DE2805029C2

DE2805029C2 - Impfstoff gegen virale hämorrhagische Sepsis von Forellen sowie Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE2805029C2
Application number: DE2805029A
Authority: DE
Inventors: Jean-Pierre Saint Hilaire sur Erre Gerard; Pierre de Noisy Le Roi Kinkelin
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1977-02-08
Filing date: 1978-02-06
Publication date: 1982-06-03
Also published as: ES466773A1; DE2805029A1; IT7820082A0; IT1092676B; DK58178A

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das nach d) inaktivierte Präparat mit Formaldehyd in einer Endkonzentration zwischen 0,01 und 0,03% im Präparat 10 Stunden bis Tage lang ergänzend behandelt.

3. Impfstoff gegen virale hämorrhagische Sepsis von Forellen, gekennzeichnet durch einen wesentlichen Gehalt an VHS-Viruspräparat, das in Fischzellkultur mit einem Anfangsgehalt zwischen 10⁴ und UFP/ml und vorzugsweise in der Gegend von ■ 10⁷ bis 5 · 10⁸ UFP/ml kultiviert und inaktiviert worden ist, nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen die virale hämorrhagische Sepsis (VHS) von Forellen. Ferner betrifft die Erfindung auch den Impfstoff als solchen.

Die üblicherweise als VHS abgekürzte virale hämorrhagische Sepsis ist eine Viruserkrankung von Forellen, die zu erheblichen Mortalitäten in der 'Fischzucht, insbesondere in Europa, führt. Sie äußert sich in Störungen der Fortbewegung, Zirkulation und Pigmentierung, die dem Tod vorausgehen. Insbesondere werden ein trudelndes Schwimmen, Ödeme, Eingeweideblutungen, Exophthalmie und Melanosis beobachtet Ie nach Form der Erkrankung können die Fische lediglich einige dieser Symptome zeigen. Meist besteht der Verdacht des Befalls einer Fischzucht mit der Krankheit, sobald Exophthalmie und Melanosis oder eine Entfärbung der Kiemen infolge der von Hämorrhagien herrührenden Anämie und eine sehr erhebliche Mortalität zu beobachten sind.

Als Ursache für diese Erkrankung ist seit langem ein Virus bekannt. Bei diesem handelt es sich um einen Rhabdovirus, der VHS-Vinus oder Egtved-Virus genannt wird. Er kann aus bei kranken Fischen entnommenen Organen isoliert und durch Sero-neutralisation oder Immunofluoreszenz in Zellkultur identifiziert werden. Er wurde zum ersten Mal 1963 bei der Regenbogenforelle durch JENSEN in Dänemark isoliert, und seine Morphologie wurde durch ZWIL-LENBERG (1965) festgestellt; seine serologische Identifizierung wurde insbesondere von VESTER-GAARD-JORGENSEN im Bull.Off. Int. Epiz„69(7-8) (1968), S. 985-989 beschrieben. In jüngster Zeit hat es sich gezeigt, daß in der Tat unterschiedliche Typen des VHS-Virus existieren.

In der Praxis ergeben sich bei der Bekämpfung der VHS schwierig zu lösende Probleme, da bislang keine immunmachende Reaktion bei einer mit der Krankheit befallenen Fischzucht festgestellt wurde und die Fischzüchter so bis zum heutigen Tage nichts anderes tun konnten, als eine strenge vorbeugende Hygiene anzuwenden. Nach einer Desinfektion muß die Wiederbevölkerung einer Fischzucht mit völlig gesunden Fischen erfolgen und der Fischzüchter muß sich vor jeder Einschleppung anderer Fische schützen. Es ist verständlich, daß diese Anforderungen nur sehr schlecht auf die üblichen Bedingungen des Betriebes von Fischzuchten abgestimmt sind. Außerdem verbieten sie praktisch eine Pachtübertragung, damit die Einschlep-

•to pung eines als Virusträger fungierenden Tiers vermieden wird und selbst unter diesen Bedingungen ist der Fischzüchter nicht vor einem erneuten Aufflackern der Krankheit durch Zuflüsse geschützt.
Diese Schwierigkeiten können nun Dank der Erfindung gelöst werden, die auf der Möglichkeit basiert, den Forellen eine erworbene Resistenz gegenüber der VHS zu verleihen, was die Einplanung einer Vorbeugungsbehandlung der Fische zuläßt, die in der Praxis sehr viel einfacher durchzuführen ist als die sanitären bzw. hygienischen Maßnahmen, welche bislang die einzige Schutzmöglichkeit gegen diese Krankheit darstellten.

Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Impfstoffes gegen virale hämorrhagische Sepsis (VHS) von Forellen, wobei die mit dem Impfstoff behandelten Forellen eine wirksame Immunisierung von langer Dauer erhalten, ohne daß eine schädliche Nebenwirkung für die Gesundheit der Forellen auftritt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen virale hämorrhagische Sepsis (VHS) von Forellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) mindestens einen VHS- bzw. Egtvod-Virus vom Serotyp 1 oder H, ausgewählt unter den Viren vom Stamm 07-71 (wie am 10. Januar 1978 beim Institut Pasteur unter der Nr. i-040 hinterlegt), vom Stamm He (wie am 10. Januar 1978 beim Institut Pasteur

unter der Nr. i-041 hinterlegt) und vom Stamm 23-75 (wie am 10. Januar 1978 beim Institut Pasteur unter der Nr. i-042 hinterlegt; Hinterlegungen des INRA) in einer Zellkultur von Fischzellen, abstammend vom Epithelium Papulosum Cyprini bzw. Epithelium Papulosum Caprio (EPC), wie sie am 10. Januar 1978 beim Institut Pasteur unter der Nr. i-039 hinterlegt wurden, oder vom FHM (Fettkopf-Elritze) oder RTG 2 (Regenbogenforellengonaden), in einem Nährmedium auf der Basis eines mit TRIS auf pH-Werte in der Gegend von 7,4 bis 7,6 gepufferten Stoker- bzw. Eagle-Milieus bei einer Temperatur zwischen 10 und 20⁰C erzeugt,

daß man das überstehende, virushaltige Material mit einem Gehalt zwischen 10⁴ und 10⁹ UFP/ml (Ansätze bzw. Kolonien bildenden Einheiten pro ml) sammelt und

mit /J-Propiolacton in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Virussuspension, bei einer Temperatur zwischen 15 und 25° C ausreichend lange inaktiviert,
die Unschädlichkeit des inaktivierten Präparates durch Einimpfen einer Probe in eine Zellkultur nachprüft und

den so erhaltenen Impfstoff gegebenenfalls schließlich einfriert.

