DE2441454C3

DE2441454C3 - Antileukämische proteinhaltige Fraktion und ihre Herstellung

Info

Publication number: DE2441454C3
Application number: DE2441454A
Authority: DE
Inventors: Morio Tokyo Kuboyama; Kazuhiro Yokohama Nagata; Minoru Komae Tokyo Saito; Eiji Narashino Takahashi
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1973-08-30
Filing date: 1974-08-29
Publication date: 1982-01-14
Also published as: GB1461335A; FR2242109A1; CH604723A5; DE2441454B2; DE2441454A1; US4054648A; CA1041010A; SE430123B; JPS5221570B2; FR2242109B1; SE7410972L; JPS5048108A

Description

Die Erfindung betrifft eine antileukämische proteinhaltige Fraktion sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus Placenta, die eine Besserung bei Leukämie bewirkt und das Wachstum maligner Blutzellen inhibiert.

Zur Extraktion physiologisch oder pharmakologisch aktiver Substanzen oder der Reinigung von Placentaextrakten gibt es bereits zahlreiche Veröffentlichungen, darunter solche, bei denen Wirkung gegen Geschwüre oder Krebs angegeben ist. Die Herstellung eines spezifischen Placentaextrakts mit einem therapeutischen Effekt bei Leukämie ist jedoch bisher nicht bekanntgeworden.

Hieda (»Reizotaiban no Seikagaku to Iryokoka« [»Biochemie und therapeutische Wirkung gefrorener Placenta«], Kinbara Shoten, 1965) berichtete vom Vorliegen einer Substanz in der menschlichen Placenta, die gegen Zirrhose wirksam ist. Kimura (Hiroshima Igaku, Bd. 22, 1969, S. 1136) und Saito (Clinical Report, Bd. 3, 1969, S. 543) beschrieben eine antiulcerative Wirkung eines Placentapräparats. Ferner berichtete Byong Ho Chin (Abstract of Papers of the 9th International Cancer Congress 196G, S. 476) von einem Mittel gegen Ehrlich-Sarkom und einem Mittel gegen N-F-Sarkom aus menschlicher Placenta.

Das Präparat gegen Zirrhose nach Hieda wurde folgendermaßen hergestellt:

Eine frische Placenta wurde mit Wasser gewaschen, bei 2 bis 4° C einige Tage lang stehengelassen, danach zerkleinert und 60 min lang gekocht. Die Zubereitung wurde einem Fünftel ihres Volumens mit 1 n-HCI bis zu einem pH von 1,8 versetzt und mit 2 g Pepsin bei 38°C 20 h lang aufgeschlossen. Das aufgeschlossene flüssige Medium wurde bei 3000 U/min 15 min lang zentrifugiert und in eine überstehende Phase und einen Niederschlag aufgetrennt. Die überstehende Phase wurde zur Herabsetzung ihrer Acidität auf einen pH-Wert von 4,4 bis 4,6 durch ein lonenaustauscherharz geleitet; ihr Volumen wurde so eingestellt, daß jeweils 100 g (Feuchtgewicht) Placenta einem Volumen von 100 ml entsprachen. Dieses Präparat wurde als Lösung A bezeichnet. Ferner wurde der Niederschlag mit konzentrierter Salzsäure durch lOstUndiges Erhitzen hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde danach mit Aktivkohle entfärbt, wobei die überschüssige flüchtige Säure durch Verdampfen im Wasserbad entfernt wurde, ind danach einer zweiten Entfärbung unterworfen. Die Acidität der Lösung wurde gleichfalls mit einem lonenaustauscherharz auf einen pH-Wert von 4,4 bis 4,6

herabgesetzt Das Volumen des Eluats wurde so eingestellt, daß jeweils 100 g (Feuchtgewicht) Placenta einem Volumen von 25 ml entsprachen. Dieses Präparat wurde als Lösung B bezeichnet Die Lösungen A und B wurden gemischt, und die Acidität des Ge misches wurde s auf einen pH-Wert von 6,1 bis 6,4 eingestellt Nach Kochen und Reinigung durch Filtration wurde das erhaltene Präparat in Ampullen abgefüllt und für Injektionszwecke sterilisiert Das Präparat stellte eine transparente gelbe Lösung mit einer Dichte von 1 0090 bis 1,0132. einem pH-Wert von 6,1 bis 6,4 und einer Trockendichte von 78,6 bis 823 mg/ml dar und verhielt sich beim Sulfosalicylsäuretest negativ. Der Aschegehalt, der Gesamtstickstoffgehalt und der Aminostickstoffgehalt betrugen 8,0 bis 93 mg/ml, 9,13 bis 11,21 mg/ml bzw. 8,56 bis 10,24 mg/ml. Für den Extrakt wurde eine lipotrope Wirksamkeit, eine Erhöhung der Gewebeatmung der Leber, eine Stimulation der Schilddrüse und des Grundumsatzes kastrierter Tiere und eine günstige Beeinflussung der Zirrhose bei Menschen und Versuchstieren geltend gemacht

Von Byong Ho Chin wurde eine Placentaemulsion hergestellt und zur Gewinnung der überstehenden Phase zentrifugiert. Bei der Zugabe von Alkohol kam es zu einer Ausfällung, die dann durch Papierelektrophore- 2^r> se fraktioniert wurde. Die resultierende Fraktion wurde gegen Wasser dialysiert; das Dialysat und die nicht-dialysierbare Fraktion wurden danach mit Aceton ausgefällt. Für den Niederschlag wurde eine wachstumsinhibierende Wirkung bei Ehrlich-Sarkom und N-F-Sarkom so angegeben.

Eine Heilwirkung gegen Leukämie wurde jedoch bei derartigen Placentaextrakten nicht beschrieben.

Andererseits sind Carbazilchinon (Arakawa, M. et al, Gann, Bd. 61,1970, S. 485), Cytosinarabinosid (Talley, K. et al. Blood, Bd. 21,1963, S. 352), Daunomycin (Tan, C. et al, Caner, Bd. 20,1967, S. 333), Adriamycin (Di Marco, A. et al. Cancer Chemotherapy Reports, Bd. 53,1969, S. 33) und L-Asparaginase (Kidd, G.G. et al, journal of Experimental Medicine, Bd. 98, 1953, S. 565) als to antileukämische Mittel bekannt, die aus natürlichen Materialien, bei deren es sich nicht um Placenta handelt, gewonnen oder auf chemischem Wege hergestellt werden. )edoch zeigen alle diese antileukämischen Mittel keine spezifische Wirkung gegenüber leukämi- t^r, sehen Zellen und bringen aufgrund klinischer Beobachtungen verschiedene Nebenwirkungen wie z. B. Leukopenie, Thrombocyptopenie, Anämie, Hämorrhagie, Erbrechen, Diarrhöe, Fieber, krankhafte Veränderungen der Niere und der Leber und Gelbsucht mit sich. ^r> <> Daher sollten bei der therapeutischen Verabreichung dieser Mittel einige Hilfsmaßnahmen ergriffen werden, um derartige sonst unvermeidbare Komplikationen zu verhindern. Bmerkenswerte therapeutische Ergebnisse sind damit im allgemeinen nicht erzielt worden, da sich aus den Nebenwirkungen ernste Komplikationen ergaben. So besteht die Chemotherapie der Leukämie gegenwärtig ausschließlich darin, eine vorübergehende Remission mit verlängerter Lebensdauer, aber verbunden mit einer zunehmenden Vergiftung des Patienten, herbeizuführen, was nicht als günstiger Heileffekt angesehen werden kann.

