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Verfahren zur Herstellung einer kombinierten Vaccine für Hunde
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines kombinierten Impfstoffes zur Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen Staupe und Hepatitis contagiosa canis (H. c. c.). Die Staupe und die H. c. c. sind zwei gefährliche und weitverbreitete Viruserkrankungen der Hunde. An Staupe erkranken ausserdem noch Füchse und Pelztiere der Marderfamilie (Mustelliden). Das H. c. c.-Virus ist ausser für Füchse (Fuchsencephalitis) pathogen.
Man kannHunde und andere empfänglicheTiere erfolgreich gegen die Staupe immunisieren. Die zur Zeit geübten Immunisierungsverfahren beruhen auf der Verabreichung eines Impfstoffes, der ein lebendes, eiadaptiertes, apathogenes Virus enthält. Daneben wird auch noch die simultane Verabreichung eines pathogenen Virus in Verbindung mit Immunserum und die Verimpfung eines Impfstoffes mit inaktiviertem Virus angewendet. Durch die Verwendung obiger Impfstoffe wurde die Hundestaupe wirksam bekämpft.
Diese Impfungen gewähren jedoch keinen Schutz gegen die H. c. c.
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen die Staupe und Hepatitis contagiosa canis (H. c. c.) gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Vaccine zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen die Staupe und H. c. c. herstellen kann, indem man die zu einer Suspension aufgearbeitete staupevirushaitigen Teile des embryonierten Hühnereies mit einem mittels Formaldehyd inaktivierten H. c. c. - Virus, das aus Hundelebern under Hundemilzen durch Extraktion oder von der Gewebekultur gewonnen wird und dessen virusschädigender Formaldehydanteil durch Zusatz einer 1, 5- bis 2fachen stöchiometri- schen Bisulfitlösung abgebunden wurde, mischt und gefriertrocknet.
Hiebei ist es vorteilhaft, wenn das H. c. c.-Antigen durch eine Aluminiumhydroxydlösung adsorbiert wird. Vorzugsweise geht man so vor,
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Die verfahrensgemäss erhaltene Staupe-H. c. c.-Vaccine (SH-Vaccine) stellt eine Verbindung zwi- schen einem lebenden, eiadaptierten, apathogenen Staupevirus und einem inaktivierten H. c. c.-Virus dar. Die Herstellung eines solchen Mischimpfstoffes bringt verschiedene Vorteile mit sich. Im Vergleich
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undgesenkt. Es ergibt sich insbesondere eine Einsparung an Abfüll-und Verpackungsmaterial und eine wesentliche Minderung der Kosten für die Lyophilisation. Ausserdem stellt die Verabreichung nur einer Vaccine an Stelle von zweien eine Vereinfachung und Verbilligung des Impfverfahrens dar.
DsrStaupe- und H. c. c.-Anteil der SH-Vaccine müssen erfindungsgemäss in eine besondere Form gebracht werden, damit keine nachteilige Beeinflussung der beiden Anteile entstehen kann. Namentlich das lebende Staupevirus ist sehr empfindlich und wird durch chemische, thermische und anders geartete Einflüsse leicht geschädigt und vernichtet. So würde beispielsweise das im H. c. c. -Vaccine-Anteil enthaltene Formaldehyd bei seiner Vermischung mit dem Staupe-Anteil das modifizierte Staupevirus innerhalb 1 h vernichten. Es ist gelungen, die virusschädigenden Eigenschaften, die durch den Formaldehyd (CH 0) hervorgerufen werden, durch die Zugabe von Bisulfit (NaHSO) zu beseitigen.
Dabei verfährt man
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Nun vereinigt man den H. c. c. -Vaccine-Anteil mit dem Staupeimpfstoffanteil unter Eiskühlung, füllt ab und lyophilisiert das Impfstoffgemisch.