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Der Impfstoff gegen virale hämorrhagische Sepsis von Forellen ist gekennzeichnet durch einen wesentlichen Gehalt an VHS-Viruspräparat, das in Fischzellkultur mit einem Anfangsgehalt zwischen 10⁴ und 10⁹ UFP/ml und vorzugsweise in der Gegend von 3· ΙΟ⁷ bis 5· 10⁸UFPZmI, kultiviert und inaktiviert worden ist, nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren.

Den erfindungsgemäßen Impfstoff erhält man durch Inaktivierung eines in Zellkultur erzeugten VHS-Virus. Den unterschiedlichen VHS-Virustypen im Rahmen der Erfindung besonders angepaßte Kulturbedingungen sind solche, wie sie insbesondere für den Egtved-Virus von P. de Kinkelin und R. Scherrer in den Ann. Rech. Vetor. (INRA), 1 (1) (1970) S. 17-30 beschrieben werden.

Im Rahmen der Durchführung der Erfindung hat es sich als vorteilhaft erwiesen, das Wachstum des auf Zellkulturen mit Abstammung vom EPC (Epithelium Papulosum Cyprini) lebenden Virus zu betreiben. Man kann jedoch auch andere Zellkulturen anwenden z. B. mit Abstammung vom FHM (Fettkopf-Elritze) und RTG 2 (Regenbogenforellengonaden), die im Handel erhältlich sind und insbesondere in den USA durch Microbiological Associates (Arnes, Ohio) abgegeben und in Frankreich durch Flow Dynalab vertrieben werden. Bei den für die Herstellung des erfindungsgemäßen Impfstoffs bevorzugten Kulturzellen bedeutet EPC eine Abkürzung für Epithelium Papulosum Cyprini oder Epithelium Papulosum Carpio. Dieses sind Karpfenhautzellen, und präziser ausgedrückt handelt es sich um eine von einem gutartigen Tumor der Karpfenhaut herrührende epitheloide Kultur, die in den Jahren 1968 bis 1970 durch Professor Fijan an der Veterinär-Schule von Zagreb (Jugoslawien) isoliert und seit 1971 im Laboratoire d'Ichtyopathologie de !'Institut National de la Recherche Agrononiique (INRA) in Frankreich aufrechterhalten wurde bzw. wird. Diese Zellkultur wurde als Mikroorganismen-Stamm bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) am Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, Paris XV« unter der Nr. i-039 am 10.1.1978 hinterlegt

Als Kulturmilieu kann man das Eagle-Milieu anwenden, wie es in dem bereits zitierten Aufsatz von P. de Kinkelin und R. Scherrer beschrieben wird. Das Ezgle-Milieu enthält pro ml: 100 Einheiten Penicillin, ΙΟΟμβ Streptomycin, 50 μ§ Kanamycin und 50 Einheiten Mycostatin. Im Rahmen der Erfindung wird diesem das Stoker-Milieu vorgezogen, welches eine Abwandlung mit verdoppeltem Gehalt an Aminosäuren und Vitaminen darstellt. Die Kulturbedingungen können den im oben genannten Aufsatz für die Herstellung des Egtved-Virus beschriebenen entsprechen. Es wurde jedoch festgestellt, daß es für die Wirksamkeit des erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffs vorteilhaft ist, in Verbindung mit Zellen mit Abstammung vom EPC ein Milieu anzuwenden, das mit einem Puffer bei pH 7,4 bis 7,6 gehalten wird, der durch TRIS gebildet wird; im übrigen könnte der pH-Wert auch innerhalb weiterer Grenzen, zwischen 7 und 8, variieren. Das Kulturmilieu wird mit einem Nährstoff versetzt, der insbesondere durch Rinderembryoserum in einer Konzentration in der Gegend von 1 bis 10% gebildet werden kann. Die Temperatur wird in einem Bereich gehalten, in dem sich der Virus kicht entwickelt, d.h. zwischen +10°C und + 20° C und zweckmäßig in der Gegend von 12 bis 15° C. Die Kultur kann in einzelligen Schichten oder auch in Suspension erfolgen.

Der in die Zellkultur eingeimpfte VHS- bzw. Egtved-Virus vom Serotyp I oder II kann in bekannter Weise aus Organen kranker Forellen, insbesondere dem Gehirn, durch Zermahlen und Zentrifugieren isoliert werden. Die Impfdosis ist innerhalb sehr weiter Grenzen variabel. Im allgemeinen wird sie auf irgendeinen Wert zwischen ΙΟ-³ und 1 Ansätze bzw. Inseln bildender Einheiten (UFP) pro Zelle festgelegt. Der Gehalt an UFP wird hier und im nachfolgenden Text als der Ansatzmeßmethode entsprechend betrachtet, wie sie von P. de Kinkelin und R. Scherrer in dem bereits zitierten Aufsatz beschrieben wird, die allerdings vorzugsweise an FPC-Zellen durchgeführt wird.

Je nach angewandter Impfdosis erfolgt die Gewinnung der überstehenden virushaltigen Flüssigkeit nach einer mehr oder minder langen Wachstumszeit. Diese Zeit wird mit Vorteil so festgelegt, daß sie für eine vollständige Zerstörung der Zellen durch den Virus ausreicht. Beispielsweise kann die Wachstumszeit des Virus bei einer bevorzugten Aüsfijhrungsart des Verfahrens von 30 Stunden bis zu 3 Tagen für eine Impfmenge von 1 bis 10~³ UFP/Zelle variieren. Der Virus kann zum Beispiel, wie es in dem zitierten Aufsatz beschrieben ist, durch Einfrieren auf —35° C und Auftauen auf Zimmertemperatur und nachfolgendes Zentrifugieren der Suspension mit 4000 Upm (10 Minuten lang) und zusätzliches Zentrifugieren der überstehenden Flüssigkeit mit 18 000 Upm (40 000 g; 2 Stunden lang) unter Wiederaufnahme der Bodensätze in das Kulturmilieu gewonnen werden.

