DE1253412B - Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes gegen infektioese Schweinegastroenteritis - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL

AC1 K 3 9/2 2 5

A 61k

Deutsche KL: 30Li-*

Nummer: 1 253 412

Aktenzeichen: D 48111IV a/30 h

Anmeldetag: 2. September 1965

Auslegetag: 2. November 1967

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung eines Impfstoffes gegen übertragbare, d. h. infektiöse Schweinegastroenteritis (im folgenden abgekürzt: IGE), insbesondere ein Verfahren zur Isolierung und Vermehrung von IGE-Virus in Gewebekulturen und zur Gewinnung von abgetöteten bzw. abgeschwächten Virus enthaltenden Vakzinen.

Die Gastroenteritis ist eine stark infektiöse und weitverbreitete Schweinekrankheit, die erhebliche wirtschaftliche Verluste verursacht. IGE kann zwar alle Altersstufen der verschiedenen Schweinerassen befallen, doch beobachtet man nur bei sehr jungen, d. h. weniger als 10 Tage alten Ferkeln hohe Sterblichkeit. Die Inkubationszeit ist sehr kurz und beträgt 16 bis 24 Stunden. Die Krankheit beginnt mit Erbrechen und Durchfall und führt bei jungen Ferkeln durch die damit verbundene Dehydratation schnell zum Tod. Der Virus wächst in erster Linie im Darmtrakt der Tiere; bei erwachsenen Schweinen nimmt die Krankheit nur höchst selten einen tödlichen Verlauf. IGE wurde erstmals von Doyle und Hutchings 1946 beschrieben (J. A. V. M. A., 108, S. 257 bis 259) und ist seitdem in vielen Ländern festgestellt worden.

IGE ist nicht zu verwechseln mit Schweinecholera, die von einem anderen Erreger hervorgerufen wird. Die Inkubationszeit für diesen Virus beträgt 4 bis 8 Tage, und die durch diesen Erreger hervorgerufene Krankheit führt bei Tieren aller Altersstufen zum Tod. Der Choleravirus wächst im Gegensatz zu dem IGE-Erreger in vielen verschiedenen Geweben des tierischen Körpers, nicht ausschließlich im Darmtrakt.

Bislang war es üblich, Eingeweide von infizierten Schweinen 3 oder mehr Wochen vor dem Abferkeln an Muttersauen zu verfüttern, um passixe Immunität auf die Ferkel zu übertragen. Dieses Verfahren ist jedoch insofern sehr ungünstig, als es zu einer weiteren Verbreitung der Krankheit beiträgt. Bislang ist es nicht gelungen, den Virus auf die Dauer auf Gewebekulturen zu übertragen und IGE durch Immunisieren der Tiere mit Gewebekulturvakzinen unter Kontrolle zu bringen. Zahlreiche Versuche, den IGE-Virus zu isolieren und serienmäßig zu vermehren, sind bereits fehlgeschlagen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht demgemäß darin, ein Verfahren zur Gewinnung eines neuartigen Impfstoffes gegen die infektiöse Schweinegastroenteritis mit einem hohen Virusgehalt in möglichst reiner und von größeren Mengen an Zellrückständen freier Form zu entwickeln, da Zellrückstände aus den Gewebekulturen bei den geimpften Tieren zu ungünstigen Reaktionen führen können. Zur Lösung dieser Aufgabe geht man erfindungsgemäß so vor, Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes
gegen infektiöse Schweinegastroenteritis

Anmelder:

Diamond Laboratories, Inc.,

Des Moines, Ia. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr. rer. nat. J.-D. Frhr. v. Uexküll, Patentanwalt,

Hamburg 52, Königgrätzstr. 8

Als Erfinder benannt:

Dr. vet. Clarence Joseph Welter,

Des Moines, Ia. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 22. September 1964
(398 398)

daß man 1 Teil Darmschleimhaut infizierter Ferkel mit 4 Teilen einer Salzserumlösung, bestehend aus 1 Teil Pferdeserum und 9 Teilen einer Pufferlösung von 16 g KH₂PO₄, 34 g Na_?HPO₄ und 8,5 g NaCl in 1000 ml Wasser, homogenisiert, das Homogenisat auf bekannte Gewebekulturen überträgt, die Viren durch wiederholte, höchstens 24stündige Passagen attenuiert und gegebenenfalls durch Bebrüten inaktiviert. Zur Gewinnung eines abgeschwächten, nicht pathogen, aber unvermindert immunisierend wirkenden Virus enthaltenden Impfstoff setzt man also die Übertragung der Viren auf neue Kulturen so lange fort, bis diese ihre Pathogenität eingebüßt haben. Durch Impfen mit dem neuartigen Vakzin können sowohl trächtige Sauen und damit ihre Ferkel während des Säugens als auch alle anderen immunologisch erwachsenen Schweine gegen IGE geschützt werden.

