DE2921040C2

DE2921040C2 - Lebendimpfstoff zum Immunisieren von fleischfressenden Tieren gegen Staupe und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE2921040C2
Application number: DE2921040A
Authority: DE
Inventors: Otar Georgievi&ccaron; Andshaparidze; Evelina Georgievna Birjukova; Evgenij Pavlovi&ccaron; Danilov; Viktor Matveevi&ccaron; Dorofeev; Vera Iosifovna Moskva Geller; Oleg Anatoljevi&ccaron; Metelkin
Original assignee: MOSKOVSKIJ NAUCNO-ISSLEDOVATEL'SKIJ INSTITUT VIRUSNYCH PREPARATOV MOSKVA SU; NAUCNO-ISSLEDOVATEL'SKIJ INSTITUT PUSNOGO ZVEROVODSTVA I KROLIKOVODSTVA RAMENSKIJ RAJON MOSKOVSKAJA OBLAST' SU
Current assignee: MOSKOVSKIJ NAUCNO-ISSLEDOVATEL'SKIJ INSTITUT VIRUSNYCH PREPARATOV MOSKVA SU; NAUCNO-ISSLEDOVATEL'SKIJ INSTITUT PUSNOGO ZVEROVODSTVA I KROLIKOVODSTVA RAMENSKIJ RAJON MOSKOVSKAJA OBLAST' SU
Priority date: 1979-05-23
Filing date: 1979-05-23
Publication date: 1984-09-27
Also published as: DE2921040A1

Description

a) durch 20 bis 40 Passagen auf der Zellkultur der Hundenieren bei 37 (± 1)° C,

b) durch 5 bis 15 Passagen auf der umimpfbaren Kultur der Nierenzellen des menschlichen Embryos/?Abei32(± IfC und

c) durch 2 bis 7 Passagen auf der gemischten Kultur, die aus den Zellen der Hundenieren und den Zellen der Embryonen der japanischen Wachteln besteht, bei 35 (± I)⁰C mit darauffolgender Adaption während 4 bis 10 Passagen zur Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln erhalten worden ist und man dann den adaptierten Virus in der Zellkultur weiterzüchter. und konfektioniert

2. Verfahren zum Herstellen des Lebendimpfstoffes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen attenuierten Staupevirus einsetzt, der aus dem Blut des staupekranken Nerzes isoliert worden ist und der

a) durch 20 bis 40 Passagen auf der Zellkultur der Hundenieren bei37 (± I)⁰C,

b) durch 5 bis 15 Passagen auf der umimpfbaren Kultur der Nierenzellen des menschlichen Embryos Rh bei 32 (± I)° C und

c) durch 2 bis 7 Passagen auf der gemischten Kultur, die aus den Zellen der Hundenieren und den Zellen der Embryonen der japanischen Wachteln besteht, bei 35 (± I)⁰C mit darauffolgender Adaption während 4 bis 10 Passagen zur Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln erhalten worden ist und man dann den adaptierten Virus in der Zellkultur weiterzüchtct und konfektioniert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Sammlung der virushaltigen Flüssigkeit nach dem Nachweis der cytopathisehen Viruswirkung in 20 bis 40% der Zellen der japanischen Wachteln unternimmt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die gesammelte virushaltige Flüssigkeit in Gegenwart von 4,5 bis 5,5 Gew.-% Sorbit und 1,4 bis 1,6 Gew.-% Gelatine Iyophilisiert.

60

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Veterinärmedizin, insbesondere auf einen Lebendimpfstoff zum Immunisieren von fleischfressenden Tieren gegen die Staupe und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Die Staupe von fleischfressenden Tieren ist eine akute kontagiöse Erkrankung von Pelztieren und Hunden. Besonders empfindlich gegen diese Infektionserkrankung sind Jungtiere von Nerzen. Silberschwarzfüchsen und Blaufüchsen. Wegen der hohen Letalität und des Fehlens von wirksamen Therapeutika führt die Erkrankung zu bedeutenden ökonomischen Schaden der Tierzuchtbetriebe.

Zur Zeit wird zur Staupeprophylaxe von fleischfressenden Tieren eine Reihe von lebendigen Virusimpfstoffen angewandt, die gemilderte zu Kulturen der Nierenzellen der Hunde oder der Affen oder zu Hühnerembryonen adaptierte Staupevirusstämme enthalten.

Die Impfstoffe, die den attenuierten Staupevirusstamm »Rockborn« enthält, der aus dem wilden, aus dem Blut kranker Hunde isolierten Virus erhalten wurde, wird auf der Zellkultur von Hundenieren bereitgestellt Zur Herstellung solch eines Impfstoffes wird der genannte Virusstamm zur Zellkultur der H^-idenieren durch mehrmalige Passagen (über 50) adaptiert und auf der genannten Zellkultur in der Hanks'schen Lösung, die 0,5% Laktalbuminhydrolysat und 10% Pferdeblutserum oder 20% Kalbblutserum enthält oder im Earleschen Medium, das 03% Laktalbuminhydrolysat und 2% Pferde- oder Kalbblutserum enthält gezüchtet Die Adaptationstemperatur wird im Bereich von 30 bis 37°C, vorzugsweise von 35 bis 37° C konstantgehalten. Der erhaltene Impfstoff wird stabilisiert und lyophilisiert(US-PS30 98 011).