Da die bekannten antileukämischen Mittel bezüglich ihrer inhibierenden Wirkung gegenüber leukämischen Zellen nicht spezifisch sind, wurden umfangreiche b5 Untersuchungen mit der Absicht durchgeführt, ein antileukämisches Mittel in entwickeln, das nicht nur selektiv das Wachstum leukämischer Zellen inhibiert, wobei normale Zellen intakt bleiben, sondern auch die abnorme Funktion maligner Zellen korrigiert

Die Erfindung gibt eine antileukämische proteinhaltige Fraktion sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung an. Die erfindungsgemäße proteinhaltige Fraktion stellt einen proteinhaltigen Placentaextrakt dar und is: erhältlich durch

(a) Zerkleinem von Placentagewebe von Mensch, Rind oder Schwein in Wasser oder einer verdünnten physiologischen Salzlösung und Herstellung einer Emulsion,

(b) Ansäuern mit einem Gemisch von 10- bis 30°/oiger wäßriger Essigsäure und 10- bis 20%iger Salzsäure in einem Verhältnis von 25 :75 bis 75 :25 bis zu einer Acidität von 0,5- bis 2,0-n,

(c) Erhitzen der angesäuerten Emulsion für 30 bis 60 min auf 75 bis 90° C und Abkühlenlassen,

(d) Abzentrifugieren der unlöslichen Proteine,

(e) Neutralisieren der Emulsion mit einer alkalischen Lösung,

(Γ) Abzentrifugieren von unlöslichem Material,

(g) Einengen bis auf Vio bis '/30 des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck,

(h) Dialysieren des konzentrierten flüssigen Mediums gegen Wasser oder Filtration durch ein geeignetes. Membranfilter,

(i) Einengen des Dialysats auf V100 bis V200 bzw. des Filtrats auf '/5 bis '/10 des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck,

(j) chromatographische Fraktionierung an Sephadex, wobei die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,96 bis 1,82 mit Sephadex G-25®, die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,35 bis 1,24 mit Sephadex G-15® bzw. die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,35 bis 1,25 mit Sephadex G-10® abgetrennt wird, und

(k) Lyophilisieren der erhaltenen Fraktion.

Die erfindungsgemäße proteinhaltige Fraktion zeigt eine ausgezeichnete antileukämische Wirkung, wobei bisher bei den angewandten Dosen keine auffälligen Nebenwirkungen beobachtet wurden. Der Wirkstoff wird nachstehend als D-Faktor bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der antileukämischen proteinhaltigen Fraktion ist entsprechend durch die oben angegebenen Verfahrensschritte (a) bis (k) gekennzeichnet.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnung erläutert; es zeigen

F i g. 1 bis 3 Chromatogramme konzentrierter Extrakte von menschlicher Placenta, die erfindungsgemäß unter Verwendung von Sephadex G-25, G-15 bzw. G-10 in Schritt (j) zur gelchromatographischen Trennung hergestellt wurden;

Fig.4 das UV-Spektrum der Fraktion 2, die mit Sephadex G-25 aus dem Placentaextrakt erhalten wurde;

Fig.5 das IR-Spektrum der Fraktion 2, die mit Sephadex G-25 aus dem Placentaextrakt erhalten wurde;

Fig.6 die wachstumsinhibierende Wirkung des D-Faktors bei Mäusen auf die Entwicklung von Zellen bei lymphoider Leukämie sowie von normalen Nierenzellen und

Fig. 7 die wachstumsinhibierende Wirkung des D-Faktors auf myelogene leukämische Zellen der Maus.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.

Herstellung einer Placcntacmulsion

und Ansäuern der Emulsion

[Schritte (a) und (b)]

Die Placenta, die gemäß der Erfindung verwendet wird, stammt ν ι in Menschen, Rind oder Schwein; sie ist frisch oder in l Irorenem Zustand leicht handzuhaben und stellt zugleich ein wirtschaftlich günstiges Ausgangsmaterial dar. Die Placenta wird mit einer ausreichenden Menge mehrfach destilliertem Wasser gewaschen; bei Verwendung von gefrorenem Material soll zuvor aufgetaut werden. Es wird steriles Wasser oder Salzlösung in dem Feuchtgcwieht des Materials entsprechender Menge zugegeben. Danach wird die Placenta in Stücke geschnitten und mit einem Gemisch aus wasseriger Essigsäure (2ö bis 30%j und Salzsäure (i bis 20%) in einem Mischungsverhältnis von 25 : 75 bis 75 ; 25 zerkleinert, wobei die Acidität der Emulsion im Bereich von 0,5- bis 2.0-n liegen kann. Durch das Ansäuern sollen die Proteine denaturiert und unlöslich gemacht und das Cytoplasma und das Bindegewebe löslich gemacht werden.

Essigsäure und Salzsäure werden verwendet, da z. B.

ι >

Salpetersäure und Schwefelsäure zur Zersetzung. Nitrierung. Dehydraiation oder Desaminierung der Proteine und Zucker in der Emulsion und zu Schwierigkeiten bei der Extraktion des D Faktors führen können. Phosphorsäure ist ebenfalls nicht günstig, da sie nicht nur zu einer langsameren Extraktion des D-Faktors führt, sondern auch die Aktivität des Faktors je Volumeinheil des gereinigten Extrakts herabsetzt.

Die optimale Acidität liegt aufgrund der experimentellen Untersuchung im Bereich von O.v bis 2.0-n. wie aus den folgenden Ergebnissen zum Extraktlonsgrad und der Aktivität des resultierenden D-Faktors hervorgeht.

Vergleich der einzelnen Fraktionen
hinsichtlich der antileukämischen In vivo-Wirkung

Es wurden insgesamt 13 Proben von Fraktionen mit dem D-Faktor hergestellt, wobei wie in obigem Beispiel mit dem Unterschied verfahren wurde, daß die Acidität im Bereich von 0,1 - bis 2,5-n variiert wurde.

Der Extraktionsgrad wird nach folgender Formel berechnet:

Fxtraktionsgrad =

Trockengewicht der D-Faktor-Fraktion Feuchtgewicht der verwendeten Placenta

Die Aktivität der den D-Faktor enthaltenden Fraktion wurde auf biologischem Wege anhand der Zellentwicklung bei lymphoider Leukämie L5I78Y der Maus bestimmt (Fischer. G. A., Annals of the New· York Academy of Science. Bd. 76. 1958. S. 673). Es wurden 13 verschiedene Testmedien hergestellt, indem jeweils 2 mg von einer der obigen 13 Proben zu 1 ml Nährmedium mit 10% Rinderfctalserum zugegeben wurden; ferner wurde ein Kontrollmedium ohne D-Faktor hergestellt. Der Vergleichsversuch wurde in der gleichen Weise mit dem Unterschied durchgeführt, daß kein D-Faktor im Medium enthalten war. Es wurden L5178Y-Zellen zu einer Zellkonzentration von 10VmI in das Medium eingeimpft. Die Kultur wurde wie üblich inkubiert, worauf die Anzahl der Zellen am sechsten Tag mit einem Hämozytomctcr gezahlt wurde. Die Aktivität des D-Faktors wurde durch die Anzahl der Zellen in 1 ml wiedergegeben. |e kleiner die Anzahl der Zellen ist. umso größer ist die Aktivität des D-Faktors anzunehmen. Es wurde festgestellt, daß eine Acidität von 1.2-n beim Extraktionsvorgang zur höchsten Ausbeute des D-Faktors und zur höchsten Aktivität des D-Faktors pro Gewichtseinheit des Extrakts führte. Wenn der txtraktionsgrad sowie die Aktivität des D-Fakion> bei einer Acidität von 1.2-n zu 100 angenommen werden, betrugen der Extraktionsgrad und die Aktivität des Faktors mehr als 70 bzw. 80 bei Aciditäten im Bereich von 03- bis 2,0-n. Aciditäten außerhalb des Bereichs führten zu einem kleineren Extraktionsgrad und einer kleineren Aktivität des Faktors. Bei einer Acidität von über 2-n kam es zu einer starken Hydrolyse der Placentaproteine und einer Vermehrung von Produkten mit einem Molekulargewicht unter 5000 Dalton bei einem deutlich größeren Extraktionsgrad jedoch war die Aktivität des D-Faktors verringert. Unter einer Acidität von 0.5-n trat keine ausreichende Hydrolyse ein: dementsprechend fielen Ausbeute und Aktivität pro Gewichtseinheit des Extrakts ab. Daraus folgt, daß die Acidität der Emulsion im Bereich von 0.5- bis ZO-n und vorzugsweise bei 1.2-n liegen solL

