DE2700338C2

DE2700338C2 - Parenteral injizierbarer Impfstoff für Schweine gegen Infektionen von Bordetella bronchiseptica sowie Verfahren zum Herstellen dieses Impfstoffes

Info

Publication number: DE2700338C2
Application number: DE2700338A
Authority: DE
Inventors: Daniel Owen Ames Ia. Farrington; William Paul Switzer
Original assignee: Iowa State University Research Foundation ISURF
Current assignee: Iowa State University Research Foundation ISURF
Priority date: 1977-01-05
Filing date: 1977-01-05
Publication date: 1985-11-21
Also published as: BE850141A; GB1552611A; AU2106677A; DE2700338A1; NL7700319A; AU516010B2; NL179875B; FR2376665A1; NL179875C; FR2376665B1; CH601479A5

Description

Die Erfindung betrifft einen parenteral mjizierbaren Impfstoff für Schweine zum Schutz vor den oder zur Bekämpfung der durch Bordetella bronchiseptica auftretenden Infektionen, wobei der Impfstoff dadurch erhalten wird, daß Bordetella bronchiseptica ATCC 31 124 in dafür üblichen Kulturen gezüchtet wird, die Zellen inaktiviert werden und das inaktivierte Impfmaterial mit einem Adjuvans versetzt wird.

Bordetella bronchiseptica wurde als Hauptursache der bei Schweinen weitverbreiteten, üblicherweise als »Nasenmuschelatrophie« bezeichneten Krankheit festgestellt, da als Folge der Primärinfektion bei den Nasenmuschelknochen häufig eine starke Störung bzw. Mißbildung auftritt, siehe Canad. J. Comp. Med., 31 (1967), S. 53—57, und die dort angegebenen Literaturstellen. Bakterien Bordetella bronchiseptica können in den Nasenhöhlen weiter existieren, was zu einer Infektion der empfänglichen Nachkommenschaft von tragenden Mutterschweinen führt.

Ferkel werden mit Bordetella bronchiseptica in einem sehr frühen Lebensabschnitt infiziert, in einem Alter von weniger als vier Wocnen, wodurch das Problem eines effektiven Schutzes besonders schwierig wird, weil das Immunitätssystem von sehr jungen Schweinen oder Ferkeln auch nicht zufriedenstellend auf Vaccinen oder Impfstoffe anspricht. Für eine wirksame Bildung von Antikörpern werden Vaccinen oder Impfstoffe bei Schweinen üblicherweise in einem Alter von etwa sechs bis acht Wochen appliziert. In diesem Alter kann jedoch, falls die Ferkel mit B. bronchiseptica infiziert worden sind, eine Schädigung der Nasenmuschelknochen bereits auftreten, obwohl die Schweine gegenüber der Infektion immunisiert werden.

Die erste Behandlung, die sich als wertvoll bei der Verminderung des Auftretens der Infektion von Ferkeln herausstellte, war die Applikation von therapeutisch wirkenden Sulfonamiden wie Sulfamethazin oder Sulfaäthoxypyridazin in den bei tragenden Herden applizierten Futterrationen. Über diese Methode wurde in der Literatur und in Patentschriften von Dr. William P. Switzer berichtet, siehe Vet Med, 58 (1963), S. 571—574, und US-Patentschrift 33 36 190. Jedoch war die Wirksamkeit der Sulfonamidtherapie bei der Ausschaltung von Infektionen durch B. bronchiseptica durch das Auftreten von sulfonamid-resistenten Stämmen dieses Mikroorganismus eingeschränkt. Beispielsweise ergab eine 1967 durchgeführte Studie, daß isolierte Stämme von B. bronchiseptica, welche von 80% der untersuchten Herden bzw. Gruppen entnommen wurden, gegenüber dem Sulfonamid resistent waren, siehe Am. J. VeL Res, 30 (September 1969), S. 1621-1624.

Diese Ergebnisse verdeutlichen die Notwendigkeit für zusätzliche Heilmittel oder insbesondere für wirksame Immunisierungsmittel. Vor der Erfindung wurde jedoch keine andere Präventivbehandlung entwickelt, welche zur Anwendung bei der kommerziellen Aufzucht von Schweinen geeignet gewesen wäre.

