DE2828947A1

DE2828947A1 - Diagnose und behandlung von neoplasma

Info

Publication number: DE2828947A1
Application number: DE19782828947
Authority: DE
Inventors: Mario Giannone
Original assignee: MEMM SpA
Current assignee: MEMM SpA
Priority date: 1977-07-01
Filing date: 1978-06-30
Publication date: 1979-01-25
Also published as: FR2398503A1; GB1587244A; JPS5417118A

Description

PATENTANWÄLTE

Dlp!.-lng. P. WlRTH ■ Dr. V. SCHMiED-KOWARZtK DIpUr 3. G. DANNENBERG · Dr. P.WEINHOLD · Dr. D. GUDEL

335024 SIEGFRIEDSTRASSE θ

TELEFON: C089)

27691/77

MEMM S.p.A.
35 Via Farini
Bologna / Italien

Diagnose und Behandlung von Neoplasma,

90 9884/0795

- r-

Die Erfindung bezieht sich auf die Diagnose und Behandlung von Neoplasma, ferner insbesondere auf ein bestimmtes, neu entdecktes Bakterium vom Genus Streptococcus, welches es dem Immunsystem des Trägers ermöglicht, die An- oder Abwesenheit eines Neoplasma anzuzeigen, und welches auch verwendet werden kann, das Neoplasma zu vernichten. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Zusammensetzungen, die dieses Bakterium enthalten und auf aktive Extrakte dieses Bakteriums, sowie auf die Verwendung des Bakteriums, der Zusammensetzungen und des Extraktes bei der Diagnose und Behandlung von Neoplasmen.

Es wurden zahlreiche Versuche durchgeführt, die zeigen, daß Krebszellen krebsspezifisches Antigen oder Antigene enthalten. Zum Beispiel haben Versuche gezeigt, daß alle Krebsarten, die durch einen gegebenen Virus bei einzelnen Stämmen von dafür empfänglichen Nagetieren induziert wurden, eine Artbesonderheit aufweisen, d. h. alle haben das gleiche Antigen. Dagegen wurde eine individuelle Spezifität bei spontan aufgetretenen und chemisch induzierten Krebsarten festgestellt. Diese Versuche haben auch gezeigt, daß solche Krebsarten - obwohl von der gleichen chemischen Substanz induziert verschiedene Antigen-Determinanten haben, und daß jede der vielfachen Krebsarten, welche in einem Tier von der gleichen chemischen Substanz induziert wurde, auch besondere Antigene ("Antigenicity") aufweist.

Jedoch wurde nie die Möglichkeit ausgeschlossen, daß wenigstens ein Antigen allen Neoplasmazellen gemeinsam ist. In dem Buch "Immunologival Surveillance" von Sir MacFairlane Burnet, Pergamon Press 1970, S. 13, heißt es:

"Bei der letzten Analyse wurden alle theoretischen Gegenpositionen, die Möglichkeit der Anwesenheit eines Antigens bei allen Tumoren als wesentliches Kriterium eines bösartigen Verlaufes in Betracht zu ziehen, durch eine einzige, völlig anerkannte experimentelle Demonstration widerlegt."

Ein anderer Faktor, den einige Forscher anerkannt haben, ist das Vorhandensein eines sogenannten "Blockierungsfaktors" ("blocking factor"), der die Verhinderung einer Krebskoloniebildung durch

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Lymphozyten blockiert. In "Immunotherapy of Cancer", erschienen in "Recent Advances in Cancer and Radiotherapeutics: Clinical Oncology"/ herausgegeben von Hainan/ The Williams and Wilkins Company (1972, S. 200-201) zeigt Anderson auf, daß die Theorie von der Existenz von Antikörper-gleichen Materialien, die Rezeptoren auf den Tumorzellen blockieren, so daß die auf das Antigen reagierenden Lymphozyten die Tumorzellen nicht erkennen und angreifen können, eine starke Stütze findet. Anderson diskutiert diese Beobachtungen und schreibt auf Seite 201:

"Die Wirte, bei denen die Krebszellen wuchsen, hatten in ihrem Serum Faktoren, die die Unterdrückung der Bildung von Krebskolonien durch die eigenen Lymphozyten verhinderten, wahrscheinlich durch Kombination mit den Krebszellen oder Kodierung ("coding") von diesen."

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß gewisse Arten des Genus Streptococcus die Fähigkeit besitzen, ein Antigen zu produzieren, das bei einem Serum-Agglutinationsversuch zum Nachweis der Anoder Abwesenheit von Neoplasma bei einem Patienten mit Krebsverdacht verwendet werden kann. Darüber hinaus kann das neute Antigen oder die Bakterienzellen, die dieses enthalten, in einer Weise verwendet werden, die es dem natürlichen Immunsystem des Wirts ermöglicht, das Neoplasma anzugreifen und zu zerstören.

Die Fähigkeit jeder einzelnen Art von Streptococcus, solch ein Antigen zu produzieren, kann durch einen einfachen Agglutinationstest bewiesen werden, welcher dem Fachmann hinreichend bekannt ist. Eine besondere Art, die ein solches Antigen produzieren kann, ist der Streptococcus faecalis, Unterart G, der aus der Luft in der Nähe von Modica, Italien, isoliert und in der "American Type Culture Collection" unter der Nummer ATCC 31 deponiert wurde. Diese Art wird nachfolgend als "Bacteria G" bezeichnet.

Die Wirkungsweise, wie sie nachstehend beschrieben wird, soll nicht als verbindlich angesehen werden. Im Experiment wurde bereits nachgewiesen, daß Neoplasmazellen Antigene besitzen, die sich von jenen Zellen unterscheiden, die nicht Neoplasmazellen

»species· 809884/0798

-A-

sind. Bisher war noch nicht nachgewiesen worden, daß Neoplasmaspezifische Antigene existieren, die in allen Neoplasmazellen vorkommen und die diese von anderen Zellen als Neoplasmazellen unterscheiden. Agglutinationsversuche mit Bacteria G beweisen jedoch/ daß der Wirtorganismus fortlaufend Antikörper produziert, die hinsichtlich solcher Antigene spezifisch sind. Das Vorhandensein dieser natürlichen Antikörper resultiert wahrscheinlich aus der ständigen Bildung von tumorähnlichen Zellen, die von dem normalen Immunsystem leicht beseitigt werden können. Bei Wirten jedoch, bei denen ein Neoplasma vorhanden und im Wachstum begriffen ist, ist etwas im Serum vorhanden, das die normale Antigen/ Antikörper-Reaktion verhindert (was den Tumor zerstören würde). Dieser unbekannte Stoff wird nachfolgend als "Blockierungsfaktor" bezeichnet.

Es wird angenommen, daß sich der Blockierungsfakor mit dem Neoplasma-Antigen verbindet und so die spezifischen Antikörper daran hindert, das Vorhandensein des Antigens wahrzunehmen. Wenn ein Neoplasma nicht erkannt wird, kann es nicht zerstört werden; daher dringen die Neoplasmazellen in das normale Gewebe ein, brechen dessen Organisation auf und sind dann oft fähig zu metastasieren. Die Geschwindigkeit der Produktion der Antikörper, die gegen diese Neoplasmazellen gerichtet sind, ist gewöhnlich niedrig; sie wird lediglich durch die große Anzahl von Zellen mit potentiellen Neoplasmaeigenschaften beschleunigt, die keinen Blockierungsfaktor produzieren. Die Überrest toter Neoplasmazellen tragen möglicherweise zur Anregung des Antikörper-Titers bei. Auch wenn der Antikörper-Titer groß wäre, könnte er jedoch nichts gegen den Neoplasma produzierenden Blockierungsfakotr ausrichten, da die Antikörper das Neoplasma einfach nicht erkennen könnten.

Es wird angenommen, daß das Wachstum von Neoplasma wie nachstehend beschrieben erfolgt. Zunächst unterliegen einige Zellen einer allmählichen oder raschen Umwandlung, die durch einige karzinogene Substanzen oder Erreger verursacht wird und erwerben Neoplasmaeigenschaf ten. Selbst während der sehr frühen Phase der strukturellen Umwandlung verändert oder modifiziert die Zelle ihre Membran-Antigene. In einem frühen Stadium der Produktion

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eines Neoplasma-Materiaüs beginnt gleichzeitig die Produktion des Blockierungsfaktors. Hat die Produktion des Blockierungsfaktors ein beträchtliches Ausmaß erreicht, können diese Zellen die Iinmunabwehr des Organismus überwinden, selbst wenn sie noch nicht alle ihrer Krebseigenschaften angenommen haben. Das Vorhandensein eines Blockierungsfaktors für das Antigen der Neoplasmazellen verhindert jedoch jeglichen Kontakt mit imraunkompetenten Zellen; daher werden diese Zellen vom immunologischen Standpunkt als normal angesehen. Jene Zellen,die das Tumor-Antigen an ihren Membranen besitzen und nicht rasch genug ausreichende Mengen des Blockierungsfaktors produzieren, können als solche erkannt und vom Immunsystem rasch vernichtet werden. Das ereignet sich ohne Zweifel im normalen Organismus sehr häufig.

Die Vernichtung von Neoplasmazellen, die den Blockierungsfaktor produzieren, kann gegebenenfalls auch dann stattfinden, wenn die Umwandlung das Auftreten anderer, starker spezifischer Antigene bewirkt hat. Daher können auch andere Antikörper die Vernichtung von Neoplasmazellen bewirken, obwohl der Plockierungsfaktor vorhanden ist. Man glaubt, daß hierin der Grund dafür liegt, daß das Auftreten von Neoplasma ein relativ seltenes Vorkommen ist.

