La présente invention est relative à un vaccin destiné à l'immunisation des animaux et en particulier du porc contre une infection due au Bordetella hronchiseptica.
On a établi que le Bordetella hronchiseptica est la cause principale de la maladie qui est largement répandue chez le porc et que l'on appelle habituellement atrophie turbinée parce que, après l'infection primaire, les os turbinés du nez subissent fréquemment une sérieuse détérioration. On peut se reporter à cet effet à Canad. J. Comp. Med. , 31,53-57(1967) et aux références bibliographiques qui y sont citées. La bactérie Bordetella hronchiseptica peut persister dans les cavités nasales, en menant à une infection des produits des truies d'élevage.
Les porcelets sont infectés très tôt par le Bordetella hronchisep- tica (avant l'âge de quatre semaines), ce qui soulève le problème particulièrement difficile d'une protection efficace, car le système d'immunisation des très jeunes porcelets n'est pas sensible aux vaccins de manière satisfaisante. Pour une production efficace d'anticorps, on administre habituellement les vaccins aux porcs à l'âge d'environ six à huit semaines. A ce moment, si les porcs ont déjà été infectés par le Bordetella bronchîseptica, une détérioration des os turbinés peut se produire, même si les porcs sont ensuite immunisés contre l'infection.
Le premier traitement qui s'est montré intéressant pour réduire le problème de l'infection chez les porcelets a consisté en l'administration d'un agent thérapeutique sulfamidé, tel que de la sulfaméthazine ou de la sulfaéthoxypyridazine, et ce dans les rations données aux troupeaux d'élevage. On a signalé cette méthode dans la littérature et elle a été brevetée par le dr William
P. Switser: Vet. Med. , 58, 571-574 (1963); brevet des Etats
Unis d'Amérique N" 3336190. Toutefois, l'efficacité d'une thérapeutique par sulfamidé pour l'élimination d'une infection due au
Bordetella bronchiseptica a été limitée par le développement de souches de l'organisme qui sont résistantes aux sulfamidés.
A titre d'exemple, une étude faite en 1967 a montré que des matières isolées de Bordetella bronchiseptica, récupérées de 80% des animaux inspectés étaient résistantes aux sulfamidés [ Am. J. Vet. Res. , 30, 1621-I 624 (sep. 1969)] Ces résultats ont mis en évidence la nécessité de pouvoir disposer de médicaments supplémentaires ou, plus particulièrement d'agents efficaces d'immunisation. Avant la présente invention, aucun autre traitement préventif utilisable dans l'élevage industriel des porcs n'a toutefois été proposé.
On a trouvé que l'introduction de cellules vivantes d'une souche à faible virulence de Bordetella bronchiseprica dans les cavités nasales de porcs non immunisés produit une infection relativement modérée et que, par la suite, le porc est immunisé contre une infection ultérieure, notamment une infection par des souches plus virulentes de l'organisme [voir J. Vet. Res. 30, 1161-1166 (juillet 1969)]. Une telle souche de faible virulence, qui n'a pas été disponible au public, a été identifiée par le code privé souche D-l.
C'est cette même souche qui a été utilisée pour préparer le vaccin à cellules entières tuées, utilisable par voie parentérale, suivant la présente invention. Toutefois, au cours des travaux antérieurs, on a trouvé que des cellules vivantes de la souche D-l persistaient dans les cavités nasales des porcs guéris. Par conséquent, la souche D- 1 a été écartée en tant que vaccin intranasal à cellules entières vivantes. De plus, on ne connaît aucune autre souche de
Bordetella hronchiseptica qui assurerait une immunité et qui s'éliminerait ensuite d'elle-même des conduits nasaux des porcs immunisés.
On a également procédé à des essais pour créer un vaccin au départ de cellules tuées de Bordetella bronchiseprica, vaccin qui pourrait créer une immunité par une administration parentérale.
L'un des premiers vaccins expérimentaux de ce genre a été préparé au départ d'une souche virulente de Bordetella hronchiseptica (identifiée sous le nom de souche B). Toutefois, ce vaccin à cellules entières n'est pas parvenu à créer une résistance à l'infection nasale, comme signalé par Harris D.L. et Switzer W.P.: Am. J.
Vet. Res. , 30, 1161-1166 (juillet 1969). En raison de cette défaillance de tels vaccins à cellules entières, utilisés par voie parentérale, Harris et Switzer ont supposé que: Une exposition du porc aux antigènes internes de Bordetella hronchiseptica peut être nécessaire à la création d'une résistance contre l'infection nasale , Am. J. Vet. Res. , 33, 1975, 1981-1982 (octobre 1972). Cette théorie s'est révélée incorrecte. Des vaccins préparés au départ de cellules rompues de Bordetella hronchiseptica, souche D- I, ne sont pas parvenus à empêcher une infection par le Bordetella hronchi- septica, mais ont supposé une élimination accélérée lors d'un essai ultérieur d'une quarantaine dejours ( A.J. Vet. Res. , 33, 1975,
1979 et 1981).
On en a conclu que le type de résistance créé par un vaccin parentéral contenant les antigènes libérés de cellules tuées étaient différent de l'immunité du porc qui avait été guéri d'une infection intranasale avec du Borcletella hronchiseptica vivant. Le but d'une immunisation efficace contre l'infection restait à atteindre et aucune solution à ce problème déroutant n'était donc perceptible.