Weiter wurde gefunden, daß die Einführung von lebenden Zellen eines niedrig-virulenten Stammes von B. bronchiseptica in die Nasalkavitäten von nicht-immunen Schweinen eine relativ milde Infektion hervorrufen und daß die Schweine danach gegenüber einer weiteren Infektion einschließlich einer Infektion durch virulentere Stämme des Mikroorganismus immun werden, siehe J. Vet. Res, 30 (Juli 1969), S. 1161-1166. Ein solcher niedrig-virulenter Stamm, der öffentlich nicht zugänglieh war, wurde durch die private Kennzeichnung »Stamm D-I (Strain D-l)« identifiziert. Hierbei handelt es sich um denselben Stamm, der zur Herstellung der parenteralen Vaccine aus abgetöteten ganzen Zellen gemäß der Erfindung verwendet wird. Jedoch wurde gemäß dem Stand der Technik gefunden, daß lebende Zellen des Stammes D-I in den Nasalkavitäten von wieder gesund gewordenen Schweinen weiter bestehen. Daher wurde der Stamm D-I als Intranasalvaccine aus lebenden ganzen Zellen ausgeschlossen. Weiterhin war kein anderer Stamm von B. bronchiseptica bekannt, der Immunität erzeugen könnte und danach von selbst aus den Nasalpassagen der immunisierten Schweine verschwinden würde.
Weiterhin wurden Versuche durchgeführt, einen Impfstoff aus abgetöteten Zellen von B. bronchiseptica zu entwickeln, welche Immunität durch parenterale Applikation induzieren könnte. Eine der ersten Vcrsuchsvaccinen dieser Art wurde aus einem virulenten Stamm von B. bronchiseptica, der als Stamm B (Strain

B) identifiziert wurde, hergestellt. Jedoch konnte diese Ganzzellenvaccine keine Resistenz gegenüber Nasalinfektion induzieren, wie von D. L. Harris und W. P. Switzer in Am. J. Vet. Res. 30 (Juli 1969), S. 1161-1166, berichtet wurde. Wegen des Versagens solcher parenteralen Ganzzellenvaccinen stellten Harris und Switzer die Forderung auf, daß: »die Exposition des Schweines gegenüber den internen Antigen von B. bronchiseptica für die Ausbildung von Resistenz gegenüber Nasalinfektionen erforderlich sein könnte«, siehe Am. J. Vet.

Res. 33 (Oktober 1972), S. 1975 und 1981/1982. Diese Theorie hat sich jedoch als nicht zutreffend herausgestellt. Vaccinen oder Impfstoffe, die aus aufgebrochenen (ultraschallbehandelten) Zellen von B. bronchiseptica, Stamm D-I, hergestellt wurden, erwiesen sich als wirkungslos zur Verhinderung einer Infektion von B. bronchiseptica, jedoch induzierten sie ein beschleunigtes Freiwerden nach 40 Tagen im Anschluß an die Applikation, siehe A. J. Vet. Res, 33 (1972), S. 1979 und 1981.

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Das durch Ultraschall aufgebrochene Zellmaterial wurde gefiltert, um ein feststoffreies Filtrat zu erhalten. Dieses Filtrat wurde dazu verwendet, die Testvaccine herzustellen, auf die in der obengenannten Literaturstelle Bezug genommen ist Diese sogenannte »Ultraschall 5 behandelte Vaccine« enthält in dem flüssigen Oberstand ausschließlich antigenes Material, das durch die Ultraschallbehandlung gelöst wurde. Sie enthält dagegen kein antigenes Material, das zur Verfugung steht, wenn D 1-Zellen in einem Kulturmedium wachsen. Ebenso wenig enthält es antigenes Material, das nach der Zellzerstörung durch Ultraschall mit den Zelltrümmern verbunden bleibt Man war jedoch bis dahin der Überzeugung gewesen, die wesentlichen Antigene, mit denen eine Immunantwort erreicht werden sollte, würden sich in dem löslichen Oberstand befinden.

Erst die Testergebnisse zeigten, daß die Ultraschallbehandlung der D 1-Zellen keine Immunisierung hervorrief. Es wurde daraus geschlossen, daß die Art einer Resistenz, wie sie durch eine die freigesetzten Antigene von abgetöteten Zellen enthaltende, parenteral Vaccine induziert wurde, von der Immunität bei Schweinen verschieden war, die sich von einer intranasalen Infektion mit lebenden B. bronchiseptica erholt hatten.