In Fällen jedoch, wo das Antigen sofort mit dem Blockierungsfaktor maskiert wird, können immunkompetente Zellen das Neoplasma nicht als fremd ("non-self") erkennen, so daß diese Zellen nicht angegriffen werden. Daher können solche Neoplasmazellen ungestört ein Stadium der strukturellen Umwandlung erreichen, das rasch eine Zerstörung des Organismus des Wirtes bewirken kann. In diesem Stadium kann die einzige Begrenzung des Wachstums der Neoplasmazellen durch eingeschränkte Ernährung erreicht werden; ein gesundheitlicher Verfall des Organismus selbst kann den großen und überernährten Neoplasmen schaden.Tritt dies ein, führt das Absterben der Neoplasmazellen zur Entdeckung des Tumor-Antigens und die immunkompetenten Zellen beginnen schließlich ihren Angriff; jedoch besteht zu diesem Zeitpunkt wenig Aussicht auf Erfolg. In jenen seltenen Fällen, in denen die immunkompetenten Zellen die Neoplasmamassen in diesem Stadium erfolgreich zerstören, spricht man von einer "spontanen Remission".

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- r-

^% - 282894?

Gleichgültig, wieviele Antikörper auch produziert werden, jene Zellen, die durch den Blockierungsfaktor geschützt sind, werden nicht angegriffen. Auch kann die nun stattfindende Iinmunreaktion zum weiteren klinischen Verfall des Patienten beitragen. Da die Antikörper nur gegenüber jenen toten Zellen reagieren, die keinen Blockierungsfaktor besitzen, und da eine große Anzahl toter Zellen zu zerstören ist, führen die Produkte der Auflösung zur fortschreitenden und raschen Intoxikation des Organismus und schließlich zum Tode.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Bacteria G das gleiche Antigen oder zumindest die gleiche Antigen-Determinante in ihren Zellwandmenbranen besitzen, wie es in Neoplasmazellen vorhanden ist. Das Bacterium selbst kann daher als einer Neoplasmazelle gleich betrachtet werden und wird daher vom Immunsystem nicht wahrgenommen.

Es wurde durch einfache Agglutinationsversuche mit Serumproben gesunder Patienten festgestllt, daß bei fast allen untersuchten Sera ein geringes Maß an Agglutination erfolgt, wenn das Serum mit Bacteria G oder einem Antigenextrakt aus diesen in Berührung gebracht wird. Die außergewöhnliche Feststellung jedoch ist jene, daß bei Versuchen mit Sera von Patienten mit Neoplasma keine Agglutination auftrat. Die Erklärung dafür liegt in der Existenz des Blockierungsfaktors. Bei Wirten ohne Neoplasma wird kein Blokkierungsfaktor gebildet; folglich ist kein solcher im Serum vorhanden. Daher verbinden sich die Antikörper, die ständig im Serum des Wirtes vorhanden und gegen Neoplasmazellen wirksam sind, mit den Antigenen' der Bacteria G, so daß eine Agglutination auftritt. Bei einem Wirt mit Neoplasma dagegen ist der Blockierungsfaktor im Serum vorhanden, welcher die Antigene der Bacteria maskiert, wodurch keine Agglutination erfolgt.

Experimentell wurde festgestellt, daß die Produktion des Blockierungsfaktors in einem sehr frühen Stadium der Entwicklung von Neoplasma erfolgt; daher können Bacteria G oder andere Baktierien des Genus Streptococcus, die ein ähnliches oder gleiches Antigen produzieren, in einem sehr frühen Stadium zur diagnostischen

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Indikation für das Vorhandensein von Neoplasma im Wirtsorganismus verwendet werden. Die außerordentliche Wichtigkeit einer frühen Indikation des Vorhandenseins von Neoplasma ist offensichtlich.

Es wurde auch festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Bacteria dazu verwendet werden können, den Blockierungsfaktor vom Neoplasma des Wirtes abzutrennen, so daß das Immunsystem des Wirtes das Neoplasma angreifen und zerstören kann. Eine Injektion von Bacteria G oder zumindest des Antigenanteils von diesen (das mit dem der Neoplasmazellen identisch ist und nachstehend als "Antigen G" bezeichnet wird), zum Beispiel, beseitigt einen Teil des Blockierungsfaktors, indem es diesen en sich zieht. Mit anderen Worten,das nicht blockierte, bakterielle Antigen G hat eine größere Affinität gegenüber dem Blockierungsfaktor als dem Neoplasma gegenüber; daher verläßt ein Teil des Blockierungsfaktors das Neoplasma und verbindet sich mit dem Antigen G der Bacteria. Gleichzeitig stimuliert das Vorhadnensein von Antigen G ohne Blockierungsfaktor die Produktion der entsprechenden Antikörper sehr. Die Folge ist, daß nach einigen Tagen das Antikörper-Titer steil ansteigt und jene Neoplasmazellen, die ohne Blockierungsfaktor verblieben sind, werden rasch zerstört, zunächst durch das Immunsystem der Körperflüssigkeit und dann das des Zellsystems. Wenn jedoch das Neoplasma durch diesen ersten Angriff nicht total zerstört wurde, verringert sich allmählich der Antikörper-Titer und die Tumorzellen produzieren abermals einen Blockierungsfaktorübersehuß. In diesem Stadium trennt eine zweite Zufuhr von Antigen G, - besonders, wenn es wie erfindungsgemäß beschrieben hergestellt wurde, so daß es eine größere Affinität gegenüber dem Blockierungsfaktor als gegenüber dem Antikörper besitzt-, abermals einen Teil des Blockierungsfaktors von dem Neoplasma-Material und führt wieder zu einem raschen Anstieg des Antikörper-Titers. Das Resultat ist, daß mehr Neoplasmazellen beseitigt werden. Entsprechend dem Volumen des Tumors, seiner Kapazität zur Produktion von Blokkierungsfaktor und je nach der Dosis des zugeführten Antigen G wird das Neoplasma mehr oder weniger schnell zerstört. Schließlich wird die Wunde durch vernarbtes Gewebe verschlossen, und nur einige wenige Anzeichen eines Rückbildungsprozesses, der andernfalls zum Tode des Wirtsorganismus geführt hätte, bleiben übrig.

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AO

Die Erfindung bezieht sich im weitesten Sinne auf ein Antigen, das von einem Bacterium des Genus Streptococcus produziert wird und die Fähigkeit besitzt, eine Agglutination im Serum eines Patienten ohne Neoplasma zu verursachen, während es keine Agglutination im Serum eines Patienten mit Neoplasma bewirkt.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine Kultur eines Mikroorganismus vom Genus Streptococcus, der genanntes Antigen produzieren kann.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf tote Zellen des Bakteriums vom Genus Streptococcus, die genanntes Antigen produzieren können.

Das Bakterium vom Genus Streptococcus ist vorzugsweise Bacteria G, d. h. Streptococcus faecalis, Unterart G ATCC 31 290, und das Antigen ist vorzugsweise Antigen G (wie vorstehend definiert), das von Bacteria G produziert wird.

Die Zellen des Mikroorganismus Bacteria G sind eiförmig, mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1 ,0 yum und kommen meist in Paaren in Form von kurzen Ketten vor, länglich in Richtung der Kette. Sie sind bewegungsunfähig und Gram-positiv; sie formen keine Endosporen. Die Nährstofferfordernisse sind komplex und variabel; der Mikroorganismus ist wahlweise anaerob. Toleranzversuche zeigten ein Wachstum bei 10°C und 45°C, sowie Wachstum in Medien, die Methylenblau (0,1 % in Milch), Natriumchlorid (6,5 %) und Galle (40 %) enthielten. Die Toleranzgrenze für den Anstoß des Wachstums lag bei einem pH-Wert von 9,6 und die Hitzegrenze war bei 60 für 30 Minuten. In reichen Medien, wie z. B. APT Agar, sind die Kolonien größer als gewöhnlich, sind glatt, zusammenhängend und selten pigmentiert. Der Mikroorganismus fermentiert Glukose und wächst in Anwesenheit von O,04 % Tellurit, das zu Tellur reduziert wird. Gelatine wird nicht hydrolysiert. Das Wachstum erfolgt in Anwesenheit von 0,02 % Natriumazid, und eine Reaktion kann in Blut-Agar beobachtet werden. Nachstehende Tabelle 1 zeigt ein Fermentationsschema für diesen Mikroorganismus.

80988A/0795

Tabelle 1

Glukose "»"

Trehalose · . ' +

Laktose +

Salicin _; +

Saccharose ■ +

Raffinose + ·

Maltose

Glycerin (aerob) ·

Glycer in (anaerob)

Mannit r

Sorbit ί

Arabinose

Insulin . -

Citrat

aufgeschlossene Gelatine . ~

Galle 10% + ■

Galle 40%. * +

. ..., . koaguliert und erzeugt Säure Lackmus-.Milch ^J ^

Methylenblau .· 0.1% - Milch koaguliert und erzeugt Säure

Wachstum pH 9,6 ***

Arginindecarboxylase +

Tellurit 0.04% + SF-Medium · . ■ + '

809884/070$

-W- Das SF-Medium setzt sich wie folgt zusammen: 2828947

Trypton	20 g
Glukose	5 g
K₂HPO₄	1,5 g
KH₂PO₄	1,5 g
NaCl	5 g
Natriumazid	0,5 g
Bromcresolrot	O_fO32 g
H₂O auf	1 1

Es kann daraus ersehen werden, daß Bacteria G Glukose, Trehalose, Laktose, Salicin, Saccharose und Raffinose innerhalb von 4 Tagen fermentiert. Es wächst auf Substraten, die 10 % und 40 % Galle enthalten. Es koaguliert und macht Milch sauer, die Lackmus und 0,1 % Methylenblau enthält. Es ist positiv gegenüber Arginindecarboxylase und wächst auf den SF-Medien rasch.

