Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen Staupe und Hepatitis contagiosa canis
Es ist ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen Staupe und Hepatitis contagiosa canis bekannt, bei dem man ein aus Hundelebern undloder Hundemilzen durch Extraktion oder aus einer Gewebekultur gewonnenes Hepatitis contagiosa canis-Virus-haltiges Material mittels Formaldehyd inaktiviert, hierauf den freien Formaldehydanteil durch Zusatz einer Lösung von sauren Salzen der schwefligen Säure, insbesondere Natriumbisulfit, abbindet und das so gewonnene Produkt mit einer aus dem embryonierten Hühnerei gewonnenen staupevirushaltigen Suspension mischt und die Mischung gefriertrocknet.
In dem genannten Verfahren wird also neben einem gegen Hepatitis contagiosa canis wirksamen Anteil eine aus dem embryonierten Hühnerei in an sich bekannter Weise gewonnene Staupevirus-haltige Suspension verwendet.
Es wurde nun gefunden, dass man anstelle einer aus embryonierten Hühnereiern gewonnenen Staupevirus-haltigen Suspension eine solche verwenden kann, die aus einer Gewebekultur, z. B. Hundenierengewebekultur, erhältlich ist. Dabei wird das Staupevirus in wenigstens 50 aufeinanderfolgenden Passagen in einer Gewebekultur unter Verwendung einer gepufferten Nährflüssigkeit bei einem pH-Wert von 7 bis 8 gezüchtet, die so erhaltene, das modifizierte Virus enthaltende Nahrflüssigkeit abgeerntet und ge gebenenfalls lyophilisiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur gleichzeitigen Immunisierung von Hunden oder Füchsen gegen Staupe und Hepatitis contagiosa canis, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine aus Hundelebern oder Hundemilzen durch Extraktion oder aus Gewebekultur gewonnenes Hepatitis contagiosa canis-Virus-haltiges Material mittels Formaldehyd inaktiviert, hierauf den freien Formaldehydanteil durch Zusatz einer Lösung, die die 1, 5 bis 2fach stöchiometrische Menge an sauren Salzen der schwefligen Säure, insbesondere Natriumbisulfit, enthält, abbindet und das so gewonnene Produkt mit einer aus einer Gewebekultur gewonnenen, durch wenigstens 50 aufeinanderfolgenden Passagen modifiziertes Staupevirus enthaltenden Suspension mischt und die Mischung gefriertrocknet.
Zweckmässig geht man so vor, dass man ein Mischungsverhältnis von einem gegen Staupe wirksamen Anteil, der aus etwa 25 % eines modifizierten Staupevirus-haltigen Gewebekulturmaterials, 60 % Rinderbouillon vom pH-Wert 7, 6 und 15 % einer 50 % igen Glukoselösung besteht, mit einem annähernd gleich grossen, gegen Hepatitis contagiosa canis wirksamen Anteil, der aus etwa 90 % eines inaktivierten Hepatitis contagiosa canis-Virus-haltigen Extraktes und 10 % einer 2. % igen Aluminiumhydroxydlösung besteht, einhält.
Beispiel
1000 ml einer aus Hundenierenzellen-Gewebekultur gewonnenen, modifiziertes Staupevirus enthaltenden Suspension werden mit 1000 ml einer mit Formaldehyd und Natriumbisulfit behandelten Hepatitis contagiosa canis-Virussuspension unter Eiskühlung gemischt. Je 2 ml dieser so erhaltenen Mischung werden in Fläschchen abgefüllt, im Stehen bei einer Temperatur von-400 C eingefroren und in einer Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert.
Die getrocknete in evakuierten Fläschchen befindliche Substanz stellt eine Vaccine gegen Staupe und Hepatitis contagiosa canis in haltbarer und lager fähiger Form dar.
