NO119491B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine mot smittsom gastoenteritisvirus (tarmkatarr).

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av

vaksine mot smittsom gastroenteritis i det følgende omtalt som S.G.E.

Smittsom gastroenteritis er en sterkt smittsom og utbrett svinesykdom som forårsaker betydelige økonomiske tap. S.G.E. kan ramme griser av alle raser og alle aldre, men forårsaker utbredt mortalitet bare på meget unge griser. S.G.E. ble først beskrevet av Doyle og Hutchings i 19^6 (J.A.V.M.A., Vol 108, side 257-259), og siden den tid har sykdommen vært rapportert i mange amerikanske stater og i andre land.

Det har vært praksis på området å mate infisert tarmkanal

fra smittet gris til sugger tre eller flere uker før grisene får unger.

På denne måte overføres passiv immunitet til grisungene. Denne

praksis er imidlertid usunn idet den tjener til ytterligere å utspre sykdommen.

Det har tidligere vært generelt kjent dyrkning av et

virus i flere etter hverandre følgende passeringer i vevkulturvæske inntil viruset ikke lenger er patogent. Imidlertid ligger foreliggende oppfinnelse i det funn at ved å korte passeringsintervalltiden er det en forbedring i overlev ingen av S.G.E.-virus. Det er tidligere kjent kultivering av S.G.E.-virus i flere etter hverandre følgende vevkulturer, men det utvikles ikke et ikke virulent antigen som ville immunisere gravide sugger som på sin side deretter ville overføre passiv immunitet til deres barn. Det er ikke tidligere utviklet en S.G.E.-vaksine som omfatter beskyttelse av sugger og smågriser.

Mens den inaktiverte eller nedsatte levende vaksine fortrinnsvis produseres på hunde- eller svinenyrer kulturvev kan den

..også dyrkes i andre vevkulturer som ape etc.

Oppfinnelsens hensikt er å tilveiebringe nye, inaktiverte eller fortynnede vaksiner inneholdende virus fremstilt i vevkulturer, hvilke vaksiner er beregnet for bruk til immunisering av purker for beskyttelse av disse og deres avkom under diegivningen pg alle andre grisetyper som er immunologisk voksne mot.S.G.E.

Oppfinnelsen vedrører altså en fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine ved at virulent smittsomt gastroenteritis-

virus inokuleres i en første vevkultur, hvori virusen får voksne under forutsatt inkubering, viruspartiklene fjernes fra nevnte kultur og innføres i en annen vevkultur og denne inkubering,inokulering og gjentatte inkuberinger av viruset fra den ene kultur til den andre fortsetter inntil viruset ikke lenger er patogen, idet fremgangsmåten erkarakterisert vedat man lar viruset voks ie i de forskjellige vevkulturer i et tidsrom på 6-24 timer, fortrinnsvis 8-12 timer, idet den ikke-patogene virus fra den siste vevkultur settes til et stabiliserende medium og inkuberes ved ca. 25°C, fortrinnsvis i 5 dager.

Fortynning av S.G.E.-virus (uttrykket "fortynning" er her brukt i betydningen virulens-reduksjon) skjer ved å dyrke eller formere viruset i vev-kulturer med intervaller på 6-24 timer inntil viruset ikke lenger fremkaller symptomer på S.G.E. hos grisunger. Viruset overføres i serier med intervaller på 6-24 timer inntil

viruset er ikke-patogen og inntil vaksine fremstilt utfra viruset vil stimulere immunogenese i svin uten å fremkalle symptomer på

S.G.E. og uten å utspre fremmede virus.

Det anvendes fortrinnsvis nyrer til fremstilling av vev-kulturene, selv om man vil forstå at det også kan brukes andre vev-typer.

Etter initiering av vekst for S.G.E.-virus og formering av viruset, fremstilles en vaksine ved å høste den virusholdige kultur, fortrinnsvis under tilsetning av en stabilisator og deretter inkubere vaksinen for å inaktivere S.G.E.-virusen. Vaksinen kan lagres som en \æske eller den kan fryses, f.eks. fryse-tørkes.