Erfindungsgemäß wird der IGE-Virus in Kulturen aus Gewebe von Rind, Schwein, Hund oder Fuchs, Katzen, Frettchen, Schaf oder anderen Tieren gezüchtet. Die Vermehrung kann in dem gleichen oder einem anderen Gewebe als dem für den ersten Schritt verwendeten vorgenommen werden. Vorzugsweise werden Nierengewebe zur Herstellung der Gewebekulturen verwendet, doch können auch andere Gewebe Verwendung finden.

Die Attenuierung des IGE-Virus wird durch Vermehrung des Virus in den Gewebekulturen und Über-

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tragung in Zeitabständen von höchstens 24 Stunden erreicht, was so lange fortgesetzt wird, bis der Virus bei Ferkeln nicht mehr die Symptome der IGE hervorruft. Der Virus wird serienweise in Zeitabständen von höchstens 24 Stunden weiter übertragen, bis er nicht mehr pathogen wirkt und ein daraus hergestelltes Vakzin bei Schweinen Immunität hervorruft, ohne daß sich die Symptome der IGE zeigen und Fremdviren verbreitet werden.

Nachdem Wachstum und Vermehrung des IGE-Virus erreicht worden sind, wird ein Vakzin dadurch hergestellt, daß man die virushaltige Kultur aberntet, vorzugsweise ein Stabilisierungsmittel zufügt und schließlich zur Inaktivierung des Virus das Vakzin einer Bebrütung unterwirft. Das Vakzin kann als Flüssigkeit gelagert werden, oder es kann eingefroren werden; beispielsweise kann es auch gefriergetrocknet werden.

Das inaktivierte IGE-Vakzin wird zum Immunisieren von Sauen und ihren säugenden Ferkeln gegen IGE verwendet, indem man das Vakzin der Sau vor dem Abferkeln injiziert und damit die Bildung von Antikörpern stimuliert, welche die Sau schützen und gleichzeitig in die Milch übergehen und dadurch die säugenden Ferkel immunisieren. Das Vakzin kann den Sauen intramuskulär oder subkutan injiziert werden.

Die folgenden Beispiele sollen zur näheren Erläuterung der Erfindung dienen; alle Mengenangaben in Teilen oder Prozent beziehen sich dabei auf das Volu

Beispiel 1

Der als Keim dienende Virus wurde von Ferkeln erhalten, welche an IGE erkrankt waren. Die Schleimhaut wurde von den Därmen dieser Ferkel abgelöst, mit einer Puffersalzlösung verdünnt und nach Zusatz von Pferdeserum homogenisiert. Die Puffersalzlösung bestand aus 16 g KH₂PO₄, 34 g Na₂HPO₄ und 8,5 g NaCl in 1000 ml wäßriger Lösung. Zu 9 Teilen der Salzlösung wurde 1 Teil Pferdeserum zugegeben. Zu 4 Teilen der fertigen Salzlösung wurde 1 Teil Schleimhaut zugefügt. Diese Puffersalzlösung ist vollständig verschieden von »Hank's Salzlösung« und anderen als Nährlösungen für Gewebekulturen üblicherweise verwendeten Salzlösungen.

Das homogenisierte Gemisch wurde zentrifugiert und durch ein Seitzfilter filtriert, um es bakteriologisch steril zu machen. Alle beschriebenen Schritte wurden bei einer Temperatur von 0 bis 4° C durchgeführt.

Das erhaltene Filtrat wurde auf verschiedene Gewebekulturen aufgebracht, d. h. Einzellenschicht- oder Suspensionssysteme, welche auf allgemein übliche Weise hergestellt wurden. Das im allgemeinen verwendete Medium bestand aus 9 bis 9,5 Teilen »Hank's Salzlösung« (Hanks, J. Cell. Comp. Physical, 31, S. 235 bis 260 [1948]) und 0,5 bis 1 Teil inaktiviertes Pferdeserum. Andere geeignete Medien zur Erzeugung und Erhaltung von infizierten Kulturen sind (a) Earles BSS mit 5 bis 10% Pferdeserum und (b) Medium 199 von Morgan et al (Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 73, S. 1 bis 8 [1959]) ergänzt durch 5 bis 10% Pferdeserum. Gegebenenfalls kann Lactalbuminhydrolysat in einer Endkonzentration von 0,5% den obenerwähnten Medien zugesetzt werden. Zum Vermehren und Abschwächen des Virus gemäß Erfindung kann eine beliebige nicht toxische Nährlösung mit Gewebekultur als Medium verwendet werden. In den folgenden Beispielen bestand das verwendete Medium aus 9 Teilen »Hank's Salzlösung« und 1 Teil inaktiviertes Pferdeserum.