An 32 Hunden wurde die verfahrensgemäss erhaltene SH-Vaccine auf ihre immunisierenden Eigen- schaften sowohl gegen Staupe als auch gegen H. c. c. geprüft. Von den mit je einer Dosis von 2 ml des kombinierten Impfstoffes subkanten vaccinierten Hunden widerstanden alle einer künstlichen Infektion mit aktivem Staupe-und H. c. c.-Virus. Dagegen erkrankten alle der insgesamt 7 nicht geimpften
Staupe-Kontrollhunde an dem für die Virusstaupe typischen Fieberverlauf. Ein Teil dieser Staupe-Kon- trollhunde wurde auf der Höhe des sogenannten zweiten Fieberanstieges getötet. Dieser Fieberanstieg ist durch die Besiedelung und Vermehrung des Virus in den Organen gekennzeichnet.
Bei der Untersuchung der Organe in der Komplementbindungsreaktion (KBR) wurde ein für die Staupe positives Ergebnis erhal- ten. 9 nicht vaccinierte H. c. c.-Kontrollhunde erkrankten mehr oder weniger heftig an H. c. c., 4 davon verendeten nach einigen Tagen. In der KBR konnte ein Befall der Organe mit dem H. c. c.-Virus nachge- wiesen werden.
Neben der Prüfung imTierexperiment wird die erfindungsgemässe SH-Vaccine auf ihren Staupevirus- gehalt an vorbebrüteten Hühnerei geprüft. Ausserdem wurden 12 weitere Versuchshunde mit je 2 ml der oben beschriebenen SH-Vaccine subkutan geimpft. Unmittelbar vor der Impfung und 3 Wochen danach wurden Blutproben entnommen und das Serum im Virusneutralisationstest am vorbebrüteten Hühnerei geprüft. Alle 12 Hunde hatten vor der Impfung keinen, 3 Wochen danach dagegen einen beträchtlichen Blutserumspiegel an staupevirusneutralisierenden Antikörpern, die ein Vielfaches einer infektiösen Virusdosis zu neutralisieren imstande sind.
Beispiel : a) Herstellung des Staupeanteiles der SH-Vaccine
Bei der Herstellung des-lebenden, eiadaptierten, apathogenen Staupevirus enthaltenden Staupeanteiles wird wie folgt verfahren :
8 Tage vorbebrütete Hühnereier werden durchleuchtet, und die Lage des Embryos wird markiert. An der bezeichneten Stelle wird die Eischale angebohrt, so dass eine Öffnung entsteht, durch welche die Chorioallantoishaut mit 0,2 ml einer zien Suspension infiziert wird. Diese Suspension enthält modifiziertes, vom Ei gewonnenes Staupevirus in Aqua dest., dem 1W/o einer 1/15 molaren phosphatpufferLösung vom pH 7, 6 zugegeben wurde. Die Impföffnung wird mit paraffingetränktem japanischem Seidenpapier verschlossen.
Die so behandelten Eier werden 5 Tage bei 370 nachbebrütet und anschliessend ge- öffnet. Die mit Staupevirus bewachsenen Eihäute werden geerntet, gesammelt, im Homogeninsator unter Eiskühlung fein zerkleinert und mit einer Stabilisatorlösung wie folgt zu einer Suspension aufgearbeitet.
Es wird beispielsweise zu 500 ml des zerkleinerten Chorioallantoismaterials eine Stabilisatorlösung zugegeben, die sich aus 400 ml Rinderbouillon vom pH 7,6 und 100 ml einer zuigen Glukoselösung zusammensetzt. Der Staupeanteil der SH-Vaccine besteht demnach aus 50/ovirushaltigemChorioallantioisma- terial, 4W/o Rinderbouillon vom pH 7,6 und lOlo einer 50loigen Glukoselösung. b) Herstellung des H. c. c. - Anteiles der SH-Vaccine
Bei der Herstellung des H. c. c. -Anteiles der SH-Vaccine wird wie folgt vorgegangen.