Gemäß der Erfindung wird das Viruspräparat, das durch die überstehende Flüssigkeit gebildet wird, die von der VHS-Viruskultur nach einer oder mehreren Übertragungen in Zellkultur gewonnen wird, einer Inaktivicrungsbehandlung unterworfen, die zu einer vollständigen Inaktivierung des Virus führt. In der Praxis wird die Anwendung eines Präparates bevorzugt, das unter mehrfacher Übertragung (etwa 2 bis 5fach) in Fischzellkultur (insbesondere mit Abstammung vom EPC) erhalten wird, wobei sich an jede Übertragung eine Kultivierung bis zur vollständigen Zerstörung der

Zellen anschließt Das der Inaktivierung unterworfene Viruspräparat hat einen Gehalt zwischen 10⁴ und 10⁹ UFP/ml und vorzugsweise zwischen 0,5 und 5 · lOoUFP/niL

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Veriahrens zur Herstellung des Impfstoffes erfolgt die Inaktivierung des Egtved-Viruspräparats mit ß-Propiolacton. Hierbei variiert die ß-Propiolactonkonzentration etwa zwischen 0,01 bis 0,1 Gew.-% bezogen auf day Gewicht der behandelten Virussuspension. Die notwen- ι ο dige Einwirkdauer für die vollständige Inaktivierung des Virus liegt im allgemeinen in der Gegend von 10 Stunden bis 5 Tagen bei Temperaturen von 15 bis 25° C Meist ist es bei einer Temperatur von etwa 15 bis 25° C nicht notwendig, über 1 bis 3 Tage hinauszugehen. Die Vollständigkeit der Inaktivierung wird überprüft, indem man beispielsweise das Fehlen einer cytopathogenen Wirkung des Präparats nachweist, wenn dieses einer Fischzellkultur eingeimpft wird.

Der erfindungsgemäße Impfstoff ist gegen virale hämorrhagische Sepsis wirksam. In dieser Form besitzt der Impfstoff einen erhöhten Wirkstoffgehalt, der meist zwischen 10⁴ und 10⁹ UFP an inaktiviertem Virus pro ml Präparat und im bevorzugten Fall insbesondere in der Gegend von 0,3 bis 5 · 10⁸ UFP/ml liegt Er kann ggf. auf —20° C eingefroren und mit Stabilisatoren für eine leichtere Aufbewahrung versetzt werden. Er kann ferner insbesondere mit Wasser verdünnt werden bis zu irgendeiner für die Anwendung gewünschten Konzentration. Ganz allgemein kann er in jede für Veterinärmittel übliche flüssige bzw. fluide oder feste Form gebracht werden, und der Impfstoff kann die inaktivierte Virussuspension zusammen mit irgendwelchen üblichen Zusätzen oder Hilfsstoffen enthalten.

Besonders wirksame Impfstoffe können bevorzugt dadurch erhalten werden, daß der vollständigen Inaktivierung des Virus durch ß-Propiolacton eine Behandlung mit Formaldehyd folgt.

Während der Phase der Inaktivierung durch /?-Propiolacton arbeitet man, wie vorstehend beschrieben ist. Vorzugsweise wird ein virulenter Stamm des VHS-Virus einer Fischzellkultur insbesondere mit Abstammung vom EPC (ggf. nach mehreren Übertragungen in eine solche Kultur) eingeimpft, von der Kultur ein virushaltiges bzw. Viruspräparat mit 10⁷ bis 10⁹ und vorzugsweise 0,5 bis 5 · 10⁸ UFP/ml (Ansätze bzw. Inseln bildende Einheiten pro ml) gesammelt und mit 0-Propiolacton in einer Menge von größenordnungsmäßig 0,01 bis 0,1 Gew.-% und vorzugsweise 0,01 bis 0,04 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der virushaltigen Flüssigkeit versetzt das man eine Zeitdauer von 10 Stunden bis 5 Tagen bei einer Temperatur zwischen 15 und 25° C bis zur vollständigen Inaktivierung des Virus einwirken läßt. Das Viruspräparat kann ggf. konzentrierter gewonnen, durch Zentrifugieren gereinigt und auf einen gewünschten Gehalt für die Inaktivierungsbehandlung mit 0-Propionlacton verdünnt werden. Die Anfangsimpfmenge wird vorzugsweise soweit verdünnt, daß 10-² bis ΙΟ-³ UFP pro Zelle erreicht werden, um die Anwesenheit von Interferon zu vermeiden, jedoch kann man auch ein Impfmaterial mit höherem Gehalt von zum Beispiel bis zu 1 UFP/Zelle anwenden, das vorangehend von Verunreinigungen der Zellkultur befreit wurde. Die Unschädlichkeit des inaktivierten Präparats wird vorteilhafterweise durch zumindest zwei Zelliibertragungen in eine virusempfindliche Zellkultur nachgewiesen. Dabei werden insbesondere Zellen, die vom EPC abstammen, in Stoker-Milieu wie bei den anderen Operationen angewandt Bei der Durchführung der Inaktivierung, wie es beschrieben wurde, kann man eine weniger als 1 UFP/ml entsprechende Unschädlichkeit zusichern.

Durch ergänzende Behandlung mit Formaldehyd kann das Impfvermögen des inaktivierten Präparats verstärkt werden. Dabei reicht indessen eine Formaidehydkonzentration, die bezogen auf diejenige, die zur Inaktivierung des nicht zuvor inaktivierten Virus notwendig sein würde, relativ gering ist Man vermeidet so die Notwendigkeit von Dialyseoperationen zur Abtrennung von überschüssigem Inaktivierungsmittel vom Endprodukt Hierbei wird Formaldehyd zum Präparat in einer Menge zugesetzt, die einer Endkonzentration unter 0,05% und vorzugsweise zwischen 0,01 und 0,03% (Formaldehyd im Präparat) entspricht, was wiederum einer Konzentration von 0,02 bis 0,1% an handelsüblichem »Formol« mit 30 bis 40% Formaldehyd entspricht Nach einer Kontaktzeit, die insbesondere in der Gegend von 10 Stunden bis 3 Tagen bei einer Temperatur zwischen 15 und 25° C liegen kann, ist der erhaltene Impfstoff anwendungsbereit oder er kann eingefroren und so bis zu seiner Verwendung aufbewahrt werden ggf. in Mischung mit irgendwelchen üblichen Exzipienten.

Der nach dem soeben beschriebenen Verfahren erhaltene Impfstoff ist hinsichtlich der Immunisierung von Forellen gegen VHS sehr wirksam. Man beobachtet im allgemeinen eine Differenz von zumindest 30% zwischen der Mortalität durch VHS bei nicht behandelten Vergleichstieren und bei den mit Impfstoff behandelten Tieren, was nach dem Verfahren der permanenten Infektion durch ein entsprechendes Bad bzw. Wasser an Hand von Experimenten ermittelt wurde, die der natürlichen Kontamination gleichkommen.

Gemäß einer ersten Verfahrensvariante kann erfindungsgemäßer Impfstoff ausgehend vom Stamm INRA 07-71 hergestellt werden, der als Stamm mit der Nr. i-040 vom Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) am 10. Januar 1978 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de !'Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, Paris, IVe hinterlegt wurde. Dieser Stamm gehört zum Egtved-Virus vom Serotyp I. Dem Stamm Nr. i-040 gleichkommend oder damit synomym ist ein Egtved-Virus des dänischen Stamms Fi, dessen Eigenschaften in dem Aufsatz von Pierre de Kinkelin und R. Scherrer, Annales de Recherches Vet6rinaires, 1 (1), (1970) S. 17—30 beschrieben wurden, der die gleichen Eigenschaften aufweist und beim Seroneutralisationsversuch identisch reagiert.