L'état de la technique dans ce domaine a été résumé par
D.O. Farrington et W.P. Switzer, à savoir les inventeurs dans le cas présent, dans un article intitulé Resistance to hor < letella zhiní- tis , Proceedings, The George A. Young Conference on Advances in Swine Repopulation and the Thirteenth Annual Nebraska SPF
Conference, Lincoln, Nebraska, 23-24 juillet 1973, pages 44-52; à la page 46 de cet article, on a signalé ce qui suit:
On sait qu'une immunisation parentérale du porc avec des bactérins (vaccins bactériens) de Bordetella hronchiseptica accélère l'élimination nasale des infections de ce Bordetella bronchiseptica. En outre, le développement des fortes lésions associées à la rhinite atrophique semble être inhibé de façon significative chez les porcs convenablement immunisés. Les essais réalisés avec des bactérins de
Bordetella bronchiseptica expérimentaux ont été résumés dans le tableau 1 de cet article. On en a conclu que, alors que des bactérins parentéraux ont montré un certain degré de libération accélérée des infections nasales dues au Bordetella bronchiseptica , de nombreuses questions restaient sans réponse avant que le développement d'un agent d'immunisation pratique contre la rhinite due au Bordetella devienne une réalité .
Comme on l'a mentionné antérieurement, l'infection due au
Bordetella bronchiseptica est la cause principale de la rhinite atrophique. Fréquemment, à la suite de l'infection, les os turbinés subissent une sérieuse atrophie. Dans la colonisation des conduits nasaux par les organismes de Bordetella, ces organismes pénètrent dans la couche de mucus et s'accrochent en colonies aux cellules épithéliales. Durant l'infection, des substances toxiques sont produites, ces substances atteignant le tissu sous-jacent et, en particulier, les cellules de formation osseuse des crêtes turbinales. On croit que ces substances toxiques produisent des lésions créant l'atrophie turbinée.
La présente invention apporte des moyens pour assurer une immunisation efficace contre les substances toxiques qui créent l'atrophie turbinée, sans empêcher l'infection primaire de Bordetella bronchiseptica. De façon plus particulière, au cours des travaux qui ont mené à la présente invention, on a découvert qu'un vaccin à cellules entières tuées pourrait être préparé au départ d'une souche de Bordetella bronchiseptica identifiée par ATCC NO 31124, ce vaccin, lorsqu'il est administré en une dose critique, étant capable d'assurer une protection efficace du porc contre le développement de l'atrophie turbinée. En outre, bien que le porc vacciné ne soit pas immunisé contre l'infection, on obtient habituellement une élimination accélérée de l'infection due au Bordetella bronchiseptica.
Toutefois, le résultat nouveau et principal de la présente invention est qu'on obtient une immunisation contre les lésions turbinées accompagnant l'infection due au
Bordetella bronchiseptica. Cela est important, car de telles lésions et la détérioration résultante des os des cavités nasales sont une cause importante de pertes économiques pour les éleveurs de porcs. En raison de la prédominance des organismes de Bordetella hronchiseptica dans les troupeaux d'élevage et de la grande difficulté pratique de maintenir ces troupeaux sans ces organismes, il est extrêmement difficile d'éviter une infection des jeunes porcs à un âge auquel ceux-ci y sont sujets.
On développe ci-apres d'autres détails importants en ce qui concerne la préparation de vaccins sous la forme de doses, suivant la présente invention, et également concernant la méthode d'utilisation de ces vaccins. On a trouvé que des bactérins parentéraux à cellules entières tuées, préparés au départ de la souche ATCC NO 31124, sont efficaces pour empêcher l'atrophie turbinée et pour réduire la durée d'une infection due au Bordetella hronchiseptica.
De plus, on a trouvé que des porcelets âgés de moins de 4 semaines répondent de façon satisfaisante aux bactérins suivant l'invention. La présente invention apporte, par conséquent, des moyens pour assurer aux porcelets une protection par anticorps contre l'atrophie turbinée, avant que ces porcelets aient eu l'occasion d'être infectés avec des lésions résultantes des os du nez.
Avant le dépôt de la demande de brevet d'origine aux Etats
Unis d'Amérique, on a placé en dépôt auprès de l'organisation
Americain Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, des échantillons viables de la souche de Bordetella hro)lchiseptica, que l'on peut utiliser comme cultures d'ensemencement pour la production du vaccin suivant la présente invention. Les échantillons identiques déposés, identifiés antérieurement par le code privé souche D-l, ont reçu le ATCC N" 31124, que l'on utilisera par conséquent comme numéro d'identification dans la présente description et les revendications. La description taxonomique disponible de la souche Bordetella hronchiseptica ATCC N" 311 24 est donnée ci-après.
Description taxonomique:
On a récupéré l'ATCC N" 31124 des produits d'exsudation du nez et de la trachée d'un jeune chien bâtard qui présentait des signes cliniques de la maladie des chiens. On a ensuite déterminé que cette souche est avirulente pour le porc et qu'elle présente les caractéristiques suivantes d'identification:
1. Petit bâtonnet Gram négatif.
2. Aérobie.
3. Colonie d'un diamètre d'environ 1 mm après incubation sur
gélose à 5% de sang de cheval, pendant 48 h, à 37"C.