Nachstehende Tabelle 2 gibt eine Übersicht der Empfindlichkeit des Mikroorganismus gegenüber bestimmten Antibiotika.

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Tabelle

Oleandomycin Tetracyclin Chloramphenicol Ampicillin Riphampin .Terizidon Penicillin Erythromycin Novobiocin Lincomycin \

Sulfamethoxypyridazin S trep t omy c in Kanamycin Methicillin

-H— =

= empfindlich

leicht empfindlich

resistent

803884/0795

Aufgrund der genannten Beobachtungen scheint .der Mikroorganismus der Beschreibung des Streptococcus faecalis im "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Ausgabe, 1974, zu entsprechen. Einige wichtige Eigenschaften jedoch unterscheiden Bacteria G von anderen Mikroorganismen der gleichen Art. Bacteria G wächst auf Kulturen, die Benzopyren enthalten, sonst aber die üblichen Medien für das Wachstum von Mikroorganismen vom Genus Streptococcus sind. Die Menge des in der Kultur vorhandenen Benzop/rens kann maximal diejenige Menge sein, die darin löslich ist. Benzopyren, das ein aktives Karzinogen ist, verhindert das Wachstum üblicher Arten von Streptococcus faecalis, beeinflußt aber nicht die Art der erfindungsgemäßen Bacteria G.

Darüberhinaus erfährt der Streptococcus faecalis G ein eigenartiges Wachstum in Anwesenheit des chemischen mutagenen Stoffes Hydroxylaminchlorid. Bei mittleren Gaben dieses mutagenen Stoffes bleibt die Lebensfähigkeit der Bakterien erhalten und das Wachstum schreitet fort.Bei niedrigen und hohen Gaben jedoch wird die Vitalität der Bakterien wesentlich reduziert. Es wäre zu erwarten gewesen, daß Dosen von Hydroxyl aminch lor id in jeder Höhe das Wachstum verhindern, wie es bei der herkömmlichen Art von Streptococcus faecalis der Fall ist. Weiterhin besit2t Bacteria G die Fähigkeit, Paramecia zu schützen, die mit sonst tödlichen Dosen von Benzopyren behandelt wurden. Benzopyren tötet normalerweise Paramecia; es wurde aber festgestellt, daß das Paramecia, das mit einem Extrakt aus Bacteria G, vorzugsweise einem solchen, der selbst mit Benzopyren behandelt wurde, völlig gegen eine nachfolgende Behandlung mit Bezopyren geschützt ist.

Ein anderer Unterschied zwischen Bacteria G und der üblichen Art des Streptococcus faecalis ist die Tatsache, daß Bacteria G gegenüber den Auswirkungen von ultravioletter Strahlung immun zu sein scheint. Obwohl zunächst die Reproduktion gehemmt ist, erholen sich die Bakterien, sofern keine anderen, hemmenden Faktoren anwesend sind.

Die Fähigkeit von Bacteria G oder seiner Antigen-Extrakte, das Vorhandensein oder das Fehlen von Neoplasma durch einfache Agglutinationsversuche zu diagnostizieren, selbst in einem sehr frühen Wachstumsstadium des Neoplasma, wird durch die folgenden Versuche

nachgewiesen.

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Versuch 1

72 weibliche Mäuse (BALB/C) wurden in 7 Gruppen aufgeteilt, wovon 3 als Vergleichsgruppen verwendet wurden. 5 der Gruppen (eine der Vergleichsgruppen) umfaßten 10 Mäuse und die anderen 2 Vergleichsgruppen umfaßten 11 Mäuse. Zwei der Versuchsgruppen wurden intravenös mit 3500 infektiösen Dosen des Frieund-Virus (FV), der dafür bekannt ist, daß er Leukämie hervorruft, infiziert. Die anderen 2 Versuchsgruppen wurden mit einer großen Überdosis des Rownson-Parr-Virus (RPV) intravenös geimpft, der splenische Lymphoma hervorruft. 15 Tage nach der Infektion wurden die Mäuse getötet und ihr Plasma entnommen.

Das Plasma wurde durch Zentrifugieren von den Erythrozyten getrennt und bei 3° C bis zur Verwendung aufbewahrt. Zu jeder Serie der serienmäßig verdünnten Plasmaproben wurde 0,01 ecm einer Suspension von Bacteria G zugegeben, die eine optische Dichte von 0,400 bei 420 nm hatte. Das Bacteria G-haltige Plasma wurde dann für 24 Stunden bei 37 C der Inkubation unterworfen und anschließend auf das Auftreten von Agglutination untersucht. Das Gewicht der Milz wurde ebenfalls bei jedem Tier festgestellt. Die Abhängigkeit zwischen dem Gewicht der Milz und dem Auftreten oder Nichtauftreten von Agglutination bei den Mäusen wird in den Tabellen 3, 4 und 5 aufgezeigt.

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-νί-

Tabelle3

Verhältnis zwischen Gewicht der Milz und Agglutinationsreaktion bei Mäusen (BALB/C), die mit Leukämie FV infiziert

wurden

Gewicht der Milz (mg)	Reaktion nach 24-stündiger Inkuba
	tion bei 37° C
284	Agglutination
892	keine Agglutination
2026	tt I»
971	Il ti
626	•1 Il
Ü53	Il »»
475	• «1 li
1990	lt Il
524	'Il Il ·
387	·· I·
605	It I·
1133	Il Il
775	Il Il
422	Il Il
566	m Ii
760	Il " Il
'833	Il Il
741	Il Il
353	•1 Il
673 •	• I Il I

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- ψ-

Tabelle4

Verhältnis 2wischen Gewicht der Milz und Agglutinationsreaktion bei Mäusen (BALB/C), die mit splenischen Lymphoma (RPV) infiziert wurden

Gewicht der Milz (mg)	Reaktion nach 24-stündiger Inkubation bei 37° C
250 .	* KEINE AGGLUTINATION
328 ■	•t - ti
477 . · · '	ti it
353	·· · ■ ι»
320	Il Il
'■ 363	Il ' U
313	1» It
' 275	1» ·«
227	it ··
386	Il 1»
452	Il \ Il
417	·· '·
413 ' -	•I It
153	AGGLUTINATION
265	KEINE AGGLUTINATION
202	..Ii ti
276	Il 1»
'355	Ii Ii ·
172 '	AGGLUTINATION
240	!'.EINE AGGLUTINATION

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-χί-Λ1

Tabelle 5

Verhältnis'zwischen Gewicht der Milz und Agglutinationsreaktion bei Mäusen (BALB/C) der Vergleichsgruppe

Gewicht der Milz (mg)	Reaktion nach 24-stündiger _v
	Inkubation bei 37 ⁰C
123	AGGLUTINATION
171	tt
145 · .	. ··
109	ii
106	Il
112	•1
106	Il
101	Il
111	Jl
131	Il
126	U
100	Il
112	Il
148	Il
140	Il
145	Il
•94	• 1
177
141	Il
147	•1
89 .	KEINE AGGLUTINATION
178	AGGLUTINATION
95	Il
138	M
148	•1
178	Il
118	Il
101	Il
116	Il
120	Il
130	•1
147	Il

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-Yl-

Diese Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden. Bei der Vergleichsgruppe der Mäuse wurde nur ein Fall keiner Agglutination festgestellt. Die Gruppe, die mit FV infiziert wurde, ergab nur einen Fall von Agglutination. Die Gruppen, die mit RPV infiziert wurden, zeigten in nur 2 Fällen eine Agglutination. Eine Gewichtszunahme der Milz, die bei den geimpften Mäusen kurz nach dem Tode ermittelt wurde, ist als Indikation dafür anzusehen, daß eine Infektion erfolgt war. Es ist bekannt, daß sich im Falle von RPV bald nach der Infizierung die Milz vergrößert, was sich für 15 20 Tage weiter fortsetzt; danach entwickelt sich die Milz normal zurück und zeigt 6-8 Monate nach der Infizierung keine Neoplasma-Läsionen mehr. Es wurde festgestellt, daß bei dem einzigen Fall von Nicht-Agglutination bei der Vergleichsgruppe ein sehr geringes Gewicht der Milz ermittelt wurde.

Dieser Versuch verdeutlicht den außerordentlich wichtigen Tatbestand, daß bei Mäusen, die mit FV oder RPV infiziert wurden, der Blockierungsfaktor im Serum offenbar nur 3-4 Tage nach der Infektion mit dem Virus vorhanden ist. Das ist 6 oder 7 Monate früher als das Vorliegen von splenischen Lymphoma hätte klinisch festgestellt werden können. Es ist also mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens eine sehr frühe Diagnose möglich.

Folglich bezieht sich die Erfindung weiterhin auch auf ein Verfahren zur Auffindung des Vorhandenseins eines Blockierungs,faktors im Plasma durch Inkubation des Plasmas mit Bacteria G oder einem Antigen-Extrakt von diesem.