Der pH-Wert des Mediums wurde auf 7,2 bis 7,6 eingestellt, wobei die Kulturen bei 35 bis 38°C bebrütet wurden. Das reihenmäßige Passieren des IGE-Virus über Gewebekulturen wurde spätestens alle 24 Stunden, meist alle 6 bis 14 Stunden durch Übertragen der vereinigten verdünnten Lösungen aus der vorhergehenden Übertragung auf frische Gewebekulturen

ίο durchgeführt. Bei jeder fünften Übertragung wurden die geernteten und zusammengegebenen Vakzinlösungen ferner Ferkeln oral verabreicht, um die Anwesenheit und/oder das Überleben des Virus zu testen. Nach 5 bis 15 Übertragungen war bei einem Titer von mindestens 10~⁵ IGE-Virus anwesend, welcher für Ferkel virulent war. Die Isolierung und Vermehrung des IGE-Virus in Gewebekulturen wurde mit Ausgangsmaterialien von verschiedenen mit IGE infizierten Schweinen erfolgreich durchgeführt. In jedem Fall konnte die Anwesenheit des Virus durch orale Verabreichung an Ferkeln nachgewiesen werden, an welchen sich die klinischen Symptome von IGE zeigten und welche starben. Die Gegenwart des Virus wurde ferner durch elektronenmikroskopische Untersuchung der Gewebekulturlösungen nachgewiesen. Die in den Gewebekulturflüssigkeiten beobachteten Virusteilchen waren identisch mit den aus der Darmschleimhaut von infizierten Ferkeln isolierten Virusteilchen.

Die elektronenmikroskopische Identifizierung des IGE-Virus gelang nach Passieren über 5, 10, 15 und 40 Gewebekulturen. Nach 20 bis 40 Passagen nahm die Virulenz des Virus gegenüber Ferkeln zunehmend ab, bis er schließlich nicht mehr virulent war.

Es wurde gefunden, daß die Gewebekulturtechniken der vorliegenden Erfindung bei Verwendung von Schweine-, Schaf-, Rind-, Hunde-, Frettchen- und Katzengewebe hohe Ausbeuten an Virus liefern. Andere tierische Gewebe können ebenfalls das Wachsturn des IGE-Virus unterhalten. Die Herstellung des Vakzins aus anderen Geweben als Schweinegewebe, d. h. insbesondere z. B. Gewebe von Hunden und Füchsen, beseitigt die Gefahr einer Verunreinigung mit anderen Schweinevirusarten. Die Virenarten, welche in kultiviertem Hundegewebe oder Hundegewebezellen, wie sie für das vorliegende Verfahren Verwendung finden, anwesend sein können, wirken für Schweine nicht pathogen und infizieren deshalb Schweine nicht, welche mit einem aus Hundegewebe gewonnenen Vakzin gemäß Erfindung geimpft werden. Der gemäß Erfindung gewonnene Virus kann entsprechend seiner Potenz verdünnt werden, wobei gegebenenfalls Stabilisierungsmittel oder andere nicht toxische Stoffe zugesetzt werden können. Zur Ver-Wendung als Vakzin kann der Virus entwässert werden, z. B. durch Gefriertrocknen, oder in flüssiger Form gewonnen werden.

Die Verabfolgung des erfindungsgemäß hergestellten Vakzins hat praktisch nur bei Schweinen Zweck, welche schützende Antikörper bilden können. Da Ferkel immunologisch zu der Zeit, wo sie von der IGE besonders bedroht sind, noch nicht ausgereift sind, können sie nicht erfolgreich geimpft werden. Säugende Ferkel können jedoch dadurch immun gemacht werden, daß man die trächtigen Sauen vor dem Abferkeln mit dem IGE-Vakzin impft. Bei einer solchen geimpften Sau säugende Ferkel sind gegen IGE immun.

