DE1792356C2

DE1792356C2 - Staupe-Kombinationsvaccinen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE1792356C2
Application number: DE1792356A
Authority: DE
Inventors: Othmar Dr. 3550 Marburg Ackermann
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1968-08-23
Filing date: 1968-08-23
Publication date: 1983-03-03
Also published as: AT297219B; BE737945A; DE1792356A1; NL6912389A; FR2016289A1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Staupe-Impfstoff zur Frühprophylaxe gegen Staupe und ggfs. gegen Hepatitis contagiosa canis sowie Leptospirose und ein Verfahren zur Herstellung solcher Impfstoffe. >

Es sind bereits Impfstoffe gegen Staupe bekannt, die teils inaktivierte, teils modifizierte Staupe'viren enthalten. Diese Staupe-Impfstoffe sind aber unwirksam, wenn die Impflinge noch maternale Antikörper gegen Staupe besitzen, da diese die Staupeviren des Impfstoffes neutralisieren und die aktive Ausbildung von Slaupeantikörpern verhindern. Es ist zwar möJich, den voraussichtlichen Zeitpunkt zu bestimmen, ,>.ri dem die Welpen die maternalen Antikörper ausgeschieden haben und somit für die aktive Immunisierung geeignet sind. Diese Teste wären jedoch sehr aufwendig, da sie nur in Spezialuntersuchungslabors ausgeführt werden können; außerdem wird es dem Tierarzt nicht immer möglich sein, vom Muttertier oder von wenige Wochen alten Welpen Blut zu entnehmen.

Um diesem Mangel abzuhelfen, hat man versucht, die Tiere mit Masernviren zu impfen (österreichische Patentschrift 2 48 791), da Masernviren mit Staupeviren antigenverwandt sind und den Tieren auch in Gegenwart mütterlicher Staupeaniikörper einen gewissen Schutz gegen Staupe verleihen. Der hierdurch erreichbare Schutz ist jedoch nicht verläßlich. Bei starker Belastung mit infektiösem Staupevirus können die Tiere dennoch erkranken. Wegen des Fehlens eines zur Frühprophylaxe gegen Staupe geeigneten Implstnfls war es bisher außerdem nicht möglich, Kombinatioiisimpfstoffe zur Frühprophylaxe von jungen Hundewclpen gegen Staupe, Hepatitis contagiosa canis (H.c.c.) und Leptospirose herzustellen, wie sie für ältere Tiere bereits sein längerem im Handel sind.

Es wurde nun gefunden, daß man einen Staupe-Impfstoff, der die obigen Nachteile nicht besitzt, unter Verwendung von durch Passierung in Primatengewebekulturen attenuierten Masernviren gewinnen kann, wenn man diese Masernviren anschließend an die Attenuierung in wenigstens 10 Kulturpassagen in Organgeweben von Caniden bzw. Musteliden adaptiert und weiterzüchtet und ihnen lebende Staupeviren zusetzt Zusätzlich kann er noch inaktivierte H.c.c-Viren und/oder die anspruchsgemäßen inaktivierten Leptospiren enthalten.

Die Masernviren bewirken keine aktive Immunisierung gegen Staupe, ihre Wirkung beruht vielmehr wahrscheinlich auf einer kompetitiven Zellbiockade, durch die die Zellen vor dem Angriff der infektiösen Staupeviren geschützt werden. Die Schutzwirkung der Masernviren nimmt daher nach einigen Monaten wieder ab. Zu diesem Zeitpunkt ist jedoch der Gehalt des Blutes an maiernalen Antikörpern so gering geworden, daß eine aktive Immunisierung der Welpen mit einer Staupevaccine vorgenommen werden kann.

Auf die erfindungsgemäße Weise kann man auch Tiere, die keine oder keine ausreichenden maternalen Antikörper besitzen, bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt aktiv und dauerhaft gegen Staupe immunisieren.

Eine weitere Ausführungsform besteht in der Kombination des erfindungsgemäßen Staupe-Impfstoffes, der die Masern- und die Staupeviren enthält, mit inaktivierten Hepatitis contagiosa canis (H.c.c.)-Viren. Daneben kann der Staupe-Impfstofl auch mit inaktivierten Leptospira canicola und Leptospira icterohaemorrhagiae kombiniert werden. Die letztgenannten Erreger rufen die sogenannte Stuttgarter Hundeseuche und die Wcil'sche Krankheit hervor. Solche Vaccinen wurden bisher noch nicht für eine Frühprophylaxe angewandt.

