DE1950774A1

DE1950774A1 - Heteroploide Zellinien

Info

Publication number: DE1950774A1
Application number: DE19691950774
Authority: DE
Inventors: Smith Sydney Edwin; O'reilly Kevin Joseph; John Prydie
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1968-10-08
Filing date: 1969-10-08
Publication date: 1970-09-17
Also published as: IT1023004B; FR2022241B2; BE739946A; CA944276A; FR2022241A2; SE370249B; GB1286250A; CH550250A; NL6915214A; DK123307B; US3709782A; ES372269A2; ZA696871B

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF

PATENTANWÄLTE
8 MÜNCHEN 2. HILBLESTRASSE 2O

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stopf. 8 MOnchen 2, HilblestroBe 20 Ihr Zeichen Unser Zeichen Datum

8. OKt. 1969

Anwaltsakte 18 896
ße/A

The Wellcome Foundation Limited London / England

"Heteroploide Zellinien" Zusatz zu P 16 "17 940.1

Diese Erfindung betrifft heteroploide Katzeneiubriozelllinien, die Züchtung von Viren auf diesen und /akzine, die solche \Tiren enthalten.

Es wurde bereits in der Hauptanmeldting P 16 17 940„1 beschrieben, daß neuartige Btämoie oder nach der neuen Sermino·

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(0811) ·5 16 20 81 Telegramm»: PATENTEULE München Banki Bayerische Verelnsbanle MOnchen 453100 Postschecki Mönchen 653 43

BAD ORIGINAL

logie 'diploide Zellinien', die von Ea tzenenibrioa ell en ίεΓα-ί ^ staksen," zur Aufnahme bzw« zur Ernährung pathogene'r /ifen geeignet sind. Diese Linien sind im wesentlichen diploid, ·■ weil wenigstens 75 "fa der"Zellen ihren chromosomen Bestand bzw. Zusammensetzung unverändert beibehalten. ' ■ /" ^; -

Es wurde nunmehr gefunden, daß die oben angegebenen Zeil-⁵ linien ~h*f wesentliche» modifiziert und in hetefoploide Zelllinien uMgewanuelt werdeii^icohnen,' '"'wenn-man' sie 'weiter über . den 4öo bis 50. Passagehstähd hinaus passieren Iäi3t*' Die - ' Fortpfla-nzung "dieser Zellinien aenkt sich" etwas^; _; zwischen" • '. der 35« und "4β ο "'Passage, und'es treten sunehrae'hd' öhromosOri·- abnormitäten ein,"Hveil' die' Linien ihren im' we sent liehen" -■■ diploiden Charakter, wie oben ,erläutert,'⁵ verlieren, -.-auhdern der Anteil der aaoriaalen Zellen auf über 25 ⁰A ansteigt, wird die Linie eine neu gebildete (manifest gewordene) heteroploide Zellinie mit nach morphologischen G-esichtspunkten epithelialen Eigenschaften tind wird fähig, i'umore in Hamsterbackentasciien zu bilden. Sie gewinnt ebenso ihre [Fähigkeit zu schnellem Wachstum y/ieder und kann nunmehr Kolonien in einem halbfesten Agarmedium bilden.

Die so gebildeten Katzenembriozellinlen köhhe'n "unmittelbar mit bestimmten pathogeneii Viren, wie den infektiösen Katzen-Enteritis-, Rhinotracheitis-, Hinder- (Herpes5 \ Liammalitis-, Katzen-Leukämieviren und Katzen^Picornaviren trotz'· der. heteroploiden Chromosom- und morphologischen

0 0 9 8 3 8/208 3 BAU ORK31NAL _^

Eigenschaften infiziert werden. Weiterhin kann man nunmehr dieselben' Viren suchten und von einer Kultur einer solchen Linie in eine andere übertragen bzw. Bie passieren lassen, ohne daß axe' Viren verunreinigt oder wechselnden' Umgeljunysbedincungen ausgesetzt werden.

Diese heteroploiden Zellen eignen bich aus diesem Grund zur Hülsenherstellung und können schnell in einem Hährmediuin gezüchtet und kultiviert werden. Jedes dem Fachmann bekannte Medium kann verwendet* werden, sofern es die notwendigen physikalischen und chemischen bedingungen und die ^Lhrzusaiuiiiensetzung für die Kultur und Yfeiter-(Unter)-Kultur, d. h. Tür Erhalten, individuellen Wuchs und Vermehrung dieser Zellen, bietet.