Gemäß einer zweiten Verfahrensvariante kann der erfindungsgemäße Impfstoff ausgehend vom Egtved-Virus vom Serotyp II dargestellt werden, der unter der Bezeichnung Stamm He von Vestergaard-Jorgensen gekennzeichnet und unter Hinweis auf diese identifizierung als Stamm Nr. i-041 bei der oben genannten Collection Nationale vom selben Hinterleger am 10.1.1978 hinterlegt wurde

Gemäß einer dritten Variante der Erfindung ermöglicht das Verfahren ebenfalls die Herstellung eines Impfstoffs ausgehend vom Virus des Stamms 23-75, der 1977 am INRA von Pierre de Kinkelin und M. Le Berre isoliert und durch diese Autoren in den Comptes-Rendus de l'Acadfemie des Sciences de Paris, 284, Serie D, Seiten 101 — 104 und 401—404 beschrieben und als Stamm Nr. i-042 am 10.1.1978 vom INRA bei der

Collection Nationale hinterlegt wurde.

Eine Untersuchung der gemäß der Erfindung ausgehend von diesen unterschiedlichen Stämmen erhaltenen Impfstoffe zeigt, daß es sich tatsächlich um wirkliche Impfstoffe handelt, die in der Lage sind, den ^r> Forellen, denen sie verabreicht werden bzw. die damit behandelt werden, eine wirksame Immunisierung von langer Dauer zu verleihen, woraus eine praktische Bedeutung resultiert, die von dem raschen aber nur kurz andauernden Schutz nicht erlangt werden kann, der m durch ein Interferon gewährleistet werden könnte. Dieser Immunisierungsschutz kann ohne schädliche Nebenwirkung für die Gesundheit der Forellen erlangt werden, da das Arzneimittel in den für den Schutz gegen die Erkrankung wirksamen Dosen praktisch frei von i^r, einer Toxizität für diese ist.

Die Behandlung der Forellen kann durch ein beliebiges Verfahren erfolgen, wie es bereits in herkömmlicher Weise für die Verabreichung von Impfstoffen an Fische angewandt wird. Verabreichungen von individuellen Dosen auf zum Beispiel intraperitonealem Wege können unter Verwendung des inaktivierten Viruspräparats, wie es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird — ggf. nach Verdünnung —, mit Dosen von etwa 10* bis 10⁷UFP erfolgen.

Bevorzugt werden indessen im allgemeinen für diese Behandlungsart »kollektive« Applikationen in den Fischzuchten. Die Behandlungen erfolgen mit Vorteil entweder durch Aufsprühen des ggf. mit desinfiziertem jo Wasser verdünnten flüssigen Produkts auf die provisorisch aus dem Wasser genommenen Fische oder durch Verdünnung bzw. Einbringen des wirksamen Produkts in das Wasser, in dem die Fische leben. Diese werden dabei vorzugsweise einer damit verbundenen Behändlung unterworfen, durch welche sie für die in ihr Wasser gebrachten Arzneistoffe aufnahmefähiger gemacht werden, und zwar insbesondere einem osmotischen Schock, einer Saugwirkung oder Depression, einer Temperaturerhöhung oder einer Kombination dieser Methoden. Ganz allgemein kann die Behandlung bei Fischen jeden Alters angewandt werden. Die Konzentration des inaktivierten Virus im Behandlungswasser liegt vorteilhafterweise über 10³ UFP/ml. Sie kann insbesondere größenordnungsmäßig 10³ bis 10⁶ oder 10⁷ UFP/ml betragen.

Eine besonders geeignete Verabreichungsart besteht in einer Behandlung der Fischbrut oder kleiner Forellen mit einem Gewicht zwischen 0,1 und 10 g, vorzugsweise unter 5 g und insbesondere zwischen 0,5 und 1 g, indem man insbesondere auf die in Brut- oder Zuchtbehältern frei von einer Viruskontamination gehaltene Fischbrut weniger als zwei Monate nach dem Ausschlüpfen einwirkt. Eine bevorzugte Applikationsart besteht darin, die Fische in das Impfstoff in einer Konzentration entsprechend 10³ bis 10⁷ UFP/ml inaktivierten Virus enthaltendes Wasser für eine Zeitdauer von zumindest 50 Minuten und vorteilhafterweise in der Gegend von 1,5 bis 24 Stunden bei einer Temperatur zwischen 8⁰C und 15^CC und vorzugsweise 8⁰C und 12°C zu bringen. Vorteilhafterweise wird außerdem eine Wiederholung durch Verabreichung einer spürbar analogen Dosis nach einer Zeit von größenordnungsmäßig 1 bis 6 Wochen nach der Erstbehandlung mit Impfstoff und vorzugsweise 2 bis 4 Wochen später vorgenommen. Gegebenenfalls kann jede Verabreichung, und zwar sowohl die Erstbehandlung als auch die Wiederholung bei den Fischen erfolgen, nach dem diese einem osmotischen Schock durch Einbringen in ein Natursalzbad ausgesetzt wurden: Sofort nach dem osmotischen Schock werden die Fische dann in einem Bad gehalten, welches das inaktivierte Viruspräparat verdünnt auf eine Konzentration von vorzugsweise 10³ bis 10⁵ UFP/ml Badwasser enthält, und zwar für eine Zeitdauer von etwa 50 Minuten bis 3 Stunden bei einer Badtemperatur, die durch die übliche Temperatur der Brut- oder Zuchtbehälter in der Gegend von 8 bis 10⁰C gebildet werden, aber auch leicht darüber in der Gegend von 10 bis 15° C liegen kann.