4. Colonie circulaire, de faible convexité, entière, opaque, lisse,
homogène avec un bord ondulé, sur gélose à 5% de sang de
cheval.
5. Alcalinisation d'un bouillon de lactose en 18-24 h sans forma
tion de gaz.
6. Alcalinisation d'un bouillon de dextrose en 18-24 h sans for
mation de gaz.
7. Positive à l'uréase en 2-12 h.
8. Positive au citrate en 12-24 h.
9. Positive au nitrate.
10. Alcalinisation de la teinture de tournesol en 48 h.
11. Motilité par flagelles péritrichiques.
12. Croissance sur gélose de MacConkeys en présence de sels
biliaires.
13. Sensible à la sulfaméthazine au taux de 5 mg/ml lors d'une
détermination sur disques.
14. Résistante à 0,02 mg/ml de furaltadone (NF-260).
15. Positive à l'hémagglutination (suspension à 2,8% de globules
rouges du mouton).
16. Hémolytique sur gélose à 5% de sang de cheval après incuba
tion à 37"C pendant 24 h.
17. Pas de formation de spores.
18. Positive à la catalase.
19. Positive à l'oxydase.
20. Négative à l'indole.
21. Négative à l'hydrogène sulfuré.
22. Négative à la liquéfaction de la gélatine.
Dans la préparation du vaccin suivant la présente invention,
on introduit des cellules viables de la souche ATCC N" 31124 de
Bordetella hronchiseptica, qui peuvent avoir été soumises à une lyophilisation pour la conservation, dans un milieu de culture approprié que l'on soumet ensuite à incubation à une température favorisant la croissance de l'organisme. D'une manière générale, on peut utiliser les procédés déjà publiés pour la culture des organismes de Bordetella hronchiseptica et on peut se reporter à cet effet, par exemple, à Am. J. Vet. Res , 30, 1161, 1162 (1969), et à Am. J. Vet. Res , 33, 1975, 1976 (1972). De façon plus particulière, on peut utiliser un bouillon de tryptose phosphate (TPB) pour la propagation de l'organisme.
On peut se procurer un tel milieu TPB auprès de la société Difco Laboratories, Inc., Detroit,
Michigan. D'autres milieux de culture utilisables sont: gélose de
Bordet-Gengou (Difco), bouillon d'infusion de cervelle cceur (Difco), bouillon tryptone-soya (Oxoid Limited, Londres,
Grande-Bretagne). Des températures de propagation de 36-38' C sont favorables. Des directives plus détaillées concernant une telle propagation sont données dans les exemples suivants.
Après propagation, la culture de l'ATCC N" 31124 est tuée sans rupture des parois cellulaires. Des agents appropriés pour tuer cette culture comprennent une concentration finale de 0,2% de formaldéhyde ou de 1/10000 de thimérosal (éthylmercurithiosalicylate de sodium). Un procédé préféré consiste à ajouter de la formaline, à savoir une solution aqueuse à 37% de formaldéhyde.
Des concentrations finales de formaldéhyde de 0,1 à 0,2% suffisent pour assurer une inactivation totale lorsque les cellules sont maintenues pendant 24 h à la température ambiante (20-25' C).
Après cette opération, les cellules intactes peuvent être conservées sous réfrigération (à savoir à 4 C). Les concentrations préférées dela bactérie vont d'environ 109à 101l cellules par ml; par exemple 1010 cellules par ml. De tels concentrés de cellules tuées conviennent bien pour la préparation de vaccins sous la forme de doses pour la mise en oeuvre de la présente invention.
Comme on le sait dans la technique de préparation de vaccins
parentéraux, on peut mélanger un adjuvant approprié avec les cel
lules tuées dans la préparation du vaccin en vue de son adminis
tration. Une quantité efficace d'un adjuvant mélangé avec les cel
lules tuées peut augmenter la production d'anticorps dans les ani
maux vaccinés. Pour des animaux de boucherie, tels que le porc, il
est désirable que l'adjuvant soit absorbable, qu'il soit injecté par
voie sous-cutanée ou par voie intramusculaire. Il est par conséquent désirable, tout au moins en vue d'une utilisation aux Etats
Unis d'Amérique, d'employer un adjuvant qui a été approuvé par
le U.S. Department of Agriculture, Veterinary Biologics Division,
pour l'administration à des animaux de boucherie.
L'hydroxyde
d'aluminium (crème d'alumine) est intéressant comme adjuvant
dans les vaccins de la présente invention et il s'agit d'un produit
approuvé pour une utilisation chez les animaux de boucherie.
L'utilisation de cet adjuvant est illustrée dans les exemples sui
vants. Un autre adjuvant utilisable est celui que l'on prépare de la
façon décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3149036. Une forme commerciale de cet adjuvant est vendue
par la société Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, Etats
Unis d'Amérique, sous la dénomination Merck Adjuvant 65. La
préparation et l'utilisation de cet adjuvant sont également décrites
dans les exemples.