Den inaktiverte S.G.E.-vaksine brukes til å immunisere sugger og deres diende grisunger mot S.G.E. ved å innsprøyte vaksinen i grisen før denne får unger for stimulering av antistoff-produksjonen som beskytter sugga, og som samtidig overføres til melken og derved beskytter de diende unger. Purka kan injiseres intramuskulært eller subkutant.

Hvor ikke annet er angitt er alle vektmengder og prosent-deler angitt i volum.

Eksempel 1.

Den opprinnelige utgangsvirus ble fremstilt fra grisunger infisert med S.G.E. Slimhuden ble fjernet fra infiserte grisers tarmkanal. Denne slimhud ble deretter fortynnet med en bufret saltoppløsning, tilsatt hesteserum og homogenisert. Den bufrede saltoppløsning besto av 16 g KH2POi|, 34 g Na^PO^ og 8,5 deler NaCl i 1000 ml vandig opp-løsning. En volumdel hesteserum ble tilsatt 9 volumdeler saltopp-løsning. En del mucosa (slimhud) ble tilsatt 4 volumdeler av den ferdige saltoppløsning. Denne bufrede saltoppløsning er helt for-skjellig fra "Hank's Balanced salt solution" og andre saltoppløs-ninger som vanligvis brukes som næringsvæsker for vevkulturer.

Homogenisatet ble sentrifugert og filtrert gjennom et Seitz-filter for å gjøre homogenisatet bakteriologisk sterilt. Alle de ovennevnte trinn ble utført ved mellom 0 og 4°C.

Filtratet fremstilt i eksempel 1, ble deretter tilsatt forskjellige vevkultur-systemer, ett lags-systemer eller suspensjons-systemer som var fremstilt ifølge vanlige fremgangsmåter. Det vanligvis anvendte medium besto av 9 til 9,5 volumdeler Hank<*>s Balanced Salt Solution (Hanks, J. Cell Comp. Physical, bind 31, sidene 235-260, 1948), og 0,5 til 1 volumdel inaktivert hesteserum. Andre media som kan brukes for initiering og befordring av infiserte kulturer omfatt er a) "Earles BSS" pluss 5—10% hesteserum og b) Medium 199 beskrevet av Morgan et al (proe.Soc.Exp. Biol. and Med., bind 73, sidene 1-8, 1959) tilsatt 5-10% hesteserum. Etter valg kan man tilsette laktalbumin-hydrolysat i endelig konsentrasjon på 0,5% til ovennevnte media. Ved dyrkningen og fortynningen av virus i henhold til foreliggende oppfinnelse kan man benytte seg av et hvilket som helst ikke giftig næringsmiddel i form av flytende vevkultur. I de følgende eksempler er det anvendte medium 9 deler Hanks Balanced Salt Solution og 1 del inaktivt hesteserum (regnet som volumdeler).

Mediets pH ble regulert til 7,2 til 7,6 med inkubering av kulturene ved 35 til 38°C. Serie-overføring av S.G.E.-virus i vev-kulturer ble utført med intervaller på 24 timer eller mindre, oftest på mellom 6 og 14 timer, ved å inokulere frisk preparerte vevkulturer med oppsamlede fortynnede væsker fra forutgående overføring. Inn-høstede og oppsamlede væsker ble også inokulert oralt hos grisunger ved hver femte overføring for å kontrollere tilstedeværelsen av virusen og/eller om virusen hadde overlevet.

S.G.E.-virus som er virulente for grisunger ble funnet

i styrker (titer) på minst 10 J etter 5 til 15 overføringer. Isolering og dyrking av S.G.E.-virus i vevkulturer er utført med materiale fra forskjellige griser infisert med S.G.E. I hvert tilfelle ble tilstedeværelsen av virus demonstrert ved oral inokulering av grisunger, som utviklet kliniske symptomer på S.G.E. og døde. Dessuten ble tilstedeværelsen av virus demonstrert ved elektron-mikroskopisk undersøkelse av vevkultur-væsker. Viruspartikler observert i disse vevkultur-væsker var identisk med viruspartikler isolert fra tarmslimhinne-ekstrakter fra infiserte (smittede) gris-, unger.