Im übrigen erfolgt die Immunisierung der Forellen gegen die VHS vorteilhafterweise mit Hilfe gemischter Impfstoffe, die durch eine Mischung von zumindest zwei Impfstoffen gebildet werden, die gemäß der Erfindung unter Verwendung von VHS-Virusstämmen von unterschiedlichen Serotypen wie z. B. eines VHS-Virusstamms vom Serotyp I und eines Virusstamms 23-75 erhalten wurden.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Der Impfstoff wurde ausgehend von lebenden Viren hergestellt, die in herkömmlicher Weise ausgehend von zerkleinertem Zellmaterial isoliert wurden, das von kranken oder als Virusträger fungierenden gesunden Fischen stammte. Für die hier beschriebene Präparation wurde ein Egtved-Virusstamm vom Serotyp I (Virus Fi) in einer vom EPC (Epithelium Papulosum Cyprini) stammenden Fischzellkultur angewandt. Der Stamm wurde bei seiner dritten Kulturübertragung auf eine einzellige Schicht benutzt, wobei an jede Übertragung eine Phase bis zur vollständigen cytopathogenen Wirkung (vollständigen Zerstörung der Zellen) angeschlossen wurde. Die Impfung erfolgte mit geringer Infektionsvervielfältigung, und zwar insbesondere mit etwa 2 · 10~³ UFP/Zelle unter Anwendung von 20 ml verdünntem Virus mit 7 · 10⁴ UFP/ml für eine Zellausbreitung von 70 ■ 10⁶ Zellen. Die Kultur wurde bei 14° C in einem Stoker-Milieu (modifiziertes Eagle-Milieu) fortgeführt, das mit 0,16 M TRIS-Puffer auf pH 7,6 gepuffert und mit 2% Rinderembryoserum versetzt worden war. Nach drei Kulturtagen war der »Zellteppich« vollständig zerstört Sodann wurde die infektiöse überstehende Flüssigkeit gesammelt

Die überstehende Flüssigkeit der dritten Übertragung wurde gesammelt und durch 10 Minuten Zentrifugieren mit 4000 g geklärt Der Gehalt des Präparats wurde vor der Inaktivierung nach dem bereits erwähnten Verfahren der Ansätze bzw. Inseln bildenden Einheiten bestimmt, wie es im zitierten Aufsatz von P. de Kinkeiin und R. Scherrer beschrieben ist, jedoch unter Ersatz des von FHM stammenden Materials durch Nachfolgezellen von EPC Es ergab sich ein Gehalt von 4 - 10⁸ UFP/ml Flüssigkeit Genauer gesagt, wurden für diese Gehaltsbestimmung Petrischalen mit 8 cm² Oberfläche mit einem Gehalt an ineinandergeflossener 24Std Kultur von EPC-Zellen, d.h. 4,5 - 106Zellen J_n 2 ml Milieu mit 0,1 ml einer Virusverdünnung in Mengen von drei Schalen pro Verdünnung infiziert Nach einstündiger Absorption bei einer Temperatur von 14 bis 20⁰C wobei die Schalen bzw. der Inhalt fünf- oder sechsmal gerührt bzw. bewegt wurden, wurde auf pH 7,6 gepuffertes KulturmiHeu auf die Zellen bei einer Temperatur von 30⁰C in einer Menge von 2 ml pro Schale gegossen. Nach 2$ bis 3 Tagen wurde 4 Stunden vor der Ablesung 1 ml 0,05%ige Neutralrot-Lösung in

Eagle-Lösung mit 0,5% Agarose auf die Primärmilieuschicht gegossen. Am dritten Tage war der Durchmesser der Ansätze oder Inseln in mm-Größenordnung.

Das Viruspräparat wurde einer Behandlung zur Inaktivierung des Virus unterworfen, indem jS-Propiolacton in einer Konzentration von 0,066 Gew.-% (V_bOoo), (bezogen auf das Gewicht der Virussuspension) hinzugegeben wurde. Die Mischung wurde unter beständigem Rühren bei +20° C gehalten. Nach 3 Tagen ß-Propiolactoneinwirkung war die Inaktivierung vollständig. Das überschüssige Inaktivierungsmittel zersetzte sich ohne weiteren Eingriff durch Hydrolyse.

Das so erhaltene Produkt kann als Impfstoff unmittelbar in dieser Form benutzt oder gefriergetrocknet werden, um dann zum Zeitpunkt der Anwendung durch Verdünnung mit einem inerten Verdünnungsmittel, wie destilliertem Wasser, wieder hergestellt zu werden.

Die Unschädlichkeit des Produkts wurde nachgewiesen. Eine erste Kontrolle bestand in der Sicherstellung der vollständigen Inaktivierung des Virus. Dazu wurde eine Probe des inaktivierten Viruspräparats auf einer Fischzellkultur in einzelliger Ausbreitung kultiviert. Es wurde keinerlei cytopathogene Wirkung festgestellt.

Außerdem wurde das Präparat intraperiioneal offensichtlich gesunden Regenbogenforellen in einer Dosis von 0,2 cm ^s pro Fisch von 10 g injiziert. Diese Dosis ist sehr viel höher als die zum Schutz der Fische ausreichenden Dosen. Nichtsdestoweniger wurde sie vollständig vertragen. Im Vergleich dazu wurde bei einer Gruppe von Vergleichstieren, denen lebender Virus injiziert worden war, eine Mortalität von 80% 10 Tage nach der Injektion festgestellt, während gleichzeitig die Injektion des inaktivierten Präparats bei einer weiteren gleichwertigen Gruppe von Forellen zu keinem Todesfall durch VHS führte.

Anwendung

Bei einem ersten Versuch zur vorbeugenden Behandlung von Forellen mit dem inaktivierten Präparat von Beispiel 1 wurden 40 000 kleine Forellen von 3 g einem nicht durch VHS infizierten Fischkulturbecken entnommen und in aufeinanderfolgenden Portionen 2 Minuten lang in ein Bad von natürlichem Meersalz mit 53 g/l gebracht. Nach diesem osmotischen Schock wurden sie in ein Behandlungsbad gebracht, das zuvor durch Verdünnen des inaktivierten Viruspräparats auf eine Badkonzentration entsprechend 1500 UFP/ml hergestellt worden war. Im Bad wurde eine Sauerstoffdiffusion sichergestellt

Die kleinen Forellen wurden in diesem Bad 1 Stunde lang gehalten und dann wieder in ein Fischzuchtbecken mit natürlicher Ernährung und einer Temperatur von 14^CC zurückgebracht Nach 4 Monaten lag die Zahl der toten Fische unter 1200, was einer üblichen Mortalität von 3% entspricht Bei einer Vergieichsgruppe von 20 000 nichtbehandelten kleinen Forellen lag die Zahl der Todesfälle nach 4 Monaten bei 15 000. Die Differenz erklärt sich durch die Empfindlichkeit der nichtbehandelten Fische gegenüber einer natürlichen Reinfektion mit VHS.

Bei einem weiteren Versuch wurde Fischbrut von 0,1 g behandelt, indem die »Setzlinge« eine Stunde lang in ein Wasserbad von 10⁰C getaucht wurden, das das inaktivierte Viruspräparat in einer Konzentration von 000 UFP/ml enthielt (erhalten durch Zugabe von 10 ml Präparat zu 1001 Wasser). Der osmotische Schock wurde vorangehend wie vorstehend angegeben durchgeführt. Die Setzlinge bzw. Brut wurden dann einen Monat lang in VHS-freiem Milieu gehalten und danach in eine nichtisolierte Fischzucht gebracht. Bei 18Grup- > pen von je 33 000 Setzlingen lag die Mortalität nach 1,5 Monaten bei 4% für die behandelten Fische gegenüber 70% bei den nichtbehandelten Vergleichsfischen.