350 g der H. c. c.-virushaltigen Leber und Milz eines Hundes werden unter Eiskühlung im Homogenisator fein zerkleinert, und das Material wird unter Zugabe von 700 ml Aqua dest. zu einer Suspension aufgearbeitet. Die Suspension wird in einer Flasche gesammelt, mit 0, 51o, d. h. 5, 25 ml 35loige Form- aldehydlösung, versetzt und 1 h im Schüttelapparat kräftig geschüttelt. Die Suspension wird in der Folge dreimal eingefroren und wieder aufgetaut und eine Woche bei Kühlschranktemperatur (etwa 40) aufbewahrt.
Die so behandelte Suspension wird anschliessend 30 min bei 3000 Umdr/min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt.
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Zu 750 ml des gewonnenen Extraktes werden 250 ml einer 2% igen Aluminiumhydroxydiösung zugesetzt. Man erhält somit 1000 ml des inaktivierten H. c. c.-virushaltigen Vaccine-Anteiles, der sich aus 75% H. c. c.-virushaltigem Extrakt und 25% einer 2% igen Aluminiumhydroxydiösung zusammensetzt. Vom H. c. c.-Vaccine-Anteil wird eine Probe zur Bestimmung des freien und des gebundenen Formaldehydgehaltes entnommen.
Der freie Formaldehyd wird durch Zugabe der 1, 5fachen stöchiometrischen Menge an Bisulfit abgebunden. Beträgt beispielsweise der freie Formaldehydgehalt 100 mg%, so werden zu l l H. c. c. -Vaccine- Anteil 26, 9 ml einer 20% igen Bisulfitlösung zugesetzt. c) Herstellung des H. c. c.-Anteiles der SH-Vaccine durch ein von der Gewebekultur gewonnenes
H. e. c. -Virus
Von einer frischen Hundeniere wird unter möglichst sterilen Verhältnissen die Nierenrinde gewonnen.
Diese wird in einer Petrischale gesammelt und zu 4 - 5 mm grossen Stücken zerkleinert. Diese Gewebestückchen werden mit einer Phosphatpufferlösung (PH 7, 5) nach Dulbecco, R. u. Vogt, M. (J. of Exp.
Med. 99 954], S. 167) gewaschen. Im Anschluss daran erfolgt die Trypsinierung der Nierenrindenstückchen mit einer 0, 25% gen Trypsinlösung im Wasserbad bei 370. Durch die Trypsinierung werden aus den Organstückchen einzelne Zellen abgespalten. Die Aufschwemmung dieser losgelöste Zellen wird gesammelt und die Trypsinierung durch Unterkühlung im Eiswasserbad unterbrochen. Durch Zentrifugieren zunächst bei 1000 und nach zweimaligem Waschen mit Phosphatpufferlösung (PH 7,5) bei 600 Umdr/min werden die Trypsinlösung und die in der Aufschwemmung enthaltenen Blutkörperchen entfernt. 1 ml gewaschene Nierenzellen werden jetzt z. B. in einer Mischung von 95 ml Kulturmedium 199 nach Morgan,
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F.aufgeschwemmt.
Zu 100 ml dieser Zellsuspension wird einAntibiotika-Gemisch, bestehend aus 20000 I. E.
Penicillin, 20000 y Streptomycin und 20 000 y Neomycin, zugesetzt und mit einer 2,8%0gen Natrium- bikarbonat-Lösung, die einen Zusatz von 0, 002% phenolrot enthalt, ein pH-Wert von 6,8 eingestellt. Mit dieser Zellsuspension werden sterile Kulturgefässe, z. B. Fernbachkolben, Erlenmeyerkölbchen oder Roll- randröhrchen, mit etwa 81o ihres Fassungsvermögens beschickt. Etwa 4 - 6 Tage nach dem Ansatz müssen die zu dem Epithelrasen auswachsenden Nierenzellen durch Ersatz der Nährlösung gefüttert werden und gegebenenfalls in den nachfolgenden Tagen der pH-Wert mit einer Natriumbikarbonat-Lösung nachgestellt werden.