Es ergeben sich somit die folgenden Kombinationsmöglichkeitcii:

Masern/Staupe-Vaccine:

Masernvirus lebend, attenuiert

Staupevirus lebend, attenuiert
Masern/Staupe/H.c.c-Vaccine:

Masernvirus lebend, atlenuiert

Staupevirus lebend, attenuiert

H.c.c.-Virus, inaktiviert
Masern/Staupe/H.c.c/Leptospirose-Vaccine:

Masernvirus lebend, attenuiert

Staupevirus lebend, attenuiert

H.c.c.-Virus inaktiviert

Leptospira canicola inaktiviert

Leptospira icterohaemorrhagiac inaktiviert

Für die erfindungsgemäß erhaltenen, gegen Staupe wirksamen Vaccinen und ihre Kombinationen, kommen insbesondere folgende Titer und Mengenbereiche in Betracht:

M a scm-Komponente:
l o·³·⁰ — 10⁶-⁰.

vorzugsweise 10⁴-^s- 10⁵ⁿTCID_w/ml
Staupe-Komponente:

H)"¹- 10¹··",

vorzugsweise 10ⁱ⁵- 10^4r>TCID_w/ml
I I.c.c.-Komponente:

KIIR-Titer 1:40 + bis 1 : 160 +,vorzugsweise

1:80 + (KBR = Komplement-Bindungs-Reaktion)

Leptospiren-Komponente (sowohl Leptospira icterohaemorrhagiae als Leptospira canicola):

Zählung im Dunkelfeld JO⁶- 10¹⁰AnI

vorzugsweise ΙΟ⁸— 10⁹/ml

Der erfindungsgemäße Staupe-Impfstoff sowie ihre Kombinationen mit H.cc.-Viren bzw. den anspruchsgemäßen Leptospiren sind vorzugsweise für die Frühprophylaxe geeignet, jedoch können auch ältere Hunde vorübergehend mit den Masern-Viren enthaltenden Vaccinen geschützt werden. Die Kombinationsvaccinen haben den Vorteil, daß die Tiere schon in sehr frühem Lebensalter einen gleichzeitigen Schutz gegen Staupe, H.cc, und Leptospirose erhalten.

Für die Herstellung des Staupe-Impfstoffs wird ein Masern-Virus verwendet, das attenuiert und damit für den Menschen ungefährlich ist Diese Eigenschaften besitzt z. B. insbesondere der Edmoiiston-Stamm (vgl. deutsche Patentschrift 11 30 558 und riaagen, Viruskrankheiten des Menschen 2, 12 [1965], Seiten 1126 — 1128), der durch Passierung über Primatengewebekulturen erhalten wurde.

Für die Adaptation der Masern-Viren kommen Gewebekulturen von Caniden und Musteliden, z. B. Nieren, Testikel, Uterus von Hunden, Füchsen, Frettchen, Nerzen, Hermelin, Wiesel, Skunk, vorzugsweise Nieren von Hunden, in Betracht. Attenuierte Staupeviren werden zweckmäßigerweise durch mehrfache Passagierung in Hundenierengewebekulturen nach dem in der deutschen Patentschrift 11 38 888 beschriebenen Verfahren gewonnen. Außer den solcherart erhaltenen Staupeviren kommen beispielsweise noch in Betracht der Cabasso-Stamm und der Onderstepoort-Stanim von Haig. Zu ihrer Gewinnung wurden Staupeviren in bekannter Weise von infizierten Freitchen isoliert, auf embryoniertes Hühnerei übertragen und bis zur Adaptierung an das Ei Wechselpassagen zwischen Frettchen und Hühnerei ausgeführt. Für die Züchtung der H.c.c.-Vircn kommen Organgewebc oder Kulturgewebe von Hunden, Füchsen oder Schweinen in Betracht, vorzugsweise Leber und Milz von Hunden als Organgewebe und Nieren von Hunden als Kulturgewebe (vgl. deutsche Patentschrift 10 76 892 und 11 49 495). Die Leptospirenantigene werden vorteilhaft durch Tieffrieren einer Suspension von Leptospira canicola und Leptospira icterohaemorrhagiae gemäß belgischer Patentschrift 6 34 903 hergestellt. Die Inaktivierung kann in bekannter Weise mit Formaldehyd vorgenommen werden; H.c.c.-Viren können außerdem auch mit UV-Strahlen, Wärme oder /?-Propiolacton inaktiviert werden.

Die Herstellung der Gewebekulturen erfolgt in bekannter Weise. Als Kulturflüssigkeitep. kommen handelsübliche Gewebekulturlösungen '.»'" beispielsweise Earle'sche Lösung oder Hanks' Losung mn Lactalbuminhydrolysat-Lösung, Eagle's Lösung oder TCM 199 (Tissue Culture Medium 199) mit oder ohne Serunizusatz in Frage.