Εε wurGe jedoch bevorsugt, "Eagle's Basal Ledium" iait etwas Rinderseriun au verwenden und besonders dieses Ledium mit I-ryptöse-EhoEphat-Brühe und dein 2-faclien der üblichen iüeiige ai. Aninosäuren und Vitaminen. Dieses Verfahren wird vorteilhc. ft erweise' bei eine:.: "enperaturbercich von 32 bis 39⁰O₁ vorzugsweise ir.;'£er ' j.i von 3> -ie 37»5°O, durchgeführt. Γ/αϊ' Erleioh Gtrun{: de; \,eiterkultivierens ist es üblich, die ineinander lit ergehe; iden Schicliten der Zellen der Linie mit Cji'jirsin u:iü einein unscliL-dlichüri Giielatbildner, wie Äthylen-■.^:i:-.i..intexri-est:i_l;siiure (Ji.DiⁿE), vor ,jeder Übertragung in das

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üön kann es zu- den iife
Verwendung der §fceii angegebenen Medieii mögiiöli Söi£t.#, die lellirtii näön der¹ iröiliegeiiSeii Irfinäuiig iii

Z§ΐ1ΐέ1ΐΐ"ίϊΰί"βίι in eiiifein äBhliöiien flüssigeii zu Mil

Um die Zeilliiifei mit dem Tiilis zu iiifiMieieiij Kann äie tiiä? dei* Zeliinie mit eiiief Säizsuspen&iön deö Viiüs g§- iüiselit iveiäeiij wQl§i diese Süspensi§ii aü§' deiü Exsüdäi it'g'efläeiii§§ iiifizisiten iiefe's §d§f äxiä ynäefäri Qüeileii ernaitefi 4ί lei defi iiif§iiti§§eii

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iiM BÖsiii ge^üfis fftg§fMl^ 11 &ΐ4* tiaQh d§#·fßfe 3§ΐ infizierte M§fü (ungefaßt 1 öis ί fs S

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BADOfilGINAL

Kernmembrane. Während der nächsten 24 Stunden scheinen die infizierten Zellen einzuschrumpfen und färben sich meist schwarz, bevor sie schließlich von dem Deckgläschen abgenommen werden* Wenn Änderungen klar erkennbar werden, wenige lage nach der Infektion, kann die infizierte Kultur, gefroren bei -30 C, gelagert v/erden» Dadurch werden die Zellen zerstört, aber der Virus behält seine Fähigkeit, neue nicht verunreinigte Kulturen der gleicnen Zellinie zu infizieren»

Bs ist möglich, einen Virusstamm., für den die heteroploide Katzeneinbriozellinie anfällig ist, durch Reihenpassagen in Kulturen der Zellinie abzuschwächen oder weiter abzuschwächen. Die neue Zellinie kann daher nicht nur zur Züchtung solcher Viren, Bonderri ebenso vorteilhafterweise zu ihrer Abscliwächung verwendet werden, weil sie leichter in dem heteroploiden als in dem diploiden Stadium gehandhabt werden können» Die Viren können daher in großem iiiaßstab leichter und zuverlässiger aufgrund der 'Tatsache hergestellt werden, daß die heteroploide Linie für. diesen Zweck ohne Einschränkung oder wesentliches- Risiko, der Qualitätsverschlechterung vermehrt oder weiterkultiviert werden kann. . . . , - . . .. _x ,..,....-. - . _:,-.-./

Nach der vorliegenden Erfindung wird daher eine kontinuierliche Katzenembrio- heteroploide Zellinie geschaffen, die Zellen enthält, die von ISatzenembrios stammen, wobei mehr

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als 25 ft der Zellen anormale Chromosom-Eigenschaften im Vergleich, zu den Chromosomenzellen von Eatsenenibriojaufweisen» In besonderer Hinsicht wird eine solche Zellinie ■ dadurch erhalten,- dai3 man eine diploide Zellinie, die ursprünglich aus einem Katzenembriogewebe herrührt, über die 4-Oo bis 5'ü. Passage hinaus Passagen durchlaufen läßt, bis

..-;Ils der Anteil der Zellen mit anormalen Chromosom-Eigenschaften

auf über 25 °f° der Gesamtmenge ansteigt«,

Die Zellinie nach eier vorliegenden Erfindung kann süsarrüen .mit einem geeigneten Kulturmedium, "./ie als kontir.uierli;i--c ICatzenembrio- heteroploide Zellkultur, dargeboten v; er den, Viie bereits festgestellt, ist ein'solches LTediun. vorzugsweise "das "Eagle's Basal Kedium", sofern notwendig modifiziert, um die verschiedenen Lengen ■ anderer J>e:;ttndteile aufzuweisen, die den Vuehs_:una die Erhaltung der Kultur unterstützen. Bin weiterer Gegenstand besteht darin, ein Verfahren zum Züchxen und zum Passagendurchlaui dar vorausgehend definierten Zellinie oder einer Kultur derselben zu schaffen, bei dem man die Zellinie in einem ITährmedium unter Kultur hält und ein ieil oder alle Zellen in ein frisches Eährmedium überträgt.