Bei einem dritten Versuch wurden 40 000 Setzlinge

in wie vorstehend unter Anwendung eines Bades mit 20 ml des Präparats mit 4 · 10⁸ UFP/ml pro 100 ml Wasser behandelt. Sie wurden dann in eine Fischzucht mit nicht desinfizierter Speisung überführt. Eine zufällige Verseuchung mit VHS 3 Monate danach führte zu einem

r. raschen Tod aller nichtbehandelten Fische, während die Mortalität bei den behandelten Tieren normal bei 4% blieb.

Beispiel 2

jii Der bereits erwähnte, beim Institut Pasteur unter der Nr. i-041 hinterlegte Stamm He wurde einer vom EF¹C (Epithelium Papulosum Cyprini) stammenden Zellkultur eingeimpft. Diese von Zellen der Karpfenhaut stammende Zellkultur wurde am 10.1.1978 unter der

>■-, Nr. i-039 bei der Collection Nationale beim Institut Pasteur vom INRA hinterlegt. Der virulente Stamm befand sich bei der 15. Übertragung in von der vom EPC stammenden Zellkultur. Die Impfung erfolgte mit geringer Infektionsvervielfältigung, d.h. insbesondere

«ι mit etwa 2 ■ 10~³ UFP/Zelle, unter Anwendung von 20 ml auf 7 ■ 10³ UFP/ml verdünntem Virus für eine Zellausbreitung von 70 · 10⁶ Zellen. Die Kultur wurde bei 14"C in Stoker-Milieu (modifiziertem Eagle-Milieu mit doppeltem Gehalt an Aminosäuren und Vitaminen)

j-, fortgeführt, das mit 0,16 M TRIS-Puffer auf pH 7,6 gepuffert und mit 2% Rinderembryoserum versetzt worden war. Die Kultivierung dauerte 3 Tage bis zur vollständigen Zerstörung der Zellen.

Die überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt und durch 10 Minuten Zentrifugieren mit 4000 g geklärt. Der Gehalt des Präparats wurde nach der erwähnten Ansatzmethode ermittelt, wie sie im bereits erwähnten Aufsatz von P. de Kinkelin und R. Scherrer beschrieben ist, jedoch unter Ersatz der FHM-Folgezellen durch die

4Ί EPC-Folgezellen wie in Beispiel 1. Es ergab sich ein Gehakvon2 - 10" U KP/ml Flüssigkeit

Zur virushaltigen überstehenden Flüssigkeit wurde dann 8-Propiolacton in einer Endkonzentration von 0,066 Gew.-% (Vbooo). bezogen auf das Gewicht der

vi Virussuspension, hinzugefügt. Die Mischung wurde unter beständigem Rühren bei +20⁰C gehalten. Nach 3 Tagen 0-Propiolacioneinwirkung war die Inaktivierung vollständig. Das überschüssige Inaktivierungsmittel zersetzte sich ohne weitere Einwirkung durch Hydrolyse.

Von 251 des so erhaltenen inaktivierten Viruspräpa rats wurde eine Probe von 10 ml entnommen und für die Impfung von 10 Schalen mit 75 cm² Zellkultur mit Abstammung vom EPC mit je 1 ml der Probe benutzt Nach 8 Tagen wurde unter Feststellung eines Fehlens von cytopathogener Wirkung eine Blindübertragung ausgehend von jeder Schale vorgenommen. Es ergab sich keinerlei Zellzerstörung durch das Präparat Das Prüfmilieu wurde durch Stoker-Milieu von pH 7,6 versetzt mit 2% Rinderembryoserum bei einer Temperatur von 14° C gebildet

Während so die Unschädlichkeit des inaktivierten Viruspräparats an einer Probe nachgewiesen wurde,

wurde zum Präparat selbst nach der Hinzufügung des /i-Propiolactons Formaldehyd in einer Endkonzentration von V2000 (0,02% Formaldehyd im erhaltenen Präparat) zugesetzt. Nach 3 Tagen Einwirkung wurde der so erhaltene Impfstoff eingefroren. >

Beispiel 3

Als Virus wurde der VHS-Virustyp 1 als Produkt der vierten Übertragung auf eine EPC-Zellkultur verwendet.

Genauer gesagt wurde der zum dänischen Stamm Fi sowohl beim Identifizierungsversuch durch Sero-neutralisation als auch hinsichtlich der Eigenschaften homologe Stamm 07-71 angewandt, wie er unter der Nr. i-040 beim Institut Pasteur hinterlegt ist. Davon i> ausgehend wurde ein Anti-Impfstoff wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.

Die Versuche zur serologischen Identifizierung wurden in an sich bekannter Weise durchgeführt. Die Seren wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit .¹H dem durch Carbowachs konzentrierten Virus erhalten, der durch wiederholte Injektionen von 10⁹UFP zunächst intramuskulär mit Freund'schem Adjuvans und dann 2 Wochen danach intravenös verabreicht wurde. Die Bezugsviren wurden verdünnt, mit 0,45 μ Porenöffnung filtriert, einer Gehaltsbestimmung unterzogen und dann in Stickstoff eingefroren. Die zu identifizierenden Stämme wurden ebenso behandelt mit Ausnahme der Einfrierbehandlung. Die Sero-neutralisation erfolgt nach der Technik der Verminderung der Zahl der ;> Ansätze bzw. Inseln um 50% (unter Bezugnahme auf den Aufsatz von CASALS J., Methods of Virology. Maramoresch und Koprewsky, Academic Press, New York, 1967, 3) unter Vergleich des neutralisierenden Gehalts eines Serums für seinen homologen Virus , (Bezugsvirus) mit demjenigen, den es für den zu identifizierenden Virus hat.

Anwendung

Der gemäß Beispiel 3 hergestellte Impfstoff wurde an ■»■ Fischbrut bzw. Setzlinge von 0,6 g durch intraperitonca-Ie Injektion nach Anästhesie in Einzeldosen von 4 · 10·" UFP inaktivierten Viren verabreicht.

Nach 75 Tagen erfolgte die Überprüfung der Wirksamkeit des Schutzes durch Vergleich von · Gruppen impfstoffbehandelter Fische mit nichtbehandelten Vergleichstieren während eines längeren Kontakts der Fische (3 Stunden) mit einer wäßrigen Virussuspension mit einem Gehalt zwischen 10⁴ und 10⁵ UFP/ml. Die Tiere wurden entweder in Schwimm- »· käfigen in ein und denselben Behälter gebracht oder in hintereinander geschaltete Aquarien, wobei die Vergieichstiefe in Zuströmrichtung ais erste angeordnet wurden. Auf diese Weise wurde eine beständige Verseuchung durch die Vergleichstiere sichergestellt ■ unter Simulierung natürlicher Bedingungen.