Der Bereich des Mischverhältnisses von Essigsäure i" mit Salzsäure wurde folgendermaßen bestimmt:

Vergleich der Ergebnisse

bei verschiedenen Mischungsverhältnissen von

Essigsäure und Salzsäure

)> Es wurden Extrakte wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei jedoch das Mischungsverhältnis der zum Ansäuern verwendeten Säuren variiert wurde, wie in Tabelle 1 angegeben ist. in der auch die erhaltenen Ergebnisse aufgeführt sind. Ein Mischungsverhältnis

■»" von Essigsäure zu Salzsäure von 35 :65 lieferte das beste Ergebnis hinsichtlich des Extraktionsgrads und der Aktivität des D-Faktors, je größer der Anteil an Salzsäure war, umso größer war der Extraktionsgrad und umso kleiner die Aktivität des D-Faktors. Andere

·>"> Werte des Verhältnisses lieferten eine geringere Aktivität als das Verhältnis 35 :65. Wenn der Extraktionsgrad und die Aktivität beim Verhältnis 35 :65 als 100 angesetzt werden, fällt das Mischungsverhältnis, das Werte von 70 für den Extraktionsgrad und 80 für die

"><> Aktivität des D-Faktors liefert, in den Bereich von 75 : 25 und 25 : 75.

Daraus ergibt sich, daß dss Mischungsverhältnis von Essigsäure und Salzsäure im Bereich von 25 :75 bis 75 .25 liegt und mit 35 :65 optimal ist.

Erhitzen [Schritt (C)]

to Die angesäuerte Emulsion wurde zur Denaturierung der Proteine und zum Löslichmachen des Cytoplasmas und des Bindegewebes erhitzt. Mehrstündiges Erhitzen bei höherer Temperatur kann zu einem Abbau des Placentamaterials unter vermehrter Bildung von Pro-

b5 dukten mit niedrigem Molekulargewicht führen, wodurch zwar die Menge der extrahierbaren Substanzen erhöht, jedoch die Aktivität des D-Faktors pro Gewichtseinheit des Extrakts herabgesetzt wird.

Tabelle 1

1 ".si}:- SaI/-s.ulic saure

90
S 5
SO
75
70
()5
60
SS

50
-45
40
35
30
25
20
15
10
S
0

0
S

IO
IS
2o
25
30
35
40
45
50
55

60
65
70
75
80
85
90
95
HK)

I vlrakliiinsiir.nl (" I

0.05

0.07

(1.07

0.10

0.11

0.

0.13

0.14

0.15

I v'.rak-

iKllls-I IHk¹V

AkIlS llal Ik¹S

I)-I aktors

5(1

^l>2

KK)

100

KK)

107

\ crgleiclisNersuch
(Medium ohne D-Iaklor)

1.(IX K)" l.OX 1(1' 1.0 X Kl 7.5 X K)' 6.0X 10' 4.5 X K)¹

4.5 X 10' 4.3 X K)' 4.2 X K)'

4.2 · K)⁴

4.3 >. K)' 3.9 X K)¹ 3.XX K)⁴

3.6 X K)⁴ 4.0X 10' 4.0X K)⁴ 5.5 X K)⁴ 6,OX K)⁴ l.OX 10' l.OX 10' 1.2 X K)'

8.5 X K)'

AkIl¹. il.ilsilllk'i lies D-1-.iUois

36 36 3(> 48 60 80 80 83 85 85 83 92 94 100 90 90 65 60 36 36 30

Der folgende Versuch vi urde durchgeführt, urn dicoptimalen Bedingungen für das Erhitzen zu ermitteln. Es wurden insgesamt 9 Placentaextrakte nach Beispiel 1 mit dem Unterschied hergestellt, daß die Erhit/ungstemperatur im Bereich von 55 bis 95^CC variiert wurde, indem nach 40minüiigem Erhitzen jeweils um 5'C erhöht wurde. Der Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors jeder Zubereitung wurden wie oben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. 40 min Erhitzen auf 80'C lieferte die besten Ergebnisse für den Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors. Wenn der Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors bei 8O⁰C und 40 min mit angesetzt werden, ergab sich für Temperaturen im Bereich von 75 bis 90⁰C und eine Erhitzungsdauer von 40 min ein Wert von über 70 für den Extraktion«,grad und über 80 für die Aktivität des D-Faktors. Erhitzen bei Temperaturen außerhalb des Bereichs von 75 bis 9O°C führte zu weniger günstigen Ergebnissen bezüglich beider Parameter.

Tabelle 2

Erhit-	Extrak	Extrak	Aktivität des	Aktivita ts-
zungs-	tionsgrad	tions-	D-Faktors	index des
tempe-	(%)	index		D-Faklors
ratur( C)

55	0,02	15
60	0,02	15
65	0,04	30
70	0,08	60
75	0,12	92
80	0.13	100

5,0XlO⁴ 5,0XlO⁴ 4,1 X 10⁴ 4,2XlO⁴ 3,8XlO⁴ 3,5XlO⁴

70 70 85 83 92 100 I ihn-/Lillys-

I vli.ik-

0.14
0.15
0.18

1 vli.ik-Huns·

HHk¹V

107
115
138

\kliul.it ik's HlIMl.its-

I)-I .ikliiis inikv lies

I)-I -ilklels

Vergleichsversuch
(Medium ohne D-l-'uklor)

3.8 X Kl'
4.3 X 10'
4.7 X K)'

8.7 X K)'

92
81

74

Ferner wurden 7 Extrakte wie in Beispiel 1 bei einer l-rhitzungstemperatur von 80'C mit dem Unterschied hergestellt, daß die Erhit/ungsdauer im Bereich von 10 bis 70 !tun jeweils mil einer Verlängerung UiTi 10 min variiert wurde. Der Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors wurden wie oben ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

hineile 3

l-.rhit-	1 vlr.ik-	Ivtr.ik-	\kli\ i.il lies	AkllMMls-
/Ul^s-	txinsprad	liiins-	I)-I .IkKHS	HHk¹V lies
ΐΙ.ΗΚΊ	C I	i nil e ν		I)-I .iklois
(MUM)
IO	0.01	1	!.0X K)"	35
20	0.05	36	5.0X K)'	70
30	0.12	86	3.8 X 10'	92
40	0.14	KKJ	3.5 X K)'	100
50	0.15	107	3.6 X 10"	97
60	0.15	107	3.6 X 10'	97
70	0.17	121	4.5 X 10'	77
Vergleich	sbeispiel		8.6 X 10'	-
(Medium	ohne I)-Faktor)

Wie aus den obigen Ergebnissen zu ersehen ist. liefert 40 min Erhitzen auf 80^cC die besten Ergebnisse bezüglich des Extraktionsgrads und der Aktivität des D-Faktors.

Wenn der Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors bei den oben angeführten optimalen Bedingungen als 100 gesetzt wird, liefert eine Erhitzungsdauer im Bereich von 30 bis 60 min mit einer Temperatur von 80 C Werte von über 70 für den Extraktionsgrad und über 80 für die Aktivität des D-Faktors. Außerhalb des angegebenen Bereichs liegende Werte erwiesen sich als nicht günstig.

