr. 21 546 des Beispiels 7 wird an einer Säule mit »DEAE-Sephadex« in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 chromatographiert Es werden 135 mg lyophilisiertes Pulver erhalten. Das erhaltene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 eluiert Eine Probe wird zur Bestimmung der in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 verwendet Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 5,2mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität eines wäßrigen, zellfreien Extraktes und 2,8mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »DEAE-Sephadex«.

Beispiel 10

Die in Beispiel 8 erhaltene Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus ATCC Nr. 21 548 (»Blackmore«-Stemm) wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 an einer »DEAE-Sephadex«-Säule chromatographiert Es werden 190 mg lyophilisiertes Pulver erhalten. Die Bestimmung der in-vitro-Antitumoraktivität in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 zeigt, daß die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit 4,8mal höher liegt gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreieu Extraktes und 23mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »DEAE-Sephadex«.

Die in den Beispielen 7, 8, 9 und 10 erhaltenen Substanzen werden jeweils in einer 0,01molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Die Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle ΙΠ angegeben.

Versuch	Konzen	Anzahl der über
	tration	lebenden Mäuse
		30 Tage nach der Injektion/Anzahl
		der getesteten
	(mg/ml)	Mäuse

Antitumorsubstanz ίο nach Beispiel 9

Antitumorsubstanz nach Beispiel 10

Antitumorsubstanz nach Beispiel 7

Antitumorsubstanz nach Beispiel 8

Wäßriger, zellfreier Extrakt von Streptococcus haemolyticus ATCC Nr. 21 546

Wäßriger, zellfreier Extrakt von Streptococcus haemolyticus ATCC Nr. 21 548

Kontrolle (0,01 molare J₅ Phosphatpufferlösung vom pH 7,2)

13,4 6,7 3,4

36,0

18,0

9,0

4,5

36,0

18,0

9,0

4,5

74,0

37,0

18,5

9,3

74,0

37,0

18,5

9,3

8/10 2/10 0/10 7/10 1/10 0/10

10/10 6/10 3/10 0/10

9/10 5/10 2/10 0/10

8/10 6/10 4/10 1/10

9/10 6/10 4/10 1/10

0/10

Beispiel 11

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus 203 S-Stamm ATCC Nr. 21 546 wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 beschrieben an einer Säule mit »TEAE-Cellulose« chromatographiert Es werden 15 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das erhaltene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Die in-vitro-Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 18,7mal höher gegenüber der

so spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 2,5ITIaI höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »TEAE-Cellulose«.

Beispiel 12

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus ATCC Nr. 21 548 (»Blackmore«-Stamm) wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 an einer Säule mit »TEAE-Cellulose« chromatographiert Es werden 21 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 72 gelöst Die in-vitro-Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 gemessen. Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 14,8mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 2£mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »TEAE-Cellulose«.

Beispiel 13

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus 203 S-Stamm ATCC Nr. 21 546 wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 an einer »Sephadex«- G-200-Säule Chromatographien. Es werden 16 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das erhaltene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Die in-vitro-Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt. Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 30,7mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 5,3mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »Sephadex«.

Beispiel 14

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus ATCC Nr. 21 548 (»Blackmore«-Stamm) wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 an einer »Sephadex«-G-200-Säule Chromatographien. Es werden 22 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das erhaltene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Die in-vitro-Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 26,3mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 4,4mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität jo der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an »Sephadex«.

Beispiel 15

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus 203 S-Stamm ATCC Nr. 21 546 wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 an einer Hydroxylapatit-Säule chromatographiert Es werden 20 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das erhaltene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst. Die in-vitro-Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit liegt 25,8mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wilßrigen, zellfreien Extraktes und 5,1 mal höher gegenüber der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an Hydroxylapatit.

Beispiel 16

Die Ammoniumsulfatfraktion von Streptococcus haemolyticus ATCC Nr. 21 548 (»Blackmore«-Stamm) wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 an einer Hydroxylapatit-Säule chromatographiert Es werden 28 mg lyophilisiertes Pulver erhalten.

Das erhaltene Pulver wird in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 gelöst Die in-vitro-Antitumoraktivität wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 bestimmt. Die spezifische Aktivität je Gewichtseinheit war um 22,1 mal höher gegenüber der spezifischen Aktivität des wäßrigen, zellfreien Extraktes und 4,1 mal höher gegenüber der Ammoniumsulfatfraktion vor der Reinigung an Hydroxylapatit.