Zur Herstellung der attenuitrten Masernviren werden die Gewebekultui cn in an sich bekannter Weise mit bekannten attenuierten Masern-Viren, beispielsweise mit Masern-Viren des Edmoriston-Stammes, infiziert. Für die Züchtung gelten die aus der Literatur allgemein bekannten Vorschriften für die Vermehrung von Viren auf Gewebekuhuren (beispielsweise Dulbecco und Vogt, J. Exp. Med. 99, 167 - 182 [1954] sowie Youngner, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 85, 202-205 [1954]). Die Masern-Viren werden in mindestens 10 aufeinanderfolgenden Passagen auf Organgeweben von Musteliden oder Caniden weiter vermehrt Es kann beispielsweise eine Passage so durchgeführt werden, daß man Gewebekulturen, beispielsweise Hundenierenepithel-" > kulturen, die als Nährmedium Earie'sche Lösung mit 0,5% Lnetalbuminhydrolysat enthalten, mit einer Masern-Virus-Suspension, die den attenuierten Edmonston-Stamm enthält, im Volumenverhältnis I : 50 beimpft 4 Tage später werden die Kulturen durch " Erneuerung des Nährmediums gefüttert. Nach Auftreten der ersten zytopathogenen Veränderungen wird das in den Kulturzellen produzierte Masern-Virus durch Abziehen der virushaltigen Kulturflüssigkeit geerntet. Durch Einbringen frischer Kulturflüssigkeit kann die "> Aberntung in 24stündiger Folge bis zur Erschöpfung der virusproduzierenden Zellen wiederholt werden (etwa 5-8mal). Die Virusernten werden bei 30-80⁰C tiefgefroren, nachdem ihnen Proben zur Durchführung von Sterilitätsprüfunger. und zur Bestimmung des Virustiters entnommen wurden. Nach einer Passagenzahi von mindestens 10 wird aus der Aberntung die Vaccine hergestellt.

Durch die Gewebekulturpassagen wird die Antigenität des attenuierten Masernvirus für Hunde erheblich "> verbessert. Die Gewebekulturvirussuspension kann anschließend beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation geklärt und in an sich bekannter Weise zu einer Masern-Vaccine verarbeitet werden, beispielsweise durch Zugabe einer Stabilisatorlösung, z. B. ' Gelatinelösung (2%ig) und Glukoselösung (50%ig) im Verhältnis 4:1. Saccharose-Glutamatlösung, Molico® oder Haemaccel®, und gegebenenfalls eines Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat oder einer Öl-Emulsion. '

Es ist zweckmäßig, die Masernkombinationsvaccinen auch lyophil zu trocknen, um sie lagerfähig zu machen. Durch die Züchtung in Gewebekuhuren von Caniden oder Musteliden wird das Masernvirus gegen Staupe genügend wirksam. Aus der erhaltenen Masemvirus-Suspension wird durch Mischen mit Staupe-Virus eine Vaccine zur Immunisierung junger riundc gegen Staupe bzw. Kombinationsvaccinen zur gleichzeitigen Frühprophylaxe gegen Staupe, H.cc. und Leptospirose hergestellt.

Beispiel 1
(Herstellungder Masernkomponente)

Hine naci, Dulbecco und V_Ogt in einem Vierkantliüschchen mit 20 mi Inhalt angelegte liundenierengc ">=> webefailtur wurde mii 2 ml des Edmonston-Stammes vom Titer 10¹⁰ TCID₅o/ml beimpft und 12 Tage bei J7°C bebrütet. Am 4. und am 8. Tag wurde die Nährlösung Ji.rch frische Nährlösung ersetzt. Am 12. Tag wurde die Masern-Virus enthaltende Nährlösung auf die nächste Hundeniercngewebekultur überimpft. Nach 3 Passagen wurden in dtr Kullur etwa vom 10. Tage nach der Infektion ab i-ytopathische Effekte in Form einer Zellzcrstorung und Ausbildung von Riesen/eilen beobachtet. Das Auftreten cytopalhischer Effekte verkürzte sich durch weitere Passagen, so daß sich bereits eine Woche nach der Infektion cytopathische Effekte zeigten. Insgesamt wurden 10 Kulturpassagen durchgeführt.

Beispiel 2

(Masern-Staupe- und Masern-Staupe-Hepatitis-Vaccine)

11 Welpen, von denen 5 acht Wochen und 6 neun Wochen alt waren, wurden in zwei Gruppen zu je 4 Welpen (Gruppe I und II) und eine Kontrollgruppe mit 3 Welpen (Gruppe III) aufgeteilt. Je 2 Welpen der Versuchsgruppen erhielten Staupe- und H.cc-Antikör- in per-enthaltendes Hundeserum, so daß Verhältnisse, wie sie bei der Übertragung durch die Kolestralmilch auftreten, vorlagen.