Prufung auf Vertragliclakeit und Wirksamkeit und Bestimfnung der Antikorpeytiter der gemass der Erfindung hergestellten Vaccine Immunisierung:
7 für das Staupe-und das Hepatitis contagiosa canis-Virus empfängliche 8 Wochen alte Welpen eines Wurfes (Bastarde) werden in einem Isolierzwinger untergebracht. 5 der Hunde werden mit je 1 Dosis = 2 ml der erfindungsgemäss hergestellten Vaccine subkutan vacciniert. Die Vaccine besitzt einen Staupevirustiter von 102 33 TCIDÏo. Die Abkürzung TCID bedeutet Tissue Culture Infectivity Dosis. TCID ;", stellt diejenige Dosis dar, die in 50 % der Gewebekulturen einen cytopathogenen Effekt bewirkt, sie errechnet sich nach der Methode von Reed und Muench (Am. J. Hyg. 27, 493 (1938).
Die beiden unbehandelten Hunde verbleiben als Kontrollen.
Vertraglichkeit :
Alle sieben Hunde bleiben während der Beobachtungsdauer von acht Wochen gesund. Lediglich drei der vaccinierten Hunde zeigen am 4. oder 5. Tage post vaccinationem (p. v.) einem massigen, ephemeren Temperaturanstieg, jedoch ohne sonstige klinische Symptome.
Bestimmung der Antikorper gegen Staupe :
Von sämtlichen Hunden werden vor Versuchsbeginn und 3 Wochen nach der Impfung Serumproben entnommen und auf Antikörper gegen Staupe und Hepatitis contagiosa canis im Virusneutralisationstest untersucht. Alle vaccinierten Hunde besitzen post vaccinationem eine erhebliche Menge an staupevirus-neutralisierenden Antikörpern in ihrem Blutserum, während bei den unbehandelten Kontrolltieren 3 Wochen p. v. keine Staupeantikörper nachweisbar sind. Der durchschnittliche Gehalt der Antikör- per bei den vaccinierten Hunden beträgt 1317740 staupevirus-neutralisierende Dosen (Staupe-VND).
Die Staupe-VND errechnen sich wieder nach der oben zitierten Methode von Reed und Muench. Sie ergeben sich aus der Anzahl der beim Virusneutralisationstest verwendeten Virus-ID0O multipliziert mit dem reziproken 50 % igen neutralisierenden Endwert des geprüften Serums. Sie sind auf 1 ml des unverdünnten Serums bezogen (Dräger, Ackermann, Barth : Medizin und Chemie, Band VI/58 (1958), Farbwerke Hoechst AG., Verlag Chemie, Weinheim/Bergstrasse).
Bestiminung der Antikorper gegen Hepatitis contagiosa canis :
Bei der Untersuchung auf Hepatitis contagiosa canis-Antikörper werden vor der Impfung bei keinem der Hunde Hepatitis contagiosa canis-virusneutralisierende Antikörper festgestellt, drei Wochen p. v. besitzen dagegen alle vaccinierten Hunde einen befriedigenden Gehalt an Hepatitis contagiosa canis-VND.
Im Serum der nicht-vaccinierten Kontrollen lassen sich keine Hepatitis contagiosa canis-Antikörper nachweisen. Der durchschnittliche Gehalt der Serumantikörper bei den vaccinierten Hunden beträgt 987 988 Hepatitis contagiosa canis-VND. Die Errechnung der Hepatitis contagiosa canis-VND erfolgt analog der der Staupe-VND. Während die Staupe VND im embryonierten Hühnerei bestimmt wird, erfolgt die Bestimmung der Hepatitis contagiosa canis-VND in der Gewebekultur aus Hundenierenepithelgewebe.
Belastungsinfektion mit Staupe-Virus
5 Wochen p. v. werden sowohl die vaccinierten als auch die Kontrollhunde mit einem hundepathogenen Staupevirusstamm der Behringwerke AG., Marburg/ Lahn, subkutan infiziert. Der verwendete Virusstamm führt bei staupeempfänglichen Hunden zum sogenannten Virusstadium der Staupe, das charakterisiert wird durch eine zweigipfelige Fieberkurve. Auf der Höhe der 2. Fieberzacke lässt sich Staupevirus in den isolierten Organ der erkrankten Hunde durch die KBR nachweisen.