Entfernung der Proteinsubstanz

und Einsteilung des pH-Wertes

[.Srhriite(ri)nnH(e)]

Ein Teil der Placentaproteine wurde durch Erhitzen im sauren Medium unlöslich gemacht. Die unlöslichen Proteine wurden abzentrifugiert. Die Oberstehende Phase wurde mit einer alkalischen Lösung, vorzugsweise mit wässerigem Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, neutralisiert. Eine maximale Abtrennung der Proteine wurde durch Zentrifugieren im sauren pH-Bereich erzielt, da einige Proteine beim Neutralisieren löslich werden, was ihre Abtrennung behindert. Beim Neutralisieren der überstehenden Phase können einige unlösliche Produkte ausfallen, die danach entfernt werden sollten.

Im allgemeinen sollen Extrakte aus lebendem Material zur Inaktivierung sämtlicher Krankheitserreger einschließlich Viren im Autoklav behandelt werden. Daher wird erfindungsgemäß nach der Neutralisation

autoklaviert. Der D-Faktor ist derart wärmebeständig, daß der Extrakt bei 110 C 15 min oder bei 120° C 10 min unter einem Druck von 1,0 bis 1,5 bar mit Dampf sterilisiert werden kann, also unter gleichen Bedingungen wie bei der Sterilisation von Mikrobenkulturme- ί dien.

Konzentrierung und Dialyse bzw. Filtration
[Schritte (f) bis (h)]

Nach der Behandlung im Autoklav wurde der Extrakt id zur Abtrennung ausgefallener unlöslicher Substanzen zentrifugiert; der Überstand wurde gesammelt. Ohne Behandlung im Autoklav war eine erneute Klärung nicht erforderlich. Die klare Lösung wurde unter vermindertem Druck bis auf ¹Ao bis '/jo ihres i"> ursprünglichen Volumens eingeengt.

Das Konzentrat wurde zur Entfernung chemischer Spezies mit höherem Molekulargewicht wie üblich gegen dreifach destilliertes Wasser dialysiert oder durch ein Membranfilter filtriert. Die Dialyse des Konzentrats :o wurde in einem üblichen Cellulose-Dialysierschlauch durchgeführt; die dialysierte Flüssigkeit wurde gesammelt. Die Filtration des Konzentrats wurde mit einem geeigneten Membranfilter vorgenommen, wobei das Filtrat gesammelt wurde. r

Erneutes Einengen und Chromatographie mit Hilfe

eines mit F.pichlorhydrin vernetzten Dextrans

[Schritte (i) und (j)]

Das dialysierte flüssige Medium wurde auf '/ioo bis » '/200 bzw. das Filtrat auf 'Λ bis '/io des Volumens der ursprünglichen Lösung unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde anschließend zur Gewinnung einer Fraktion mit einem Gehalt an D-Faktor an Sephadex® G-25. G-15 und G-10 s Chromatographien. Die jeweilige Säule wurde mit 1 : 100 verdünnter, mit Phosphat gepufferter Salzlösung, die kein Calcium und Magnesium enthielt, mit dreifach destilliertem Wasser äquilibriert. Das Konzentrat wurde dann oben auf die Säule aufgegeben und danach mit -i dem gleichen Puffer mit einer Geschwindigkeit von 5 bis 10 ml/10 min eluiert. Die Fraktionen mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,9b bis 1,80 bei Sephadex G-25, 0,35 bis 1,24 bei Sephadex G-15 bzw. 0,35 bis 1,25 bei Sephadex G -10 wurden gesammelt.

Die Größe der zu verwendenden Säule hängt vom Volumen des Konzentrats ab, ist jedoch von dessen Konzentration unabhängig. Zur Gewinnung einer Fraktion mit dem D-Faktor soll die Größe der jeweiligen Säule das 10- bis 20fache des Volumens des ~> Konzentrats betragen. Die gelchromatographisch abgetrennte Fraktion wird durch den Verteilungskoeffizienicfi (Kd) cbäfäkicnSicfi, ucF iiäCu fuigcfidcF röfinci berechnet wird:

^i =

V-V V-V

a-G

Volumen, das bis zur Elution des gelösten Stoffs

ausfließt;

Lösungsmittelvolumen außerhalb der Gelteilchen; Lösungsmittelvolumen in den Gelteilchen;

a: Gewicht der trockenen Gelteilchen;

G-. Gewicht des pro Gewichtseinheit trockener Gelteilchen festgehaltenen Lösungsmittels.

Der Verteflungskoeffizient dient zur Indizierung einer gelösten Substanz, um die diese Substanz enthaltende Fraktion unabhängig von der Größe der

65 Säule und der Elutionsgeschwindigkeit zu definieren, die aus der Säule eluiert wird. Da das Molekulargewicht des D-Faktors relativ klein ist, werden Sephadex G-25, G-15 oder G-10 zur Abtrennung verwendet. Die Verwendung von Sephadex G-50 oder noch höher vernetzter Dextrangele führte nicht zur Gewinnung einer Fraktion mit einem Gehalt an D-Faktor, wie im folgenden erläutert wird:

Nach Beispiel 1 hergestellter konzentrierter Placentaextrakt (Gesamtfeststoffgehalt 20%), wurde unter den in Tabelle 4 angegebenen Bedingungen an Sephadex G-25, G-15 und G-IO Chromatographien. D:e optischen Dichten der Fraktionen des Eluats bei 280 bzw. 260 nm wurden spektralphotomeirisch bestimmt. Mit Sephadex G-25 wurden folgende Fraktionen mit folgenden /Cd-Werten erhalten:

Fraktion i: 0,03 bis 0,94;

Fraktion 2: 0,95 bis 1.82;

Fraktion 3: 1,83 bis 2,55; und

Fraktion 4: 2,56 bis 3,04.

Mit Sephadex G-15 wurden folgende Fraktionen mit folgenden /C_rf-Werten erhalten:

Fraktion 1: 0,06 bis 0,34;
Fraktion 2: 0,35 bis 1,25;
Fraktion 3: 1,26 bis 1,85; und
Fraktion 4: 1,86 bis 3,3.

Mit Sephadex G-10 wurden folgende Fraktionen mit folgenden Kd-Werten erhalten:

Fraktion 1: 0,06 bis 0,34;

Fraktion 2: 0,35 bis 1,25;

Fraktion 3: 1,26 bis 1,85; und

Fraktion 4: 1,86 bis 3,3.

Der Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors wurden an den 12 Fraktionen wie oben beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen Chromatogramme des Placentaextrakts, der mit Sephadex G-25, G-15 bzw. G-10 erhalten wurde. In jeder Figur sind an der Ordinate die optischen Dichten (OD) des abfließenden Mediums und an der Abszisse die Nr. der Röhrchen und die Kd-Werte angetragen. Die ausgezogenen Kurven geben die OD bei 260 nm, die gestrichelten Kurven die OD bei 280 nm wieder. Die Fraktion 2 jeder Säule zeigte eine kräftige wachstumsinhibierende Wirkung auf die Zellentwicklung bei lymphoider Leukämie der Maus. Keine der anderen Fraktionen zeigte eine derartige Wirkung. Wie den Fig. 1 bis 3 und Tabelle 5 zu entnehmen ist, wurde der D-Faktor ausschließlich aus der jeweiligen Fraktion 2 gewonnen.

ι_ΓαΓ2ΐΐ5 iCigt, u5u HäCli ucm et linulingSgCtTiavCu

Verfahren der D-Faktor oder eine Fraktion mit einem Gehalt an D-Faktor in wirksamer Weise erhalten werden können.