Versuch 2

Versuche nach Beispiel 1 wurden mit dem Serum von Menschen'durchgeführt, und zwar bei einigen, bei denen Neoplasma histologisch diagnostiziert worden war, und einigen, die keine Anzeichen von Neoplasma besaßen und daher als Vergleichsgruppe verwendet wurden. Die Ergebnisse wurden in Tabelle 6 aufgezeigt. Dazu ist zu bemerken, daß diese Versuche Blindversuche waren, d. h. der Person, die die Versuche vornahm, war die Identität der Sera zur Zeit des Agglutinationstests unbekannt. Einige der Sera, die bei diesem Versuch

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282894.1

verwendet wurden, wurden auch auf Agglutination mit einer Suspension einer herkömmlichen Art des Streptococcus faecalis hin untersucht. Die Resultate.werden in Tabelle 7 aufgezeigt.

Tabelle .6

Sera von Patienten mit festgestelltem Neoplasma, die mit einer Bacteria-G-Suspension getestet wurden

Histologische Diagnose	Agglutinations-Reaktion	1/2	1/4	1/8
- ADENOCARCINOM EPtTHELIOMA Hals-CARCINOM CARCINOM CARCINOM . ADENOMA . LIPOMA Krebs II. Stadium CARCINOM AOENOCARCINOM ADENOCARCINOiA ·_'." LIPOMA ' CARCINOM " ADENOCARCINOM .-DIFFUS METASTASEN RECTUM ADENOCARCINOM PROSTATA -CARCINOM CARCINOM . COLON-AOENOCARCINOM . COLON-CARCINOM MAMMA-CARCINOM. ' METASTAT» CARCINOM METASTAT, ADENOCARCINOM . MYELOID-LEUKAEMIE MYELOID-LEÜKAEMIE .	Verdünnungen	± ++++ + + mm ++++ + mm .+	• / — +++ + ++ +	+ + + +++ + ++ + -

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Tabelle 6 (Forts.)

•	Agglutinations-Reaktion	1/2	1/4	1/8	++
Histologische Diagnose
	Verdünnungen		4-4-	4-4-	—
				-
MAMMA CARCINOM . MIT DIFFUSEN	4-1			+4-
METASTASEN · "	±·	_±	±	+
EPITHELIOMA	+		₊	-
LYMPHOMA				+4-4·
HALS-CARCINOM *				+
ADENOMA *	14·
.MAGENKREBS *
CARCINOM *	4-4-4· 4-	4-4-4-	—
ÜLZERATIVES CARCINOM *	±		±
KNOCHEN-METASTASEB NACH PROSTATi	_	—	-
CARCINOM *	-	-	4·
LYMPHOMA*	+++	++	—
PORTIO-CARCINOM. *	+	+1
CARCINOM . *	±	_
CARCINOME KjJCNOCHEN-METASTASEN *	4-+4-4-	4-4-4-	-
I.SJADIUM ADENOCARCINOM	+	+	- "
RECTUM ADENOCARCINOM	±
METASTASE NACH MAMMA-CARCINOM
LE3ER £ CARCINOM *	_
EPITHELIOMA	•fl		-H-
LYMPHOMA	-	—	+
MAGENKREBS -	4-1	±	l+l
CARCINOM
ADENOCARCINCM	• ₊
ADENOMA		⁺
MAMMA-CARCINOM '	-	±
DIFFUSE METASTASEN DURCH MAMMA		. _
KREBS	+++4-	+4-4-4-
PROSTATA CARCINOM
ADENOCARCINOM. .
ME T AS TAT.· ADENOCARCINOM	•11 H-	+4+
VERGLEICHSSERUM VON PATIENTEN
OHNE KREBS	⁺
56 FÄLLE
3 FÄLLE
1 FALL

Diese Sera wurden auch mit Streptococcus faecalis getestet

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Tabelle 6 (Forts.)

- = keine Agglutination

- = zweifelhaft

+ = Agglutination

+ - ++++ = relatives Ausmaß der Agglutination

Tabelle 7 Agglutinationsreaktion mit Bacteria G oder Streptococcus faecalis

Histologische Diagnose	Verdünnungen der Bacteria G- Suspension	1/4	1/8	Verdünnungen der Streptococcus- faecalis-Suspension	1/4	1/8
•	1/2	±	±	1/2
HALS- CARCINOM	±	-	±		₊₊₊	₊₊
ADENOMA	±	:	:		⁺⁺⁺	⁺⁺
MAGENKREBS CARCINOM	-	-	-	*v
ULZERATIVES CARCINOM	-				₊	₊
LYMPHOMA	t	-	-	₊	+++	++
PORTIO CARCINOM	-	-	-	+++	+	i
CARCINOM .	-			++	⁺⁺	⁺
CARCINOM. MIT KNOCHEN METASTASEN		± .	⁺	⁺⁺	⁺⁺	⁺
LEBER - CARCINOM	i	+++ o^er	-H-
Vergleichs-Serum von Patienten ohne Krebs 20 Fälle	,111 I₁ TTTT oder	*

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Aus Tabelle 6 kann ersehen werden, daß in 45 der 52 Fälle, in denen Neoplasma histologisch diagnostiziert worden war, keine oder zweifelhafte Agglutination eintrat. Die 7 Fälle, in denen trotz vorhandenen Neoplasmas eine wesentliche Agglutination auftrat, waren durchweg Fälle, bei denen das Neoplasma schon sehr weit fortgeschritten war und bereits Metastasen aufgetreten waren. Es wird angenommen, daß diese Neoplasmen bereits so weit fortgeschritten waren, daß kein ausreichender Blockierungsfaktor mehr im Serum vorhanden war, um die Agglutination zu verhindern. In klinischen Situationen wären allerdings die Testdiagnosen, wie sie erfindungsgemäß aufgezeigt werden, für solche Patienten nicht notwendig, da in diesen Fällen das Neoplasma so weit fortgeschritten ist, daß keine Zweifel über deren Existenz bestehen.

Bei den Vergleichsgruppen ist für die zweifelhaften Fälle wahrsc heinlich ein sehr niedriger Antikörper-Titer bei diesen Patienten verantwortlich, oder es besteht die Möglichkeit, daß die Patienten ein bislang nicht diagnostiziertes Neoplasma haben.

Vergleiche der Ergebnisse in Tabelle 6 mit jenen der Tabelle 7, wo eine herkömmliche Art des Streptococcus faecalis verwendet wurde zeigen, daß bei der Verwendung der herkömmlichen Art eine Agglutination in fast allen Fällen auftrat, unabhängig vom Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Neoplasma.

Bei beiden genannten Versuchen wurden die Bakterien 24 Stunden bei 37° C in "Tryptic Soy Broth" -Nährboden (TSB), einem Produkt der Difco Inc., gezüchtet. Die Zusammensetzung von TSB ist folgende:

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2028947 .

Trypton	17	g
Soyton	3	g
NaCl	5	g
H„O auf	1	1.

Die Zellen wurden dann zentrifugiert und mit einer 0,45 %igen wässerigen Natriumchloridlösung gewaschen. Dann wurden die Zellen mit einer wässerigen Kochsalzlösung in einem Ausmaß verdünnt, daß sie eine optische Dichte von 0,400 bei 420 nm ergaben- Die Lösung wurde dann bei 5 C bis zur Verwendung kühl gelagert. Die bei den Versuchen verwendete herkömmliche Art des Streptococcus faecalis ist die Art, wie sie von der "American Type Culture Collection" unter der Nr. ATCC 8043 erhalten werden kann.

Aus den genannten Versuchen kann ersehen werden, daß das Bacteria G oder zumindest dessen Antigen-Anteil, der hier als "Antigen G" bezeichnet wird, bei Versuchen mit Sera, die als neoplastisch oder nicht-neoplastisch bekannt waren, die Fähigkeit besitzen, sowohl den Blockierungsfaktor (bei als neoptetisch bekannten Sera) als auch die Antikörper (bei als nicht-neoplastisch bekannten Sera) binden können. Da diese Eigenschaft eine solche des Antigens im Bacteria G ist, können sowohl die Antigene selbst, lebende Bacteria G, tote Bacteria G oder jeder Teil der Baktierien, der diese Antigen-Aktivität aufweist, verwendet werden. Lebende Bacteria G sind für Menschen nicht schädlich.

Die Konzentration der verwendeten Bakterien oder des Antigens ist nicht entscheidend, vorausgesetzt, daß eine Agglutination festgestellt werden kann. In der vorliegenden Beschreibung wird die Konzentration der Bakterien mit Hilfe der optischen Dichte einer Suspension der Bakterien in jeder physiologischen Lösung bei 420 nm gemessen. Unterhalb einer optischen Dichte von 0,200 ist es sehr schwierig, bei normaler Vergrößerung eine Agglutination festzustellen. Bei einer Dichte über O,500 sind die Bakterien selbst so dicht, daß es schwierig ist, eine Agglutination festzustellen. Obwohl jede Konzentration,bei der Agglutination auftritt, verwendet werden kann, sind daher bevorzugte Konzentrationen solche mit einer optischen Dichte von zwischen etwa 0,200 und 0,500 bei 420 nm, insbesondere wird eine Konzentration bevor-

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INSPECTED .

zugt, die einer optischen Dichte von 0,400 entspricht. Die Bakterien können in jeder physiologischen Lösung vorliegen.

Obwohl die beschriebenen Versuche mit lebenden Bakterien durchgeführt wurden, werden identische Ergebnisse auch mit getöteten Bakterien erzielt. Wenn die Bakterien getötet werden, darf das dazu verwendete Mittel nicht die Fähigkeit des Antigen G beeinträchtigen, sich mit dem Blockierungsfaktor und mit Antikörpern zu verbinden. Zum Beispiel können stark oxydierende Mittel die Fähigkeit zur Verbindung mit dem Blockierungsfaktor beeinträchtigen und sollten deshalb nicht verwendet werden. Es wurde gefunden, daß das geeignete Mittel zum Töten der Bakterien Pheno'l ist.