Die neue Zellinie ist zur Vermehrung von Viren hervorragend geeignet, besonders für die Viren der infektiösen Katzen- : Enteritis, Katzen-Ehinotracheitis oder für Katzen-Picornaviren, für den Rinder- (Herpes) Liaramalitis- und den Katzen-

009838/2083 BADORIGlNAt' ~^?~

as έ 33as Ver'i'aiir'en zur V^rmeiirüng einSa YIr¹Us $ für" don εοϊϋϊιβ Zsjllinifen anfällig sirid^ ©der" eines Vii-'us aus des⁵ öuöii definier'ten ör'üppe bestellt dur^iiij daß man die iieteföploiäe Zellifile als eine foil iuikr'i^Or'gahisrdfe uniffeiiiiytinr-freie" iiaiiür Merstöllfj difes© Kultur niif cifes Virus iinpl'tf die KUitüi* Ser' εο ini'iäierten Bö "beilseliält j düiE öiiie Teriueilrüng des iiiolii

ii 3ta:..ias des ?irüs' gebildet wir·¹.- Sie üö iierg cteliten Virer, bilden ein tartigsnes' iüäterl-alj das iii o.ier" äbgesüiiwäehter .For'm Terwer^det vver'den is

iL-weeiie der' inaivtiviui-'ung karai beispiei-Bv/eisi äer* Virenifti-"t p^ysi^c-liee-ien öder' eheiaisuiifefi L-it-t§li± behandeii

die den Virus a fet οι eil uiia dlidiir*öii de«i .&ΐ&Εϋ.ι §eirie Anst-eö}Eiin^_:;sf aiii-xeit und g&thof.eiie ',Vir'kiiiv· nehiri'&iif @hn'e Je= cec'ii seine ¥äiii;:k-eit zxi feesei ii^eiij eine iinaiinögene ReäxEtio bei des zu söhütäönaeh Si er* gegen die infection fail; einem virulßftten Sta.a^ desselben Virus au bsv.'ir'iiefti Bs v/ur'de ge= da^ Beicpiylsweise l^v0P2u?li-n ©dei¹* k^Pi^opiolaoton für'

n_t5 söi©xier Vireiii besoHafef^s' ies Kätze'i-i=Rlii-ii£ivirus j geeignet s'i

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f üria -San iläiiii ^i? in Sei* äüiO'ii die vör'Iie¹= Si^ei"indu!ig gesöLaffeneii üete'föplG'ideii Seilinie übe? sug-eri: iuufc-ii ifaa§e^vn üiTtd sie öUsiöiöiiiö e iiir'e Iniiünit&f er'seiiiCHi-ie Wip'Äiliic iü-

verlieren. Die vorliegende Erfindung schafft daher ebenso ein Verfahren zur Abschwächung eines Virus aus der oben angegebenen Gruppe, bei dem man die heteroploide Zellinie als eine von Liikro-Organismen-Verunreinigungen freie Kultur herstellt, diese Kultur mit einem virulenten Stamm des' Virus impft, dann die infizierte Kultur des Virus unter Verwendung weiterer Kulturen der heteroploiden Zellinie, die frei von Verunreinigungen durch Mikro-Organismen ist, reihenweise Passagen durchlaufen läßt, bis der über Passagen erhaltene Virus seine Ansteclcungsfähigkeit und pathogen machende Y/irkung verliert, aber noch seine Immunität erzeugende Wirkung beibehalte Die Anzahl der Passagen hängt von der Virulenz des Virusstamms ab, und es kann notwendig werden, ihn mehr als 40 mal über Passagen laufen zu lassen, um einen zufriedenstellenden Stamm zu erhalten. Vorteilhafterweise kehrt der so erhaltene abgeschwächte Stamm nicht zu seinem virulenten Status zurück, wenn er von dem geimpften Tier in andere Tiere, die mit diesem in Kontakt kommen, überwechselt.

Das antigene Liaterial aus inaktivierten oder abgeschwächten Viren, das unter Verwendung der Katzen- heteroploiden Zeillinie nach der vorliegenden Erfindung erhalten wurde,, kann als Vaicz-in zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger dargeboten werden. Der '!rager kann die Form einer injizierbaren Flüssigkeit,-wie einer wäßrigen, gepufferten Salzlösung, haben,- oder es kann ein fester Träger .sein,, der

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V BAD ORIGINAL -9-

"beispielsweise Stabilisatoren oder andere Additive enthalte Zu den Stabilisatoren, die für diesen Zweck geeignet sind, gehören abgebaute Gelatine, die-als 'Sol-u-pro' auf den Harkt gebracht wird, oder Sorbitol_o

