AT227876B - - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung einer kombinierten Vaccine für Hunde 
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines kombinierten Impfstoffes zur Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen Staupe und Hepatitis contagiosa canis (H. c.   c.).   Die Staupe und die H. c. c. sind zwei gefährliche und weitverbreitete Viruserkrankungen der Hunde. An Staupe erkranken ausserdem noch Füchse und Pelztiere der Marderfamilie (Mustelliden). Das H. c. c.-Virus ist ausser für Füchse (Fuchsencephalitis) pathogen. 



   Man kannHunde und andere empfänglicheTiere erfolgreich gegen die Staupe immunisieren. Die zur Zeit geübten Immunisierungsverfahren beruhen auf der Verabreichung eines Impfstoffes, der ein lebendes, eiadaptiertes, apathogenes Virus enthält. Daneben wird auch noch die simultane Verabreichung eines pathogenen Virus in Verbindung mit Immunserum und die Verimpfung eines Impfstoffes mit inaktiviertem Virus angewendet. Durch die Verwendung obiger Impfstoffe wurde die Hundestaupe wirksam bekämpft. 



  Diese Impfungen gewähren jedoch keinen Schutz gegen die H. c. c. 



   Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen die Staupe und Hepatitis contagiosa canis   (H. c. c.)   gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Vaccine zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen die Staupe und H. c. c. herstellen kann, indem man die zu einer Suspension aufgearbeitete staupevirushaitigen Teile des embryonierten Hühnereies mit einem mittels Formaldehyd inaktivierten H. c.   c. -   Virus, das aus Hundelebern   under   Hundemilzen durch Extraktion oder von der Gewebekultur gewonnen wird und dessen virusschädigender Formaldehydanteil durch Zusatz einer 1, 5- bis 2fachen   stöchiometri-     schen   Bisulfitlösung abgebunden wurde, mischt und gefriertrocknet.

   Hiebei ist es vorteilhaft, wenn das H. c. c.-Antigen durch eine   Aluminiumhydroxydlösung   adsorbiert wird. Vorzugsweise geht man so vor, 
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   Die verfahrensgemäss erhaltene   Staupe-H. c. c.-Vaccine   (SH-Vaccine) stellt eine Verbindung zwi-   schen   einem lebenden, eiadaptierten, apathogenen Staupevirus und einem inaktivierten H. c. c.-Virus dar. Die Herstellung eines solchen Mischimpfstoffes bringt verschiedene Vorteile mit sich. Im Vergleich 
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 undgesenkt. Es ergibt sich insbesondere eine Einsparung   an Abfüll-und Verpackungsmaterial   und eine wesentliche Minderung der Kosten für die Lyophilisation. Ausserdem stellt die Verabreichung nur einer Vaccine an Stelle von zweien eine Vereinfachung und Verbilligung des Impfverfahrens dar. 



     DsrStaupe- und H. c. c.-Anteil   der SH-Vaccine müssen erfindungsgemäss in eine besondere Form gebracht werden, damit keine nachteilige Beeinflussung der beiden Anteile entstehen kann. Namentlich das lebende Staupevirus ist sehr empfindlich und wird durch chemische, thermische und anders geartete Einflüsse leicht geschädigt und vernichtet. So würde beispielsweise das im H. c. c. -Vaccine-Anteil enthaltene Formaldehyd bei seiner Vermischung mit dem Staupe-Anteil das modifizierte Staupevirus innerhalb 1 h vernichten. Es ist gelungen, die virusschädigenden Eigenschaften, die durch den Formaldehyd (CH 0) hervorgerufen werden, durch die Zugabe von Bisulfit   (NaHSO)   zu beseitigen.

   Dabei verfährt man 

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Nun vereinigt man den   H. c. c. -Vaccine-Anteil   mit dem Staupeimpfstoffanteil unter Eiskühlung, füllt ab und lyophilisiert das Impfstoffgemisch. 



   An 32 Hunden wurde die verfahrensgemäss erhaltene SH-Vaccine auf ihre immunisierenden Eigen- schaften sowohl gegen Staupe als auch gegen   H. c. c.   geprüft. Von den mit je einer Dosis von 2 ml des kombinierten Impfstoffes subkanten vaccinierten Hunden widerstanden alle einer künstlichen Infektion mit aktivem   Staupe-und H. c. c.-Virus.   Dagegen erkrankten alle der insgesamt 7 nicht geimpften
Staupe-Kontrollhunde an dem für die Virusstaupe typischen Fieberverlauf. Ein Teil dieser Staupe-Kon- trollhunde wurde auf der Höhe des sogenannten zweiten Fieberanstieges getötet. Dieser Fieberanstieg ist durch die Besiedelung und Vermehrung des Virus in den Organen gekennzeichnet.

   Bei der Untersuchung der Organe in der Komplementbindungsreaktion (KBR) wurde ein für die Staupe positives Ergebnis erhal- ten. 9 nicht vaccinierte H. c.   c.-Kontrollhunde   erkrankten mehr oder weniger heftig an   H. c.   c., 4 davon verendeten nach einigen Tagen. In der KBR konnte ein Befall der Organe mit dem H. c. c.-Virus nachge- wiesen werden. 