Nach der Testinfektion bleiben alle vaccinierten Hunde vollkommen gesund und fieberfrei, die beiden unbehandelten Kontrollhunde zeigen dagegen die typischen Symptome einer Staupeinfektion. Das Staupevirus wird durch die Komplementbindungs-Reaktion nachgewiesen.
Belastutagsinfektion mit Hepatitis contagiosa canis-
Vit-us :
14 Tage nach der Infektion mit dem Staupevirus werden alle vaccinierten Hunde unter Zuziehung von Infektionskontrollen auch mit einem hundepathogenen Hepatitis contagiosa canis-Virus infiziert. Alle vaccinierten Hunde bleiben danach gesund und zeigen keinerlei Symptome, die für Hepatitis contagiosa canis sprechen. Die Infektionskontrollen dagegen erkranken mit Fieber an Hepatitis contagiosa canis und verenden schliesslich. Hepatitis contagiosa canis wird bei ihnen durch den Sektionsbefund und den Nachweis des Virus in der Komplementbindungs-Reaktion festgestellt.
Praxisversuch :
Die erfindungsgemäss hergestellte Vaccine wurde unter Praxisbedingungen überprüft. Von 9 verschiedenen Prüfern wurden 292 Hunde mit je 1 Dosis subkutan vacciniert. Die Impflinge wurden auf lokale und allgemeine Verträglichkeit der Vaccine beobachtet. Ausserdem wurden von einem Teil der Impflinge vor und 4 Wochen nach der Impfung Serumproben für die Untersuchung auf virusneutralisierende Antikörper genommen.
Die Vaccine erwies sich als gut verträglich und für die Immunisierung geeignet und führte zu keinen beachtenswerten Nebenerscheinungen. Die Serumproben enthielten stets eine erhebliche Menge von staupevirusneutralisierenden Antikörpern, was die ausgezeichnete Wirksamkeit der Vaccine bestätigt.
Process for the production of a vaccine for the simultaneous immunization of dogs or foxes against distemper and contagious hepatitis
A process for the production of a vaccine for the simultaneous immunization of dogs or foxes against distemper and contagious hepatitis canis is known, in which a material containing hepatitis contagiosa canis virus obtained from dog livers and / or dog spleen by extraction or from a tissue culture is inactivated by means of formaldehyde, the free formaldehyde content is then set by adding a solution of acidic salts of sulphurous acid, in particular sodium bisulfite, and the product obtained in this way is mixed with a suspension containing the concha virus obtained from the embryonated hen's egg and the mixture is freeze-dried.
In the process mentioned, in addition to a component effective against hepatitis contagiosa canis, a suspension containing distemper virus obtained from the embryonated hen's egg in a known manner is used.
It has now been found that, instead of a suspension containing distemper virus obtained from embryonated chicken eggs, one can use one which is obtained from a tissue culture, e.g. B. canine kidney tissue culture. The distemper virus is grown in at least 50 successive passages in a tissue culture using a buffered nutrient fluid at a pH of 7 to 8, the resulting nutrient fluid containing the modified virus is harvested and optionally lyophilized.
The present invention therefore relates to a process for the production of a vaccine for the simultaneous immunization of dogs or foxes against distemper and contagious hepatitis canis, which is characterized in that a hepatitis contagiosa canis virus obtained from dog livers or dog spleen by extraction or from tissue culture containing material is inactivated by means of formaldehyde, then the free formaldehyde content by adding a solution that contains 1.5 to 2 times the stoichiometric amount of acidic salts of sulfurous acid, in particular sodium bisulfite, sets and the product obtained in this way with one obtained from a tissue culture mixing suspension containing at least 50 consecutive passages of modified distemper virus and freeze-drying the mixture.