Die vorliegende Erfindung schafft in weiterer Hinsicht ein Verfahren zum Schutz von Tieren, im besonderen Katzen, gegen die infektiöse Katzen-Enteritis oder Eatzen-Rhinotracheitis oder gegen Infektionen mit Katzen-Picornaviren oder gegen Katzen-Leukämie„ In ähnlicher V/eise können Rinder gegen Binder- (rlsrpes) luammalitis geschützt werden,. Die entsprechenden Verfahren beinhalten die Impfung des anfälligen Tiers mit einem 1/akzin gegen die entsprechende, vorausgehend erläuterte Krankheit, wobei dieses ausreichend antigenes Material enthält, um einen Schutz gegen eine natürliche Infektion mit einem wilden Stamm des jeweiligen Virus zu verleihen«,

Sowohl die abgeschwächten wie inaktivierten. Vakzine gegen infektiöse Katzen-Enteritis haben Katzen erfolgreich gegen einen Befall durch einen solchen wilden Virusstamm geschützt ο Es wird bevorzugt, einen inaktivierten Staüua des Rhinotracheitisvirus, der nach dem vorliegenden Verfahren erhalten und als Vakzin dargeboten wird, zum Schutz von Katzen gegen die ![rankheit zu" verwenden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

Eine Probe aus wenigstens ungefähr 1 χ 10° Seilen einer Kultur des Zellstsmns nach, der 40. Passage, hergestellt nach dem Beispiel"! der iiaupt.anmeldung P 16 '17 940.1, wurde in eine 112 ml (4 oz.) große flache Ab decks cha Ie überführt, die Sagle-'s Basal Ledium (80 Vol.Teile) (vgl. ri. j-.ix"le, Science, 1955, 122, 504) enthielt, wobei dieses mit den 2-fachen der üblichen Menge an Aminosäuren und Vitaminen, mit i'ryptose-Phofjphat-iirühe (1.0 VoI,'Teile)' und Binder serum.. (10 Vol.Seile) modifiziert una als sterile Lösung verwendet wurde.."..-., .

Die so gebildeten lionoschichtkulturen wurden mittels Serienpassageii des Inhalts von einer Hasciie ein- oder av/eisal ■wöchentlich weiter unterkultiviert. Die Zellen wurden au diesem 2,weck mit einer U, 5 ^igen IVatriuneaetatlösung in einer 0,1 folgen ^rYpsinlösur-g in dem oben a i-g eg ebenen Typ von Phosphat-gepüfi'erter Salzlösung erneut suspendiert.

Es wurde beobachtet., daß die ",/uchsgeschv/ihdigkeit sich tis ungefähr zur 45» Passage verlangsamte, aber danach erneut normal wurde. Die Ohromosömabnormitäten vairden zunehraend üblich, und die Kultur nahm allmählich einen heteroploiden Charakter ein. Die so erhaltene Zellinie wurde wz-iter bis -zur 61 ο Passage vermehrt.

: ■' -11-

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Sine weitere Probe der 12. Passage des in 'Beispiel 5 des in der-liauLtanmeldung beschriebenen KuI turrerf ahrens -"wurde nach dem Verfahren des vorausgenenden Beispiels 1 mittels Reihenpao^a^en vermehrt, und der so erhaltene Zellstamm wurde allmählich in eine h-e-teroploide LJellinie umgewandelt, die man dann weiter bis zur 61 _o Passage, venr. ehrte.

Die beiden Zellinien, wie sic in Beispiel 1 und 2 beschriebe:: :;ind, wird en in verschiedenen Passa^enh-ahen lait infektiösem Ku'-::-3ii-Snteri""i£";virus auo einer einzigen Quelle, die ' ir der angegebenen Beschreibung besenrieben ist, infiziert. Le -..'Lirde f o^tirestelli, da^ sie in l-'hnliuher Weise für den Virus er.:pfLi:i_;-.lich waren ".vie die Ori ;in^l;;ellstämme, und der 'Jrad der Infektion wurde durch den Prosentsatz der infi- ^iorteii Zellen bei einer zweifachen Vex^duiuiun;' des Vix-uc

Lie ilrp-ebniise uind nachfolgend angegeben:

der Zellen ^c,'i infisierta Zellen bei ^raali^ej

Verdünnung des Virus, wobei die Zellen mit einem Virus ir.fisiert wurden,: der. aus einer Quelle erhalten \vurde .

68

70 Ti

2QQ3 ^BAD

Fortsetzung Tabelle: Passagehzahl der Zellen

50-51(gemischt)

53 -■-■■

54

56

56 '

57 ",'■■·' ■58

59 60 61 · infizierte Zellen bei 2maliger Verdünnung des Virus, wobei die Zellen mit einem Virus infiziert wurden, der aus einer Quelle er-. halten wurde \ -

.70 70

70 71 70

69

64 61

12 14 17 20 23 32 36 37 42 49 55 61 44 77 69 71 72 72 74 77 75 73 - 76 72

Man ließ den infektiösen Katzen-Enteritisvirus weiter in verschiedenen Kulturen der Katzenerabriozellinie über Serien-■passagen-'laufen,wobei einigender Kulturen in dem diploiden und einige in dem iieteroploiden Zustand waren. In jeden