Es ist auch ein Impfstoff gegen Staupe bekannt, der aus dem Virus erhalten wurde, welcher 10 Passagen auf der Zellkultur von Hundenieren im Earleschen Medium durchgemacht hat, das 5% Laktalbuminhydrolysat und 5% Pferdeblutserum bei einer Temperatur von 38,5° C enthält (US-PS 33 54 038).

Die genannten Impfstoffe besitzen eine hohe immunogene Wirksamkeit, haben jedoch eine Reihe von Nachteilen. Einer der Nachteile besteht in der niedrigen Reproduktionsfähigkeit des Virus in der Zellkultur von Hundenieren.

Ein anderer Nachteil der genannten Impfstoffe besteht in der Verwendung der Zellkultur von Hundenieren als Substrat für die Virusabschwächung und Bereitstellung der Impfstoffe. Die Hundenieren können jedoch durch fremde Viren verunreinigt sein. Um die Infizierung der Hunde auszuschließen, ist es notwendig, eine spezielle Tierzuchtfarm zu schaffen, auf welcher sich die Tiere unter streng kontrollierbaren Bedingungen befinden. Dies erfordert allerdings große Kosten.

Der nächste Nachteil der bekannten Impfstoffe besteht in der Schwierigkeit, ihre biologische Wirksamkeit zu bestimmen, weil die Virusreproduktion durch eine unde Jtlich ausgeprägte cytopathogene Wirkung begleitet wird, die sich bis zum 20. Tag nach der Infizierung äußert, wo unspezifische degenerative Veränderungen der Zellen auftreten können, welche die Einschätzung der Ergebnisse erschweren.

Noch ein weiterer Nachteil der genannten auf der Zellkultur von Hundenieren bereitgestellten Impfstoffe besteht im langsamen Wachstum dieser Zellen (die Monoschicht der Zellen wird nur am 5. bis 7. Tag geformt), was den technologischen Herstellungsprozeß der Impfstoffe verlängert.

Die Virusimpfstoffe zur Bekämpfung der Staupe von fleischfressenden Tieren, die durch die Züchtung des Virusstammes auf der Zellkultur von 9 Tage alten Hühnerembryonen oder auf Chorioallantoishüllen der Hühnerembryonen erhalten werden, können infolge einer hohen Verunreinigung der Hühnerembryonen mit frem-

den Viren, insbesondere mit Viren der Leukose-Sarkomatose-Gmppe, gefährlich sein (US-PS'en 29 12 361. 29 65 544).

Den genannten Nachteil besitzen auch die Impfstoffe, die in der Zellkultur von Hühnerembryonen aus dem Stamm bereitgestellt wurde, der unter der Benennung K-F 668 (UdSSR) bekannt ist

Der amerikanische Impfstoff, der als Impfstoff ASL bekannt ist, ist unschädlich und besitzt den genannten Nachteil nicht, weil er in der Zellkultur von leukosefreien Hühnerembryonen erhalten wird. Jedoch sind für die Züchtung der leukosefreien Hühner spezielle Geflügelzuchtfarmen notwendig, deren Schaffung und Haltung kompliziert und recht kostspielig ist. Außerdem ergibt der Virusstamm keine regelmäßige cytopathische Wirkung in der Zellkultur von Hühnerembryonen, was die Herstellungstechnologie der Impfstoffe erschwert.

Es ist auch ein Virusimpfstoff gegen die Staupe bekannt, der durch Züchtung des Staupevirus auf der Kultur von Nierenzellen von grünen Affen erhalten wird (US-PS 40 04 974). Dieser Impfstoff ist recht immunogen, areaktogen, unschädlich und entspricht den höchsten Standarden.

Jedoch wird zur Zeit das Affenesnfangen in vielen Ländern wegen der Verminderung des Tierbestandes begrenzt. Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß die genannten Impfstoffe die Verwertung der Abfälle von der Produktion der Poliomyelitisimpfstoffe vorsieht, die für den Menschen bestimmt ist, und mit dieser Produktion unmittelbar verbunden ist, ist es leicht zu begreifen, daß die Schaffung einer speziellen Produktion der Staupeimpfstoffe, gegründet auf der Zellkultur von Affennieren, kostspielig und unzweckmäßig ist.

Auf diese Weise ist die Auswahl des Zellsubstrats für die Bereitstellung der Virusimptsioffe kompliziert. Die obligatorische Bedingung ist das Fehlen der Verunreinigungen des Zellsubstrats mit fremden Viren sowie die Möglichkeit, den Impfstoffvirus in ausreichender Menge zu erhalten.

Aus der DE-AS 12 35 505 ist schon ein Lebendimpfstoff gegen Staupe bekannt, wobei man den Staupevirus durch heterologe Adaptierung auf Zellkulturen attenuiert.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Lebendimpfstoffes gegen die Staupe bei fleischfressenden Tieren, der eine hohe Immunogenität, Areaktogenität, Unschädlichkeit besitzt, keine fremden Viren enthält und dabei von niedrigen Selbstkosten ist.