Sobald der Zellrasen voll ausgebildet ist, wird er mit einer Suspension, die ein aus Hundeleber herausgezüchtetes und durch einige Passagen an die Gewebekultur adaptiertes H. c. c. - Virus enthält, beimpft. Das H. c. c.-Virus wird nach etwa 6 - 7 Tagen, nachdem sich ein vollständiger cytopathogener Effekt ausgebildet hat und eine Loslösung der abgestorbenen Epithelzellen erfolgt ist, durch Abgiessen der Zellsuspension geerntet. Der H. c. c.-Virusgehalt bzw. die Antigenität der Suspension wird durch Beimpfen von Kulturröhrchen in verschiedenen Verdünnungen (Virustitration) oder durch Untersuchung in der Komplementbindungsreaktion (KBR) geprüft.
Die von der Gewebekultur gewonnene H. c. c.-virushaltige Zellsuspension wird mit 0, - 0, 2go = 857o Formaldehydlösung versetzt und zur Inaktivierung 1 Woche lang bei Kühlschranktemperatur (etwa 40) aufbewahrt. Danach werden zu 750 ml der Suspension 250 ml einer 2% igen Aluminiumhydroxydiösung zugesetzt.
Der freie Formaldehyd wird bestimmt und vor der Vermischung mit dem Staupe-Anteil durch die Zugabe der 1, 5fachen stöchiometrischen Menge Bisulfit abgebunden. d) Mischung des Staupe-und H. c. c.-Anteiles der SH-Vaccine
1000 ml des Staupe-Anteiles werden mit 1000 ml des mit Bisulfit behandelten H. c. c.-Anteiles unter Eiskühlung gemischt und zu je 2 ml in Fläschchen abgefüllt. Die so erhaltene Staupe-H. c. c. -Vaccine- Mischung wird im Stehen bei einer Temperatur von-400 eingefroren und in der Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert. Dadurch wird der Impfstoff in eine haltbare und lagerfähige Form übergeführt.
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Process for the preparation of a combined vaccine for dogs
The invention relates to a method for producing a combined vaccine for the immunization of dogs or foxes against distemper and contagious hepatitis (H. c. C.). The distemper and the H. c. c. are two dangerous and widespread canine viral diseases. In addition, foxes and fur animals of the marten family (mustellids) suffer from distemper. The H. c. c. virus is pathogenic except for foxes (fox encephalitis).
Dogs and other susceptible animals can be successfully immunized against distemper. The immunization methods currently practiced are based on the administration of a vaccine which contains a live, egg-adapted, non-pathogenic virus. In addition, the simultaneous administration of a pathogenic virus in connection with immune serum and the inoculation of a vaccine with inactivated virus are also used. Canine distemper was effectively combated by using the above vaccines.
However, these vaccinations do not provide protection against H. c. c.
It has now been found a process for the production of a vaccine for the simultaneous immunization of dogs or foxes against distemper and hepatitis contagiosa canis (H. cc), which is characterized in that a vaccine for the simultaneous immunization of dogs or foxes against distemper and H. c. c. can be produced by treating the parts of the embryonated hen's egg that have been made into a suspension with a H. c. c. - Virus that is obtained from dog livers under dog spleen by extraction or from tissue culture and whose virus-damaging formaldehyde content has been bound by adding a 1.5 to 2 times stoichiometric bisulfite solution, mixed and freeze-dried.
In this connection it is advantageous if the H. c. c. antigen is adsorbed by an aluminum hydroxide solution. The preferred approach is
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The distemper-H obtained according to the method. c. c.-Vaccine (SH-Vaccine) establishes a connection between a living, egg-adapted, apathogenic distemper virus and an inactivated H. c. c. virus. The production of such a mixed vaccine has various advantages. Compared
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and lowered. In particular, there is a saving in filling and packaging material and a substantial reduction in the costs for the lyophilization. In addition, the administration of only one vaccine instead of two simplifies and makes the vaccination process cheaper.