Zu der erwünschten Wirkung eines Impfstoffes gegen infektiöse atrophische Rhinitis ist zu bemerken, daß es besonders wichtig ist, daß durch den Impfstoff besonders junge, vorzugsweise nicht mehr als eine Woche alte Schweine immunisiert werden können. Die größten wirtschaftlichen Schäden in der Schweinezucht treten insbesondere als Sekundärerscheinung nach der Infektion durch Verformung des Nasenknochens auf. Diese Mißbildung läßt sich nicht mehr aufhalten, wenn erst einmal eine Infektion stattgefunden hat, auch wenn diese sehr schnell unter Kontrolle gebracht wird. Daher sind die Schaden dann besonders groß, wenn sehr junge Schweine infiziert werden. Wie aus der Literaturstelle A. J. Vet. Res. 33 (1972), S. 1979 bis 1981, hervorgeht, ist aber gerade das Immunisieren von besonders jungen Schweinen aus ultraschall-zerstörten Zellen des Stammes D-I nicht möglich. Die Fig. 1 auf Seite 1980 der genannten Lileraturstelle zeigt, daß die Immunisierungsreaktion auf die Ultraschall-Vaccine bei Schweinen, die zur Zeit der ersten Impfung zwei Wochen alt waren, sehr schlecht ist. Die durchgezogene Linie im oberen Schaubild der Fig. 1 zeigt den Antikörper-Titer für Schweine, die im Alter von zwei Wochen geimpft wurden, verglichen mit der mittleren, gepunkteten Linie, die den Titer für acht Wochen alte Schweine zeigt, sowie mil der obersten gestrichelten Linie für den Titer bei Schweinen, die im Alter von 4 Wochen geimpft wurden. Diese Ergebnisse werden durch Fig. 3 auf Seite 1981 der genannten Literaturstelle bestätigt, die ebenfalls den niedrigen Antikörpertiter zeigt, der sich ergibt, wenn zwei Wochen alte Schweine mit der Ultraschall-Vaccine behandelt werden.

Tabelle 1 auf Seite 1979 der genannten Literaturstelle demonstriert eine weitere Wertlosigkeit der ultraschallbehandelten Vaccine. Bei Schweinen, die im Alter von zwei, vier und acht Wochen mit der Ultraschall-Vaccine behandelt wurden, zeigte es sich, daß der unerwünschte, infektiöse Stamm über einen Zeitraum von 40 Tagen noch in der Nasensekretion der Schweine gefunden werden kann. In diesem Zeitraum werden aber die Toxine gebildet, die dafür verantwortlich sind, daß die atrophischen Erscheinungen in den Nasenmuscheln, die den wirtschaftlichen Schaden verursachen, fortschreiten. Trotz der aktiven Infektion der Nasenhöhlen dieser zwei Wochen alten, geimpften Schweine fällt der Antikörper-Titer kontinuierlich ab. Gerade in diesem Zeitraum benötigt somit das sehr junge Ferkel dringend einen Schutz. Dieser Schutz wird ihm eindeutig nicht durch die Ultraschall-behandelte Vaccine gewährt Diese Vaccine enthält ganz offensichtlich nicht diejenigen Antigene, die die erforderliche Antikörperreaktion für eine Kontrolle der Infektion und ein wirkungsvolles Verhindern der Nasenmuschelatrophie nötig ist.

In der Literaturstelle A. J. Vet Res. 33 (1972), S. 1979 bis 1981, ist durch die Tabellen und Figuren klar gezeigt, daß die Ultraschall-Vaccine nicht die gewünschte Immunreaktion hervorruft und somit im eigentlichen Sinne nicht als Vaccine zu bezeichnen ist Es handelt sich hier vielmehr um den vergeblichen Versuch, eine solche Vaccine zur Verfugung zu stellen. Tatsächlich erhielt man mit dem Präparat jedoch gerade bei den ganz besonders gefährdeten, sehr jungen Schweinen keine Immunreaktion, so daß insofern auch nicht von einem Impfstoff bezüglich des Ultraschall-behandelten Präparats gesprochen v/erden kann. Das Ziel einer wirksamen Immunisierung gegenüber der Infektion war also noch nicht erreicht und es war keine Lösung dieses dringenden Problems sichtbar.