Einige physikalisch-chemische Eigenschaften der Fraktion 2 werden nachstehend angegeben: Das Absorptionsmaximum im UV-Bereich lag bei 258 nm. Für das Molekulargewicht ergab sich ein Wert unter 5000 Dalton. Das IR-Spektmm des gefriergetrockneten Präparats der Fraktion 2 (KBr-Preßling) ist in Fig.5 wiedergegeben, aus der das Vorliegen von Peptidbindungen, Phosphatesterbindungen und Amidogruppen entnommen werden kann. Dementsprechend können Nucleinsäuren, Peptide und Zucker im Extrakt vorliegen. Andere Eigenschaften der gekhromatographisch isolierten Fraktion 2 sind in Tabelle 6 zusammengestellt

11

Tabelle 4

12

	Sephadex Cj-25	Sephadex Ci-15	Sephadex G-Kl
Gewicht der Süulenfüllung (g)	86	66	76
Säule:
Durchmesser (cm) X Länge (cm)	2,5 X 90	2,5X40	2,5X40
Eingesetzte Probenmenge (ml)	20	6	6
Klutionsmiticl	verdünnte (1 : 100) mit	verdünnte (1 : 100) mit	verdünnte (1 : 100) mil
	phosphinige puftertcr	phosphatgepufTerter	phosphatgepulTerter
	Salzlösung	Salzlösung	Salzlösung
1:1 ulionsgesch windigkeit	7	5	4,5
(ml/10 min)
Elutionswert (ml/Röhrchcn)	7	5	4,5
Tabelle 5

Sephadex (Ί-15

Sephadex Ci-K)

Irak- Sephadex (i-25

lion Nr. Verteilungs- lixliak- Aktivität des Verteilung*- lixtrak- Akliviliii des Verleilungs- lixtrak- Aktivität

koeirizicnt lions- D-Iaktors koel'fi/ieni lions- D-laklors koelTi/ient lions- des

grad (%> gradl",) grad (%) D-l-akKus

I 0,03-0,94 0,009 1,0X10" 2 0,95-1,82 0,130 .1,4XlO⁴ 3 1,83-2,25 0,082 8,5X10' 4 2,56-3,04 0,009 1,0X10"	0,02-0,34 0,005 0,35-1,24 0,110 1,25-1.81 0,090 1,82-2,76 0,004	3,12	l,0X 3,4 X 7,2 X Ι,ΟΧ	10" 0,06-0,34 10" 0,35-1,25 10' 1,26-1,85 10" 1,86-3,3	0,003 1,0X10" 0,096 3,4X10' 0,048 7,8XiO' 0,003 1,0X10'	Sephadex G-K)
Vergleichsversuch 8,5X10"	Vergieichsversuch	8,5 X	K)' Vergleichsversuch 8,6X10'	6,30 säurelöslich
Tabelle 6				6,26 säureunlösiich
	Sephadex (i-25		Sephadex (j-15	0,04
Protein-Peptidc (mg/ml)	7,20 säurelöslich		6,80 säurelöslich	1.24
(Lowry-Folin-Methode)	7,19 säureuniösiieh		6,78 säureuniösiieh	3,56
Kohlenhydrate (mg/ml)	0,01		0,02
Phenol-Schwefelsäure (berechnet als Glucose) 1,00		1,38
Nucleinsäuren Ribonucleinsäuren		3.81

(mg/ml) (Orcinol-Methode)

Desoxyribonucleinsäuren {mg/ml) (Indol-Methode)

Organische Lösungsmittel 70% Äthanol Äthyläther Chloroform Aceton

Sulfosalicylsäure-Reaktion Biuret-Reaktion

Ninhydrin-Reaktion Molisch-Test Farbe des Pulvers

2,03

löslich	löslich
unlöslich	unlöslich
unlöslich	unlöslich
unlöslich	unlöslich

hellgelb

1,84

löslich unlöslich unlöslich unlöslich

hellgelb

Weiterverarbeitung des Extrakts
[Schritt (k)]

Die erhaltene Fraktion mit dem D-Faktor (Fraktion 2) wurde durch ein steriles Membranfilter mit einer Porengröße <0,2μπι filtriert, in sterilisierte Ampullen abgefüllt und gefriergetrocknet.

Vergleichsversuche

Placentaextrakte, die nach den oben erläuterten Arbeitsweisen von Hieda bzw. Byong Ho Chin hergestellt und lyophilisiert worden waren, wurden hinsichtlich ihrer Wirkung mit der erfindungsgemäßen Fraktion wie folgt verglichen:

Es wurden Medien mit einem Gehalt von 10% Rinderfetaiserum und 2 mg/ml D-Faktor, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden war. sowie Vergleichsmedien ohne D-Faktor und Placentaextrakte nach Hieda und Byong Ho Chin hergestellt. Diese Medien wurden mit L5!78Y-Zellen mit einer Zeilkonzentration von 1 χ 10⁴ZmI geimpft und in üblicher Weise inkubiert, worauf am 6. Tag die jeweilige Anzahl Zellen mit einem Hämocytometer bestimmt und die Aktivität des D-Faktors durch die Anzahl Zellen pro ml Medium angegeben wurde. Dabei wurde die Anzahl Zellen in einem Medium mit zugegebenem D-Faktor zu 100 festgesetzt; die Anzahl Zellen in einem Medium mit einem Zusatz an anderen Substanzen wurde als Aktivitätsverhältnis des D-Faktors angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt.

Tabelle 7

Zusatz	D-i-aktor-	D-I'aktor-
	Aklivitiit	Akliviiiits-
		vcrhältnis
Hrfindungsgcmüßer	3,6XIO⁴	KX)
D-Faktor
Nach Hieda erhaltene	5.0X10'	7
Substanz
Nach Byong Ho Chin	3.0X10'	12
erhaltene Substanz
Vergleich (Inkubation in	8,5X10'	-
einem Medium ohne
Lxtraktzusatz)

Wie aus Tabelle 7 ersichtlich, tritt bei den Placentaextrakten nach Hieda und Byong Ho Chin keine Wirkung wie beim D-Faktor auf, daß die normale Zellfunktion bei leukämischen Zellen wiederhergestellt wird.

Danach wurde die den D-Faktor enthaltende Fraktion die gemäß der Erfindung hergestellt worden war, folgendermaßen getestet:

Wirkung des D-Fakiorsauf die Wiederherstellung

der normalen Funktion eryihroblastischer

leukamischer Zellen (T-3-CI-1) in vitro

Normale erythroblastischc Zellen können Hämoglobin synthetisieren. Bei der crythroblastischen Leukämie der Maus (T-3-CI-1) können die Zellen infolge zellulärer Veränderungen kein Hämoglobin synthetisieren. Wenn demgemäß der D-Faktor wieder zur llämoglobonsvn these bei T-3-C1-1 führt, ist anzunehmen, daß er di normale Funktion leukamischer Zellen wiederherstellt Der Stamm T-3-C1-1 wurde von lkawa (Gann, Bd. 5/ 1966, S. 641; ibid, Bd 58.1967.S. 155; Proceedings of the Japan Academy, Bd. 47, 1971, S. 220) wie folgt hergestellt:

Friend-Virus (von C. Friend gefundener Leukämie-Virus der Maus) wurde Mäusen intraperitoneal injiziert um einen Fokus in der Milz hervorzurufen. Die Milz dei

ίο getöteten Tiere wurde entfernt und die Zellen de Gewebes in einer Salzlösung dispergiert. Die Milzzellensuspension wurde dann Mäusen subcutan injiziert, um ein Neoplasma zu erzeugen. Die auf diese Weise gebildeten neoplasmatischen Zellen wurden wiederum Mäusen zur Ausbildung einer aszitischen Form intraperitoneal injiziert, aus der ein Klon (T-3-C1-1) in vitro gewonnen wurde. Zu einem Nährmedium mit 20% Kälberserum wurden 2 mg D-Faktor pro ml zugegeben der nach Beispiel 1 hergestellt worden war. Al

Λ» Kontrollmedium diente ein Nährmedium ohne D-Fak tor. Die Impfung erfolgte in üblicher Weise mi T-3-CI-1-Zellen, worauf die Kulturen 4 Tage inkubier wurden. Die Aktivität der Aminolävulinsäuresynthetase der Zellen wurde in dieser Zeit bestimmt. Die

.'■> enzymatische Akivität wird als Index für die Differen tiation angesehen; bei der Reaktion des Enzym Aminolävulinsäuresynthetase handelt es sich um der geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der nachfolgen den Hämoglobinsynthese.

i" In der Vergleichskultur betrug die Enzymaktivität nu 10,5 pmol/30min · mg Protein. In der erfindungsgemä Ben Kultur betrug sie 67,8 pmol/30 min ■ mg Protein Dieses Ergebnis zeigt klar, daß der D-Faktor die Enzymaktivität erhöht und auf der anderen Seile zu

r> Differentiation der leukämischen Zellen beiträgt.