Es wird bevorzugt, daß der Antigen G - haltige Stoff (z. B. die Bakterien), der für Agglutinationsversuche verwendet wird, eine Agglutination innerhalb von 24 Stunden bei Körpertemperatur herbeiführen kann. Da der Blockierungsfaktor bei längeren Zeitspannen zerstört wird, sind die Ergebnisse nicht aussagekräftig, wenn es langer als 24 Stunden dauert, ehe eine Agglutination auftritt. Auch hier zeigen einfache Routineversuche jedes Antigen G-haltigen Stoffes mit nicht-neoplastischen Sera, ob das Material eine Agglutination innerhalb von 24 Stunden bewirken kann.

Die vorher beschriebenen Versuche zeigen 2 wichtige Merkmale der vorliegenden Erfindung auf. Erstens kann das Vorhandensein von neoplastischem Wachstum in einem sehr frühen Stadium festgestellt werden, viel früher als dies bisher möglich war. Zumindest kann das erfindungsgemäße diagnostische Verfahren dazu verwendet werden, eine zweifelhafte Diagnose zu bestätigen oder vor dem möglichen Vorhandensein von Neoplasma zu warnen. Da übereinstimmende Ergebnisse mit einer großen Anzahl von verschiedenen Arten von Neoplasma gefunden wurden, beweisen zweitens die Versuche die Hypothese, daß ein Antigen existiert, das allen Neoplasmen gemeinsam ist.

Bacteria G ist nicht nur von Bedeutung, weil ihm ein Antigen eigen ist ähnlich jenem, das alle Neoplasmen besitzen, sondern auch deswegen, weil es offensichtlich keinen Blockierungsfaktor produziert,sondern auch die Wirkung aufweist, daß der Blockierungsfaktor, der bereits mit einem Neoplasma verbunden ist, das Neoplasma verläßt und sich mit den Bakterien verbindet. Diese Eigen-

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2928947. Ji

schäften machen die Bakterien zur Behandlung von Neoplasma geeignet, was durch die folgenden in-vitro-Versuche bestätigt wird.

Versuch 3

Kulturen von Heia- und KB-Krebszellen; 6 oder 7 Tage alt, wurden auf Objektträgern bereitet und dann in Reagenzgläsern in Medium 199 gezüchtet. Das Medium 199 wurde dann aus den Reagenzgläsern ausgegossen und Eagle's Medium, das eine Suspension von Bacteria G enthielt, zugegeben.Es wurden wesentlich mehr Bakterienzellen als Krebszellen verwendet. Nachdem man die Bakterien- und Krebszellen etwa 4 Stunden in Kontakt belassen* hatte, wurden die Bakterien entfernt, indem das Medium abgegossen wurde. Eine Lösung von Antikörpern aus menschlichem Serum oder menschliches Serum selbst wurde dann zusammen mit einem komplementären System (Sclavo) zugegeben. Nach der Berührung mit dem Serum und dem Komplementmaterial konnte festgestellt werden, daß die Krebszellen, die in Berührung mit dem Bacteria G gekommen waren, durch Lyse zerstört worden waren. Vergleichszellen, die nicht mit Bakterien behandelt worden waren, wurden durch die Antikörper oder das Serum nicht beeinflußt. Dieser Versuch zeigt nicht nur,daß der Blockierungsfaktor von den N eoplasmazellen selbst ausgenutzt wird, sondern daß das Bacteria G den Blockierungsfaktor von den Neoplasmazellen entfernen kann.

Bei der Verwendung von Bacteria G für die Behandlung von Neoplasma durch Entfernen des Blockierungsfaktors von Neoplasmen und deren nachfolgende Zerstörung durch natürliche Antikörper werden optimale Ergebnisse erzielt, wenn die verwendeten Bakterien die größtmögliche Fähigkeit besitzen, sich mit dem Blockierungsfaktor zu verbinden (Affinität gegenüber dem Blockierungsfaktor), während sie gleichzeitig die geringste Neigung besitzen, sich mit den Antikörpern zu vereinigen (Affinität gegenüber Antikörpern). Eine Injektion solcher Bakterien würde bewirken, daß die größtmögliche Menge an Blockierungsfaktor vom Neoplasma abgetrennt und die kleinstmögliche Menge an Antikörpern durch Vereinigung mit den nicht-pathogenen Bakterien verloren geht. Es wurde experimentell festgestellt, daß die Fähigkeit der Bakterien, sich entweder mit Blockierungsfaktor oder Antikörpern zu vereinigen, ent-

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sprechend dem Verfahren, mit dem die Bakterien gezüchtet wurden, variiert und daß durch sorgfältige Standardisierung der Wachstumsbedingungen optimale Verhältnisse erreicht werden können. Es sei jedoch festgestellt, daß - unabhängig von den Bedingungen des Wachstums - nützliche Ergebnisse durch die Behandlung mit Bacteria G oder eines Antigen-Extraktes aus diesen erzielt werden können, insbesondere bei der ersten Behandlung.

Bei Versuchen mit Ratten mit natürlichen Tumoren (meist Mammaadenokrebs) als auch bei Ratten, die mit Walker carceno-sarcoma 256 geimpft wurden, wurde beobachtet, daß der Tumor nach 2-3 Behandlungen mit Bacteria G in Dosen von 1,5 Einheiten optischer Dichte bei 420 nm (subkutan injiziert in einer Menge von 1 ecm pro Ratte) bei etwa 50 % der behandelten Tiere völlig zerstört war. Bei den übrigen Tieren waren große Tumore vorhanden, die bereits ein fortgeschrittenes Stadium erreicht hatten; jedoch wurde eine Nekrose des Tumors mit starker blutiger Entzündung des umliegenden Gewebes und eine Reduzierung der Tumormasse um etwa ein Fünftel ihres ursprünglichen Ausmaßes festgestellt. Diese Ergebnisse resultierten von der Erstbehandlung; keine weiteren wesentlichen Ergebnisse wurden bei einer 2. und 3. Behandlung erzielt. Es wird angenommen, daß die Ursache dafür, daß die außerordentlichen Ergebnisse nicht auf die 2. und 3. Behandlung ausgedehnt werden konnten, von der Fähigkeit der Bacteria G herrührt, sich mit den Antikörpern verbinden zu können. Bei der ersten Behandlung ist der Antikörper-Titer sehr niedrig, und eine große Menge Bakterien bewirkt, daß eine große Menge an Blockierungsfaktor vom Neoplasma abgetrennt wird, ehe die Bakterien von den Antikörpern zerstört werden. Nach der ersten Behandlung steigt der Antikörper-Titer jedoch drastisch an, daher wird die Wirkung weiterer Behandlungen sehr vermindert, weil ein vergrößerter Antikörper-Titer die Bakterien zerstört, ehe sie eine entscheidende Menge des Blockierungfaktors vom Neoplasma abtrennen konnten.

Um die verschiedenen Grade der Fähigkeit einer Bindung des Blokkierungsfak tors mit den Antikörpern während der verschiedenen Phasen des Wachstums der Bakterien festzustellen, wurde der folgende Versuch durchgeführt.

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Versuch 4

Eine große Anzahl von Mäusen wurde mit einer Aszites-Flüssigkeit von einem Ehrlich-Tumor geimpft. 5 Tage nach der Impfung wurden jene Tiere herausgesucht, die ein vergrößertes Knötchen von nicht mehr als 3 cm Durchmesser aufwiesen. Es wurden insgesamt 3ΘΟ Mäuse ausgewählt. Diese wurden in 5 Gruppen zu je 60 Mäusen aufgeteilt. Um die Wirkung einer niedrigen oder hohen Schwelle der Ansprechbarkeit mit verschiedenen Suspensionen der Bakterien zu vermeiden , wurde jede Gruppe von 60 Mäusen in 6 Untergruppen zu 10 Mäusen aufgeteilt. Diese Untergruppen, obwohl sie mit der gleichen Art der Lösung behandelt wurden, erhielten 6.verschieden starke Dosen derselben.Eine der 5 Gruppen diente als Verglexchsgruppe und wurde keiner Behandlung unterzogen. Die anderen 4 Gruppen wurden jeweils mit einer Suspension unterschiedlichen Alters behandelt, das heißt: mit einer 1 Tag-Kultur, einer 3 Tage-Kultur, einer 5 Tage-Kultur und einer 7 Tage-Kultur. Die verschiedenen Dosen wurden in Einheiten optischer Dichte bei 420 nm bezeichnet, d. h. 0,050, 0,100, 0,200, 0,400, 0,800 und 1,600.. Die Bakterien-Suspension wurde jeder Maus in einer Menge von 0,3 ecm durch subkutane Impfung in den Rücken verabreicht. Die erste Behandlung wurde am 5. Tage des Wachstums des übertragenen Neoplasma-Materials begonnen. Die 2. Behandlung erfolgte 11 Tage nach der 1. Behandlung (dem 16. Tage des Wachstums) und die 3. Behandlung 11 Tage später (am 27. Tage des Wachstums). 35 Tage nach der ursprünglichen übertragung des Neoplasma-Materials wurden die Mäuse untersucht, um die Fähigkeit der Bakterien zur Immunisierung, ihre Fähigkeit, das Tumorwachstum auf der entsprechenden Stufe eu halten und ihre Fähigkeit, eine Regression einzuleiten zu ermitteln. Die Ergebnisse werden in Tabelle 9 beschrieben.