Le vaccin suivant la présente invention, sous la forme d'une
dose injectable par voie parentérale, consiste essentiellement en
l'adjuvant susdit en mélange avec environ 109 et 1011 cellules
entières tuées de cette souche ATCC N" 31124. La dose préférée
de vaccin contient de 5 à 15 x 109 cellules de cette souche. De telles doses de vaccin conviennent particulièrement bien pour
l'immunisation du porc contre le développement de l'atrophie tur
binée. Le volume total de la dose du vaccin comprendra le volume
des cellules plus le volume de l'adjuvant absorbable et injectable.
Le volume de la dose sera habituellement de plus de 0,5 ml et de
moins de 3,0 ml, mais il devrait être d'une valeur suffisante pour
englober une quantité efficace de l'adjuvant. Des volumes de dose
de 0,8 à 2,5 ml conviennent particulièrement bien pour une admi
nistration intramusculaire ou sous-cutanée. Dans une préparation que l'on préfère, on a de 10 à 15 x 109 cellules, et le volume total de la dose est de 1,8 à 2,2 ml.
On peut également utiliser le vaccin suivant l'invention pour la protection des produits d'une truie gravide contre le développement de l'atrophie turbinée. A titre d'exemple, on administre au moins une dose du vaccin contenant de 109 à 1011 cellules entières tuées de la souche ATCC N" 31124, par voie parentérale, à la truie gravide, au moins 14j avant que la truie ne mette bas. Suivant un procédé préféré, on administre 2 à 3 doses du vaccin à la truie gravide à des intervalles non inférieurs à 5 j entre les doses.
A titre d'exemple, on peut prévoir 2 injections du vaccin, respectivement environ 28j et environ 14j avant que la truie ne mette bas.
Des procédés de mise en oeuvre de la présente invention sont plus particulièrement illustrés encore par les exemples suivants: Exenipie 1:
On peut produire des bactérins utilisables dans la mise en oeuvre de la présente invention par le procédé suivant:
1. On retire une souche D-l (ATCC N" 31124) lyophilisée, d'une conservation à 20 C et on soumet à incubation pendant la nuit à 37 C dans du TPB (bouillon de tryptose phosphate).
2. On transfère la culture dans le TPB dans une quantité désirée de TPB se trouvant dans un récipient approprié.
3. On procède à une incubation aérobie pendant 24-48 h.
4. On vérifie la pureté et on détermine les unités de formation de colonies sur de la gélose à 5% de sang de cheval.
5. On ajoute du formaldéhyde en solution à 37% (J.T. Baker,
Phillipsburg, N.J., Etats-Unis d'Amérique) jusqu'à une concentration finale de formaline de 1/1000 et on mélange convenablement.
6. On procède à incubation pendant la nuit à la température ambiante, on mélange convenablement, puis on inactive et on vérifie la stérilité sur de la gélose à 5% de sang de cheval.
7. On conserve à 4 C.
Eremple 2:
On peut préparer de la façon suivante des adjuvants appropriés pour la mise en oeuvre de la présente invention:
Adjuvant d'hy dr onde d'aluminium
1. On mélange une quantité appropriée d'un gel comprimé d'hydroxyde d'aluminium, par exemple 384 g, contenant environ 9,5% de A12O3, avec de l'eau désionisée en quantités variables pour donner une solution finale à 20% d'hydroxyde d'aluminium.
2. La solution finale donnera environ 2% d'AkO3.
3. On échantillonne en autoclave.
4. On conserve à la température ambiante.
Adjuvant d'huile d'arachide
1. L'adjuvant est composé de 85,0% d'huile d'arachide, de 10,6% de mono-oléate de mannide (Arlacel A), et de 4,4% de monostéarate d'aluminium.
2. On mélange une quantité appropriée de chaque ingrédient dans les proportions précédentes, dans un récipient approprié, sur un dispositif d'agitation et de chauffage.
3. On élève la température à raison de 4 C/mn jusqu'à 120 C.
4. On agite constamment le mélange avec une baguette de verre durant le chauffage.
5. On répartit la matière homogène dans des bouteilles de couleur ambre et on traite à l'autoclave.
6. On conserve à la température ambiante.
Cet adjuvant est appelé Adjuvant 65 et peut s'obtenir de la société Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., Etats-Unis d'Amérique (voir le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3149036).
E.remple 3:
Des procédés appropriés de préparation de vaccins en utilisant les adjuvants de l'exemple 2 sont développés ci-après.
Préporation 'l'un i'a:cin Oi.CC un a±ljui'oiit (I 'hi 'hox3(Ie 'l'ahnnhiiu,ii
1. Des volumes égaux de l'adjuvant d'hydroxyde d'aluminium
(solution à 20%) et de la culture en bouillon de la souche D-l
dans du TPB à l'état inactivé sont convenablement mélangés dans
un récipient approprié pour former le vaccin complet.
2. Ce vaccin contient environ 1% d'Al2O3.
3. La concentration finale du vaccin comporte environ
1010) cellules par ml.
4. On conserve le vaccin à 4 C jusqu'à son utilisation dans
des ampoules de verre bouchées, d'une contenance de 100 ml,
comportant un bouchon de caoutchouc.
5. Pour l'administration à des porcelets, on utilise 2 ml du
vaccin par voie sous-cutanée.