Tierversuch zur Ermittlung der Wirkung des D-Faktors auf leukämische Zellen in vivo

In gleicher Weise wie oben wurden T-3-C1-1 -Zellen ir zwei verschiedenen Medien mit einer Zellkonzentratioi von 5 ■ 10VmI suspendiert. Gruppen von Mäuse (Versuchsgruppen und Vergleichsgruppen) mit jeweil 10 Tieren wurde intraperitoneal 1 ml Suspensio injiziert. Den Tieren wurde reichlich Trockenfutte verabreicht; sie wurden in Käfigen bei konstante Feuchtigkeit und Temperatur gehalten. Das Überlebe der Versuchstiere wurde in beiden Gruppen jeden Ta zur Ermittlung der Wirkung des D-Faktors überwach Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die Tiere de Versuchsgruppe bis zu durchschnittlich 60 Tag überlebten, während der Durchschnitt in der Vergleichs gruppe 34 Tage betrug. Daraus geht klar hervor, daß de D-Faktor der Malignität leukämische Zellen in viv· entgegenwirkt. Die Überlebenszeit in Tagen eine Gruppe von Mäusen, denen T-3-CI-1-Zellen injizier worden waren, die in einem Medium mit D-Fakto inkubiert waren, ist gegenüber der Vcrgleichsgrupp stark verlängert. Damit ist gezeigt, daß Mäuse, die mi leukämischen Zellen geimpft wurden, die vorher mi D-Faktor behandelt wurden, langer überleben a einfach mit leukäimischen Zellen geimpfte Maus Aufgrund dessen ist anzunehmen, daß der D-Faktor de Malignität leukamischer Zellen in vivo entgegen« irkt

Zur Bestimmung der wirksamen und geeignete Dosis wurden die nachsiehenden Tierversuche in \\\< durchgeführt:

Bestimmung der wirksamen und geeigneten Dosis

Jeweils 1 ml (5 χ je 10) einer T-3-C1-1-Zellsuspension, die wiü oben hergestellt war, wurde 25 Mäusen unter den gleichen Bedingungen intraperitoneal injiziert, wobei die Mäuse in drei Gnjppen aufgeteilt wurden. D-Faktor, der auf gleiche Weise wie oben hergestellt war, wurde in sterilem Wasser zu einer Konzentration von 280 mg/ml aufgelöst und 9 Mäusen der Gruppe B in einer Menge von 0,1 ml und 7 Mäusen der Gruppe C in einer Menge von 0,2 ml kontinuierlich 3 d lang, ausgehend vom 4. Tag nach der Injektion von T-3-C1-1 -Zellen, verabreicht. Daneben wurde je 0,2 ml sterilisierte physiologische Salzlösung 9 Mäusen der Gruppe A als Vergleichsgruppe 3d lang verabreicht Die Oberlebenszeit der Mäuse jeder Gruppe wurde zur Ermittlung der wirksamen Dosis festgestellt. Nach der Bestimmung der durchschnittlichen Überlebenszeit in Tagen jeder Gruppe wurden die Indices der durchschnittlichen Überlebenszeit in Tagen der Gruppen B und C berechnet, woraus das Verhältnis der Lebenszeitverlängerung errechnet wurde; die durchschnittliche Überlebenszeit in Tagen der Gruppe A ist dabei zu 100 angenommen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 8 aufgeführt.

Tabelle	8	Anzahl	Durch- Verhältnis
Gruppe	Verabreichte	der	schnittliche der Lebens-
	Substanz	Mäuse	l'her- Verlängerung
			lehcnsreii
			Ul)
		9	25.3 100
Λ	Salzlösung	9	33.3 132
Ii	D-Faktor
	(durch
	schnittlich
	1400 mg/kg I	7	36.4 149
C	D-Faktor
	(durch
	schnittlich
	2800 mg/kg)

Wie aus der Tabelle 8 ersichtlich beträgt die Lebensverlängerung der Gruppen B und C. denen der D-Faktor verabreicht wurde, etwa das 1.3- bzw. 1.5fache gegenüber der Vergleichsgruppe A.

Durch diesen Test wurde nachgewiesen, daß die durchschnittliche Überlebenszeit bei Mäusen gegenüber der Vergleichsgruppe (Gruppe A) durch 3 Tage lange Verabreichung von D-Faktor in einer Dosis von 1400 mg/kg Körpergewicht um ei λ a 30% verlängert werden kann.

Akute Toxizität

D-Faktor wurde zu einer Konzentration von 170 mg/ml in destilliertem Wasser gelöst und sterilfiltriert. 80 5 Wochen alten männlichen Mäusen in 8 Gruppen zu je 10 Mäusen wurde diese Lösung des D-Faktors in der in der Tabelle 9 angegebenen Menge einmal intrapcritoiu-ul verabreicht. Zur Auswertung wurde die Mortalität bestimmt.

Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 9 hervor.

Tabelle 9

Menge der verab	Menge des verab	Morta
reichten D-Faktor-.	reichten D-Faktors in	lität
Lösung	ml/kg Körpergewicht
(ml/g Körpergewicht)

0,0100

in 0,0150

0,0200

0,0230

0,0234

0,0235

0,0240

0,0250

1700
2550
3400
3910
3980
3995
4080
4250

0 0 0

1Ü

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Fraktion einen LDm-Wert von 3980 mg/kg hatte, wobei alle Mortalitätsfälle vom Schock innerhalb von 1 bis 15 min nach der Verabreichung herrührten. Bei der Autopsie dieser durch Schock gestorbenen Mäuse wurde eine Entfärbung und Atrophie der Milz und eine Teilentfärbung der Leber festgestellt. Demgemäß sind die Mäusen therapeutisch verabreichten Mengen D-Faktor von durchschnittlich 1400 mg/kg bzw. 2800 mg/kg sicher ohne Risiko, wie sich aus den Versuchsergebnissen zur akuten Toxizität ergibt.

Die erfindungsgemäße proteinhaltige Fraktion stellt somit ein wirksames Heilmittel gegen Leukämie in der Human- und Veterinärmedizin dar, dessen Wirksamkeit und Sicherheit im Tierversuch in vivo bestätigt wurden.

Wirkung des D-Faktors auf die Wiederherstellung

der normalen Funktion lymphoider leukämischer Zellen bei der Maus in vitro

Lymphoide leukämische Zellen der Maus (L5i78Y) bilden in einem Medium aus Nährmedium mit 10% Rinderfetalserum und Agar eine charakteristische Kolonie, wie dies auch bei anderen Tumorzellen im allgemeinen der Fall ist. Wenn daher die leukämischen Zellen im Medium mit dem D Faktor keine charakteristische Kolonie bilden, kann daraus geschlossen werden, daß der D-Faktor eine Wiederherstellung der normalen Funktion derartiger leukämischer Zellen bewirkt hat.

Es wurden zwei Versuchsmedien hergestellt, die 0.5 bzw. 2,0 mg D-Faktor pro ml des obigen Mediums enthielten; das Vergleichsmedium enthielt keinen D-Faktor. Jedes Medium wurde auf 5 Petrischalen verteilt; in jede Schale wurden L5178Y-Zellen in einer Zellkonzentration von 10³ eingeimpft. Die insgesamt 15 Schalen wurden in üblicher Weise inkubiert. Am 12. Tag wurde die Gesamtzahl der Kolonien jeder Schale ermittelt. Zur Untersuchung der Wirkung des D-Faktors auf die Wiederherstellung der normalen Funktion der L5178Y-Zcllen wurden die Kolonien unter einem Mikroskop mit schwacher Vergrößerung durch Analyse des Kolonietyps in kompakte und aufgelockerte Kolonien eingeteilt.