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Tabelle

DOSEN

1 Tag-Kultur

/

3 Tage-Kultur

/

5 Tage-Kultur

/

7 Tage-Kultur

/

/ -

/

3.3 ml
3.D.*_:
0.050
fc*J 420nrr

I. II. III.
Behandlung

/

I. II. III.
Behandlung

Stasis

70 %^X)

I. II. III.
Behandlung

/

I. II. III.
Behandlung

/

3.3 ml
3.D. -
0.100
be« 420nrr

/

Λ

20 %^x)

/

Stasis

/
«

/

Stasis

Regres

3 ion

3.3 ml
5.0. »
0.200
b<JA20nn\

Stasis

/

" /

Stasis

/

Stasis

/

Stasis ·

be
einigen
Mäusen

L
90 %
der M.

).3 ml
3,0. «
0.400
b*l420nm

.Stasis

5tasis

/ *

/

Stasis

/

Regres

3 ion

3.3 ml
).D. «=
0.8CO
bei 420nrr,

Stasis

Stasis

be
einigen
Mäusen

S.
! 90 %
der M.

D.3 ml
3.D-. =
1.600
&*« 420nm

/

χ)= Überlebensrate größer als die der Kontrollgruppe (in %) / = wie Vergleichsgruppe

2828547-

Alle Mäuse der Vergleichsgruppe starben nach 23 - 30 lagen. Regression bedeutet in der Tabelle die Beseitigung des Tumors.

Die Ergebniss der Tabelle 9 können wie folgt zusammengefaßt werdden. Die Gruppe, die mit einer Suspension, welche aus einer 1 Tag lang inkubierten Kultur hergestellt worden war, behandelt wurde, zeigte (verglichen mit der Vergleichsgruppe.) eine Tumor-Stasis bei Dosen von 0,100, 0,200 und 0,400 Einheiten lediglich nach der ersten Impfung. Nach der 2. Impfung war ein Zuwachs der Sterblichkeit mit Ulzeration der Tumormasse zu beobachten. Diese Gruppe zeigte, statt sich zu erholen, ein verschlechtertes. Befinden und einen höheren Sterblichkeitsindex als die Vergleichsgruppe der Mäuse.

Die Gruppe, die mit einer Suspension, welche aus einer 3 Tage-Kultur hergestellt worden war, behandelt wurde, zeigte keinen wesentlichen Unterschied zu der Gruppe, die mit der 1 Tag-Kultur behandelt worden war. Die Dosis, die die höchste Überlebensrate ergab, war 0,200.

Die Gruppe von Mäusen, die mit einer 7 T^ge-Kultur behandelt worden waren, zeigten verhältnismäßig positive Ergebnisse mit einer Uberlebensrate, die größer als die der Vergleichsgruppe war und einer Regression der Tumormasse bei Dosen von 0,400 und 0,800 Einheiten. In dieser letzten Gruppe waren praktisch nur 3 Behandlungen notwendig, um fortschreitendes Wachstum zu blockieren und die Tumore zu zerstören. Mit dieser 7 Tage-Kultur wurde bei Gaben von 0,4oo und 0,800 Einheiten eine vollständige Eliminierung des Tumors bei 90 % der Mäuse erreicht; dies ist ein überraschendes und bedeutendes Ergebnis. Die einzigen Mäuse, die innerhalb von 28 Tagen nach der übertragung des Neoplasmamaterial starben, waren jene, die mit einer Dosis von 0,050 Einheiten behandelt worden waren. Die anderen Tiere, die keine Tumor-Regression aufwiesen, zeigten vollständige Stasis; bei fast allen Mäusen war der Tumor ziemlich hart und hypotrophisch und - wie es schien - verkalkt. Bei der Vergleichsgruppe der Mäuse wurde der Tumor nie besonders hart.Ehe eine vollständige Regression des Tumors erreicht wurde, wurde ein Teil des Neoplasmamaterials abgestoßen und verursachte eine Art von offenem Abszeß. Am Schluß der Versuchsperiode war eine völlige Vernarbung des vom Tumor betroffenen Gewebes erfolgt,

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die nur noch sehr schwer erkennbar war.

Die Schlüsse, die aus diesem Versuch gezogen werden können, sind: Kulturen von Bacteria G, die bei 37° C auf TSB gezüchtet wurden, produzieren ein Antigen, dessen Affinität zum Blockierungsfaktor und/oder zu den Antikörpern entsprechend dem Alter der Bakterienkultur sehr variabel ist. Die Ergebnisse dieses Versuches zeigen, daß eine optimale Kultur durch 6-7 Tage lange Inkubation auf TSB bei 37° C hergestellt worden ist.

Noch bessere Ergebnisse können mit mehr konstanten, reproduzierbaren optimalen Mengengaben der Bakterienkultur erreicht werden, wenn die Kultur des Bacteria G unter Bedingungen kontrollierten aeroben Wachstums gezüchtet wird. Dieses kontrollierte aerobe Wachstum, das nachfolgend als "Hypoxia" bezeichnet wird, wird erreicht, wenn die Kultur nach.der Impfung in einem luftdichten Gefäß eingeschlossen wird und so ohne Schütteln bis zur Verwendung aufbewahrt wird. Dieses Verfahren unterscheidet sich von einer mit Sauerstoff behandelten Kultur, bei der die Bakterien unter freier Luftzufuhr gezüchtet und geschüttelt werden. Der Unterschied zwischen Kulturen mit Sauerstoffzufuhr und "Hypoxia"-Kulturen kann aus nachfolgendem Versuch ersehen werden.

Versuch 5

180 Mäuse wurden subkutan mit einer Aszites-Flüssigkeit von Ehrlich-Tumoren, wie im vorangegangenen Experiment, geimpft. Sie wurden dann in 3 Gruppen zu 60 Mäusen aufgeteilt und jede dieser Gruppen wurde wiederum in 6 Untergruppen eingeteilt; Wie im vorangegangenen Versuch, erhielt jede der Untergruppen eine verschiedene-Dosis Bacteria G. Die erste Gruppe erhielt Gaben von Bacteria G, die in Kulturen mit SauerStoffeinfluß gezüchtet worden waren, .die zweite Gruppe erhielt Gaben von Bacteria G, die in Hypoxia-Kulturen gezüchtet worden waren, die dritte Gruppe wurde als Vergleich benutzt und wurde nicht mit Bacteria G behandelt. Die erste Behandlung erfolgte 5 Tage nach der übertragung des Neoplasmamaterials; die 2. Behandlung erfolgte 11 Tage später und die 3. Behandlung 11 Tage nach der zweiten. Die Resultate werden in Tabellen 10 und 11 beschrieben. In jedem Falle war das verwendete Bacteria G 6 Tage alt.

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Tabelle 10

Die Mäuse wurden mit 6 Tage altem Bacterium G behandelt, das in einem Medium unter Luftzufuhr gezüchtet wurde (optische Dichte

ητη =

Dosen von 0_f3 ml opt.Dichte b.42Onm)

II. Behandlung nach 11 Tagen III.Behandlung n. zweimal 11 Tagen

Resultate nach d. III.Behandlung

0,050

0,100

0,200

Stasis bei 60 % der Mäuse Stasis bei 60 % der Mäuse

Stasis

die verbleibenden 40 % wie Vergleichsgruppe

0,400

Stasis bei 60 % der Mäuse Stasis bei 60 % der Mäuse

Stasis

die verbleibenden 40 % wie Vergleichsgruppe

0,800

Stasis bei 70 % der Mäuse Stasis bei 70 % der Mäuse

Stasis

die verbleibenden 30 % der Mäuse wie Vergleichsgrupee

1,600

Stasis Stasis

Stasis

/ = wie die Vergleichsgruppe

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2528947

- 3ή -

Tabelle 11

Die Mäuse wurden mit 6 Tage altem Bacterium G behandelt, das in einer Hypoxia-Kultur gezüchtet wurde (opt. Dichte bei 192 nm = 1,4)

Dosen von 0,3 ml (opt.Dichte b.42Onm	II.Behandlung nach 11 Tagen	III.Behandlung nach zweimal 11 Tagen	Resultate nach der III. Behandlung
0,50	■ /	/ .	/
0,100	Stasis	Stasis	Stasis
0,200	Regression bei 50 % der Mäuse •	Regression bei 6o % der Mäuse	Tumor bei 40 % d.Mäuse reduziert Regression bei 6o % der Mäuse
0,400	Regression bei 80 % der Mäuse	Regression	Regression
0,800	Regression bei 80 % der Mäuse	Regression	t Regression
1,600	Stasis	Stasis	Stasis

/ = wie die Vergleichsgruppe

Regression = völlige Elimination des Tumors

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2328947

Obwohl eine bemerkenswerte Verbesserung des Zustandes der Gruppe von Mäusen beobachtet werden konnte, denen Sauerstoff-behandelte Kulturen verabreicht worden sind, traten im Vergleich zur Vergleichsgruppe nur relativ wenige einzelne Regressionen auf, die auf keinen offensichtlichen Zusammenhang mit speziellen Dosen hinwiesen. Die Resultate, die in der Gruppe erzielt wurden, die mit Hypoxia-Kulturen behandelt worden sind, waren dagegen noch bemerkenswerter. Es wurde eine vollständige Regression der Tumormasse bei Mäusen, die mit Dosen von 0,200, 0,400 und 0,800 Einheiten behandelt worden sind, erzielt; eine Stasis wurde mit Dosen von 0,100 und 1 ,600 Einheiten erreicht. Kein Erfolg wur.de mit Dosen von 0,05o Einheiten erzielt.