Préparation d'un vaccin alyec un adjuvant d 'l7uile c/'al d'ai.achùie
1. Des volumes égaux de l'adjuvant d'huile d'arachide et de la culture en bouillon de la souche D-l dans du TPB à l'état inactivé sont émulsionnés convenablement pour former le vaccin complet.
2. La concentration finale du vaccin comporte environ 10111 cellules par ml.
3. On conserve le vaccin à 4 Cjusqu'à son utilisation, dans des ampoules en verre fermées, d'une contenance de 100 ml, comportant des bouchons de caoutchouc.
5. Pour l'administration à des porcelets, on utilise 2 ml du vaccin par voie sous-cutanée.
Exemple 4:
Un procédé préféré de vaccination pour les porcelets est le sui
vant:
1. On administre une dose de 2 ml de l'un ou l'autre des vaccins de l'exemple 3 à chaque porcelet à l'âge de 1 semaine et à l'âge de 4 semaines.
2. Ce vaccin est injecté par voie sous-cutanée.
Exemple 5:
Un procédé préféré de vaccination pour les truies avant que
celles-ci mettent bas est le suivant:
1. On administre une dose de 2 ml de l'un ou l'autre des vac
cins de l'exemple 3 à chaque truie respectivement 4 semaines et
2 semaines avant qu'elle mette bas.
2. Le vaccin est injecté par voie sous-cutanée.
3. On peut s'attendre à ce que des truies présentant des taux
élevés d'anticorps humoraux contre le Bordetella bronchiseptica
transfèrent des taux élevés de ces anticorps anti-Bordetella bron
chiseptica par l'intermédiaire du colostrum aux porcelets sujets à
une telle infection.
En résumé, pour protéger les porcs contre le développement
de l'atrophie turbinée associée à une infection due au Bordetella
bronchiseptica, on administre par voie parentérale à ces porcs, à
l'âge de 2 à 56 j, au moins une dose d'un vaccin contenant de 109 à
1011 cellules entières tuées de la souche de Bordetella hronchisep-
tica, identifiée par ATCC N 31124. Cette dose pourra contenir par exemple 5 à 15 x 109 cellules de la souche susdite. On admi
nistre cette dose deux à trois fois à des intervalles non inférieurs à
5 j.
Pour protéger les produits d'une truie gravide contre le déve
loppement de l'atrophie turbinée associée à une infection due au
Bordetella bronchiseptîca, on administre par voie parentérale à la
truie gravide, au moins 14 j avant que cette truie mette bas, au
moins une dose d'un vaccin comprenant de 109 à 1011 cellules
entières tuées de la souche ATCC N 31124 de Bordetella hronchiseprica. On administre de préférence deux ou trois doses de ce
vaccin aux truies gravides en prévoyant des intervalles non infé
rieurs à 5 j entre les doses.
The present invention relates to a vaccine intended for the immunization of animals and in particular of pigs against an infection due to Bordetella hronchiseptica.
Bordetella hronchiseptica has been established to be the main cause of the disease which is widespread in pigs and is usually referred to as turbinate atrophy because, after primary infection, the turbinate bones of the nose frequently undergo serious deterioration. Reference may be made to Canad. J. Comp. Med. , 31, 53-57 (1967) and the bibliographical references cited therein. Bordetella hronchiseptica bacteria can persist in the nasal cavities, leading to infection of products from breeding sows.
Piglets are infected very early with Bordetella hronchiseptica (before the age of four weeks), which raises the particularly difficult problem of effective protection, since the immunization system of very young piglets is not sensitive. vaccines satisfactorily. For efficient antibody production, the vaccines are usually administered to pigs at about six to eight weeks of age. At this time, if the pigs have already been infected with Bordetella bronchîseptica, deterioration of the turbinate bones may occur, although the pigs are subsequently immune to the infection.
The first treatment which proved useful in reducing the problem of infection in piglets consisted of the administration of a sulfonamide therapeutic agent, such as sulfamethazine or sulfaethoxypyridazine, in the rations given to breeding herds. This method has been reported in the literature and was patented by Dr William
P. Switser: Vet. Med. , 58, 571-574 (1963); state patent
United States of America No. 3336190. However, the efficacy of sulfonamide therapy for the elimination of infection due to
Bordetella bronchiseptica has been limited by the development of strains of the organism which are resistant to sulfonamides.
By way of example, a study carried out in 1967 showed that materials isolated from Bordetella bronchiseptica, recovered from 80% of the animals inspected, were resistant to sulfonamides [Am. J. Vet. Res. , 30, 1621-I 624 (Sep. 1969)] These results have demonstrated the need to be able to have additional drugs or, more particularly effective immunization agents. Prior to the present invention, no other preventive treatment which can be used in industrial pig farming has however been proposed.
It has been found that the introduction of live cells of a low virulence strain of Bordetella bronchiseprica into the nasal cavities of unimmunized pigs produces a relatively mild infection and that, subsequently, the pig is immune to further infection, especially infection by more virulent strains of the organism [see J. Vet. Res. 30, 1161-1166 (July 1969)]. Such a low virulence strain, which has not been available to the public, has been identified by the private code strain D-1.