Unter kompakten Kolonien wurden solche verstanden, bei denen alle Zellen dicht aneinanderklebten; unter aufgelockerten Kolonien wurden solche verstände, bei denen die Zellen im pheripheren Bereich der Kolonie im Agar dispergiert waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 wiedergegeben. Die gesamte Anzahl der Kolonien im D-Faktor-haltigen Medium war deutlich kleiner als beim Vergleichsmcdium. Die Häufigkeit aufgelockerter Kolonien war ferner bei jedem behan-

delten Medium größer als beim Vergleichsmedium. Daraus ergibt sich klar, daß der D-Faktor zu einer normalen Funktion der Lymphozyten führt, und zwar zu

Tabelle 10

einer lokomotorischen Aktivität der L5178Y-Zellen, und die Wiederherstellung der normalen Funktion lymphoider leukämischer Zellen der Maus bewirkt

Klassifikation

Konzentration des D-Faktors (mg/ml)

Vergleichsversuch 0

Versuch 0,5

(D-Faktor-halliges

Medium)

Versuch 2,0

(D-Fuktor-haltiges

Medium)

Anzahl	der Kolonien	52	Anzahl	kompakter	52
insgesamt	57		Kolonien	37
	48		47
	44		43
	45		45
	49,2		44,8
	25		23
	43	Mittel	27
Mittel	36		28
	30		24
	37		33
	34,2		27,0
	1		0
	3	Mittel	0
Mittel	2		2
	3 1		1 1
			~Ö8

	Mittel
Mittel

Anzahl aufgelockerter Kolonien

0
0
1
1
0_

Mittel 0,4

2
16

Mittel 7,2

1
3
0
2

0
Mittel 1,2

Inhibierende Wirkung des D-Faktors in vitro

auf das Wachstum lymphoider leukämischer Zellen der Maus (LSI 78Y) und normaler Zellen

In diesem Versuch wurde gezeigt, daß der D-Faktor der erfindungsgemäßen proteinhaltigen Fraktion eine wachstumsinhibierende Wirkung auf leufcämische Zellen, jedoch nicht auf normale Zellen ausübt.

L5178Y-Zellen wurden in einer Zellkonzentration von 10⁴ZmI in zwei Nährmedien mit 10% Rinderfetalserum geimpft, von denen das eine 2 mg/ml D-Faktor (hergestellt nach Beispiel 2) und das andere keinen D-Faktor enthielt. Die Medien wurden wie üblich inkubiert. Die Zählung der Zellen wurde am 2. bis 8. Tag mit einem Hämocytometer unter einem Mikroskop durchgeführt, um festzustellen, ob irgendeine wachstumsinhibierende Wirkung des D-Faktors zu beobachten war.

Als Vergleichssystem wurden normale Zellen, die in vitro aus normalen Mäusenieren erzeugt waren, in einer Konzentration von 7 · 10Vm! in zwei Eagle-Medien mit 10% Kälberserum geimpft, von denen das eine D-Faktor in einer Menge von 2 mg/ml und das andere keinen D-Faktor enthielt. Die Kulturen wurden wie üblich inkubiert. Nachdem die Zellen durch Trypsinisation vom Boden abgelöst worden waren, wurde die Zellzahl vom 1. bis zum 7. Tag nach der Inkubation mit einem Hämocytometer wie vorstehend beschrieben ermittelt, um die wachstumsinhibierende Wirkung des D-Faktors auf normale Zellen zu untersuchen.

Das Ergebnis ist in Fig.6 dargestellt, wobei die Ordinate die Zellzahlen pro ml Medium und die Abszisse die Kulturdauer in Tagen wiedergeben; die Kreise gelten für die Vergleichsgruppe, die ausgefüllten bO

Kreise für die Versuchsgruppe; die ausgezogenen Kurven gelten für die Zählung der L5I78Y-Zellen und die gestrichelten Kurven für die Zählung der normalen Zellen.

Wie Fig.6 zu entnehmen ist, übt der D-Faktor eine spezifische wachstumsinhibierende Wirkung auf leukämische Zellen aus.

Inhibierende Wirkung des D-Faktors in vitro

auf das Wachstum myelogener leukämischer Zellen

der Maus (M-I -CI-34)

M-l-CI-34-Zellen wurden von Ischikawa (Journal of Cell Physiology, Bd. 74, 1969, S. 223) wie folgt hergestellt: Myelogene Zellen einer leukämischen Maus, die spontan Leukämie entwickelte, wurden einer normalen Maus des gleichen Stamms intravenös injiziert. Nach 2 Wochen wurden myelogene leukämische Zellen aus hypertrophen Lymphknoten des Tieres gewonnen. Das Kulturmedium wurde hergestellt, indem 1,3 g Aminosäure/Vitaminmediumpulver in 1 I Nährmedium gelöst und dem Gemisch 15% Pferdeserum zugesetzt wurden. Die myelogenen Zellen wurden in einer Zellkonzentration von 2 · 10⁷/ml in das Medium in einer Petrischale eingeimpft (Durchmesser 60 mm). Es wurde wie üblich 5 Tage inkubiert, wobei zwischendurch geschüttelt wurde. Es wurden nur Zellen, die im Medium suspendiert waren, gesammelt (nachstehend mit M-I bezeichnet).

Ausgehend von M-1-Zellen wurden M-l-Cl-34-Zellen als Klon nach der Weichagarmethode erhalten, bei der ein doppelschichtiges Agarmedium mit einem Gehalt von 20% Pferdeserum und 0,33% Agar in der Deckschicht und 0,5% in der Bodenschicht verwendet wurde.

Das Testmedium für M-l-CI-34-ZelIen wurde durch Lösen von 0,85 g Aminosäure/Vitaminmediumpuiver in 1 1 M EM-Medium und Zusatz von 10% Kälberserum hergestellt. Die M-l-CI-34-ZeIlen wurden in einer Zellkonzentration von 2 · W/ml in 2 Teilmengen des obigen Mediums geimpft, von denen das eine D-Faktor in einer Menge von 2 mg/ml (hergestellt nach Beispiel 3) und das andere keinen D-Faktor enthielt und als Vergleich bei der Feststellung diente, ob eine wachstumsinhibierende Wirkung auf myelogene leukäirische Zellen der Maus vorlag. Die Teilmengen wurden in üblicher Weise inkubiert, wobei die Zellzählung vom 1. bis 10. Tage unter Verwendung eines Hämocytometers unter einem Mikroskop durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in F i g. 7 dargestellt, wobei die Ordinate die Zellzahl/ml und die Abszisse die Kulturdauer in Tagen wiedergibt; die Kreise bezeichnen die Vergleichsgruppe, die ausgefüllten Kreise die Versuchsgruppe.

Wie F i g. 7 zu entnehmen ist, war zu beobachten, daß die Zellzahl vom Beginn der Inkubation abfiel, was anzeigte, daß die M-l-Cl-34-Zellen im D-Faktor-haltigen Medium nicht wachsen konnten. Auf der anderen Seite zeigten die M-I -Cl-34-Zellen ein aktives Wachstum im Medium ohne D-Faktor. Daraus ist ersichtlich, daß der D-Faktor das Wachstum myelogener leukämischer Zellen inhibiert.