In Übereinstimmung mit der genannten Aufgabe wurde ein Verfahren zur Herstellung eines Lebendimpfstoffes unter Verwendung eines neuen Staupevirusstammes entwickelt, der fähig ist, auf einem unschädlichen und zugänglichen Substrat gezüchtet zu werden, und gestattet, den Impfstoff mit einer hohen Immunogenität, Antigenität, Unschädlichkeit beim Ausbleiben von fremden Viren zu erhalten.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt wie aus den vorstehenden Ansprüchen ersichtlich. Gegenstand der Erfindung ist also ein Lebendimpfstoff gegen Staupe bei fleischfressenden Tieren, der den attenuierten Stamm EQM des Staupevirus enthält, der unter Nummer 10-76 im Staatlichen Allunions-Forschungsinstitut für Veterinäre Präparate des Ministeriums für Landwirtschaft der UdSSR hinterlegt worden ist und aus dem wilden, aus dem Blut staupekranker Nerze isolierten Virus durch mehrmalige Passagen der Reihe nach auf folgenden Zellkulturen erhalten wurde:

1) auf der Zellkultur der Hundenieren,

2) auf der umimpfbaren Kultur von Nierenzellen des menschlichen Embryos Rh;

3) auf einer gemischten Zellkultur, die aus den Zellen von Hundenieren und Zellen von Embryonen der japanischen Wachteln besteht, zur Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln adaptiert und auf dieser Kultur gezüchtet wurde.

ίο Der genannte attenuierte Virusstamm, der für die Bereitstellung des Staupeimpfstoffes verwendet wird, wurde als Stamm EQM (Embryo Quail Moscow) benannt.
Der Stamm EQM des Staupevirus wurde

)5 a) aus dem wilden, aus dem Blut staupekranker Nerze isolierten Virus durch 20 bis 40 Passagen auf der Zellkultur von Hundenieren bei einer Temperatur von37(±1)°C

b) durch 5 bis 15 Passagen auf der Kultur der Nicrenzellen des menschlichen Embryos Rh bei einer Temperatur von 32 (± I)⁰C und

c) durch 2 bis 7 Passagen auf der gemischten Kultur, die aus den Zellen von Hundenieren und den Zellen von Embryonen der japanischen Wachteln besteht, bei einer Temperatur von 35 (± I)⁰C mit darauffolgender Adaption während 4 bis 10 Passagen auf der Zellkultur von Embryonen der japanischen Wachteln (Coturnix yaponica) erhalten.

Zum Erhalt des Impfstoffes wird der genannte Stamm auf der Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln im geeigneten Nährmedium, beispielsweise im Medium 199 oder im Earleschen Medium unter Zugabe von 10% Rindviehblutserum gezüchtet. Die erste Portion der virushaltigen Flüssigkeit wird nach dem Nachweis der cytopathischen Viruswirkung in 20 bis 40% der Zellen gesammelt. Die gesammelte virushaltige Flüssigkeit wird in Gegenwart eines geeigneten Stabilisators, z. B. in Gegenwart von 4,5 bis 5.5% Sorbit und 1,4 bis 1,6% Gelatine, lyophilisiert

Der Impfstoffstamm EQM 10-76 ist hoch attenuiert, vermehrt sich gut in der Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln mit einer deutlich ausgeprägten cytopathischen Wirkung, was die Impfstoffherstellung bedeutend vereinfacht. Der genannte Stamm besitzt eine gute Stabilität.

Der erfindungsgemäße Lebendimpfstoff hat folgende Vorteile:

a) Er ist unschädlich, besitzt keine toxische Wirkung, wird in der Zellkultur von Embryonen der japanischen Wachteln hergestellt, die ein billiger und zugänglicher Rohstoff darstellt, der auf das Fehlen fremder Viren zuverlässig kontrolliert werden kann.

Die japanischen Wachteln sind von Natur aus gegen Viren der Leukose-Sarkomatose-Gruppe unempfindlich und deswegen stellt die Zellkultur aus ihren Embryonen das optimale Substrat zur Herstellung der Lebendimpfstoffe dar.

b) Die Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln besitzt eine hohe ProÜferationswirksamkeit, was gestattet, die Zellsuspension zu infizieren, ohne die Formung der Zeilmonoschicht zu erwarten.

c) Der Impfstoff besitzt eine hohe antigene Wirksamkeit, induziert bei geimpften Tieren eine gespannte und langwierige Immunität. Die Anwendung des

Impfstoffes in den Herden der Staupeepizootie von fleischfressenden Tieren liquidiert schnell den Infektionsherd.

d) Der Impfstoff kann nicht nur parenteral, sondern auch in Aerosolform angewandt werden, was die Durchführung der Impfprophylaxe bedeutend erleichtert und verbilligt.

e) Da der Impfstoff hochwirksam ist, ist es möglich, ein Handelspräparat herzustellen, das einen breiten Dosisintervall von 1 bis 500 in einer Ampulle oder Flasche enthält, was große Bequemlichkeiten bei der individuellen und Massenanwendung der Impfrtoffe bietet

Die genannten und andere Vorteile sind aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der Impfstoffe, des Verfahrens zu deren Herstellung und Anwendung zu ersehen.

Der Herstellung des Lebendviruskulturimpfstoffes liegt das System des Impfvirus zugrunde. Das System des Impfvirus sieht im großen Umfang die Herstellung des impfstoffvirus, der aiien Forderungen des attenuierten Stammes entspricht, dessen Aufbewahrung im eingefrorenen Zustand und dessen Verwendung nach Notwendigkeit zur Herstellung der Impfstoffe vor.