Der Stand der Technik wurde von D. P. Farrington und W. P. Switzer in einem Aufsatz mit dem Titel »Resistenz gegenüber Bordetella Rhinitis« in Proceedings, The George A. Young Conference on Advances in Swine Repopulation und der 13. Annual Nebraska SPF-Konferenz, Lincoln, Nebraska, 23724. Juli 1973, Seiten 44—52, zusammengefaßt, wobei hier auf Seite 46 angegeben ist, daß »die parenterale Immunisierung von Schweinen mit Bakterienextrakten aus B. bronchiseptica bekanntermaßen das nasale Freiwerden von Infektionen mit B. bronchiseptica beschleunigt. Zusätzlich scheint die Entwicklung von starken, mit atrophischer Rhinitis verbundenen Verletzungen beträchtlich bei geeignet immunisierten Schweinen inhibiert zu sein.« Versuche mit experimentellen Bakterienextrakten bzw. Bakterienvaccinen von B. bronchiseptica sind in der Tabelle I zusammengestellt. Es wurde geschlossen, daß »zahlreicht, nicht beantwortete Fragen offen bleiben, bevor die Entwicklung eines praktischen, immunisierenden Mittels gegen Bordetella-Rhinitis Realität wird«, obwohl »parenterale Bakterienextrakte bzw. Bakterienvaccinen ein gewisses Ausmaß eines beschleunigten Freiwerdens von nasalen Infektionen durch B. bronchiseptica gezeigt haben«.

Es war daher Aufgabe der Erfindung, einen parenteral injizierbaren Impfstoff gegen Infektionen durch B. bronchiseptica sowie ein Verfahren zum Herstellen des Impfstoffes zur Verfugung zu stellen.

Wie bereits zuvor beschrieben, ist die Infektion durch B. bronchiseptica die Hauptursache der atrophischen Rhinitis. Häufig erfährt die Nasenmuschel eine schwere Atrophie als Nachwirkung der Infektion. Bei der Kolonienbildung der Bordetella-Mikroorganismen in den Nasalpassagen durchdringen sie die Schleimhautschicht und setzen sich selbst in Kolonien an den Epithelzellen fest. Während der Infektion werden toxische Substanzen gebildet, welche das darunterliegende Gewebe erreichen können, und insbesondere die knochenbildenden Zellen der Nasenmuschel.

Es wird angenommen, daß solche toxischen Substanzen die die Nasenmuschelatrophie hervorrufenden Verletzungen hervorrufen. Die vorliegende Erfindung liefert ein Mittel zur wirksamen Immunisierung gegenüber den toxischen Substanzen, welche die Nasenmuschel-

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.atrophie hervorrufen, ohne daß eine Primärinfektion durch B. bronchiseptica verhindert wird. Insbesondere wurde bei den zu der vorliegenden Erfind'ing führenden Untersuchungen gefunden, daß eine Vaccine aus abgetöteten ganzen Zellen aus einem Stamm von B. bronchiseptica hergestellt werden konnte, der die Hinterlegungsnummer ATCC 31 124 trägt Wenn diese in einer kritischen Dosismenge appliziert war, konnte ein effektiver Schutz von Schweinen gegenüber der Entwicidung der Nasenmuschelatrophie erzielt werden. Obwohl die mit Vaccine behandelten Schweine nicht gegenüber der Infektion immun sind, wird ein beschleunigtes Freiwerden der Infektion durch B. bronchiseptica üblicherweise erreicht Jedoch iiegt das hauptsächliche neue Ergebnis, das erfindungsgemäß erzielt werden kann, darin, daß eine Immunisierung gegenüber Naselmuschelbeschädigungen, welche eine Infektion durch B. bronchiseptica begleiten, auftritt Dies ist wesentlich, da rolche Schädigungen und die hieraus folgende Verformung des Nasenknochens ein Hauptgrund für die wirtschaftlichen Verluste bei Schweinezüchtern sind. Wegen des Vorherrschens von Mikroorganismen von B. bronchiseptica in Zuchtherden und der großen praktischen Schwierigkeit des Freihaltens solcher Zuchtherden von B. bronchiseptica ist es äußerst schwierig, eine Infektion von jungen Schweinen oder Ferkeln in einem für eine Ansteckung geeigneten Alter zu vermeiden.