It is this same strain which was used to prepare the killed whole cell vaccine, which can be used parenterally, according to the present invention. However, during previous work, it was found that living cells of the D-1 strain persisted in the nasal cavities of recovered pigs. Therefore, the D-1 strain was discarded as a live whole cell intranasal vaccine. In addition, no other strain of
Bordetella hronchiseptica which would ensure immunity and which would then eliminate by itself from the nasal passages of immunized pigs.
Attempts have also been made to create a vaccine from killed cells of Bordetella bronchiseprica, which vaccine could create immunity by parenteral administration.
One of the first such experimental vaccines was prepared from a virulent strain of Bordetella hronchiseptica (identified as strain B). However, this whole cell vaccine failed to create resistance to nasal infection, as reported by Harris D.L. and Switzer W.P .: Am. J.
Vet. Res. , 30, 1161-1166 (July 1969). Due to this failure of such whole cell vaccines, used parenterally, Harris and Switzer hypothesized that: Pig exposure to internal antigens of Bordetella hronchiseptica may be necessary for the creation of resistance against nasal infection, Am. J. Vet. Res. , 33, 1975, 1981-1982 (October 1972). This theory has proven to be incorrect. Vaccines prepared from ruptured cells of Bordetella hronchiseptica, strain D-I, failed to prevent infection with Bordetella hronchi- septica, but assumed accelerated elimination in a subsequent 40-day trial ( AJ Vet. Res., 33, 1975,
1979 and 1981).
It was concluded that the type of resistance created by a parenteral vaccine containing the antigens released from killed cells was different from the immunity of the pig which had been cured of intranasal infection with live Borcletella hronchiseptica. The goal of effective immunization against infection remained to be achieved and no solution to this puzzling problem was therefore discernible.
The state of the art in this field has been summarized by
D.O. Farrington and W.P. Switzer, namely the inventors in this case, in an article entitled Resistance to hor <letella zhiní- tis, Proceedings, The George A. Young Conference on Advances in Swine Repopulation and the Thirteenth Annual Nebraska SPF
Conference, Lincoln, Nebraska, July 23-24, 1973, pages 44-52; On page 46 of this article, the following was noted:
It is known that parenteral immunization of pigs with bacteria (bacterial vaccines) of Bordetella hronchiseptica accelerates the nasal elimination of infections of this Bordetella bronchiseptica. In addition, the development of strong lesions associated with atrophic rhinitis appears to be significantly inhibited in suitably immunized pigs. Tests carried out with bacteria from
Experimental Bordetella bronchiseptica have been summarized in Table 1 of this article. It was concluded that, while parenteral bacteria showed some degree of accelerated release of nasal infections due to Bordetella bronchiseptica, many questions remained unanswered until the development of a practical immunizing agent against rhinitis due to Bordetella becomes a reality.
As previously mentioned, infection due to
Bordetella bronchiseptica is the main cause of atrophic rhinitis. Frequently, as a result of infection, the turbinate bones undergo serious atrophy. In the colonization of the nasal passages by Bordetella organisms, these organisms enter the mucus layer and cling in colonies to the epithelial cells. During infection, toxic substances are produced which reach the underlying tissue and, in particular, the bone-forming cells of the turbinal ridges. These toxic substances are believed to produce lesions creating turbinate atrophy.
The present invention provides means for ensuring effective immunization against toxic substances which create turbinate atrophy, without preventing primary infection of Bordetella bronchiseptica. More particularly, during the work which led to the present invention, it was discovered that a killed whole cell vaccine could be prepared from a strain of Bordetella bronchiseptica identified by ATCC NO 31124, this vaccine, when It is administered in a critical dose, being able to provide effective protection of the pig against the development of turbinate atrophy. In addition, although the vaccinated pig is not immune to infection, there is usually an accelerated clearance of infection due to Bordetella bronchiseptica.
However, the new and main result of the present invention is that immunization is obtained against turbinate lesions accompanying infection due to
Bordetella bronchiseptica. This is important, because such lesions and the resulting deterioration of the bones of the nasal cavities are a major cause of economic losses for pig farmers. Due to the predominance of Bordetella hronchiseptica organisms in breeding herds and the great practical difficulty of maintaining these herds without these organisms, it is extremely difficult to avoid infection of young pigs at an age when they are there. are subjects.
Further important details with respect to the preparation of vaccines in dosage form according to the present invention, and also with regard to the method of using such vaccines, are developed below. Killed whole cell parenteral bacteria prepared from strain ATCC NO 31124 have been found to be effective in preventing turbinate atrophy and in reducing the duration of infection due to Bordetella hronchiseptica.
In addition, it has been found that piglets less than 4 weeks old respond satisfactorily to the bacteria according to the invention. The present invention therefore provides means for providing piglets with antibody protection against turbinate atrophy, before such piglets have had the opportunity to be infected with resulting lesions of the nasal bones.
Before filing the original patent application in the States
United of America, we placed in deposit with the organization
American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, viable samples of the strain of Bordetella hro) lchiseptica, which can be used as seed cultures for the production of the vaccine according to the present invention. Identical samples deposited, previously identified by the private code strain D1, received the ATCC N "31124, which will therefore be used as the identification number in the present description and the claims. The available taxonomic description of the Bordetella strain hronchiseptica ATCC No. 311 24 is given below.