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lall wurden, wenn intranukleare Änderungen"durch Verfärben mit Haematoxylin und Eosin erkennbar wurden, die infizierten ,Kulturen gefroren und bei -30⁰C gelagert»

i)er%ei -30 Ό gefroren gelagerte Virus wurde spatel* aufgetaut und über nicht infizierte Kulturen von Katzenembriozellinien passieren lassen. H'ach einer entsprechenden Zeit, die durch das Vorhandensein von intranuklearen Änderungen bestimmt wurde, wurden die infizierten Kulturen der Zellen erneut gefroren bei -30 G bis zur nächsten Passage gelagert,

Wenn man den Virus in Katzenembriozellinien über Passagen laufen ließ, war es üblich, den Virus gleichzeitig mit den Zellen und dem Wuchsmedium dem Kulturgefäß zuzugeben.. Die Kultur der Embriozellstämme mit dem Virus inoculum wurde bei 37°C gebrütet»

Der Virusstamm, der abgeschwächt für Katzen verwendbar beansprucht wird, wurde in dieser Weise über Serienpassagen in Katzenzellinien vermehrt, wobei diese aus Lungen der Embrios stammten_o Die Endstufen, die zur Erreichung einer zufriedenstellenden Abschwächung notwendig waren, waren:

Passagenzalil des Virus

.. 40 41

42 "

Passagenzahl der. Zellen

117 ) 18 ) diploide Linien

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-14-

- .14. -

Forts etsung Tab eile: Passagenzahl'de.s Virus

' 50 ■

■:■.■■ ...5.2 '.'.'.

Passascenzahl der Zellen

45-	~ 53 .)., ■ , , ...... --,..
4ο :. . -.·;	.' ;55 )-.-..:■ ... ;.
-'■-., 47' "^;r'^r .■.'-	*^: ' 5 δ ) -,,-_ ■ ■- ■ _t* . .--**
„ : _:.... 48 : j	' ⁶^ ) '
γ49,:	62 ) heteroploide Linien

•6.5 -71

Der Virus, Stand Γ48» Passage, vv'urde bei Katsen tiurcii ti von drei" Versuchstieren, mi't-.einen»I,_illiliter der, Tir'ujssuspension-geprüfte ■; - . ? ^^., _s

Die nachfolgenden Ergebnisse v/urderi erhalten:

-15-

8/2083^ y % { ^

Geometrisches Kittel der Lcuko zyt eiizählung

	Kaeh Vakzination	Fach Herausforderung mit virulen	oral verabfolgt
Tag	von 3 Katzen	tem IKE-Virus,	3 Kontroll-
		3 vakzinierte	Katzen
		Katzen	21.800
O	9.800	5.200	ni cht
1	8.700	nicht	durchgeführt
		durchgeführt	nicht
2	7.200	nicht	durchgeführt
		durchgeführt	10.400
3	6.700	8.6Ό0	15.300
4	5.700	9.100	12.300
5	5.700	8.300	5.400
6	6.600	10.900	1.500*
7	7.200	9.000	1.800*
8	9.300	9.500	2.600
9	10.000	9.300	9'.5OO
10	9.400	12.100

*) Eine Kcntrollkatse verendete am 7. und 8. Tag.

Ec ist zu ersahen, daß das Abschwächungsverfahren erfolgreich war und aa.iS die heteroploide Katzenembriozellinie für diesen Zweck vorteilhaft verwendet werden konnte.

Beispiel 5 _t '

Die Kulturen von Katzenembrio- heteroploiden Zellinien, wie sie in Beispiel 1 erhalten wurden, wurden mit einer Probe von 17aser,- und Augen-Exsudat einer Katze, die an Katzen-Ehinotraclieitis erkrankt war, infiziert. Das Exsudat wurde Hit einer Phos.phat-gepuff erteil Kochsalzlösung (2,0 ml), die

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■'■-'■ 16 -

ebenso 200 Einheiten Penicillin und 100 mg Streptomycin pro ml enthielt, gemischt„ - ,

Die Zellinien-Lionoschichten wurden wie in Beispiel 1 in fünf verschiedenen Röhrchen hergestellt« Das üährmedium wurde entfernt und durch das Exsudat-Puffergemisch ersetzt und 2 ütd. bei 37°G gebrütet. Das Uxsudat-Puffergemisch wurde dann entfernt und die Zellen mit frischer steriler Pufferlösung gewaschen. Die infizierten Röhrchen mit frischem ITährmedi um (1,5 ml pro Röhrchen) wurden dann bei 37 C in frischem iiährmedium (1,5 ml) gebrütet. _f

Die infizierten Kulturen und Kontrollkulturen, die mit steriler Salzlösung anstelle dem Bxsudat-Puffergemisch hergestellt wurden, wurden täglich mikroskopisch geprüft«