Wie oben gezeigt wurde, wird zur Herstellung des erfindungsgemäßen Impfstoffes der attenuierte Stamm EQM 10-76 benutzt. Der genannte Stamm wurde, wie oben erwähnt, erhalten. Der erhaltene Virusstamm wird nach der Methode der Maximalverdünnungen in der Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln kloniert. Im Ergebnis gewinnt der Virusstamm eine deutlich ausgeprägte cytopathische Wirksamkeit, die gestattet, die Impfstoffherstellung zu kontrollieren, die Sammlung der Virusportionen in optimalen Fristen durchzuführen, die Bestimmung der Infektionswirksamkeit des Virus bedeutend zu vereinfachen und außerdem die Virusspezifik in der Zellkultur zu bestimmen und die Antikörper im Blutserum geimpfter Tiere nachzuweisen. Der erhaltene Virusstamm wird durch folgende Merkmale gekennzeichnet:

1) Durch die Spezifik in der Neutralisationsreaktion in der Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln,

2) durch die Unschädlichkeit für die Labortiere: Mäuse, Meerschweinchen, Kaninchen, Hühnerembryonen sowie für Nerze und Füchse;

3) durch die Infektionswirksamkeit in der Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln;

4) durch die antigene Wirksamkeit;

5) durch die immunogene Wirksamkeit (in der Neutralis^tionsreaktion an Tieren und in der Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln);

6) durch das Ausbleiben der verunreinigenden Viren;

7) durch die bakterielle Sterilität, durch das Fehlen der Mykoplasmen PPIO;

8) durch die Stabilität bei der Aufbewahrung;

9) durch das Fehlen der Kontagiosität.

Aus dem EQM Virusstamm, der die oben aufgezählten Merkmale besitzt, wird der Impfvirus auf der Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln erhalten. Der Impfvirus muß analog mit dem genannten Stamm alle Qualitätscharakteristiken haben. Der Impfvirus wird im eingefrorener. Zustand bei einer Temperatur von höchstens — 20⁰C aufbewahrt und nach Bedarf eingesetzt.

Zur Herstellung der Impfstoffe wird die irypsinisierte Kultur der Gewebezellen der Embryonen der japanischen Wachteln verwendet Dazu wird das Gewebe der 9 bis 10 Tage alten Embryonen der japanischen Wachteln zerkleinert und in üblicher Weise trypsinisiert. Die erhaltene Zeilsuspension wird mit dem Impfvirus infiziert und das geeignete Nährmedium hinzugegeben. Als Nährmedium können bekannte Medien verwendet werden, die zur Züchtung von Zellen und Viren angewandt

ίο werden, beipielsweise das Medium 199, das 10% Rindviehblutserum enthält, bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5. Die infizierte Zellkultur wird unter Rollerbedinungen bei einer Temperatur von 35 (± I)⁰C inkubiert Nach der Bildung der Zellmonoschicht und dem Nachweis der cytopathischen Wirksamkeit in 20 bis 40% der Zellen wird die erste Sammlung der virushaltigen Flüssigkeit vorgenommen. Zur Erhöhung der Virussammlungen und zu einer besseren Ausnutzung der Zellkultur wird die mehrmalige Sammlung der virushaltigen Flüssigkeit von einem und demselben Kulturmuster durchgeführt, indem dabei frisches Nährr>?dium hinzugesetzt wit-H^ rjig benannten VOr¹⁷Sn⁰C wsi^ien bis zur vollen Degeneration der Zellkultur wiederholt.
Zum Entzug des intrazellularen Virus wird die ZeIlkultur eingefroren und abgetaut. Die gesammelte virushaltige Flüssigkeit vereinigt man nach der Kontrolle der Sterilität und Infektionsaktivität in einen Behälter, fügt den Stabilisator hinzu, füllt in Flaschen oder Ampullen ab und lyophilisiert Das getrocknete Präparat hat eine Restfeuchtigkeit bis 3%.

Die Tauglichkeitsfrist des lyophilisierten Impfstoffpräparats beträgt mindestens 1 Jahr. Der lyophilisierte Impfstoff wird bei einer Temperatur von höchstens 4° C aufbewahrt. Beim Aufbewahren der Impfstoffe bei einer niedrigeren Temperatur wird die Tauglichkeitsfrist noch für einige Monate verlängert. Vor der Verwendung wird für die Verdünnung der Impfstoffe eine Salzlösung genommen, die auf der Grundlage der Hanks'schen Lösung bereitgestellt wird.

Der erhaltene Impfstoff wird der Kontrolle auf Sterilität, Unschädlichkeit, Spezifik, Ausbleiben der verunreinigenden Viren, Infektionsaktivität, immunogene und antigene Aktivität und Restfeuchtigkeit unterzogen. Danach kann er sowohl für prophylaktisch? Immunisierung der Pelztiere und Hunde, als auch für die therapeutische Anwendung während der ersten Tage nach dem Kontakt mit staupekranken fleischfressenden Tieren eingesetzt werden. Eine Durchschnittsdosis für das Impfen der Tiere muß mindestens 10 ZGD50 (cytopathische Gewebedosiü) enthalten. Die Erhöhung des Virusgehalts bis 100 000 ZGD₅₀ ruft keine unerwünschten Reaktionen bei Tieren hervor.

Die 'mmunisierung der Tiere wird durch die intramuskuläre Einführung von 1,0 ml Impfstoff durchgeführt.