Taxonomic description:
ATCC No. 31124 was recovered from the exudates of the nose and trachea of a young mongrel dog which showed clinical signs of dog disease. This strain was then determined to be avirulent to pigs and that it has the following identification characteristics:
1. Small gram negative rod.
2. Aerobic.
3. Colony with a diameter of about 1 mm after incubation on
5% horse blood agar, for 48 hours, at 37 ° C.
4. Circular colony, of low convexity, entire, opaque, smooth,
homogeneous with a wavy edge, on 5% blood agar
horse.
5. Alkalinization of a lactose broth in 18-24 hours without forma
gas tion.
6. Alkalinization of a dextrose broth in 18-24 hrs without alcohol
gas mation.
7. Urease positive in 2-12 h.
8. Citrate positive in 12-24 h.
9. Positive for nitrate.
10. Alkalinization of the sunflower tincture in 48 hours.
11. Motility by peritrichic flagella.
12. Growth on MacConkeys agar in the presence of salts
gallstones.
13. Sensitive to sulfamethazine at a level of 5 mg / ml during
determination on discs.
14. Resistant to 0.02 mg / ml furaltadone (NF-260).
15. Positive haemagglutination (2.8% suspension of blood cells
red sheep).
16. Hemolytic on 5% horse blood agar after incubation
tion at 37 ° C for 24 h.
17. No formation of spores.
18. Positive for catalase.
19. Oxidase positive.
20. Negative to indole.
21. Negative for hydrogen sulfide.
22. Negative on gelatin liquefaction.
In preparing the vaccine according to the present invention,
viable cells of the ATCC N "31124 strain of
Bordetella hronchiseptica, which may have been subjected to lyophilization for storage, in a suitable culture medium which is then incubated at a temperature favorable to the growth of the organism. In general, the already published methods can be used for culturing Bordetella hronchiseptica organisms and reference may be made in this connection, for example, to Am. J. Vet. Res, 30, 1161, 1162 (1969), and Am. J. Vet. Res, 33, 1975, 1976 (1972). More particularly, one can use a broth of tryptose phosphate (TPB) for the propagation of the organism.
Such a TPB medium can be obtained from Difco Laboratories, Inc., Detroit,
Michigan. Other culture media that can be used are: agar
Bordet-Gengou (Difco), brain heart infusion broth (Difco), tryptone-soy broth (Oxoid Limited, London,
Britain). Propagation temperatures of 36-38 ° C are favorable. More detailed guidelines for such propagation are given in the following examples.
After propagation, the culture of ATCC N "31124 is killed without breaking the cell walls. Suitable agents for killing this culture include a final concentration of 0.2% formaldehyde or 1/10000 thimerosal (sodium ethylmercurithiosalicylate). A preferred method is to add formalin, i.e. a 37% aqueous solution of formaldehyde.
Final formaldehyde concentrations of 0.1 to 0.2% are sufficient to ensure complete inactivation when cells are maintained for 24 h at room temperature (20-25 ° C).
After this operation, the intact cells can be stored under refrigeration (ie at 4 ° C). Preferred concentrations of the bacteria are from about 109-101 cells per ml; for example 1010 cells per ml. Such concentrates of killed cells are well suited for the preparation of vaccines in the form of doses for the practice of the present invention.
As is known in the art of vaccine preparation
parenterals, a suitable adjuvant can be mixed with the cells.
lules killed in preparation of vaccine for administration
tration. An effective amount of an adjuvant mixed with the cel
killed cells can increase antibody production in ani
vaccinated ailments. For slaughter animals, such as pork, it
It is desirable that the adjuvant be absorbable, whether it is injected by
subcutaneously or intramuscularly. It is therefore desirable, at least for use in the States.
States of America, to use an adjuvant which has been approved by
the U.S. Department of Agriculture, Veterinary Biologics Division,
for administration to slaughter animals.
Hydroxide
aluminum (alumina cream) is useful as an adjuvant
in the vaccines of the present invention and it is a product
approved for use in slaughter animals.
The use of this adjuvant is illustrated in the examples below.
vants. Another useful adjuvant is that which is prepared from
as described in U.S. Patent No. 3149036. A commercial form of this adjuvant is sold
by Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, States
United States of America, under the name Merck Adjuvant 65. The
preparation and use of this adjuvant are also described
in the examples.
The vaccine according to the present invention, in the form of a
parenteral injectable dose, essentially consists of
the aforementioned adjuvant mixed with approximately 109 and 1011 cells
whole killed of this strain ATCC N "31124. The preferred dose
of vaccine contains 5 to 15 x 109 cells of this strain. Such doses of vaccine are particularly suitable for
immunization of pigs against the development of tur atrophy
binée. The total vaccine dose volume will include the volume
cells plus the volume of the absorbable and injectable adjuvant.
The dose size will usually be more than 0.5 ml and
less than 3.0 ml, but it should be of sufficient value to
include an effective amount of the adjuvant. Dose volumes
from 0.8 to 2.5 ml are particularly suitable for an administration
intramuscular or subcutaneous administration. In a preferred preparation, there are 10-15 x 109 cells, and the total dose volume is 1.8-2.2 ml.