Eine durch Viren hervorgerufene eytopathische Wirkung wurde beobachtet. Y/'eitere Versuche zeigen, dai3 die infizierten Kulturen frei von weiteren i,:ikro-0rganismen v/areii. Der Virus konnte serienmäßig auf frische l'ubenkulturen des gleichen Zellstammes übertragen werden, in welchen ähnliche zelldegenerative Änderungen stattfanden. G-eeignete Verdünnungsversuelie zeigten weiterhin, daß eine Vermehrung des Virus stattfände .".--'.-

Die in dieser Wei^e erhaltenen Viren konnten durch Behaiid-' lung mit Porr.rallr· oder 13-Propiolacton nach den üblichen dem mariii bekannten Verfahren inaktiviert werden, und es

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konnten Katzen mit dein so hergestellten Vakzin geimpft werden» Die Ergebnisse zeigen, daiJ ein zufriedenstellender Grad an Immunität gegen den Befall mit einem virulenten Stamm des Rhinotracheitisvirus erreicht werden konnte»

Beispiel 6

Kulturen von Katzenembrio- heteroploiden Zellinien, die nach Beispiel 1 erhalten v/urden, v.urden mit einer Probe von Fasen- oder Augen-Exsudat von Katzen, die an 'Katzen-Influenza' erkrankt waren, infiziert, wobei dieses Exsudat als Quelle für Katzen-Picornavirus verwendet wurde»

Die Probe wurde mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (2,0 ml), die ebenso 200 Einheiten Penicillin und 100 mg Streptomycin pro ml enthielt, gemischt»

Von der Z eil inien-iuo no schient v.-urde das riährmedium entfernt und durch das Exsudat-Puffergemisch ersetzt und bei 37°0 2 Std» gebrütet. Das Exsudat-Puffergemisch wurde dann entfernt und-die Zellen mit frischer steriler Pufferlösung gewaschen» Die infizierte Zelliiiie wurde dann bei 37⁰C in eineia frischen ITährmedium (1,5 ml) gebrütet»

Die infizierte Kultur und eine Kontrollkultur, die aus steriler Salzlösung anstelle des Exsudat-Pufiergemisclis hergestellt wurde, v/urde danach täglich mikroskopisch geprüft. Es v/urde festgestellt, dai3 die Zelldegeneration (cytopathi-

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^: - 18 - ■,.■■.■ ■■■'.; ■

sehe Wirkung), die nach mehreren 'x'agen Brütens austrat, nicht unähnlich war der, die mit Human-Picornaviren, beispielsweise Polioiu^elitisviren, hergestellt wurde. Der Virus konnte .durch. Üeihenpassagen in Kulturen des ZeilStamms übertragen v/erden, und geeignete Verdür:rain_osveröu^he zeigten, daß eine Verme-irung des Virus in dem Zellctavim .'.stattgefunden hatteo. »eitere Untersuchungen zeigen, cia^ aio εο durch !Reihenpassage;-! erhaltenen Kulturen frei von Verunreinigungen durch andere L-ikro-organismen waren.

Beispiel 7

Eine heteroploiöe Linie wurde durch Reihenpassage der Katzener.;brio- diploiden 2ellinie, die- aus £:t.naen ^.o nach dem Verfahren von Beispiel 2 der Patentanrael P 16 17 940.1 .erhalten './urden, hergestellt=,

Sov/ohl aie 19. Passage (diploide Stufe) als auch die 46. Passage (heteroplcide Stufe) v/urden aus einer;: AriEatz- von infektiösem Katzen-Enteritis virus , .vie in ■ =. ;,ispiol 3 der vorliegenden Beschreibung, inüziert.. Der Proser_"jGatz dsr infizierten Zeilen betrug 66 ozv/. 67 i**

Beispiel 8

Kulturen von Katzenscibrio- Iieteroploiden Zellinidn, die nach Beispiel 1 erhalten wurden, wurden mit ._Iaΐsen-infektiös en linteritisvirus in der üblichen Veise infiziert,-.

009838/2083 SADQRKSJNAl.

JaCi- .-Je-Oi'.!ton-.wurden die Kulturen eingefroren und dreimal auf.getaut u^vid dann mit einer Lü;:unr von 4-0'ui^ejn !Formaldehyd do eingestellt, üaiJ ihre Konzentration in dem 1 ediura- 0,2 /ί betru.-;. iiiy KuI :ur -./urde mit (Jeu InaktivierungSKitbei bei 37°0 ;'; lage ebrätet»

Zu einer trobe der behandelten -Culüuren v/ui'de Pho&phc,t-^epu—'i'ei'tü j-Zo-jüsalzlöfaung (Mo), msreiCi,^ ΰ für ein.; 3ndkonze-.tratioii von 25 ψ Pü3, . zubegeben. Zu einer weiteren Probe ;rarde- Alhydrogel unter Einstellung einer 2^rj ^ig Konzentration