Bei diesem Versuch wurde lediglich eine Mortalität von 10% bei den impfstoffbehandelten Fischen gegenüber 60% bei den Vergleichstieren festgestellt.

Bei einem weiteren Versuch wurde der gleiche w Impfstoff Setzlingen bzw. Fischbrut von 03 g verabreicht, die 2 Minuten lang in eine 5,35%ige wäßrige NaCl-Lösung getaucht und dann 3 Stunden lang in einem Bad von 10° C mit 10⁶UFPZmI inaktiviertem Virus gehalten wurden. Eine Wiederholung wurde unter den gleichen Bedingungen am 40. Tag vorgenommen. Am 75. Tag erfolgte die Kontrolle der Schutzwirkung wie oben. Die Mortalität lag bei den impfstoffbehandelten Fischen bei '4% gegenüber 62% bei den Vergleichstieren.

Anwendung

In einem VHS-freien Milieu wurde der Impfstoff von Beispiel 3 (hergestellt ausgehend vom Stamm 07-71 gemäß der Präparationsweise von Beispiel 2) 30 000 Setzlingen von 0,6 g verabreicht, und zwar durch 2 Minuten Eintauchen in eine NaCl-Lösung von 53 g/l und dann 1,5 Stunden in ein impfstoffhaltiges Bad mit 10⁵ UFP/ml inaktivierten Viren. Die Badmenge betrug 2,51 pro 1 kg Fisch. Darin wurde beständig eine Sauerstoffdiffusion aufrechterhalten. Die Temperatur betrug 10⁰C. Der pH-Wert lag zu Beginn bei 7,4 und sank bis auf 6,9 am Ende der Behandlung ab.

Die Fische wurden einen Monat lang in unversehrtem Milieu belassen, einer Wiederholung der Impfstoffbehandlung unterworfen und dann erneut 2 Monate lang in unversehrtem Milieu gehalten.

Nach dieser Zeit wurden sie in eine Fischzucht in VHS-verseuchtem Milieu gebracht. Die 2 Monate danach ermittelte Mortalität lag bei 5% für die impfstoffbehandelten Fische gegenüber 66% bei den nicht mit Impfstoff behandelten Vergleichstieren.

Anwendung

Gruppen von je 80 Forellen mit einem Gewicht von 6 g wurden nach >:inem dreitägigen Nahrungsentzug unter Anwendung eines gemäß Beispiel 3 hergestellten Impfstoffs wie folgt behandelt:

Gruppe 1:

Vergleichstiere Osmotischer Schock durch 2 Minuten Eintauchen in ein NaCl-Bad mit 53 g/l bei einer Wassertemperatur von 11.5⁼C; pH: 7.1.

Gruppen 2 und 3:

Anästhesie der Fische durch Zugabe eines im Hände! als MS 222 bezeichneten Produkts der Firma Sandoz zu ihrem Wasser in einer Dosis von 0.2 g pro 4 1 Wasser. Intraperitoneale Verabreichung des Impfstoffs in einer Einzeldosis von 0,1 ml entsprechend 1 bis 2 ■ 10^; UFP inaktivierten Viren. Einbringen der behandelten Tiere in frisches Wasser von 11.5°C:pH:7.1.

Gruppe 4:

Verabreichung des Impfstoffes durch 1.5 Stunden Eintauchen der Fische in ein mit Impfstoff in einer Dosis entsprechend 3 bis 6 · 10' UFP inaktivierten Viren pro ml Wasser versetztes Wasserbad von 1200 ml. Zwischen Anfang und Ende des Versuchs veränderte sich die Badtemperatur von iö⁼C auf 8" C und der pH-Wert von 7.1 auf 7,8.

Gruppe 5:

Osmotischer Schock durch 2 Minuten Eintauchen in ein NaCI-Bad von 53 g/I. Danach Verabreichung des Impfstoffs unter den gleichen Bedingungen wie bei der Gruppe 4. Die Fische wurden in eine dem Dreifachen ihres Gewichts entsprechende Wassermenge getaucht

Nach 2 Wochen wurden die verschiedenen Gruppen erneut jeweils der gleichen Behandlung unterworfen, was für die Gruppen 2 bis 5 einer Impfwiederholung entsprach.

20 Tage später wurden die verschiedenen Gruppen

einer Resistenzprüfung unterzogen, die darin bestand, die Tiere 3 Stunden lang in ein Bad mit virulenten Viren vom Stamm 07-71 in einer Dosis von 10⁵ UFP/ml zu tauchen. Die Vergleichstiere der Gruppe 1 wurden dem parallelen Speisewasserstrom für die Bäder der Gruppen 2 bis 5 vorgeschaltet, wodurch sichergestellt wurde, daß die mit Impfstoff behandelten Fische zumindest ebenso viel wie die Vergleichstiere den Verseuchungsrisiken ausgesetzt wurden.

Die Mortalitäten in jeiler Gruppe wurden vor und nach dieser Infektion <rmittelt. Jede verdächtigte Mortalität vor der lnfek'ion war Gegenstand einer virologischen Diagnostik. Der Grund der Todesfälle nach der Experimentalinfektion wurde durch Ermittlung der Anwesenheit der Viren in den Organen der Fische festgestellt.

Die Ergebnisse bestätigen die Wirksamkeit der Impfbehandlung: Der Mortalitätsanteil bei den impfstoffbehandelten Fischen war einen Monat nach der Infektion stets um wenigstens 30% niedriger als der bei den Vergleichstieren beobachtete Mortalitätsanteil.

Beispiel 4

Der Rhabdovirus 23-75 wurde im INRA bei der Bachforelle (Trutta fario) isoliert und erwies sich als sowohl für die Regenbogenforelle als auch für die Bachforelle pathogen. Der Stamm wurde mit seiner fünften Übertragung in EPC-Zellkultur beim Institut Pasteur (als Nr. i-039, wie bereits beschrieben) hinterlegt.

In vitro vermehrt sich der Virus 23-75 wie der Egtved-Virus vom Serotyp 1 (wie der Stamm 07-71). Seine Eigenschaften wurden von P. de Kinkelin und M. Le Berre 1977 in dem Aufsatz über »Isolierung eines für die Bachforelle pathogenen Rhabdovirus«, C. R. Acad. Sei. Paris, 284, Serie D, 101-104 und von P. de Kinkelin, A.M. Baudony und M. Le Berre 1977 im Aufsatz »Reaktion der Bachforelle (Salmotrutta L. 1766) und Regenbogenforelle (Salmo gairdneri, Richardson, 1836) auf die Infektion durch einen neuen Rhabdovirus«, C. R. Acad. Sei. Paris, 284, Serie D, 401 -404, beschrieben.