The vaccine according to the invention can also be used for the protection of the products of a pregnant sow against the development of turbinate atrophy. By way of example, at least one dose of the vaccine containing from 109 to 1011 killed whole cells of the strain ATCC N-31124 is administered parenterally to the pregnant sow at least 14 days before the sow gives birth. In a preferred method, 2-3 doses of the vaccine are administered to the pregnant sow at intervals of not less than 5 days between doses.
By way of example, 2 injections of the vaccine can be provided, respectively approximately 28 days and approximately 14 days before the sow gives birth.
Methods of carrying out the present invention are more particularly further illustrated by the following examples: Exenipie 1:
Bacterins which can be used in the practice of the present invention can be produced by the following process:
1. Lyophilized strain D-1 (ATCC N-31124), stored at 20 ° C., was removed and incubated overnight at 37 ° C. in TPB (tryptose phosphate broth).
2. The culture is transferred to the TPB in a desired amount of TPB in a suitable container.
3. Aerobic incubation is carried out for 24-48 h.
4. Check for purity and determine colony forming units on 5% horse blood agar.
5. Formaldehyde in 37% solution is added (J.T. Baker,
Phillipsburg, N.J., USA) to a final formalin concentration of 1/1000 and mix well.
6. Incubate overnight at room temperature, mix well, then quench and check for sterility on 5% horse blood agar.
7. Store at 4 C.
Example 2:
Adjuvants suitable for carrying out the present invention can be prepared as follows:
Aluminum hydride adjuvant
1. Mix a suitable amount of a compressed aluminum hydroxide gel, eg 384 g, containing about 9.5% A12O3, with deionized water in varying amounts to give a final 20% solution. aluminum hydroxide.
2. The final solution will give about 2% AkO3.
3. Sampling is carried out in an autoclave.
4. Store at room temperature.
Peanut oil adjuvant
1. The adjuvant is composed of 85.0% peanut oil, 10.6% mannide mono-oleate (Arlacel A), and 4.4% aluminum monostearate.
2. Mix an appropriate amount of each ingredient in the above proportions, in a suitable container, on a stirring and heating device.
3. The temperature is raised at a rate of 4 C / min to 120 C.
4. The mixture is stirred constantly with a glass rod during heating.
5. Distribute the homogeneous material into amber-colored bottles and autoclave.
6. Store at room temperature.
This adjuvant is called Adjuvant 65 and can be obtained from Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., USA (see US Patent No. 3149036).
E. Example 3:
Suitable methods of preparing vaccines using the adjuvants of Example 2 are discussed below.
Preporation 'one i'a: cin Oi.CC un a ± ljui'oiit (I' hi 'hox3 (Ie' ahnnhiiu, ii
1. Equal volumes of aluminum hydroxide admixture
(20% solution) and broth culture of strain D-l
in TPB in the inactivated state are suitably mixed in
a suitable container to form the complete vaccine.
2. This vaccine contains approximately 1% Al2O3.
3. The final concentration of the vaccine is approximately
1010) cells per ml.
4. The vaccine is stored at 4 ° C until use in
stoppered glass ampoules with a capacity of 100 ml,
with a rubber stopper.
5. For administration to piglets, 2 ml of the
vaccine by subcutaneous route.
Preparation of a vaccine with an adjuvant of oil c / al of alcohol
1. Equal volumes of peanut oil adjuvant and broth culture of strain D-1 in inactivated TPB are suitably emulsified to form the complete vaccine.
2. The final concentration of the vaccine is approximately 10111 cells per ml.
3. The vaccine is stored at 4 ° C until use, in closed glass ampoules, 100 ml capacity, with rubber stoppers.
5. For administration to piglets, 2 ml of the vaccine is used subcutaneously.
Example 4:
A preferred method of vaccination for piglets is the sui
before:
1. A dose of 2 ml of one or the other of the vaccines of Example 3 is administered to each piglet at the age of 1 week and at the age of 4 weeks.
2. This vaccine is injected subcutaneously.
Example 5:
A preferred method of vaccination for sows before
these put down is as follows:
1. A 2 ml dose of either vac is administered.
cins of example 3 to each sow respectively 4 weeks and
2 weeks before she gave birth.
2. The vaccine is injected subcutaneously.
3. It can be expected that sows showing high levels
elevated humoral antibodies against Bordetella bronchiseptica
transfer high levels of these anti-Bordetella bron antibodies
chiseptica via colostrum to piglets prone to
such an infection.
In summary, to protect pigs against development
turbinate atrophy associated with Bordetella infection
bronchiseptica, these pigs are administered parenterally,
2 to 56 days of age, at least one dose of a vaccine containing 109 to
1011 whole cells killed of the strain of Bordetella hronchisep-
tica, identified by ATCC N 31124. This dose may contain, for example, 5 to 15 × 109 cells of the aforementioned strain. We admit
Take this dose two to three times at intervals not less than
5 d.
To protect the offspring of a pregnant sow against deve
development of turbinate atrophy associated with infection due to
Bordetella bronchiseptica, is administered parenterally to the
pregnant sow, at least 14 days before this sow gives birth, at
at least one dose of a vaccine containing 109 to 1011 cells
whole killed of Bordetella hronchiseprica strain ATCC N 31124. Preferably two or three doses of this are administered.
vaccine for pregnant sows with non-inferred intervals
laughter 5 days between doses.