Inzwischen ist festgestellt worden, daß es sich bei dem gemäß Beispiel 3 hergestellten gereinigten Präparat um ein Protein handelt, das ein Molekulargewicht von etwa 200 000 — bestimmt durch Säulenchromatographie an einem Dextrangel — besitzt.

Die gemäß Beispiel 3,9 und 10 aus drei verschiedenen Species haemolytischer Streptococcen unter sonst gleichen Bedingungen hergestellten Präparate stimmen in ihren physikochemischen Eigenschaften weitgehend überein. Dies berechtigt zu der Aussage, daß aus beliebigen Species haemolytischer Streptococcen die Antitumorsubstanz gewonnen werden kann. In Tabelle IV sind die Eigenschaften der Präparate gemäß Beispiel 3,9 und 10 zusammengefaßt.

Tabelle IV	Präparat gemäß Beispiel 3	Präparat gemäß Beispiel 9	Präparat gemäß Beispiel 10
	+ ± + +	+ ± + +	+ ± + +
Farbreaktionen Ninhydrin Orcin Molisch Burette	280	280	280
UV-Absorption (max; πιμ)	1650 1520	1650 1520	1650 1520
IR-Absorption Hauptbande, cm-¹	46,05 7,40 1432	45,85 738 14,40	46,23 7,45 14,10
Elementaranalyse (%) C H N

Säulenchromatographie an
DEAE-Sephadex
NaCl-Konzentration in Mol/Liter,
bei der produkthaltige Fraktion
eluiert wird

Maximum bei

Bereich bei

0,60 0,45-0,68 0,60
0,42—0,65

0,60
0,46—0,65

Der überraschende technische Fortschritt der Antitumorsubstanz ergibt sich aus folgendem:

Die Antitumorsubstanz der Erfindung ist reiner als das gemäß JF-AS1647/Ί963 hergestellte Präparat

Die gemäß Beispiel 2 und 3 hergestellten Präparate, d. h. ohne und mit zusätzlicher Reinigung an DEAE-Sephadex-A-50 hergestellten Präparate, haben die nachstehend angegebenen pharmakologischen Eigenschaftea Ihre akute Toxität ist deutlich geringer und ihre in-vitro-Antitumoraktivität erheblich verbessert gegenüber dem Präparat der JP-AS1647/1963.

Im Gegensatz zu dem sehr wärmeempfindlichen Präparat der JP-AS 1647/1963 ist das gemäß Beispiel 2 — als das ohne zusätzlichen Reinigungsschritt — hergestellte Präparat bei 23°C innerhalb 1 Stunde unverändert aktiv. Aus der JP-AS1647/1963 ergibt sich, daß das Präparat sehr wärmeempfindlich ist, da ausdrücklich angegeben ist, den wäßrigen zellfreien Extrakt bei Temperaturen von 2 bis 4° C mit dem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit Aceton, zu versetzen, und das Präparat auszufällen.

Aus dem Vergleich des Verfahrens gemäß Beispiel 2 mit dem Verfahren gemäß JP-AS 1647/1963 ergibt sich die höhere Reinheit, die zwangsläufig zu einer geringeren Sensibilisierung und einer geringeren Gefahr des Auftretens eines anaphylaktischen Schocks führt

1. Akute Toxizität

6 Wochen alten ddY-Mäusen mit einem Körpergewicht von 18,5 bis 21,5 g werden die zu untersuchenden Präparate iatraperitoneal verabfolgt Die LDso-Werti (mg/kg) werden nach der Methode von litchfield-Wil coxon berechnet Dabei wird die Mortalität innerhall von 7 Tagen nach Verabfolgung einer einzigen Dosii berücksichtigt

2. in-vitro-Antitumoraktivität

Gemäß Ayako M ο r i w a k i, Chemical and Pharma ceutical Bulletin (Tokyo), Bd. 10 (1962), Seite 462, wire die in-vitro-Antitumoraktivität bestimmt Die in folgen der Tabelle angegebenen Werte sind Relativwerte wobei die Antitumoraktivität von 1 mg Trockensub stanz des zellfreien Extraktes als 1 gesetzt ist

Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt Tabelle V

Substanz gemäß JA-AS 5647/1963

Substanz gemäß Beispiel 2

Substanz gemäß Beispiel 3

Akute

Toxizität

(mg/kg)

Antitumoraktivität

etwa 80

0,88

138 (73-202)·)

1,8

etwa 300

*) 95 Prozent Vertrauensbereich.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

10 Patentansprüche:

1. Antitumorsubstanz aus haemolytischen Streptococcen zur unterstützenden Behandlung maligner s Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß sie entweder