Zur Zuverlässigkeit der Impfung kann man nach 10 bis 14 Tagen serologische Untersuchungen immunisierter Tiere durchführen und die Antikörpertiter in der Neutralisatio<nsreaktion auf der Zellkultur der Embryo· nen der japanischen Wachteln bestimmen, indem als Antigen der genannte Impfstoffstamm verwendet wird, der einen deutlich ausgeprägten cytopathischen Effekt ergibt. Die Antikörper werden bei allen immunisierten Tieren in einem Titer von 1 : 16—32 nachgewiesen. Die maximale Antikörperanreicherung (im Titer 1 :256) hat schon bis zum 30. Ta^ stattgefunden.
Die Antikörper werden im Blut während 18 Beobachtungsmonate aufrechterhalten. Bei der nachfolgenden

Lösung der immunisierten Tiere mit dem Virulenzstamm'Snyder Hill 1, 3, 6, 12 und 18 Monate nach der Immunisierung mit den genannten Impfstoffen wurden keine Erkrankungsfälle festgestellt. Auf diese Weise besitzt der erfindungsgemäßc Impfstoff die 100%ige immunogene und antigene Wirksamkeit.

Der erfindungsgemäße Impfstoff wurde in der Tierzuchtwirtschaft zum Zeitpunkt des Ausbruchs der Staupe unter Silberschwarzfüchsen erprobt. Einen Monat nach der Impfung hörte die Staupe auf, und eine Erkrankung wurde in der nachfolgenden Periode nicht beobachtet. Neben der Fuchszuchtfarm befand sich eine Nerzzuchtfarm. Wegen der hohen Kontagiositat des Staupevirus der fleischfressenden Tiere wurden einzelne Fälle der Nerze-Erkrankung registriert. Die unverzügliche Einführung des erfindungsgemäßen Impfstoffes beugte dem Staupeausbruch unter den Nerzen vor.

Dadurch zeugen die erhaltenen Ergebnisse von der Fähi<jif<>it Acc orfinHpin<rc_n»_msß_e- !noi^iciic-; den ir. der Tierzuchtwirtschaft begonnenen Staupeausbruch während 3 bis 4 Wochen zu liquidieren.

Der erfindungsgemäße Impfstoff kann auch zur Immunisierung der Tiere durch Aerosoleinführung verwendet werden.

Zu diesem Zweck kann der für die Injektion bereitgestellte Impfstoff, d. h. gewöhnliche Handelsimpfstoffserien, verwendet werden. Die Aerosolmethode gestattet, in kurzer Zeit eine große Tiermenge zu immunisieren.

Im Ergebnis der Prüfung der angebotenen Impfstoffe an Tieren während der Prophylaxe wurde festgestellt, daß praktisch in 100% der Fälle Antikörper im hohen Titer gebildet werden, die die Tiere vor Staupeerkrankung völlig schützen. Außerdem war der Impfstoff auch als Mittel zur Liquidation des Erkrankungsherdes effektiv.

Der erfindungsgemäße Impfstoff hat verhältnismäßig niedrige Selbstkosten dank der Verwendung der Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln als Substrat. Im Vergleich zu anderen bekannten Kulturen hat die genannte Kultur folgende Vorteile. Der Hauptvorteil besteht darin, daß die japanischen Wachteln von Natur gegen die Viren der Gruppe der Geflügelleukosen unempfindlich sind und bei deren Infizierung resistent bleiben.

Ein anderer wichtiger Vorteil der Zellkultur besteht darin, daß sie eine hohe Proliferationsaktivität hat und daß die Zellmonoschicht am 1. bis 2. Tag nach der Zellimpfung geformt wird.

Der nächste Vorteil besteht darin, daß die Zellsuspension infiziert werden kann. Das führt zu einer zusätzlichen Verminderung der Dauer der Impfstoffherstellung.

Der Vorteil der Erfindung ist auch die mehrmalige Sammlung der virushaltigen Flüssigkeit, bis 5 Sammlungen von einem Kulturmuster.

Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß die japanischen Wachteln zugänglich und billig sind und die Haltung der Wachteln-Zuchtfarmen keine Schwierigkeiten bietet und keine großen Kosten erfordert, ist es leicht, den kommerziellen Wert der angebotenen Impfstoffe zu verstehen.

Zur Veranschaulichung der Erfindung werden Beispiele angeführt, von denen Beispiel 1 die Herstellung des EQM 10-76 und Lebendkulturimpfstoffe, und Beispiele 2 bis 8 die Impfstoffanwendung an Tieren zeigen.

Beispiel 1
Herstellung des attenuierten unter Nr. 10-76 hinterlegten Stammes EQM des Staupevirus der fleischfressenden Tiere aus dem wilden Virulenzstamm.
In IO Glasröhrchen, die die primäre Zellkultur von Hundenieren enthalten, werden je 0,2 ml des defibrinierten Ί Blutes staupekranker Nerze eingefüllt. Nach dem dreistündigen Kontakt bei Zimmertemperatur wird die Zellkultur mit dem Nährmedium 199 sorgfältig gewaschen, in jedes Glasrohr werden je 1.5 ml frisches Nährmedium 199 mit 10% Rindviehblutserum eingeführt und die ZeII-kulturen werden bei 37°C inkubiert. Dabei wird 1 bis 2mal wöchentlich das Nährmedium gewechselt. 62 Tage nach der Infizierung wird die virushaltige Flüssigkeit aus den Glasröhrchen gesammelt und zur Infizierung einer neuen Portion der Zellkultur von Hundenieren

is verwendet. Dazu werden in jedes der 10 Glasröhrchen, die die neue primäre Zellkultur der Hundenieren enthalten, zu je 0.3 ml der erhaltenen virushaltigen Flüssigkeit und zu je 1 ml Nährmedium 199 unter Zugabe von 10% "indvicnbiüiScrüiTi ciMgciülii; die ZeiikuiiuriMi werden bei 37³C inkubiert.