DsrStaupe- and H. c. According to the invention, the c. portion of the SH vaccines must be brought into a special shape so that the two portions cannot be adversely affected. The living distemper virus in particular is very sensitive and is easily damaged and destroyed by chemical, thermal and other influences. For example, in H. c. c. The formaldehyde contained in the vaccine component will destroy the modified distemper virus within 1 hour when it is mixed with the distemper component. We have succeeded in eliminating the virus-damaging properties that are caused by formaldehyde (CH 0) by adding bisulfite (NaHSO).
One proceeds here
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Now the H. c. c. -Vaccine part with the distemper vaccine part under ice cooling, fills and lyophilises the vaccine mixture.
The SH vaccine obtained according to the method was tested on 32 dogs for its immunizing properties both against distemper and against H. c. c. checked. Of the dogs vaccinated with a dose of 2 ml each of the combined vaccine, all of them withstood an artificial infection with active distemper and H. c. c. virus. In contrast, all of the 7 not vaccinated fell ill
Distemper control dogs on the fever that is typical for virus distemper. Some of these distemper control dogs were killed at the height of the so-called second rise in fever. This rise in fever is characterized by the colonization and multiplication of the virus in the organs.
When examining the organs in the complement fixation reaction (CFR), a positive result for distemper was obtained. 9 non-vaccinated H. c. c. control dogs became more or less severely ill with H. c. c., 4 of them died after a few days. In the KBR, an infection of the organs with H. c. c. virus can be detected.
In addition to testing in animal experiments, the SH vaccine according to the invention is tested for its content of distemper virus on pre-incubated hen's eggs. In addition, 12 other test dogs were vaccinated subcutaneously with 2 ml each of the SH vaccines described above. Immediately before the vaccination and 3 weeks afterwards, blood samples were taken and the serum tested in the virus neutralization test on pre-incubated hen's eggs. All 12 dogs had no antibodies in the blood before the vaccination, but 3 weeks afterwards they had a considerable blood serum level of antibodies which neutralize the congestion virus and which are able to neutralize many times an infectious virus dose.
Example: a) Production of the stagnation part of the SH vaccine
The following procedure is used to produce the live, egg-adapted, non-pathogenic distemper virus containing constipation:
Hen eggs that have been pre-incubated for 8 days are x-rayed and the position of the embryo is marked. The egg shell is drilled at the designated point so that an opening is created through which the chorioallantoic skin is infected with 0.2 ml of a zien suspension. This suspension contains modified distemper virus obtained from eggs in distilled water, to which 1W / o of a 1/15 molar phosphate buffer solution of pH 7.6 has been added. The inoculation opening is closed with paraffin-soaked Japanese tissue paper.
The eggs treated in this way are re-incubated for 5 days at 370 and then opened. The membranes overgrown with distemper virus are harvested, collected, finely comminuted in the homogenizer with ice cooling and worked up to a suspension with a stabilizer solution as follows.
For example, a stabilizer solution is added to 500 ml of the comminuted chorioallantoic material, which is composed of 400 ml of beef broth with a pH of 7.6 and 100 ml of a certain glucose solution. The stagnation portion of the SH vaccine therefore consists of 50% ovirus-containing chorioallantioism material, 4% / o beef broth with a pH of 7.6 and 10% of a 50% glucose solution. b) Making the H. c. c. - Share of SH vaccines
When making the H. c. c. -Part of the SH vaccine, proceed as follows.
350 g of H. c. C. virus-containing liver and spleen of a dog are finely chopped in a homogenizer while cooling with ice, and the material is removed by adding 700 ml of distilled water. worked up to a suspension. The suspension is collected in a bottle containing 0.51o, i. H. 5, 25 ml 35 ml formaldehyde solution, added and shaken vigorously in the shaker for 1 h. The suspension is then frozen and thawed three times and stored at refrigerator temperature (around 40) for one week.