Beispiel 2

Das Filtrat wurde gemäß Beispiel 1 hergestellt, und der IGE-Virus wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung von 9 Teilen »Hank's Salzlösung« und 1 Teil inaktiviertem Pferdeserum vermehrt. Die virushaltigen Flüssigkeiten der Übertragungen von der zehnten bis zur zwölften Gewebekultur wurden 1 : 20 verdünnt und auf eine Einschicht von Hundenierenzellen in Standard Povitsky-Flaschen übertragen. Die Flaschen wurden 10 Stunden lang bei 37⁰C bebrütet; während dieses Zeitraumes war insgesamt kein cytopathischer Effekt zu beobachten. Die Zellschichten wurden durch Einfrieren und Auftauen von der Flüssigkeit abgetrennt. Die Identität des Virusgehaltes in den Flüssigkeiten wurde durch orale Verabreichung von jeweils 1 ml jeder Serie nach lOfacher Verdünnung an Ferkel festgestellt, wobei diese getrennt in isolierten Boxen gehalten wurden. Es wurde ein Virusinfektionstiter von mindestens 10~⁵ beobachtet.

Wenn ein inaktiviertes Vakzin gewonnen werden soll, dann wird die virushaltige Kultur mit einem Stabilisierungsmittel vereinigt und vorzugsweise 5 Tage lang bei 25°C bebrütet. Nach der Bebrütung kann das Vakzin gefriergetrocknet oder bei tiefer Temperatur' z. B. bei —41 oder —35°C gelagert werden. Die Inaktivierung des Virus wurde dadurch bestätigt, daß eine orale Verabreichung von 10 ml der Flüssigkeit bei Ferkeln keine IGE hervorrief.

Beispiel 3

Die Wirksamkeit der gemäß Beispiel 2 hergestellten

ίο Vakzine wurde durch intramuskuläre Übertragung auf Sauen während der letzten 6 Wochen ihrer Trächtigkeit geprüft. Alle Sauen stammten aus einem speziellen pathogenfreien Bestand und kamen aus Zuchten, in denen IGE mehr als 20 Jahre lang nicht aufgetreten war. 48 Stunden nach dem Abferkeln wurden zum Vergleich zwei bis drei Ferkel jedes Wurfs der Sau weggenommen und getrennt untergebracht. Diese Vergleichsferkel, welche 2 Tage lang keine Saumilch erhielten und deshalb anfällig für IGE waren, sowie alle bei der Sau verbleibenden Ferkel wurden im Alter von 4 Tagen mit 1000 Einheiten des TGE-Virus oral infiziert. Zum Vergleich wurden ferner von einer nichtgeimpften Sau geworfene Ferkel ebenfalls infiziert. Sämtliche Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1
Immunisierung von Sauen mit inaktiviertem IGE-Virus aus Gewebekulturen

Sau Nr.*	Impfdosis	Impfzeitpunkt (Tage	Reaktion (Krankheitstage	Anzahl to Gesamtzahl bei Sau	te Ferkel/ an Ferkeln	Anzahl ve mit IGE-S Gesamtzahl hpi *saii	η Ferkeln ymptomen von Ferkeln
		vor dem Ferkeln)	der Sau)	verbliebene	isolierte Ferkel	verbliebene	isolierte Ferkel
	ml			Ferkel		Ferkel
1	4	15	0	0/5	2/2**	0/5	2/2
2	2	19	0	0/5	2/2**	0/5	2/2
3	4	13	0	0/4	2/2	0/4	2/2
4	2	12	0	0/5	3/3	0/5	3/3
5	0	Kontrollsau	2	6/6	2/2	6/6	2/2
6	2	30	2	1/6	2/2	6/6	2/2
7	1	33	2	2/4	2/2	4/4	2/2
8	0,5	41	0	2/3	1/1	3/3	1/1
9	2	40 und 19	1	0/9	2/2	0/9	2/2
10	0	Kontrollsau	6	9/9	2/2	9/9	2/2

* Die Sauen Nr. 1 und 2 erhielten ein nichtentwässertes Vakzin. Die Sauen Nr. 3, 4, 6, 7, 8 und 9 erhielten ein zunächst entwässertes und dann wieder aufgebautes Vakzin.

** Die Anwesenheit des IGE-Virus wurde durch orale Verabreichung von bakteriologisch sterilen Darmextrakten dieser Ferkel an andere Ferkel bestätigt.

Vor dem Abferkeln mit 2 oder 4 ml des inaktivierten IGE-Vakzins geimpfte Sauen übertrugen eine passive Immunität gegen IGE an ihre Ferkel. Die zum Vergleich von ihrem Muttertier isolierten Ferkel und 2 Tage später mit 1000 Einheiten des IGE-Virus infizierten Ferkel wurden innerhalb von 24 bis 48 Stunden von wäßriger Diarrhöe und Erbrechen befallen und starben innerhalb von 4 bis 5 Tagen. Die experimentell infizierten immunen Ferkel, welche von einer geimpften Sau gesäugt wurden, zeigten keine IGE-Symptome, solange sie von der Sau Milch erhielten. In manchen Fällen bekam die experimentell nichtinfizierte Sau 1 bis 2 Tage lang leichtes Fieber, Diarrhöe, und die Milch blieb aus. Infolgedessen konnten die Ferkel von dieser Sau keine Milch erhalten und bekamen ebenfalls Durchfall. Die diarrhoeischen Ferkel genasen jedoch, sobald die Sau wieder Milch gab. Andere Versuchsergebnisse haben die Beobachtung bestätigt, daß für einen wirksamen Schutz gegen IGE eine ununterbrochene Abgabe von Muttermilch an die Ferkel erforderlich ist.