Weitere wesentliche Einzelheiten im Hinblick auf die Herstellung von Vaccinen oder Impfstoffen in Dosismengenform gemäß der Erfindung und das Verfahren zur Verwendung solcher Vaccinen bzw. Impfstoffe werden im folgenden näher erläutert Parenterale Bakterienextrakte bzw. Bakterienvaccinen aus getöteten ganzen Zellen, hergestellt aus dem Stamm ATCC 31 124, haben sich als wirksam bei der Verhinderung einer Nasenmuschelatrophie und bei einer Verminderung der Dauer der Infektion durch B. bronchiseptica als wirksam herausgestellt. Weiterhin wurde gefunden, daß Ferkel in einem Alter von unter vier Wochen in zufriedenstellender Weise auf die Bakterienextrakte bzw. Bakterienvaccinen gemäß der Erfindung ansprechen. Die vorliegende Erfindung liefert daher ein Mittel, um bei Ferkeln einen Antikörperschutz gegenüber Nasenmuschelstrophie aufzubauen, bevor diese eine Möglichkeit zu einer Infektion mit den daraus folgenden Schädigungen des Nasenknochens hatten.

Vor der Pricritätsanmeldung der vorliegenden Anmeldung wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, lebensfähige Proben des Stammes von B. bronchiseptica hinterlegt, die als Impfkulturen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vaccine verwendet werden können. Die hinterlegten, identischen Proben, welche früher mit der privaten Bezeichnung »Stamm D-1« bezeichnet wurden, erhielten die Hinterlegungsnummer ATCC 31 124, wobei diese Hinterlegungsnummer im folgenden zur Identifizierung des Stammes verwendet wird. Die zugängliche, taxonomische Beschreibung des Stammes ATCC 31 124 von B. bronchiseptica ist wie folgt:

Taxonomische Beschreibung

ATCC 31 124 wurde aus den nasalen und trachealen Ausscheidungen von einem jungen Mischrassenhund, der klinische Anzeichen von Hundestaupe aufwies, gewonnen. Dieser Stamm wurde anschließend als Avirulent gegenüber Schweinen bestimmt, und es wurden die folgenden Identifikationsmerkmale an ihm bestimmt:

1. kleine, gram-negative Stäbchen.

2. aerob.

3. Kolonie annähernd 1 mm im Durchmesser nach dem Inkubieren auf einem 5%igen Pferdeblutagar während 48 Stunden bei 37° C.

4. Kolonie kreisförmig, gering konvex, ganz, opak, glatt, homogen mit wellenförmigem Rand auf 5%igem Pferdeblutagar.

5. Alkalischmachen von Lactosebrühe in 18—24 Stunden ohne Gasbildung.

6. Alkalischmachen von Dextrosebrühe in 18—24 Stunden ohne Gasbildung.

7. Urease-positiv innerhalb 2—12 Stunden.

8. Citrat-positiv innerhalb 12—24 Stunden.
9. Nitrat-positiv.

10. Alkalischmachen von Lackmusmilch innerhalb 48 Stunden.

11. Beweglich durch Mundwimpern.

12. Wachstum auf MacConkeys-Agar in Anwesenheit von Gallensalzen.

13. Empfindlich gegenüber Sulfamethazin bei einem Gehalt von 5 mg/ml beim Schalenversuch.

14. Resistent gegenüber 0,02 mg/ml Furaltadone (NF-260).

15. Hämagglutination-positiv(2,8°/oige Suspension von roten Schafsblutzellen).

16. Hämolytisch auf 5%igem Pferdeblutagar nach Inkubation bei 37° C für 24 Stunden.

17. Bildet keine Sporen.
18. Catalase-positiv.

19. Oxidase-positiv.

20. Indol-negativ.

21. Schwefelwasserstoff-negativ.

22. Negativ bei der Gelatineverflüssigung.

Bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Impfstoffes werden lebensfähige Zellen des Stammes ATCC 31 124 von B. bronchiseptica, die einem Gefriertrocknen für die Konservierung unterzogen worden sein können, in ein geeignetes Kulturmedium eingeführt, welches dann bei einer das Wachstum des Mikroorganismus begünstigenden Temperatur inkubiert wird. Im allgemeinen können die veröffentlichten Arbeitsweisen zum Kultivieren von Mikroorganismen von B. bronchiseptica angewandt werden, siehe z. B. Am. J. Vct. Res., 30 (1969), S. 1161/1162, sowie Am. J. Vet. Res., 33 (1972), S. 1975/1976. Insbesondere kann Tryploscphosphatkulturlösung (TPB) für das Wachstum des Mikroorganismus verwendet werden. Eine geeignete