The suspension treated in this way is then centrifuged for 30 min at 3000 rev / min and the supernatant is suctioned off.
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250 ml of a 2% aluminum hydroxide solution are added to 750 ml of the extract obtained. This gives 1000 ml of the inactivated H. c. c. virus-containing vaccine content, which is made up of 75% H. c. c. virus-containing extract and 25% of a 2% aluminum hydroxide solution. From H. c. c. vaccine content, a sample is taken to determine the free and bound formaldehyde content.
The free formaldehyde is bound by adding 1.5 times the stoichiometric amount of bisulfite. For example, if the free formaldehyde content is 100 mg%, then l l H. c. c. -Vaccine- portion 26.9 ml of a 20% bisulfite solution added. c) Making the H. c. c. portion of the SH vaccine by a tissue culture obtained
H. e. c. -Virus
The kidney cortex is obtained from a fresh dog kidney under the most sterile conditions possible.
This is collected in a Petri dish and cut into pieces 4 - 5 mm in size. These pieces of tissue are mixed with a phosphate buffer solution (PH 7, 5) according to Dulbecco, R. u. Vogt, M. (J. of Exp.
Med. 99 954], p. 167). The pieces of kidney cortex are then trypsinized with a 0.25% trypsin solution in a water bath at 370. As a result of the trypsinization, individual cells are split off from the pieces of organ. The suspension of these detached cells is collected and the trypsinization is interrupted by supercooling in an ice water bath. The trypsin solution and the blood cells contained in the suspension are removed by centrifuging first at 1000 and after washing twice with phosphate buffer solution (pH 7.5) at 600 rpm. 1 ml of washed kidney cells are now z. B. in a mixture of 95 ml culture medium 199 according to Morgan,
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F. bloated.
An antibiotic mixture consisting of 20,000 I.E. is added to 100 ml of this cell suspension.
Penicillin, 20,000 y streptomycin and 20,000 y neomycin, were added and a pH of 6.8 was set with a 2.8% sodium bicarbonate solution containing 0.002% phenol red. With this cell suspension, sterile culture vessels, e.g. B. Fernbach flasks, Erlenmeyer flasks or roll-rim tubes, loaded with about 81o of their capacity. Approximately 4-6 days after the start, the kidney cells that have grown into the epithelial lawn must be fed by replacing the nutrient solution and, if necessary, the pH value must be adjusted with a sodium bicarbonate solution in the following days.
As soon as the cell layer is fully developed, it is treated with a suspension containing an H. c. C. Grown from dog liver and adapted to the tissue culture through a few passages. c. - contains virus, inoculates. The H. c. c. virus is harvested by pouring off the cell suspension after about 6-7 days after a complete cytopathogenic effect has developed and the dead epithelial cells have been detached. The H. c. c. virus content or the antigenicity of the suspension is checked by inoculating culture tubes in various dilutions (virus titration) or by examining the complement fixation reaction (KBR).
The H. c. Obtained from the tissue culture. Cell suspension containing c. virus is mixed with 0, - 0, 2go = 857o formaldehyde solution and stored for 1 week at refrigerator temperature (about 40) for inactivation. 250 ml of a 2% strength aluminum hydroxide solution are then added to 750 ml of the suspension.
The free formaldehyde is determined and set by adding 1.5 times the stoichiometric amount of bisulfite before it is mixed with the distemper component. d) Mixture of distemper and H. c. c. proportion of the SH vaccine
1000 ml of the distemper portion are mixed with 1000 ml of H. c. Treated with bisulfite. c. portion mixed with ice cooling and filled into bottles of 2 ml each. The so obtained Staupe-H. c. c. -Vaccine mixture is frozen while standing at a temperature of -400 and lyophilized in the freeze dryer. This transforms the vaccine into a durable and storable form.
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