   Neben der   Prüfung   imTierexperiment wird die erfindungsgemässe SH-Vaccine auf ihren Staupevirus- gehalt an vorbebrüteten Hühnerei geprüft. Ausserdem wurden 12 weitere Versuchshunde mit je 2 ml der oben beschriebenen SH-Vaccine subkutan geimpft. Unmittelbar vor der Impfung und 3 Wochen danach wurden Blutproben entnommen und das Serum im Virusneutralisationstest am   vorbebrüteten   Hühnerei geprüft. Alle 12 Hunde hatten vor der Impfung keinen, 3 Wochen danach dagegen einen beträchtlichen   Blutserumspiegel   an staupevirusneutralisierenden Antikörpern, die ein Vielfaches einer infektiösen Virusdosis zu neutralisieren imstande sind. 



   Beispiel : a)   Herstellung des Staupeanteiles der SH-Vaccine  
Bei der Herstellung des-lebenden, eiadaptierten, apathogenen Staupevirus enthaltenden Staupeanteiles wird wie folgt verfahren :
8 Tage   vorbebrütete   Hühnereier werden durchleuchtet, und die Lage des Embryos wird markiert. An der bezeichneten Stelle wird die Eischale angebohrt, so dass eine   Öffnung   entsteht, durch welche die Chorioallantoishaut mit 0,2 ml einer   zien   Suspension infiziert wird. Diese Suspension enthält modifiziertes, vom Ei gewonnenes Staupevirus in Aqua dest., dem   1W/o   einer 1/15 molaren phosphatpufferLösung vom pH 7, 6 zugegeben wurde. Die Impföffnung wird mit paraffingetränktem japanischem Seidenpapier verschlossen.

   Die so behandelten Eier werden 5 Tage bei 370 nachbebrütet und anschliessend ge- öffnet. Die mit Staupevirus bewachsenen Eihäute werden geerntet, gesammelt, im Homogeninsator unter Eiskühlung fein zerkleinert und mit einer Stabilisatorlösung wie folgt zu einer Suspension aufgearbeitet. 



  Es wird beispielsweise zu 500 ml des zerkleinerten   Chorioallantoismaterials     eine Stabilisatorlösung   zugegeben, die sich aus 400 ml Rinderbouillon vom pH 7,6 und 100 ml einer   zuigen   Glukoselösung zusammensetzt. Der Staupeanteil der SH-Vaccine besteht demnach aus   50/ovirushaltigemChorioallantioisma-   terial,   4W/o   Rinderbouillon vom pH 7,6 und   lOlo   einer   50loigen Glukoselösung.   b) Herstellung des H. c.   c. - Anteiles   der SH-Vaccine
Bei der Herstellung des H. c.   c. -Anteiles   der SH-Vaccine wird wie folgt vorgegangen. 



   350 g der H. c.   c.-virushaltigen   Leber und Milz eines Hundes werden unter Eiskühlung im Homogenisator fein zerkleinert, und das Material wird unter Zugabe von 700 ml Aqua   dest.   zu einer Suspension aufgearbeitet. Die Suspension wird   in einer Flasche gesammelt, mit 0, 51o, d. h. 5, 25 ml 35loige Form-   aldehydlösung, versetzt und 1 h im Schüttelapparat kräftig geschüttelt. Die Suspension wird in der Folge dreimal eingefroren und wieder aufgetaut und eine Woche bei Kühlschranktemperatur (etwa 40) aufbewahrt. 



   Die so behandelte Suspension wird anschliessend 30 min bei 3000 Umdr/min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. 

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   Zu 750 ml des gewonnenen Extraktes werden 250 ml einer   2% igen Aluminiumhydroxydiösung   zugesetzt. Man erhält somit 1000 ml des inaktivierten H. c. c.-virushaltigen Vaccine-Anteiles, der sich aus 75% H. c. c.-virushaltigem Extrakt und 25% einer   2% igen Aluminiumhydroxydiösung   zusammensetzt. Vom   H. c. c.-Vaccine-Anteil   wird eine Probe zur Bestimmung des freien und des gebundenen Formaldehydgehaltes entnommen. 



   Der freie Formaldehyd wird durch Zugabe der 1, 5fachen stöchiometrischen Menge an Bisulfit abgebunden. Beträgt beispielsweise der freie Formaldehydgehalt 100   mg%,   so werden zu   l l   H. c.   c. -Vaccine-   Anteil 26, 9 ml einer   20% igen Bisulfitlösung   zugesetzt. c) Herstellung des   H. c. c.-Anteiles   der SH-Vaccine durch ein von der Gewebekultur gewonnenes
H. e.   c. -Virus  
Von einer frischen Hundeniere wird unter möglichst sterilen Verhältnissen die Nierenrinde gewonnen. 



  Diese wird in einer Petrischale gesammelt und zu   4 - 5   mm grossen Stücken zerkleinert. Diese Gewebestückchen werden mit einer Phosphatpufferlösung (PH 7, 5) nach Dulbecco, R. u. Vogt, M. (J. of Exp. 