so Quelle eines solchen TPB-Mediums ist im Handel erhältlich von Difco Laboratories, Ine Detroit, Michigan, USA. Andre geeignete Kulturmedien umfassen: Bordet-Gengou-Agar (erhältlich von Difco), Hirn-Herz-Infusions-Kulturlösung (erhältlich von Difco), Trypton-Soja-KuIturlösung (erhältlich von Oxoid Limited, London, England). Wachstumstemperaturen von 36—38°C sind günstig. Mehr ins einzelne gehende Anweisungen für die Vermehrung bzw. das Wachstum ergeben sich aus den folgenden Beispielen.

Nach dem Wachstum wird die Kultur von ATCC 31 124 ohne Aufbrechen der Zellenwändc abgetötet. Geeignete Abtötungsmittel umfassen eine Endkor.zentration von 0,2% Formaldehyd oder 1 :10 000 Thimerosal (Natriumäthyl-Quecksilbe^MJ-thiosalicylat). Eine bevorzugte Arbeitsweise besteht darin. Formalin in 37°/oiger wäßriger Lösung von Formaldehyd zuzusetzen. Endkonzentrationen an Formaldehyd von 0,1 bis 0,2% sind ausreichend für eine vollständige Inak-

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tivierung, wenn die Zellen für 24 Stunden bei Zimmertemperatur (20—25⁰C) aufbewahrt werden. Nach dem Abtöten können die intakten Zellen unter Kühlen (z. B. bei 4° C) aufbewahrt werden. Bevorzugte Konzentrationen des Bakteriums reichen von etwa 10⁹ bis 10" Zellen/ml, z. B. praktisch 10¹⁰ Zellen/ml. Solche Konzentrate von abgetöteten Zellen sind sehr geeignet, um Vaccine oder Impfstoffe in Dosisform zur Durchführung der Erfindung herzustellen.

Wie auf dem Fachgebiet der Herstellung von parenteralen Vaccinen bekannt, kann ein geeigneter Hilfsstoff mit den abgetöteten Zellen bei der Herstellung der Vaccine für die Applikation vermischt werden. Eine wirksame Menge eines mit den abgetöteten Zellen vermischten Hüfsstoffes kann die Ar.tikörperproduktion bei den geimpften Tieren erhöhen. Für Tiere zur Fleischerzeugung, wie Schweine, ist es wünschenswert, wenn der Hilfsstoff absorbierbar ist, gleichgültig ob er subkutan oder intramuskulär injiziert wurde: Es ist daher vorteilhaft, je nach den gesetzlichen Bestimmungen des betreffenden Staates einen Hilfsstoff zu verwenden, der zur Applikation bei Tieren zur Fleischerzeugung zugelassen ist. L. B. in den USA vom U.S. Department of Agriculture, Veterinary Biologies Division. Aluminiumhydroxid (Aluminiumoxidpaste) ist ein vorteilhafter Zusatzstoff bei den erfindungsgemäßen Vaccinen und es ist zur Verwendung bei Tieren zur Fleischerzeugung zugelassen. Die Verwendung dieses Hüfsstoffes ist in den Beispielen illustriert. Ein weiterer, anwendbarer Hilfsstoff ist ein Präparat, das entsprechend den Angaben in der US-Patentschrift 31 49 036 hergestellt wurde. Dieser Hilfsstoff ist im Handel erhältlich, z. B. von Merck & Co., Inc. Rahway, New Jersey, USA, mit der Bezeichnung Merck Adjuvant 65. Die Herstellung und die Verwendung dieses Zusatzstoffes ist ebenfalls in den Beispielen beschrieben.

Der erfindungsgemäße Impfstoff in parenteral inji-/.lerbarer Dosisform besteht im wesentlichen aus dem Hilfsstoff in Mischung mit etwa 10⁹ bis 10¹¹ abgetöteten, ganzen Zellen des Stammes ATCC 31 124. Die bevorzugte Vaccinedosis enthält von 5 bis 15 χ ΙΟ⁹ Zellen dieses Stammes. Solche Vaccinedosismengen sind besonders geeignet zur Immunisierung von Schweinen gegenüber der Entwicklung von Nasenmuschelatrophie. Das Dosisgesamtvolumen der Vaccine umfaßt das Zellenvolumen plus dem Volumen des injizierbaren, absorbierbaren Zusatzstoffes. Das Dosisvolumen beträgt üblicherweise mehr als 0,5 ml und weniger als 3,0 ml, jedoch sollte es eine ausreichende Größe besitzen, um eine wirksame Menge des Hilfsstoffes einzuschließen. Dosisvo'umina von 0,8 bis 2$ m! sind besonders geeignet für die intramuskuläre oder subkutane Applikation. Bei einer bevorzugten Präparation liegen 10 bis 15 χ 10⁹ Zellen vor, und das Gesamtdosisvolumen beträgt von 1,8 bis 2a ml.