Eine o-rupc-e von ι Katzen wurde subkutan mit 1 ml von jeder Art der oueu an- _;i_c- ebenen Vakzine geinoii.. 21 Tage später erliieixeu aie Ka ^:;en eine zweite üor.is derselben Quantität,

ITa σ·. v. eil'..ren 21 Tagen wurden die _L:esi..:.iuei: vakziniert ei: 'Jjiiizen unu drei Kontrollkatzen oral ::iit virulentem infel-ctiöüen Ka u^en-Ünteritiüvix'us in. isic-rt. Koinuc der vakzinierten Jiv."re vere:.ie^e, v.'ührerd zwei der Kontroll-;;ierc ein-

Daraus i'oi.-ert, da^· das in der obigen Weise Hergestellte i::~.c~ivier::e Vuiczin einen sufrieoenstellenden Schutt bilde—

- 2 Ο

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BAD ORIGINAL

Beispiel 9

Infektiöser Katzen-Enteritisvirus wurde 48 mal über Kulturen von Katzenembrio- heteroploiden Zellinien in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise passi-eren lassen. Der- in der Kulturflüssigkeit vorhandene Virusstamm und Zellen der letzten Weiterkulturstufe wurden drei Katzen subkutan ohne' jede Verdünnung in einer Dosis von 1 ml verabfolgt, und es wurden zufriedenstellende Leukozytzählungen in verschiedenen Stufen nach der Impfung beobachtet, wobei zwei der Tiere, die am 21. Tag nach der Impfung infiziert wurden, den Versuch überlebten,. Alle außer einem Versuchstier verendeten an der Infektion.

Beispiel 10

1 -

Drei Vol.Teile des nach Beispiel 9 hergestellten flüssigen Vakzins wurden mit 2 Vol.Teilen einer 25 folgen Sorbitollösung und 2 Vol.Teilen einer 25 $>igen 'Sol-u-pro' (Schutzmarken-Lösung gemischte Das Gemisch v/urde gefriergetrocknet, und zwei Proben des getrockneten Produkts wurden bei 30 0 47 und 75 Wochen und zwei andere Proben bei 4 0 die gleiche Zeitdauer gehalten. Die neu gebildeten Vakzine zeigten zufriedenstellende Titer bei G-ewebekulturuntersuchungen.

Feuii Wocnen alte Katzen v/urden mit Proben des Vakzins geimpft, und eine v/eitere Dosierung wurde 2 Wochen später

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verabfolgt. !lach v/eiteren H Tagen wurde den Sieren Blut entnommen, und es wurde festgestellt, daß eine zufriedenstellende Antikörperraenge in den gesamten Versuchstieren vorhanden war.

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Claims

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF PATENTANWÄLTE 8 MÜNCHEN 2. HIUBLESTRASSE »■ Dr. Berg Dipl.-Ing. Slapf, 8 München 2, HllblesiraBe 20 · m S ΰά! ά!ύ Ihr Zeichen Unser Zeichen 18 Datunl 2.MärZ 1970 Wellcome Foundation... Anwaltsakte-Nr. 18 896 Neue Patentansprüche

1. Kontinuierliche Katzenembryo-heteroploide Zellinie oder deren Kultur, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Katzenembryo herrührende Zellen, von denen mehr als 25% im Vergleich zu den Chromosomen der Zellen der Katzenembryos anormale Chromosomen-Eigenschaften besitzen, ab-' , stammend aus einer diploiden, ursprünglich aus Katzenembryogewebe stammenden Zellinie durch aufeinanderfolgen de Passagen über die 40. bis 50. Passage hinaus bis zu

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einem Anstieg des Anteils der Zellen mit anormalen Chromosomen-Eigenschaften auf über 25% der Gesamtmenge, gegebenenfalls zusammen mit einem Kulturmedium, umfaßt.

2,. Verfahren zur Herstellung einer kontinuierlichen Katzenembryo-heteroploiden Zellinie oder deren Kultur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine diploide Zellinie, die ursprünglich aus Katzenembryogeweben stammt, in einem Medium, das die notwendigen physikalischen und chemischen Bedingungen und die Nährzusammensetzung zur Kultur und Weiterkultur der Zellen besitzt, über die 40. bis 50. Passage hinaus nacheinander Passagen durchlaufen läßt, bis der Anteil der Zellen mit anormalen Chromosomen-Eigenschaften auf über 25% der Gesamtmenge steigt und, sofern erforderlich, die Zellen von dem Medium trennt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellinie in einem Nährmedium kultiviert und einen Teil oder die gesamten Zellen in ein frisches Nährmedium, soweit erforderlich, überführt. ^i ^

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nährmedium Eagle's Basal Medium mit Rinderserum verwendet.