Nach der ersten Behandlung mit den Kulturen von Bacteria G erfolgte eine mikroskopische Entzündung der Tumormasse; diese trat bei Verwendung von "Hypoxia"-Bakterien später auf als bei der Behandlung mit Sauerstoff-behandelten Kulturen. Es wird angenommen, daß die Ursache in der niedrigen Affinität der Hypoxia-Kulturen gegenüber den Antikörpern zu suchen ist; deshalb ist die erfoderliche Dosis für eine erste Entzündungserscheinung bei diesen Kulturen höher. Auf die 2. Behandlung sprachen die Tiere besser an, die mit Folge-Dosen jener Bakterien, die zur Erstentzündung geführt hatten, behandelt wurden. Später bestanden in Bezug auf die ursprünglichen Dosen kein Unterschied mehr. Bei den Tieren, bei denen eine Tumor-Stasis erreicht wurde, zeigte sich auf mikroskopischer Ebene keine Verschlechterung in ihrer allgemeinen Verfassung; das Verhalten und Aussehen dieser Tiere unterschied sich sehr von dem der Vergleichsgruppe: sie säuberten sich selbst, ihr Fell war in guter Verfassung und sie sahen ganz normal aus.

Es wurde festgestellt, daß ein Weg zur Feststellung der relativen Affinitäten einer Kultur gegenüber dem Blockierungsfaktor und gegenüber den Antikörpern darin besteht, eine Suspension von Bakterien mit einer optischen Dichte von 0,07 bei 420 nm auf ihre optische Dichte bei 192 nm zu untersuchen. Je größer die optische Dichte bei 192 nm ist (bei dieser besonderen Kombination), desto größer ist überraschenderweise die Affinität der Bakterien gegenüber dem Blockierungsfaktor, und desto geeigneter sind die Bakterien für die klinische Verwendung.

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2928947 .χ

Es soll darauf hingewiesen werden, daß in Versuch 5 die optische Dichte einer Suspension mit einer optischen Dichte von 0,07 bei 420 nm den Wert 1,4 bei 192 nm für Bakterien aufwies, die unter Hypoxia gezüchtet wurden, und den Wert 0,85 für Bakterien, die in einer Kultur mit Sauerstoffzufuhr gezüchtet worden sind. Es wird daher angenommen, daß gute Ergebnisse erzielt werden, wenn die optische Dichte einer Bakteriensuspension, die bei 420 nm eine optische Dichte von 0,07 hat, bei 192 nm wenigstens 0,70 beträgt und daß bessere Ergebnisse bei einer optischen Dichte von mehr als 0,90 erzielt werden. Vorzugsweise sollte die optische Dichte größer als etwa 1,0, insbesondere größer als etwa 1,2 betragen.

Es wird angenommen, daß das optimale Alter und die bevorzugte Wachstumsmethode einer Kultur entsprechend dem jeweiligen Kulturmedium differieren können; die Messung der optischen Dichte bei 192 nm jedoch kann ein rasches Anzeichen für den Grad des zu erwartenden Resultats und die zu verwendende optimale Kultur geben. Tabelle 12 zeigt Werte optischer Dichte (OD) bei 192 nm für verschiedene Kulturmedien und -Alter; jede Suspension besaß eine optische Dichte von 0,07 bei 420 nm und die Bakterien stammten jeweils aus Hypoxia-Kulturen.

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Tabelle 12

KuItur- • Medium	Alter der Kultur	4 Tage	7 Tage
TSBG TSAG MH ■ SF	40' Stunden	• 1.500 0.680 0.730 1.5S0*	1.560 0.800 1.270 1.700 *
0.700 0.550 0.750 0.340

sehr hohe Werte aufgrund von Bromcresol-rot im Kulturmedium

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2928947

Die Kultur-Medien, die verwendet wurden, waren die folgenden;

TSBG: ■ ■■■!■ H ■ ■■	Tripton	TSAG:	Tripton	17 g	~-	17 g	1.5g
Soyton	Soyton	3 g	3 g	11
Glucose	Glucose	.2.5g	2.5 g
NaCl	NaCl	5g	5g
K₂HPO₄	K₂HPO₄	2.5 g	2.5 g
H₂O auf	Agar	1 L	20 g
H₀O auf	1 1
Mueller Hinton:
Fleisch-Extrakt	3g
	¹¹ Bacto Casimino"-Säurenl7.5 g
. Starch
H₀O auf

8 09884/0705'

Das SF-Medium wurde bereits vorher beschrieben.

Es ist festzuhalten daß das Alter der Kultur und die Art und Weise der Züchtung - obwohl diese eine Auswirkung auf die gezüchteten Bakterien haben - nur für die Bestimmung der relativen Wirksamkeit der Behandlung mit Bacteria G entscheidend ist. Auch 1 Tag-Kulturen, die unter Sauerstoffzufuhr gezüchtet wurden, bewirken wertvolle Resultate, wenn nur eine Behandlung erforderlich ist; solche Kulturen sind daher Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Für einen Patienten mit Neoplasma ist sogar eine Stasis eine entscheidende und wichtige Verbesserung des Zustandes.

Versuch 6

Gruppen von 25 Versuchsmäusen (CDF/1) wurden intraperitoneal mit etwa 10 Leukämie-Zellen L 1210 geimpft. Die ausgewählten Mäuse hatten ein Körpergewicht zwischen 25 und 30 g. Eine Gruppe der Mäuse wurde als Vergleichsgruppe benutzt und erhielt keine Behandlung. Die Einzelheiten über Sterblichkeit und durchschnittliche Gewichtszunahme wurden in Tabelle 13 aufgezeigt. Eine andere Gruppe von Mäusen wurde mit einer Suspension behandelt, die die bekannten Bakterien Streptococcus faecalis ATCC 8043 enthielt. Jede Maus erhielt drei intramuskuläre Injektionen einer Suspension der Bacteria G von 0,2 ecm mit einer optischen Dichte von 1,200 bei 420 nm. Die Ergebnisse werden in Tabelle 14 beschrieben. Der dritten Gruppe wurden drei intramuskuläre Injektionen von je 0,2 ecm einer Suspension von Bacteria G mit einer optischen Dichte von 1,200 bei 420 nm verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 angegeben.

Die Suspensionen beider Stämme des Streptococcus faecalis waren auf einem TSB-Medium bei 37° C 6 Tage unter Hypoxia gezüchtet worden. Aus den Tabellen 13 und 14 kann ersehen werden, daß die Sterblichkeitsrate bei der Vergleichsgruppe innerhalb von 9 Tagen 100 % erreichte und bei der Gruppe, die mit Streptococcus faecalis ATCC 8043 behandelt wurde, wurden 100 % innerhalb von 14 Tagen erreicht. 100 %ige Sterblichkeit trat jedoch bei der Gruppe auch nach 25 Tagen nicht auf, die mit Bacteria G behandelt worden war.

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2S28947

'³Ii

Tabelle 13

Tag	Behandlungen	Sterblichkeit %	Gewichtszunahme (Durchschnitt)	•	J 0,4 gr
0	X=	E	1 gr
. 1 ■ 2	C=	C	1,5 gr
3	C=	S=	1,8 gr
4	=		2,5 gr
5			= ■
6		1OX
7		3054
8	=	80S«
9	_■	1005ί

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2328947

Tabelle 14

Tag	Vehandlungen	Sterblichkeit %	Gewichts zunalmne (Durchschnitt)
. O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11	1« SX SS Xt Bt 2· S M 3° St	* SC K= SS ws SX 20X 30% 70% 80X 9OX 100X	S= 0,8 0.8 1.5 2 2.8 X= er c:

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- -JA- -

ha

Tabelle 15

Tag	Behandlungen	•	4°	•	Sterblichkeit %	Gewichtszunahme iDurchschnitt)
. O	1°				rs
1				rs	0,8 gr
2				ac	0,6 gr
3				a .	0,4 gr
4			S=	r:
5	2°	B
6		=	=
7			0,4 gr
8		tu	0,6 gr
9		S	0,8 gr
10	3°	20%	0*8 gr
11		a=	0,8 gr
' 12		30«
13	Ο
14	SS
15
16	ac
17	40%
18
19"	St
20	60%
21
22	as
23	-
24	SS
25	S

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Die vorstehenden Resultate zeigen, daß Bacteria G und Antigen-Extrakte von diesen verwendet werden können, um Neoplasma⁺beim Menschen zu behandeln. Daher betrifft die Erfindung ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Bacteria G oder einen Antigen G-Extrakt von diesen in Mischung mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger- oder Verdünnungsmittel enthält.

Alle für pharmazeutische Zusammensetzungen üblichei Verabreichungsformen können auch für die erfindungsgemäße Zusammensetzung angewendet werden, je nach Art und Lage des zu behandelnden Neoplasma. Orale oder parenterale Verabreichung wird bevorzugt, insbesondere bevorzugt wird die intravenöse Verabreichung, obwohl auch intramuskuläre Verabreichungen gegeben werden können. Die Dosis sollte von Fall zu Fall ermittelt werden (je nach der Heftigkeit der Symptome und der Art der Verabreichung). Jedoch ist es von Wichtigkeit, daß die Menge der verabreichten Bakterien ausreicht, sich mit einer genügenden Menge des Blockierungsfaktors zu verbinden, damit die Antikörper des Wirtes die Neoplasmazellen angreifen können. Die Menge sollte allerdings nicht so groß sein, daß eine Verbindung mit wesentlichen Mengen der gebildeten Antikörper erfolgt. Es kann z. B. eine intravenöse Injektion von 2 ecm Bacteria G in einer Suspension mit einer Konzentration, die eine optische Dichte von 2,0 bei 420 nm ergibt, gegeben werden. Sollten Anzeichen eines anaphylaktischen Schocks auftreten, ist das ein Zeichen dafür, daß die Anfangsdosis zu groß war; dann sollten größere Zeitabstände zwischen den Behandlungen eingeschaltet werden. Die 2. Dosis sollte erst gegeben werden, wenn der Antikörper-Titer im Serum des Patienten (der als Resultat der 1. Injektion wesentlich angestiegen ist) auf ein konstantes Niveau gesunken ist. Dies kann 11 bis 20 Tage dauern, im allgemeinen sind es 11 Tage, obwohl - wie nachstehend beschrieben - Dosen in etwas häufigeren Intervallen gegeben werden können.Tritt kein Zeichen eines aaaphylaktischen Schocks nach der 1. Injektion auf, dann sollte die 2. Injektion mit gleicher Dosis erfolgen. Die Behandlung ist fortzusetzen, bis der neoplastische Zustand behoben ist.