Der erfindungsgemäße Impfstoff kann ebenfalls zum Schutz der Nachkommenschaft eines tragenden Mutterschweines gegenüber der Entwicklung von Nasenmuschelatrophie verwendet werden. Beispielsweise wird wenigstens eine Dosis der Vaccine, welche von 10⁹ bis 10" abgetötete ganze Zellen des Stammes ATCC 31 124 enthält, parenteral bei dem tragenden Mutterschwein nicht weniger als 14 Tage vor dem Werfen appliziert Bei einer bevorzugten Arbeitsweise werden zwei bis drei Dosismengen der Vaccine bei dem tragenden Mutterschwein in Intervallen von nicht weniger als fünf Tagen zwischen den Dosismengen appliziert Beispielsweise können zwei Injektionen der Vaccine gegeben werden, die erste etwa 28 Tage vor dem Werfen und die zweite etwa 14 Tage vor dem Werfen.

Die Arbeitsweisen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen werden anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Bakterienextrakte bzw. Bakterienvaccinen zur Anwendung bei der Durchführung der Erfindung können nach folgender Arbeitsweise hergestellt werden:

is 1. Lyophilisierter Stamm ATCC 31 124 wird aus dem Lagerzustand bei —20°C entnommen und über Nacht bei 37°C in TPB (Tryptosephosphatkulturlösung) inkubiert.

2. DieTPB-Kulutur wird in die gewünschte Menge an TPB in einem geeigneten Behälter überführt.

3. Es wird für 24 bis 48 Stunden aerob inkubiert.

4. Die Reinheit wird überprüft und es wird eine Bestimmung der Kolonien bildenden Einheiten auf 5%igem Pferdeblutagar durchgeführt.

5. Es wird Formaldehyd in 37°/oiger Lösung bis zu einer Endformalinkonzentration von 1 :1000 hinzugegeben und gut vermischt.

6. Es wird über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert und gut vermischt. Die Überprüfung auf Inkativierung und Sterilität wird auf 5%igem Pferdeblutagar durchgeführt.

7. Es wird bei 4° C gelagert.

Beispiel 2

Zusatzstoffe oder Hilfsstoffe, welche für eine Anwendung bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Anwendung geeignet sind, können wie folgt hergestellt werden:

Aluminiumhydroxid-Zusatzstoff

1. Eine geeignete Menge an komprimiertem Aluminiumhydroxidgel, z. B. 384 g, welche etwa 9,5% an AI2O5 enthalten, wird mit entionisiertem Wasser in geeigneten Mengen vermischt um eine Aluminiumhydroxidlösung mit einer Endkonzentration von 20% herzustellen.

2. Die fertige Lösung liefert annähernd 2% AI2O3.
3. Eine Probe wird im Autoklaven sterilisiert

4. Es wird bei Zimmertemperatur gelagert

Erdnußöl-Zusatzstoff

1. Der Zusatzstoff besteht aus 85,0% Erdnußöl, 10,56% Mannidmonooleat (Arlacel A) und 4,4% Aluminiummonostearat

2. Eine geeignete Menge eines jeden Inhaltsstoffes wird in den oben angegebenen Anteilen in einem geeigneten Behälter auf einer Heizrühreinrichtung vermischt

3. Die Temperatur wird mit einer Geschwindigkeit von 4° C/Min. aufl20°Cerhöht

4. Das Gemisch wird konstant mit einem Glasstab während des Aufheizvorganges gerührt

5. Das homogene Material wird dann in braunen Flaschen abgefüllt und im Autoklaven sterilisiert

6. Es wird bei Zimmertemperatur gelagert.

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Dieser Zusatzstoff ist erhältlich (Bezeichnung Adjuvant 65 von Merck), siehe US-Patentschrift 31 49 036.