Für die ersten 10 Passagen dient als Infizierungsstoff die 35 bis 40 Tage nach der Infizierung der vorherigen Kulturen gesammelte virushaltige Flüssigkeit. Für die nächsten 23 Viruspassagen wird die virushaltige Flüssigkeit verwendet, die 15 bis 20 Tage nach der Infizierung gesammelt wird; es wird auch der Virus verwendet, der aus den infizierten Zellen nach deren Einfrieren-Abtauen entzogen vird.

Danach werden nach der ähnlichen Infizierungsmethode 12 Viruspassagen in der umimpfbaren Kultur der Nierenzellen des menschlichen Embryos Rh bei 32°C durchgeführt. Der Stoff für jede nachfolgende Infizierung ist die 15 bis 20 Tage nach der vorigen Infizierung gesammelte virushaltige Flüssigkeit.

Im weiteren wird die Virusattenuierung durch Passieren auf der gemischten Kultur, die aus 2 Mill. Zellen von Hund?nieren und 2 MiIL Ζεϋεη von Embryonen der japanischen Wachteln besteht, bei 35⁰C durchgeführt. In solch einer gemischten Kultur wurden 3 Viruspassagen unternommen. Danach wird der Virus 5 mal in der Zellkultur von Embryonen der japanischen Wachteln bei 35° C unter Rollerbedingungen bei 4 U/min passiert. Von der fünften Passage an rief der Virus regelmäßig die cytopathische Zelldestruktion hervor, die 5 bis 7 Tage nach der Infizierung nachgewiesen wurde. Solch ein Virus wurde durch Maximalverdünnungen in der Zellkultur von Embryonen der japanischen Wachteln kloniert und als Impfstoffstamm verwendet. Der erhaltene attenuierte Stamm, der zu der Zellkultur der Embryonen von japanischen Wachteln adaptiert wurde wird nach folgenden Merkmalen kontrolliert:

1) Auf die Spezifik (Identifizierung) in der Neutralisationsreaktion auf der Zellkultur von Embryonen der japanischen Wachteln;

2) auf die Unschädlichkeit (an Labortieren: Mäusen, Embryonen, Meerschweinchen, Kaninchen sowie Nerzen und Füchsen);

3) auf die Infektionsaktivität in der Zellkultur von Embryonen der japanischen Wachteln;

4) auf die antigene Wirksamkeit;

5) 'aufdieimmunogene Wirksamkeit;

6) auf das Fehlen der verunreinigenden Viren;

7) auf die bakterielle Sterilität; das Fehlen von Mykop'asmen (PPIO);

8) auf die Stabilität des Präparats bei der Aufbewahrung;

9) auf das Fehlen der Kontagiositat

Bereitstellung des Impfvirus und des Impfstoffes.

a) Bereitslellungdes Impfvirus.

Aus dem vie oben beschriebenen erhaltenen Stamm EQM 10-76 wird der Impfvirus erhalten. Dazu werden 9 bis 11 Tage alte Embryonen von japanischen Wachteln genommen, die aus einer kontrollierbaren speziellen Wachtelzuchtfarm gebrashl wurden. 100 Embryonen werden in üblicher Weise trypsinisiert und es werden 3 300 000 000 Zellen erhalten, die in 4.120 1 Nährmedium 199 unter Zugabe von 10% Rindviehblutserum und 100 mg/ml Monomycin suspendiert werden. 300 ml Zellsuspension (Aufschwemmung) werden jeweils zu 150 ml in zwei Flaschen von 1 I Inhalt abgefüllt und zur Kontrolle gelassen. In den anderen Teilen der Zellsuspension werden 10 ml Kulturflüssigkeit eingefüllt, die den Stamm EQM 10-76 enthält, und jeweils zu 150 ml in Flaschen von 1 I Inhalt abgefüllt. Alle Flaschen werden bei 35°C unter Rollerbedingungen inkubiert. 3 Tage nach der Impfung und Infizierung der Zellen wird das Nährmedium entferni und in die Flaschen werden frisches Nährmedium 199 und 100 mg/ml Monomycin eingefüllt. 6 Tage nach der Zellinfizierung wird beim Nachweis der Herde der cytopathischen Virusaktivität die virushaltige Flüssigkeit aus den Flaschen gesammelt; es werden die Proben für entsprechende Kontrollen entnommen, und in die Flaschen wird frisches Nährmedium 199 eingefüllt. Die nachfolgenden Sammlungen der virushaltigen Flüssigkeit werden mehrmals solange unternommen, bis 50% der Zellen aufbewahrt werden. In der letzten Stufe werden 70 ml frisches Nährmedium 199 eingefüllt, die Zellkultur wird im Trockeneis eingefroren und zum Entzug des intrazellularen Virus abgetaut. In allen Stufen der Bereitstellung des Impfvirus werden Kontroüproben entnommen. Der impfvirus muß nach folgenden Merkmalen kontrolliert werden: auf die Spezifik, Unschädlichkeit, Infektionsaktivität, Antigenität, Immunogenilät, auf das Fehlen der verunreinigenden Viren, die Sterilität, das Fehlen der Kontagiosität. Der den genannten Kontrollforderungen entsprechende Impfvirus wird im eingefrorenen Zustand bei höchstens — 20⁰C aufbewahrt.