  Med. 99   954],   S. 167) gewaschen. Im Anschluss daran erfolgt die Trypsinierung der Nierenrindenstückchen mit einer 0,   25% gen   Trypsinlösung im Wasserbad bei 370. Durch die Trypsinierung werden aus den Organstückchen einzelne Zellen abgespalten. Die Aufschwemmung dieser losgelöste Zellen wird gesammelt und die Trypsinierung durch Unterkühlung im Eiswasserbad unterbrochen. Durch Zentrifugieren zunächst bei 1000 und nach   zweimaligem   Waschen mit Phosphatpufferlösung (PH 7,5) bei 600 Umdr/min werden die Trypsinlösung und die in der Aufschwemmung enthaltenen Blutkörperchen entfernt. 1 ml gewaschene Nierenzellen werden jetzt   z. B.   in einer Mischung von 95 ml Kulturmedium 199 nach Morgan, 
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F.aufgeschwemmt.

   Zu 100 ml dieser Zellsuspension wird   einAntibiotika-Gemisch,   bestehend aus   20000 I. E.   



  Penicillin, 20000 y Streptomycin und 20 000 y Neomycin, zugesetzt und mit einer   2,8%0gen   Natrium- bikarbonat-Lösung, die einen Zusatz von   0, 002% phenolrot enthalt,   ein pH-Wert von 6,8 eingestellt. Mit dieser Zellsuspension werden sterile Kulturgefässe, z. B. Fernbachkolben,   Erlenmeyerkölbchen oder Roll-   randröhrchen, mit etwa   81o   ihres Fassungsvermögens beschickt. Etwa   4 - 6   Tage nach dem Ansatz müssen die zu dem Epithelrasen auswachsenden Nierenzellen durch Ersatz der Nährlösung gefüttert werden und gegebenenfalls in den nachfolgenden Tagen der pH-Wert mit einer Natriumbikarbonat-Lösung nachgestellt werden.

   Sobald der Zellrasen voll ausgebildet ist, wird er mit einer Suspension, die ein aus Hundeleber herausgezüchtetes und durch einige Passagen an die Gewebekultur adaptiertes H. c.   c. - Virus enthält,   beimpft. Das H. c. c.-Virus wird nach etwa   6 - 7   Tagen, nachdem sich ein vollständiger cytopathogener Effekt ausgebildet hat und eine Loslösung der abgestorbenen Epithelzellen erfolgt ist, durch Abgiessen der Zellsuspension geerntet. Der H. c.   c.-Virusgehalt   bzw. die Antigenität der Suspension wird durch Beimpfen von Kulturröhrchen in verschiedenen Verdünnungen (Virustitration) oder durch Untersuchung in der Komplementbindungsreaktion (KBR) geprüft.

   Die von der Gewebekultur gewonnene H.   c.     c.-virushaltige   Zellsuspension wird mit 0,   - 0, 2go   =   857o   Formaldehydlösung versetzt und zur Inaktivierung 1 Woche lang bei Kühlschranktemperatur (etwa 40) aufbewahrt. Danach werden zu 750 ml der Suspension 250 ml einer   2% igen Aluminiumhydroxydiösung   zugesetzt. 



   Der freie Formaldehyd wird bestimmt und vor der Vermischung mit dem Staupe-Anteil durch die Zugabe der 1, 5fachen stöchiometrischen Menge Bisulfit abgebunden. d) Mischung des   Staupe-und H. c. c.-Anteiles   der SH-Vaccine
1000 ml des Staupe-Anteiles werden mit 1000 ml des mit Bisulfit behandelten H. c. c.-Anteiles unter Eiskühlung gemischt und zu je 2 ml in Fläschchen abgefüllt. Die so erhaltene Staupe-H. c.   c. -Vaccine-   Mischung wird im Stehen bei einer Temperatur   von-400   eingefroren und in der Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert. Dadurch wird der Impfstoff in eine haltbare und lagerfähige Form übergeführt. 

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Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen die Staupe und Hepatitis contagiosa canis (H. c. c.), dadurch gekennzeichnet, dass man ein aus Hundelebern und/oder-milzen durch Extraktion oder von der Gewebekultur gewonnenes H. c. c.virushaltiges Material in an sich bekannter Weise mittels Formaldehyd inaktiviert, hierauf den freien Formaldehydanteil durch Zusatz einer Lösung, die die 1, 5- bis 2fach stöchiometrische Menge an sauren Salzen der schwefeligen Säure, insbesondere Natriumbisulfit, enthält, abbindet und das so gewonnene Produkt mit einem aus dem embryonierten Hühnerei in an sich bekannter Weise gewonnenen staupevirushaltigen Suspension mischt und die Mischung gefriertrocknet. <Desc/Clms Page number 4> 2.

   Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Mischungsverhältnis von einem EMI4.1 7,H. c. c.-Anteil, der aus etwa 75% eines inaktivierten, H.c.c.-virushaltigen Extraktes und 25% einer 2% igen Aluminiumhydroxydiösung besteht, einhält.