Eine virulente Impfmenge dieses Stammes (verdünnt auf eine lnfektionsverv'elfältigung von 10~³ UFP/Zelle) wurde einer 24 Stunden alten EPC-KuItur eingeimpft. Dabei wurden die Infektionsvervielfältigung wie bei den anderen Beispielen und entsprechend den Angaben in den Annales de Recherches Veterinaires (INRA) 1970,1, S. 19 in Kultur auf Zellen mit EPC-Abstammung gemessen.

Nach einer Absorptionszeit von 2 Stunden bei 18°C wurde ein Kulturmilieu hinzugegeben, und zwar Stoker-Milieu ergänzt durch 2% Rinderembryoserum. Die Inkubation erfolgte dann 3 Tage lang bei 14°C, nach welcher Zeit die Zerstörung des Zellteppichs normalerweise vollständig ist

Nach 15 Minuten Zentrifugieren mit 3000 g wurde die infektiöse überstehende Flüssigkeit gesammelt, auf eine Temperatur zwischen 18 und 22⁰C gebracht und mit /J-Propiolacton in einer Endverdünnung von 0,025 Gew.-% (1 pro 4000) und 0,066 Gew.-% (1 pro 6000) versetzt

Nach 2 bis 3 Stunden Rühren wurde die Inaktivierung 2 Tage lang bei der genannten Temperatur durchgeführt Danach wurden 2 ml pro Liter Präparat entnommen, die für eine Unschädlichkeitskontrolle am Tage nach dieser Entnahme oder 3 Tage nach der Inaktivierung verwendet wurden.
Sogleich nach der Entnahme für die Unschädlich-

-, keitskontrolle wurde die Suspension mit Formaldehyd in einer Endverdünnung zwischen 1 pro 1000 und 1 pro 3000 versetzt. Nach 24 Stunden Behandlung mit Formaldehyd wurde das Impfstoffpräparat in Volumina von 100 ml aufgeteilt und auf -20°C bis Erhalt des

in Unschädlichkeitsergebnisses eingefroren. Es konnte dann in Gebrauch genommen werden.

Für die Unschädlichkeitsprüfung wurden Fläschchen oder Behälter von 25 cm² EPC-Zellkultur mit einem Alter von 24 Stunden mit je 0,5 ml Impfstoffpräparat

ι--, pro Fläschchen oder Behälter, und zwar 4 Fläschchen pro Liter geimpft. Die dafür ausgenutzte Impfstoffentnahme enthielt keinen Formaldehyd, der die Zellen zerstört haben würde und so den Nachweis der Anwesenheit bzw. Abwesenheit von virulenten Viren

2(i unmöglich gemacht hatte.

Wenn nach einer Woche keinerlei cytopathogene Wirkung aufgetreten war (Infektionsvervielfältigung unter 1 UFP/ml), wurde eine erneute Impfung ausgehend von den überstehenden Flüssigkeiten des vorange-

7-, henden Impfmaterials vorgenommen und das Fehlen eines cytopathogenen Effekts bei dieser zweiten Übertragung kontrolliert.

Anwendung

to Für die Impfstoffbehandlung der Forellen wurde ein gemischter Impfstoff von VHS-Viren vom Stamm 07-71 und vom Virus 23-75 verwendet, der durch Mischen gleicher Teile der gemäß Beispiel 3 und 4 hergestellten Impfstoffe und Verdünnen auf eine Konzentration

j5 entsprechend 2 - 10⁸ UFP/ml für jeden Stamm erhalten wurde.

Der Impfstoff wurde in Einzeldosen von 0,1 ml Setzlingen von 0,5 g intraperitoneal injiziert mit einer Wiederholung 3 Wochen nach der ersten Dosis. Nach 76 Tagen wurden die Fische in ein entweder mit VHS-Virus vom Serotyp I (Stamm 07-71) F, oder mit dem Virus 23-75 verseuchtes Milieu (infiziert mit 10⁵ UFP/ml) gleichzeitig mit nicht mit Impfstoff behandelten Vergleichstieren gebracht.

Einen Monat nach der Infektion (106 Tage nach der ersten Impfbehandlung) verteilte sich die Mortalität durch VHS in folgender Weise:

Infektion mit VHS I:
Vergleichstiere:

18 tote Fische von 30 Fischen;
Tiere mit Impfbehandlung:
3 tote Fische von 28 Fischen;

Infektion mit Virus 23:

Vergleichstiere:

37 tote Fische von 44 Fischen;
Tiere mit Impfbehandlung:
6 tote Fische von 23 Fischen.

Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit des gemischten Impfstoffs zur Immunisierung von Forellen gegenüber den beiden vereinigten Viren.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen virale hämorrhagische Sepsis (VHS) von Forellen, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) mindestens einen VHS- bzw. Egtved-Virus vom Serotyp I oder II, ausgewählt unter den Viren vom Stamm 07-71 (wie am 10. Januar 1978 beim Institut Pasteur unter der Nr. i-040 hinterlegt), vom Stamm He (wie am 10. Januar 1978 beim Institut Pasteur unter der Nr. i-041 hinterlegt) und vom Stamm 23-75 (wie am 10. Januar 1978 beim Institut Pasteur unter der Nr. i-042 hinterlegt; Hinterlegungen des INRA) in einer Zellkultur von Fischzellen, abstammend vom Epithelium Papulosum Cyprini bzw. Epithelium Papulcsum Caprio (EPC), wie sie am 10. Januar 1978 beim Institut Pasteur unter der Nr. i-039 hinterlegt wurden, oder vom FHM (Fettkopf-Elritze) oder RTG 2 (Regenbogenforellengonaden), in einem Nährmedium auf der Basis eines mit TRIS auf pH-Werte in der Gegend von 7,4 bis 7,6 gepufferten Stoker- bzw. Eagle-Milieus bei einer Temperatur zwischen 10 und 20⁰C erzeugt,

b) daß man das überstehende, virushaltige Material mit einem Gehalt zwischen 10⁴ und 10⁹ UFP/ml (Ansätze bzw. Kolonien bildenden Einheiten pro ml) sammelt und

c) mit /9-Propiolacton in einer Konzentration von 0,01 bis 0,1 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Virussuspension, bei einer Temperatur zwischen 15 und 25° C ausreichend lange inaktiviert,

d) die Unschädlichkeit des inaktivierten Präparates durch Einimpfen einer Probe in eine Zellkultur nachprüft und

e) den so erhaltenen Impfstoff gegebenenfalls schließlich einfriert.