b) Bereitstellung des Impfstoffes. Dazu werden 9 bis 11 Tage alte Embryonen von japanischen Wachteln genommen, die aus einer kontrollierbaren speziellen Wachtelzuchtfarm gebracht wurden. 200 Embryonen werden in üblicher Weise trypsinisiert und es werden 6 600 000 000 Zellen erhalten, die in 8,2501 Nährmedium 199 unter Zugabe von 10% Rindviehblutserum und 100 mg/ml Monomycin suspendiert werden. 750 ml Zellsuspension werden jeweils zu 150 ml in 5 Flaschen von 1 1 Inhalt abgefüllt und zur Kontrolle gelassen. In den anderen Teil der Zellsuspension werden 10 ml Kulturflüssigkeit zugegeben, die den nach a) erhaltenen Impfvirus enthält, und jeweils zu 150 ml in Raschen von 11 Inhalt abgefüllt Alle Flaschen werden bei 35° C unter Rollerbedingungen inkubiert 3 Tage nach der Impfung und Infizierung der Zellen wird das Nährmedium entfernt und in die Flaschen werden frisches Nährmedium 199 und 100 mg/ml Monomycin eingefüllt 6 Tage nach der Infizterung der Zellsuspension wird beim Nachweis der Herde der cytoDathischen Virusaktivität in 30% der Zellen die

virushaltige Flüssigkeit aus den Flaschen gesammelt; es werden die Proben für entsprechende Kontrollen entnommen und in die Flaschen wird frisches Nährmedium 199 eingefüllt. Die nachfolgenden Sammlungen der virushaltigen Flüssigkeit werden mehrmals solange unternommen, bis 50% der Zellen aufbewahrt werden; es werden 70 ml Nährmedium 199 eingefüllt. Die Zellkultur wird im Trockeneis eingefroren und zum Entzug des intrazellularen Virus abgetaut.

Man vereinigt alle sterilen virushaltigen Sammlungen in einem Behälter, gibt den Stabilisator hinzu, der aus 5% Sorbit und 1,5% Gelatine besteht, füllt den Impfstoff in Ampullen oder in Flaschen ab und lyophilisiert. Diese Portion stellt eine Impfstoffserie dar. Der erhaltene Impfstoff kann in Flaschen und Ampullen von verschiedenem Inhalt von 1 ml bis 33 ml abgefüllt werden und in einer Flasche oder Ampulle von 1 bis 500 Dosen je nach dem Wunsch des Verbrauchers enthalten.

In allen Stufen der Impfstoffherstellung werden Kontrollproben entnommen. Der Impfstoff muß nach folgenden Merkmalen kontrolliert werden: auf die Spezifik, Unschädlichkeit, Infektionsaktivität, antigene und immunogenc Aktivität, auf das Fehlen der verunreinigenden Viren, die Sterilität und auf das Fehlen der Kontagiosität.

Die den genannten Kontrollforderungen entsprechende Impfstoffserie kann zur Immunisierung der Tiere genommen werden. Im gegebenen Beispiel sind in einer Serie 360 000 Impfstoffdosen enthalten.

Beispiel 2
Prüfung auf Unschädlichkeit

Der Impfstoff wurde in einer Dosis von 1 ml, die ZGDw des Virus enthielt, nach der vorläufigen Verdünnung mit der Hanks'schen Lösung angewandt Der mpfstoff wurde intramuskulär eingeführt. Es wurden 24 Jungnerze und 12 Jungfüchse geimpft. Zur Kontrolle wurden noch 16 Jungnerze und 8 Jungfüchse genommen. Die geimpften Tiere wurden täglich während 28 Tage beobachtet. Alle Tiere blieben klinisch gesund. Es wurden keine pathologischen Reaktionen — Ablehnen des Futters, Hemmung, Verdauungsstörungen — nachgewiesen. Die Tiere, die sich in Kontakt mit den geimpften Tieren befanden, erkrankten an Staupe nicht.

Beispiel 3

Prüfung auf Antigenität

Den Tieren, die mit einer Präparatdoses nach Beispiel geimpft wurden, wurden nach 10 bis 14 Tagen Blutproben entommen und es wurden die Antikörpertiter in der Neutralisationsreaktion auf der Zellkultur von Embryonen der japanischen Wachteln bestimmt indem als Antigen EQM 10-76 genommen wurde. Die Antikörper wurden bei allen Tieren im Titer von 1 :16—32 nachgewiesen. Die maximale Titeranreicherung (im Titer 1 :256) wurde schon am 30. Tag festgestellt Die Antikörper blieben während der !8 Beobachtungsmonate erhalten.

n.