Beispiel 3

Geeignete Arbeitsweisen zur Herstellung von Vaccinen unter Verwendung der Zusatzstoffe des Beispiels 2 werden im folgenden näher erläutert.

Herstellung von Vaccine mit

Aluminiumhydroxid-Zusatzstoff

1. Gleiche Volumina des Aluminiumhydroxid-Zusatzstoffes (20%ige Lösung) und von inaktivierter TDD ι/..u..-u«':^ ..«« e«-_nmm I^ 1 ,„_a»i_an :_nn;» ;_n ._ς

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einem geeigneten Behälter zur Bildung der fertigen Vaccine vermischt.

2. Die Vaccine enthält etwa 1 % AI2O3.

3. Die Endkonzentration an Vaccine enthält etwa 10¹⁰ Zellen/ml.

4. Die Vaccine wird bei 4° C bis zur Anwendung in mit Gummistopfen verschlossenen, versiegelten 100-ml-Glasbehältern aufbewahrt.

5. Für die Applikation bei Ferkeln werden 2 ml der Vaccine subkutan appliziert

Herstellung von Vaccine mit Erdnußöl-Zusatzstoff

1. Gleiche Volumina des Erdnußöl-Zusatzstoffes und der inaktivierten TPB-Kulturbrühe des Stammes ATCC 31 124 werden innig unter Bildung der fertigen Vaccine emulgiert.

2. Die Endkonzentration der Vaccine enthält annähernd 10¹⁰ Zellen pro ml.

3. Die Vaccine wird auf 4° C bis zur Verwendung in mit Gummistopfen verschlossenen, versiegelten 100-ml-Glasbehältern aufbewahrt.

4. Für die Applikation an Ferkeln werden 2 ml der Vaccine subkutan verabreicht

40 Beispiel 4

Eine bevorzugte Arbeitsweise zur Vaccinebehandlung bei Ferkeln ist wie folgt:

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1. Eine Dosis von 2 ml eines der Vaccineprodukte des Beispiels 3 wird bei jedem Ferkel in einem Alter von 1 Woche und 4 Wochen appliziert

2. Die Vaccine wird subkutan injiziert

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Be is pi ε! 5

Eine bevorzugte Arbeitsweise zur Vaccinebehandlung an Mutterschweinen vor dem Werfen ist wie folgt:

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1. Eine Dosis von 2 ml einer der beiden Vaccineprodukte von Beispiel 3 wird jedem Muttertier 4 Wochen und 2 Wochen vor dem Werfen appliziert

2. Die Vaccine wird subkutan injiziert

3. Weibliche Tiere mit hohen Werten von humoralen Antikörpern gegen B. bronchiseptica können erwartungsgemäß hohe AVerte von Anti-Bordetellabronchiseptica-Antikörpern über die Vormilch auf die empfangsbereiten Ferkel übertragen.

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Durch die Applikation der Vaccine bei tragenden Mutterschweinen vor dem Werfen kann wenigstens ein partiellerSchutzder Nachkommenschaft erreicht werden.

Claims

27 QO 338 Patentansprüche:

1. Parenteral injizierbarer Impfstoff für Schweine zum Schutz vor den oder zur Bekämpfung der durch Bordetella bronchiseptica auftretenden Infektionen, wobei der Impfstoff dadurch erhalten wird, daß Bordetella bronchiseptica ATCC 31 124 in dafür üblichen Kulturen gezüchtet wird, die Zellen inaktiviert werden und das inaktivierte Impfmaterial mit einem Adjuvans versetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die für den Impfstoff verwendete Kultur von Bordetella bronchiseptica ATCC 31 124 nach dem Züchten als solche, ohne Aufbrechen von Zellen inaktiviert wird.

2. Verfahren zum Herstellen eines parenteral injizierbaren Impfstoffes für Schweine zum Schutz vor den oder zur Bekämpfung der durch Bordetella bronchiseptica auftretenden Infektionen, durch Züchten von Bordetella bronchiseptica ATCC 31 124 in dafür üblichen Kulturen, Inaktivieren der Zellen und Versetzen des inaktivierten Impfmaterials mit einem Adjuvans, dadurch gekennzeichnet, daß die nach Züchtung von Bordetella bronchiseptica ATCC 31 124 erhaltene Kultur als solche, ohne Aufbrechen von Zellen inaktiviert wird.