Beispiel 1

400 g menschliche Placenta wurden mit einer ausreichenden Menge mehrmals destilliertem Wasser gewaschen, in Stücke zerschnitten und mit 500 ml Wasser zu einer Emulsion zerkleinert. Zur Emulsion wurde ein Gemisch aus 20%iger Essigsäure und 10%iger Salzsäure im Verhältnis 35:65 bis zu einer Acidität von 1,2-n zugegeben. Die angesäuerte Emulsion wurde dann 40 min auf 80⁰C erhitzt und nach dem Abkühlen mit 3000 U/min 20 min zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde bei 110°C 20 min autoklaviert, nachdem der pH-Wert mit 1 n-NaOH auf 7 eingestellt worden war; nach dem Abkühlen wurde 30 min mit 10 000 U/min zur Abtrennung von unlöslichem Material zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde im Vakuum auf '/20 des Volumens eingeengt in einem Celluloseschlauch gegen das zehnfache Volumen dreifachdestilliertes Wasser dialysiert. Die Dialyse wurde zweimal wiederholt; das dialysierte flüssige Medium wurde gesammelt. Das Dialysat wurde dann im Vakuum auf '/200 des Volumens konzentriert und in einer Säule (2,5 χ 90 cm) an Sephadex G-25 Chromatographien, wobei die Säule mit einer 1 :100 verdünnten Phosphatpuffer-Salzlösung, die kein Calcium und Magnesium enthielt, mit einer Geschwindigkeit von 7 ml/12 min eluiert wurde. Die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,96 bis 1,80 wurde gesammelt. Die Fraktion wurde lyophilisiert und lieferte etwa 450 mg D-Faktor in Form eines hellgelben Pulvers.

. Beispiel 2

300 g menschliche Placenta wurden mit einer reichlichen Menge mehrfach destilliertem Wasser gewaschen, in Stücke geschnitten, mit 400 ml einer 1 :100 verdünnten Salzlösung verseht und zu einer Emulsion zerkleinert Zu der Emulsion wurde ein Gemisch aus 20%iger Essigsäure und 15%iger Salzsäure im Verhältnis 50 :50 bis zu einer Acidität von 1-n zugegeben. Die angesäuerte Emulsion wurde 60 min auf 75⁰C erhitzt und nach dem Abkühlen 20 min mit 3000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde 10 min bei 120⁰C autoklaviert und nach dem Abkühlen zur Abtrennung von unlöslichem Material bei 5000 U/min 30 min zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde im Vakuum auf '/io des Volumens eingeengt und unter reduziertem Druck mit einem geeigneten Membranfilier filtriert. Das FiJtrat wurde nach Einengen auf Vio des Volumens im Vakuum an einer Säule (2,5 χ 40 cm) mit Sephadex G-15 Chromatographien, wobei die Säule mit dem gleichen Puffer wie in Beispiel 1 mit einer Geschwindigkeit "on 5 ml/10 min eluiert wurde. Die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,35 bis 1,24 wurde gesammelt. Sie wurde lyophilisiert und lieferte etwa 300 mg D-Faktor in Form eines hellgelben Pulvers.

Beispiel 3

500 g gefrorene Rinderplacenta wurden aufgetaut, mit einer ausreichenden Menge mehrfach destilliertem Wasser gewaschen, zu Stücken zerschnitten und mit 500 ml mehrfach destilliertem Wasser zu einer Emulsion zerkleinert. Zu der Emulsion wurde ein Gemisch aus 25%iger Essigsäure und 15^ö/oiger Salzsäure im Verhältnis 70 : 30 bis zu einer Acidität von 1,2-n zugegeben. Die angesäuerte Emulsion wurde 40 min auf 8O⁰C erhitzt und nach dem Abkühlen 30 min mit 3000 U/min 30 min zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde nach Neutralisation mit 2 n-NaOH bis auf pH 6,5 15 min bei 110⁰C zur Abtrennung von unlöslichem Material autoklaviert. Die überstehende Phase wurde nach

4-, Einengen auf V20 des Volumens im Vakuum durch ein geeignetes Membranfilter filtriert. Das Filtrat wurde nach Einengen auf '/to des Volumens im Vakuum an einer Säule (2,5 χ 40 cm) mit Sephadex G-10 Chromatographien, wobei die Säule mit dem gleichen Puffer wie in Beispiel 1 mit einer Geschwindigkeit von 4,5 ml/ 10 min eluiert wurde. Die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,35 bis 1,25 wurde gesammelt und lyophilisiert, wobei etwa 500 mg D-Faktor in Form eines hellgelben Pulvers erhalten wurden.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

!. Aniileukämische proteinhaltige Fraktion, erhältlich durch ΐ

(a) Zerkleinern von Placentagewebe von Mensch, Rind oder Schwein in Wasser oder einer verdünnten physiologischen Salzlösung und Hersteilung einer Emulsion,

(b) Ansäuern mit einem Gemisch von 10- bis 30%iger wäßriger Essigsäure und 10- bis 20%iger Salzsäure in einem Verhältnis von 25 :75 bis 75 :25 bis zu einer AciditSt von 0,5-bis 2,0-n,

(c) Erhitzen der angesäuerten Emulsion für 30 bis 60 min auf 75 bis 90⁰C und Abkühlenlassen,

(d) Abzentrifugieren der unlöslichen Proteine,

(e) Neutralisieren der Emulsion mit einer alkalischen Lösung,

(f) Abzentrifugieren von unlöslichem Material,

(g) Einengen bis auf '/to bis '/*> des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck,

(h) Dialysieren des konzentrierten flüssigen Mediums gegen Wasser oder Filtration durch ein geeignetes Membranfilter,

(i) Einengen des Dialysats auf Vioo bis '/200 bzw. des Filtrats auf '/5 bis ¹Ao des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck,
(j) chromatographische Fraktionierung an Sphadex, wobei die Fraktion mit einem Verteilungs- jo koeffizienten von 0,96 bis 1,82 mit Sephadex G-25®, die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,35 bis 1,24 mit Sephadex G-15® bzw. die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,35 bis 1,25 mit Sephadex G-10® « abgetrennt wird, und
(k) Lyophilisieren der erhaltenen Fraktion.
2. Verfahren zur Herstellung der antileukämischen proteinhaltigen Fraktion nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

(a) Zerkleinern von Placentagewebe von Mensch, Rind oder Schwein in Wasser oder einer verdünnten physiologischen Salzlösung und Herstellung einer Emulsion,

(b) Ansäuern mit einem Gemisch von 10- bis <^r, 30%iger wäßriger Essigsäure und 10- bis 20%iger Salzsäure in einem Verhältnis von 25 : 75 bis 75 : 25 bis zu einer Acidität von 0,5-bis 2,0-n,

(c) Erhitzen der angesäuerten Emulsion für 30 bis ->o 60 min auf 75 bis 9O⁰C und Abkühlenlassen.

(d) Abzentrifugieren der unlöslichen Proteine,

(e) Neutralisieren der Emulsion mit einer alkalischen Lösung,

(f) Abzentrifugieren von unlöslichem Material,

(g) Einengen bis auf Vio bis '/w des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck,

(h) Dialysieren des konzentrierten flüssigen Mediums gegen Wasser oder Filtration durch ein geeignetes Membranfilter, t,o

(i) Einengen des Dialysats auf Vioo bis V200 bzw. des Filtrats auf '/5 bis >/io des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck,

(j) chromatographische Fraktionierung an Sephadex, wobei die Fraktion mit einem Verteilungs- tv koeffizienten von 0,96 bis 1,82 mit Sephadex G-25®, die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0.35 bis 1.24 mit SeDhadex G-15® bzw. die Fraktion mit einem Verteüungskoeffizienten von 035 bis 1,25 mit Sephadex G-10® abgetrennt wird, und
(k) Lyophilisieren der erhaltenen Fraktion.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zum Ansäuern der Emulsion in Schritt (b) ein 35:65-Gemisch aus 10- bis 30%iger Essigsäure und 10- bis 20%iger Salzsäure verwendet und bis zu einer Acidität von 1,2-n angesäuert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) 40 mir. auf 8O⁰C erhitzt wird.
5. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend die antileukämische Proteinfraktion nach Anspruch 1.