Beispiel 4

Prüfung auf Immunogenität und Immunitätsdaucr

a) 24 Jungnerzen und 12 Jungfüchsen wurde intramuskulär zu je I ml verdünnte Impfstoffe eingeführt, die 100 ZGD50 des Virus enthielt. Zur Kontrolle wurden 16 Jungnerze und 8 Jungfüchse genommen. Nach 30 Tagen wurde die Infizierung der geimpften und Kontrolltiere mit dem Virulenzvirus (Snyder Hill für Nerze und Gaujasski für Füchse) geprüft. Die Tiere wurden täglich beobachtet. Die Kontrolltiere (d. h. die nicht geimpften) gingen an Staupe ein und bei den geimpften Tieren wurden keine Reaktionen auf die Einführung des virulenten Staupevirus nachgewiesen. Während der ganzen Beobachtungsfrist (21 Tage nach der Infizierung) blieben die geimpften Tiere klinisch gesund.

b) 1 Jahr und 1,5 Jahre nach der Impfung werden die Tiere wiederum mit dem virulenten Virus Snyder Hill und Gaujasski infiziert. Kein geimpftes Tier erkrankte an Staupe und alle blieben am Leben.

Beispiel 5
Prüfung unter Feldbedingungen

Während der Sommerimpfung wurden zwecks Prophylaxe in 15 Tierzuchtfarmen 1 Mill 400 T. Füchse, 45,5T. Blaufüchse, 25 T. Zobel, 300T. Nerze und 255 Hunde geimpft.

Kein Tier erkrankte an Staupe, ungeachtet dessen, daß in Gebieten, wo sich die Tierzuchtfarmen befanden, Staupeausbrüche beobachtet wurden

Beispiel 6
Prüfung im Staupeherd

In einer Tierzuchtfarm, wo zahlreiche Staupefälle unter den Silberschwarzjungfüchsen registriert wurden (durch Laboranalysen bestätigt), erreichte das Eingehen der Jungtiere bis 120 pro Tag. Es wurden alle Tiere geimpft Nach zwei Monaten verminderte sich das Eingehen der Jungfüchse um das Zweifache, und nach einem Monat hörte es überhaupt auf.

In einer Nerzzuchtfarm, die sich in direkter Nähe der Fuchszuchtfarm befand, wurden einzelne Fälle der Staupeerkrankung registriert Nach der Extraimpfung aller Nerze wurde dem Staupeausbruch in der Farm vorgebeugt

Beispiel 7

Prüfung des erfindungsgemäßen Präparats
im Vergleich zu bekannten Impfstoffen

stark und nach 2 Monaten wurde der Staupeausbruch liquidiert. Auf diese Weise stand der erfindungsgemäße Impfstoff dem bekannten Impfstoff ASL in der Effektivität in nichts nach.

Beispiel 8
Prüfung bei der Aerosolmethode

Für die Aerosoleinführung wurden Impfstoffe verwendet, die ähnlich dem Impfstoff bereitgestellt wurden, der für die intramuskuläre Einführung bestimmt ist. Nach der Aerosolmethode wurden 300 Jungnerze im Alter von 45 bis 60 Tagen immunisiert. Die Exposition der Impfstoffzerstäubung wurde so durchgeführt, daß die eine Nerzgruppe eine gewöhnliche Dosis und die andere Gruppe drei gewöhnliche Dosen erhielt; unter gewöhnlichen Dosen versteht man die für die intramuskuläre Einführung angebrachten Dosen. Die Antikörper zum Staupevirus im Blutserum immunisierter Tiere wurden in der Neutralisationsreaktion auf der Zellkultur der Embryonen der japanischen Wachteln bestimmt, indem als Antigen der Stamm EQM 10-76 verwendet wurde. In der Gruppe der mit einer Dosis geimpften Nerze wurden die Antikörper in einer Verdünnung von i : 8 bestimmt, in der anderen Gruppe der Nerze, die drei Dosen erhielten, wurden die Antikörper in einer Verdünnung von 1 :32 bestimmt.
Es wurde kein wesentlicher Unterschied in der Titergröße der virusneutralisierenden Antikörper bei Tieren nachgewiesen, die nach der Aerosolmethode und intramuskulär (nach Beispiel 3 immunisiert wurden.

Zur Prüfung der Gespanntheit der Immunität bei den nach der Aerosolmethode geimpften Tieren wurde die Methode der Infizierung mit dem virulenten Stamm Snyder Hill angewandt. Nach der Infizierung mit dem genannten wirulenten Virus wurde bei den nach der Aerosöirnethode behandelten Tieren keine Staupeerkrankung beobachtet.

Wie aus dem Beispiel 8 zu ersehen ist, ist der erfindungsgemäße Impfstoff auch bei der Aerosolimmunisierung effektiv.

In einer Tierzuchtwirtschaft wurde in der Nerzzuchtfarm mit zahlreichen Fällen der Staupe unter den Jungtieren der ganze Tierbestand mit dem bekannten Impfstoff K-F 668 (UdSSR) immunisiert Nach der Impfung verminderte sich die Tlermortalität nicht und erreichte 180 Jungtiere pro Tag. Im Zusammenhang damit wurde dringend die wiederholte Immunisierung von 14 612 Tieren mit dem angebotenen Impfstoff und 15 580 Tiereu mit dem bekannten Impfstoff ASL (USA) durchgeführt Nach der Immunisierung mit den genannten tmpfstoffen verminderte sich die Sterblichkeit der Jungtiere

Claims

Patentansprüche:

1. Lebendimpfstoff zum Immunisieren von fleischfressenden Tieren gegen Staupe, mit einem durch heterologe Adaptierung auf Zellkulturen attenuierten Staupevirus als Wirkstoff, dadurch gekennzeichnet, daß man einen attenuierten Staupevirus einsetzt, der aus dem Blut des staupekranken Nerzes isoliert worden ist und der