Elektronmikroskopisk identifisering av denne S.G.E.-virus ble utført ved 5., 10., 15- og 40 vevkulturoverføring. På høyere overføringstrinn (20-40) ble virusens virulens sta dig mindre for grisunger inntil virusen ble avirulent.

Man har funnet at oppfinnelsens vevkulturteknikker gir virus i høyt utbytte fra vev som stammer fra griser, sauer, kveg, hunder, mår og katter. Det kan også brukes annet dyrisk vev for å frembringe formering av S.G.E. virus. Fremstilling av vaksine fra andre vevtyper enn svinevev, spesielt vev fra dyr av hunde-slekten, f.eks. hunder og rever, eliminerer uønskede forurensninger i form av virus i svin. Hundeslekt-virus som kan finnes i de dyrkede hundevev eller hundevevceller anvendt i foreliggende metode,

er ikke patogene overfor svin, og har derfor ingen virkning på

griser som mottar en vaksine basert på hundeslekt-vevkulturer.

Den virus som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan for-tynnes etter potens eller kan tilsettes stabilisatorer eller andre ugiftige forbindelser. For anvendelse som vaksine kan virusen tørkes, f.eks. ved fryse-tørkning, eller kan prepareres i flytende form.

Administrering av oppfinnelsens vaksine kan i praksis

bare brukes på svin, som kan fremstille beskyttende antistoffer. Siden grisunger er immunologisk umodne og samtidig er mest mottakelig for S.G.E., kan de ikke vaksineres med hell. Man kan imidlertid gi grisungene immunitet ved å innsprøyte S.G.E.-vaksine i purka før denne nedkommer med grisekullet. Grisunger som dier disse vaksinerte sugger er immune mot S.G.E.

Eksempel 2.

Filtratet ble fremstilt som angitt i eksempel 1, og S.G.E.-virus ble dyrket ifølge fremgangsmåten beskrevet ovenfor, og man brukte 9 deler Hanks Balanced Salt Solution og 1 del inaktivert hesteserum. Virus-holdige væsker fra 10. til 12. vevkultur-overføring ble fortynnet 1 til 20, og inokulert i vanlige Povitsky-flasker inneholdende et enkelt lag av hundenyre-celler. Flaskene ble inkubert ved 37°C i 10 timer, i løpet av hvilke man ikke kunne observere noen cytopatisk effekt. Enkeltlagene ble frigitt til væsken ved frysing og opptining. Identiteten av væskens virusinnhold ble bestemt ved oral inokulering av 1 ml doser av hver 10. serie-fortynning i grisunger som ble holdt i individuelle adskilte bur. Man fant infek-sjonstitre for virusen på minst 10 .

Når det ønskes å fremstille en inaktivert vaksine, slåes den virusholdige kultur sammen med et stabiliserende medium og inkuberes ved 25°C i fortrinnsvis 5 dager.

Etter inkubering kan vaksinen fryse-tørkes eller lagres

ved lav temperatur, f.eks. -4l°C eller -35°C Virusens inaktivering ble bekreftet ved at oral administrering av 10 ml væske ikke frem-kalte S.G.E. hos grisunger.

Eksempel 3.

Effektiviteten for de vaksiner som er fremstilt i henhold til eksempel 2 ble prøvet ved intramuskulær inokulering i purker i de siste 6 uker før nedkomsten. Alle purker var av spesielle patogen-frie kull og ble tatt fra grisefarmer som ikke hadde hatt S.G.E. på over 20 år. 48 timer etter fødingen ble 2 eller 3 griser

(kontroll) fra hvert kull tatt fra purka og isolert i adskilte rom. Disse kontroll-grisunger, som ikke fikk noe melk fra purka på 2 dager og derfor var utsatt for S.G.E. samt alle grisunger som ble hos purka, ble utsatt for oral smitte i en alder av 4 dager med 1000 smitte-doser S.G.E. Grisunger som stammet fra en ikke-vaksinert purke (kontroll) ble også utsatt for smitte, og resultatene fremgår av tabell 1.