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5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 32 und 39°C, vorzugsweise zwischen 35 und 37_f5°C durchführt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung in Monoschichtkulturen unter Bildung ineinanderübergehender Zellschichten durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die ineinanderübergehenden Schichten mit Trypsin oder einem unschädlichen Chelatbildner vor jeder Übertragung in ein frisches Medium behandelt. _v

8. Verfahren nach Anspruch 3 im wesentlichen wie in einem der Beispiele 1 oder 2 beschrieben.

9. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryoheteroploiden Zellinie oder deren Kultur nach Anspruch 1 zur Fortpflanzung eines Virus, gegen den kontinuierliche Katzenembryo-Heteroploid-Zellinien oder Kulturen derselben gemäß Anspruch 1 empfindlich sind, dadurch gekennzeichnet, daß man die heteroploide Zellinie als eine von

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Mikroorganismen-Verunreinigung freie Kultur herstellt, diese Kultur mit einem Virusstamm impft und die Kultur der so infizierten Wirtszellen zum Erreichen einer Vermehrung des Virus unterhalt.

10. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryoheteroploiden Zellinie oder deren Kultur nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Virus der infektiöse Katzen-Enteritisvirus, Katzen-Rhinotracheitisvirus, Katzen-Picornavirus, Rinder-(Herpes)Mammalitisvirus und . Katzen-Leukämievirus verwendet wird.

11. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryoheteroploiden Zellinie oder deren Kultur nach einem der Ansprüche 9 und 10 im wesentlichen wie in einem der Beispiele 3 bis 8 beschrieben.

12. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryoheteroploiden Zellinie oder deren Kultur nach Anspruch 1 zum Abschwächen eines Virus, wie des infektiösen Katzen-Enteritisvirus, Katzen-Rhinotracheitisvirus, Katzen-Picornavirus, Rinder-(Herpes)Mammalitisvirus und Katzen-Leukämievirus, dadurch gekennzeichnet, daß man die heteroploide Zellinie als eine von Mikroorganismen-Verun-

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reinigung freie Kultur herstellt, diese Kultur mit einem virulenten Stamm des Virus impft, dann die mit dem Virus infizierte Kultur Reihenpassagen durchlaufen läßt, wobei Kulturen aus heteroploiden Zellinien verwendet werden, die frei sind von Verunreinigung durch Mikroorganismen, bis der durch Passagen gelaufene Virus seine Ansteckungsfähigkeit sowie seine pathogenen Eigenschaften verliert, jedoch seine Immunität erzeugende Wirkung noch beibehält.

13. Verwendung, einer kontinuierlichen Katzenembryoheteroploiden Zellinie oder deren Kultur nach Anspruch im wesentlichen wie in einem der Beispiele 3 bis 7 beschrieben.

14. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryöheteroploiden Zellinie oder deren Kultur nach Anspruch 1 zur Herstellung eines antigenen Materials, dadurch gekennzeichnet, daß man den Virus gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11 züchtet und danach den Virus durch physikalische oder chemische Mittel, wie durch Behandlung mit Formalin oder 3-Propiolacton nach an sich bekannten Verfahren, inaktiviert.

15. Verwendung einer Zellinie oder deren Kultur nach

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Abspruch 14 im wesentlichen wie in Beispiel· 8 beschrieben.

16. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryoheteroploiden Zellinie oder deren Kultur als antigenes Material nach Schwächung oder Inaktivierung des Virus gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15.

17. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryohecercr * ^Ά<ζη ^ellinie oder deren Kultur, gekennzeichnet durcL inei. lalt an abgeschwächtem Virus nach einem der Ansprüche 12 c» _} zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Ί. _r als Vakzin.

18. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryoheteroploiden Zellinie oder deren Kultur, enthaltend gemäß einem der Ansprüche 14 bis 15 einen inaktivierten Virus zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger als Vakzin.

19. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryoheteroploiden ZelÜnie oder deren Kultur als Vakzin gemäß einem der Beispiele 3 bis 8.

20. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryo-

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heteroploiden Zellinie oder deren Kultur als- Vakzin, enthaltend einen abgeschwächten Virusstamm nach einem der Ansprüche 13 oder 14 sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

21. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryoheteroploiden Zellinie oder deren Kultur als Vakzin, enthaltend einen gemäß einem der Ansprüche 16 oder inaktivierten Virusstamm sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

22. Verwendung einer kontinuierlichen Katzenembryoheteroploiden Zellinie oder deren Kultur als Vakzin gemäß einem der Ansprüche 17 bis 1-9, gekennzeichnet durch einen festen pharmazeutisch verträglichen Träger; der einen gefriergetrockneten Exzipienten enthält.

23. Verwendung einer Zellinie oder deren Kultur gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der gefriergetrocknete Exzipient einen Stabilisator enthält, wie eine abgebaute Gelatine oder Sorbitol.

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