Die Gruppe I wurde mit Masern-Staupe-Vaccine, is die lebendes Masernvirus und lebendes Staupevirus enthielt (Vaccine Nr. 5) und

die Gruppe II mit Masern-Staupe-H.c.c-Vaccine, die lebendes Masern-Virus, lebendes Staupevirus und inaktiviertes H.cc-Virus enthielt (Vaccine Nr. 2η 6), vaccinieri.

Die Vaccinen wurden gut vertragen. 4 Wochen nach der Vaccinierung wurden alle Tiere mit Staupevirus

Tabelle 1

Immunisierung von Hunden mit Ma^ern-Staupe-Vaccinen:

Vaccine Nr. 5 = Masernvirus, lebend + Staupevirus, lebend

Vaccine Nr. 6 = Masernvirus, lebend + Staupevirus, lebend t H.cc.-Virus, inaktiviert

Snyder-Hill-Stamm (ImI = 100 dim s.c.) und nach weiteren drei Wochen mit pathogenem H.cc.-Virus infiziert. Nach der Testinfektion mit Staupevirus blieben alle Versuchstiere gesund- Die beiden Tiere der Kontrollgruppe, die keine Antikörper erhalten hatten, verendeten an Staupe. Das dritte Tier, das eine Serumgabe erhalten hatte, aber zum Zeitpunkt der Belastungsinfektion keine nachweisbaren Staupeantikörper besaß, wurde krank, verendete jedoch nicht. Durch die Testinfektion mit dem pathogenen H.cc.-Virus erkrankten die Kontrolltiere und die Hunde, die mit einer Vaccine immunisiert worden waren, die keine H.c.c-Komponente enthielt. Zwei von 4 Tieren verendeten an H.cc. Die mit Rcc-Virus-haltiger Vaccine geimpfte Welpengruppe blieb demgegenüber nach der Testinfektion mit pathogenem H.cc.-Virus gesund (siehe Tabelle 1). Bei der serologischen Untersuchung von Serumproben entwickelten alle Hunde Staupeantikörper, die mit dem erfindungsgemäßen Impfstoff geimpft wurden. Ebenso entwickelten H.cc-Antikörper nur jene Hunde, die mit einer Vaccine, die eine inaktivierte H.c.c-Komponente enthielt, geimpft wurden.

Hunde-	Maternale	Vacciniert	Staupe-	H.cc-	Teslinfektion	Testinfektion
Gruppe	Anti	mit	Antikörper	Antikörper	mit je 1 ml	mit
Nr.	körper		4 Wo. p. v.	4 Wo. p. v.	= 100 dim Snyder-	H.cc.-Virus
			VND/ml	VND/ml	Hill-Stamm SC.

I 2 Hunde
2 Hunde

J«
nein

Vaccine Nr. 5 se.

318000 3 787

keine keine

o.B.

krank, davon 2 verendet

Il 2 Hunde
2 Hunds

ja
nein

Vaccine Nr. 6 se.

281 19 104

412 000 269 000

o.B.

Ill I Hund
2 Hunde

nein

Kontrollen

keine keine

keine 1 Hund krank

keine 2 Hunde verendet

VND/ml = Virusneutralisierende Dosen pro ml.

o. B. =-- ohne Besonderheit.

* = Masernvirus gemäß der Erfindung.

se. = Subcutan.

p. v. = post vacdnationem.

Claims

Patentansprüche:

1. Staupe-Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß er in Primaten-Gewebekulturen attenuierte und durch wenigstens 10 Kulturpassagen in Organgewebe von Caniden oder Musteliden adaptierte Masernvire.i und attenuierte Staupeviren enthält.

2. Staupe-Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er 10³-10* TCIDw/ml, vorzugsweise 10⁴·⁵ bis 10⁵ TCIDso/ml, Masernvirus enthält.

3. Staupe-Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich inaktivierte Hepatits contagiosa canis-Viren und/oder inaktivierte Leptospira canicola und Leptospira icterohaemorrhagiae enthält, wobei der Anteil an den Leptospiren jeweils 10⁶— 10¹⁰, vorzugsweise 10⁸ bis 10⁹ Organismen pro ml beträgt.

4. Verfahren zur Herstellung eines Staupe-Impfstoffes nach Anspruch 2 unter Verwendung von in Primatengewebekulturen attenuierten Masernviren, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Primatengewebekultur attenuierten Masernviren durch wenigstens zehn Kulturpassagen in Organgewebe von Caniden oder Musteliden adaptiert und weiterzüchtet, das Virus erntet und mit einem Virustiter von 1(P-IO" TCID₅o/ml, vorzugsweise 10⁴⁵ bis 10⁵ TCIDw/ml mit einem attenuierten Staupevirus in bekannter Weise zu einer Vakzine verarbeitet.