Purker som ble vaksinert med 2 eller 4 ml inaktivert S.G.E.-vaksine før kull-nedkomst, overførte en passiv immunitet overfor S.G.E. til deres grisunger. Kontrollgrisunger som ble tatt fra purka og isolert og utsatt for smitte to dager etter med 1000 smitte-doser S.G.E., fikk vanligvis vann-diaré og oppkast etter 24 til 48 timer, og døde etter 4-5 dager etter smitte. Eksperimentelt infiserte immune grisunger som dier en vaksinert purke viste ingen symptomer på S.G.E. sålenge de fikk melk fra purka. I enkelte tilfelle ble purker som ikke var eksperimentelt smittet utsatt for en svak feber, diaré og agalaktia (manglende melkegivning) i en eller to dager. På grunn av dette kunne grisungene ikke få melk fra purka og fikk derfor diaré. Når purka igjen ble i stand til å

gi melk, ble grisungene kvitt diaréen. Andre eksperimenter har også bestyrket den iakttagelse at det er nødvendig med en stadig til-førsel av purkemelk til grisungene for å beskytte disse mot S.G.E.

Fortrinnsvis bør vaksineringen bestå av en minst 2 ml

dose som gis innen 6 uker før purker får unger.

Ikke-vaksinerte purker ga på den annen side ingen immunitet overfor S.G.E. til grisungene. Disse grisunger fikk vanndiaré og brekninger etter 24-48 timer og døde i løpet av 6-7 dager etter smitte. Vaksinen var også en effektiv immuniserings-agens.for sugger. Ikke vaksinerte purker fikk alvorligere symptomer på S.G.E. sammen-lignet med vaksinerte purker.

Eksempel 4.

Væsker inneholdende S.G.E. virus formert eller dyrket som beskrevet i eksempel 2 i løpet av 40 overføringer på hundenyre, ble slått sammen med stabiliserings-medium i et forhold på 50% væske til 50% stabiliseringsmedium, og fryse-tørket. Vaksinens avirulens ble prøvet ved flere orale inokuleringer tilsvarende 5 eller 10 ml ufortynnet vevkultur-væske i grisunger. Man kunne ikke iaktta noen S.G.E. symptomer i løpet av en observasjonsperiode etter inokulering på 10 dager til 2 uker. Tilstedeværelse av S.G.E. virus ble bekreftet ved elektron-mikroskopisk undersøkelse av væskene.

Eksempel 5.

Effektiviteten for den fortynnede vaksine fremstilt som i eksempel 4, ble undersøkt ved intramuskulær inokulering av purker 17 eller 34 dager før kull-nedkomst. Resultatene er oppført i tabell 2.

Fortynnet S.G.E. vaksine besørget effektiv immunisering av purker (aktivt) og deres grisunger (passivt). Kontroll-grisunger som ble tatt fra purka og smittet 48 timer senere med 1000 smitte-doser S.G.E. fikk typiske symptomer på S.G.E. og døde. Ingen av de immune griser som diet vaksinerte purker døde, selv ora 1 fikk vann-diaré i en dag. Den ikke-vaksinerte purke var mottagelig for S.G.E., og overførte ikke immunitet mot S.G.E. til grisungene.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av en vaksine ved at virulent, smittsomt gastroenteritis-virus, inokuleres i en første vevkultur hvori virusen får vokse under fortsatt inkubering, viruspartiklene fjernes fra nevnte kultur og innføres i en annen vevkultur og denne inkubering, inokulering og gjentatt inkuberinger av virusen fra den ene kultur til den andre fortsetter inntil virusen ikke lenger er patogen,karakterisert vedat man lar virusen vokse i forskjellige vevkulturer i et tidsrom på 6-24 timer, fortrinnsvis 8-12 timer,idet den ikke patogene virus fra den siste vevkultur settes til et stabiliserende medium og inkuberes ved ca. 25°C, fortrinnsvis i 5 dager.