Die Impfung soll vorzugsweise innerhalb der letzten 6 Wochen vor dem Ferkeln unter Verwendung von einer Dosis von mindestens 2 ml stattfinden.

Nichtgeimpfte Sauen gaben an ihre Ferkel keine Immunität gegen IGE weiter. Diese Ferkel bekamen innerhalb von 24 bis 48 Stunden wäßrigen Durchfall und Erbrechen und starben 6 bis 7 Tage nach der Infektion. Das Vakzin wirkt auch immunisierend für die Sauen selbst. Nichtgeimpfte Sauen zeigten im Vergleich zu geimpften Sauen viel ernstere IGE-Symptome.

Beispiel 4

Flüssigkeit, welche den durch 40maliges Passieren über Hundenieren vermehrten IGE-Virus enthielt, wurde mit dem Stabilisierungsmittel in einem Verhältnis von 50% Flüssigkeit zu 50% Stabilisierungsmittel vereinigt und gefriergetrocknet. Durch mehrmalige orale Verabreichung des Äquivalents von 5 oder 10 ml der unverdünnten Gewebekulturflüssigkeit an Ferkel wurde geprüft, daß das Vakzin nicht mehr virulent war. Während der 10- bis 14tägigen Beobachtungszeit nach der Verabreichung wurden an den

10

Ferkeln keine IGE-Symptome festgestellt. Andererseits wurde die Anwesenheit des IGE-Virus durch elektronenmikroskopische Untersuchung der Flüssigkeit bestätigt.

Beispiel 5

Die Wirksamkeit des gemäß Beispiel 4 gewonnenen abgeschwächten Vakzins wurde durch intramuskuläre Verabfolgung an Sauen 17 bzw. 34 Tage vor dem Ferkeln geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2
Immunisierung von Sauen durch abgeschwächten IGE-Virus aus Gewebekulturen

Sau Nr.

Impfdosis
ml

Impfzeitpunkt

(Tage
vor dem Ferkeln)

Reaktion

(Krankheitstage

der Sau)

Anzahl tote Ferkel/
Gesamtzahl an Ferkeln

bei Sau

verbliebene

Ferkel isolierte Ferkel

Anzahl von Ferkeln
mit IGE-Symptomen/
Gesamtzahl an Ferkeln

bei Sau

verbliebene

Ferkel

isolierte Ferkel

2
5
0

Kontrollsau

0 0

2/2 2/2 2/2

1/6
0/4
6/6

2/2 2/2 2/2

Das abgeschwächte IGE-Vakzin immunisierte erfolgreich sowohl Sauen (aktiv) als auch deren Ferkel (passiv). Vergleichsferkel, welche von ihrem Muttertier getrennt und 48 Stunden später mit 1000 Einheiten des IGE-Virus infiziert wurden, zeigten die typischen Symptome der IGE und starben. Keines der immunen, an einer geimpften Sau säugenden Ferkel starb, eines hatte einen Tag lang wäßrigen Durchfall. Die nichtgeimpfte Sau war gegenüber der IGE anfällig und gab keine Immunität gegen IGE an ihre Ferkel weiter.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produkte haben sich als wirkungsvolle, bequem und praktisch zu handhabende Mittel zum Immunisieren von säugenden Ferkeln und erwachsenen Sauen gegen IGE erwiesen.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffes gegen die infektiöse Schweinegastroenteritis, dadurch gekennzeichnet, daß man 1 Teil Darmschleimhaut infizierter Ferkel mit 4 Teilen einer Salzserumlösung, bestehend aus 1 Teil Pferdeserum und 9 Teilen einer Pufferlösung von 16 g KH₂PO₄, 34 g Na₂HPO₄ und 8,5 g NaCl in 1000 ml Wasser, homogenisiert, das Homogenisat auf bekannte Gewebekulturen überträgt, die Viren durch wiederholte, höchstens 24stündige Passagen attenuiert und gegebenenfalls durch Bebrüten inaktiviert.