Ausführlichere Erläuterungen über die Art der Darreichung werden nachfolgend gegeben.

beispielsweise ein Carcinom, Sarcora oder Leukämie

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Subkutane Verabreichung ist im Falle sehr großer Neoplasmen angezeigt. Die verabreichten Bacteria G verbleiben für eine relativ lange Zeit an den befallenen Stellen und darüberhinaus wird aufgrund der niedrigen Austauschgeschwindigkeit des Blockierungsfaktors die Möglichkeit einer extensiven Nekrose klein. Die Dosis sollte der Schwere des pathologischen Bildes entsprechen. Es ist zweckmäßig, mit Gaben von 1 bis 2 ecm einer Suspension von Bacteria G mit einer optischen Dichte von 1 ,4 bei 420 nm zu beginnen. Diese Dosis ist an 2 aufeinander folgenden Tagen zu geben; danach ist eine Unterbrechung von 6 oder 7 Tage angezeigt, gefolgt von einer erneuten Verabreichung an 2 aufeinander folgenden Tagen. Diese Art der Verabreichung ist fortzusetzen, bis das Neoplasma zerstört ist.

Intramuskuläre Injektion ist in Fällen angezeigt, bei denen ein Neoplasma gerade aufgetreten ist und auf jeden Fall keine mit vielen Gefäßen versehenen Organe betroffen sind, da die Gefahr von Blutungen aufgrund von Nekrose des Neoplasma besteht. Sie gestattet eine gute Austauschmoglichkeit des Blockierungsfaktors und das Bacteria G wird rasch eliminiert. Die Dosis kann über einen sehr weiten Bereich variieren, im allgemeinen von etwa 1 bis 10 ecm einer Suspension mit einer optischen Dichte von 1,400 bei 420 nm. Die Dosis wird vorzugsweise an 2 oder 3 aufeinander folgenden Tagen verabreicht, dann tritt eine Unterbrechung von 6 bis 7 Tagen ein, danach erfolgt eine erneute Verabreichung an 2 oder 3 aufeinander folgenden Tagen, gefolgt von einer 6 oder 7-tägigen Unterbrechung. Der bevorzugte Plan für die Verabreichung ist der gleiche wie für eine subkutane Verabreichung.

Intravenöse Injektion erlaubt einen sehr guten Austausch des Blokkierungsfaktors, hat jedoch einige Nachteile, hauptsächlich ,weil das Bacteria G zu rasch eliminiert wird. Daher wird diese Art der Verabreichung am besten nur angewendet, um das Auftreten einer primären immunologischen Wirkung zu beschleunigen. Auf jeden Fall sollte die intravenös verabreichte Dosis an Bacteria G nie die Werte einer hypothetischen Verdünnung im Blut übersteigen, die einer optischen Dichte von 0,03 bei 420 nm entspricht, da sonst die Gefahr eines Immunitätsblocks besteht. Für einen erwachsenen Patienten mit einem Körpergewicht von 65 - 70 kg wird

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dieser Grenzwert mit etwa 2 Dosen von je 10 ecm Bacteria G ~ Suspension mit einer optischen Dichte von 1,000 bei 420 nm erreicht.

Bei oraler Verabreichung müssen die Dosen vergrößert werden, da Verluste durch die Dispersion im Chymus und Chylus auftreten. Trotzdem ist dies die bequemste Art der Verabreichung. Das Bacteria G sollte vorzugsweise lyophilisiert und in Kapseln verabreicht werden, die Magensaft-beständig sind, damit die Kapseln unverdaut durch das gastrische System gelangen. Wenn die Bacteria G lebend verabreicht werden, können sie im Darm proliferieren, wodurch eine nützliche Dosis an Bakterien geschaffen werden kann. Die VerabreichungsZeitpunkte sind vorzugsweise die gleichen wie für intramuskuläre Gaben. Die bevorzugte Dosis beträgt zwischen etwa 0,01 bis 0,1 g lyophilisierter Bacteria G.

Bei rektaler Verabreichung kann eine Suspension von Bacteria G verwendet werden. Dies hat die gleichen Vorteile wie eine orale Verabreichung, und darüberhinaus besteht keine Risiko der Zersetzung durch Enzyme. Die bevorzugte Dosis, die nach der Entleerung der Exkremente verabreicht wird, beträgt zwischen 10 bis 20 ecm. Die VerabreichungsZeitpunkte sind vorzugsweise die gleichen wie für intramuskuläre Gaben.

Die topische Verabreichung ist nur von untergeordneter Bedeutung und sollte vorzugsweise nur in Verbindung mit anderen Arten der Verabreichung nach dem gleichen Verabreichungsplan wie bei den anderen Arten gegeben werden. Die Dosis richtet sich nach dem Ausmaß der Läsion; jedoch wird vorzugsweise eine relativ geringe Menge an Bacteria G-Suspension (1-5 ecm von 1,000 optischer Dichte bei 420 nm) verwendet. Die Bacteria G können mit jedem geeigneten Träger- oder Verdünnungsmittel, das für topische Präparate üblich ist, formuliert werden. Im allgemeinen kann jedes Träger- oder Verdünnungsmittel, das üblicherweise für pharmazeutische Präparationen benutzt wird, mit Bacteria G oder dessen Antigenextrakt verwendet werden. Das jeweilige Träger- oder Verdünnungsmittel wird je nach der Art der vorstehend beschriebenen Verabreichungsmethoden ausgewählt. Jedoch werden keine Träger- oder Verdünnungsmittel empfohlen, die eine starke oxydierende oder reduzierende Wirkung haben. Vorzugsweise sollte das entsprechende

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Verdünnungsmittel zu den Bacteria G (lyophilisiert oder bei - 20° C gefroren) kurz vor der Verabreichung zugegeben werden. Bevorzugte Formulationen sind:

lebende Bacteria G plus isotonische Salzlösung (0,9 % NaCl) lebende Bacteria G plus physiologische Salzlösung ohne Glukose lebende Bacteria G plus 0,9 % NaCl plus 0,5 % Phenol Lyophilisierte lebende Bacteria G in einer Magen-resistenten

Kapsel

Suspensionen in destilliertem Wasser.

Bei den Formulierungen, die Phenol enthalten, tötet das Phenol die Bakterien; daher sollten diese vorzugsvzeise 1 Stunde vor Verwendung hergestellt werden.

Bei der Anwendung von Suspensionen mit destilliertem Wasser wird empfohlen, daß die Suspension sofort nach ihrer Herstellung verwendet wird. In den anderen Fällen ist es empfehlenswert, die Präparationen bald nach deren Herstellung zu verwenden.

Bei allen vorher beschriebenen Versuchen wurden lebende Bakterien verwendet; jedo.ch wurden bei Wiederholung der Versuche mit toten bakteriellen Zellen im allgemeinen die gleichen Resultate erzielt.

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Claims

Patentansprüche

1. Microorganismus Streptococcus faecalis G (ATCC 3129ο).

2. Microorganismen-Kultur, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Microorganismus Streptococcus, insbesondere Streptococcus faecalis G, umfaßt.

3. Verwendung von einem Microorganismus Streptococcus, insbesondere Streptococcus faecalis G,bzw. des Antigen von diesem zur Bekämpfung von Neoplasma bei Mensch und Tier.

A. Die Verwendung von einem Microorganismus Streptococcus, insbesondere Streptococcus faecalis G, bzw. das Antigen von diesem zur diagnostischen Untersuchung von Mensch oder Tier auf das Vorhandensein von Neoplasma.

5. Ausführungsform nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Microorganismen in lebendiger oder abgetöteter Form als eine gewaschene, physiologische Lösung mit Zellen einer solchen Konzentration verwendet werden, daß die Lösung mit einer optischen Dichte von etwa 0,07 bei etwa 420 nm eine optische Dichte von wenigstens etwa 0,7 bei einer Wellenlänge von etwa 192 nm besitzt.

6. Ausführungsform nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Dichte bei etwa 192 nm wenigstens etwa 0,9, vorzugsweise wenigstens etwa 1,0, insbesondere wenigstens etwa 1,2, beträgt.

7. Ausführungsform nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein das Antigen enthaltende Material zu dem Serum des zu untersuchenden Individuums zugefügt wird.

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8. Ausführungsform nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als das Antigen enthaltende Material lebende oder abgetötete Zellen des Streptococcus faecalis G in einer gewaschenen physiologischen Lösung einer solchen Konzentration verwendet wird, daß die optische Dichte bei etwa 420 nm etwa 0,2 bis 0,5 beträgt.

9. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Microorganismus Streptococcus, insbesondere Streptococcus faecalis G, oder einen dessen Antigen enthaltenden Extrakt, gegebenenfalls in Mischung mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger oder Verdünnungsmittel, umfaßt.

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