It is advisable to proceed in such a way that a mixing ratio of a proportion effective against distemper, which consists of about 25% of a modified tissue culture material containing distemper virus, 60% beef broth with a pH of 7, 6 and 15% of a 50% glucose solution, is used an approximately equally large proportion effective against contagious hepatitis canis, which consists of about 90% of an extract containing inactivated canis contagious hepatitis virus and 10% of a 2% aluminum hydroxide solution.
example
1000 ml of a modified canine distemper virus-containing suspension obtained from canine kidney cell tissue culture are mixed with 1000 ml of a hepatitis contagiosa canis virus suspension treated with formaldehyde and sodium bisulfite while cooling with ice. 2 ml each of this mixture obtained in this way are filled into bottles, frozen while standing at a temperature of −400 ° C. and lyophilized in a freeze-drying system.
The dried substance in evacuated vials represents a vaccine against distemper and hepatitis contagiosa canis in a durable and storable form.
Verification of compatibility and effectiveness and determination of the antibody titre of the vaccine immunization produced according to the invention:
7 8-week-old puppies of a litter (hybrids) susceptible to the canine distemper virus and the hepatitis contagiosa virus are housed in an isolation kennel. 5 of the dogs are vaccinated subcutaneously with 1 dose = 2 ml each of the vaccines prepared according to the invention. The vaccine has a congestion virus titer of 102 33 TCIDÏo. The abbreviation TCID means Tissue Culture Infectivity Dose. TCID; "represents that dose which causes a cytopathogenic effect in 50% of the tissue cultures; it is calculated using the method of Reed and Muench (Am. J. Hyg. 27, 493 (1938)).
The two untreated dogs remain as controls.
Contractability:
All seven dogs remained healthy during the eight week observation period. Only three of the vaccinated dogs show a moderate, ephemeral increase in temperature on the 4th or 5th day post vaccinationem (p. V.), But without any other clinical symptoms.
Determination of antibodies against distemper:
Serum samples are taken from all dogs before the start of the experiment and 3 weeks after the vaccination and tested for antibodies against distemper and contagious hepatitis canis in the virus neutralization test. All vaccinated dogs have a considerable amount of post-vaccination-neutralizing antibodies in their blood serum, while the untreated control animals have 3 weeks p. v. no antibodies can be detected. The average level of antibodies in the vaccinated dogs is 1317740 doses that neutralize the distemper virus (distemper-VND).
The distemper VND are again calculated using the above-cited method by Reed and Muench. They result from the number of virus ID0O used in the virus neutralization test multiplied by the reciprocal 50% neutralizing end value of the tested serum. They are based on 1 ml of the undiluted serum (Dräger, Ackermann, Barth: Medicine and Chemistry, Volume VI / 58 (1958), Farbwerke Hoechst AG., Verlag Chemie, Weinheim / Bergstrasse).
Determination of antibodies against contagious hepatitis canis:
When testing for hepatitis contagiosa canis antibodies, antibodies neutralizing hepatitis contagiosa canis virus are not found in any of the dogs before vaccination, three weeks p. v. In contrast, all vaccinated dogs have a satisfactory level of hepatitis contagiosa canis-VND.
No hepatitis contagiosa canis antibodies can be detected in the serum of the non-vaccinated controls. The average level of serum antibodies in the vaccinated dogs is 987 988 Canis contagious hepatitis VND. The calculation of the hepatitis contagiosa canis VND is analogous to that of the distemper VND. While distemper VND is determined in embryonated hen's eggs, canine hepatitis contagiosa VND is determined in tissue culture from canine kidney epithelial tissue.
Stress infection with distemper virus
5 weeks p. v. Both the vaccinated and the control dogs are infected subcutaneously with a canine-pathogenic distemper virus strain from Behringwerke AG., Marburg / Lahn. The virus strain used leads to the so-called virus stage of distemper in dogs susceptible to distemper, which is characterized by a two-peaked fever curve. At the level of the 2nd fever spike, distemper virus can be detected in the isolated organ of the diseased dog by the KBR.
After the test infection, all vaccinated dogs remain completely healthy and free of fever, whereas the two untreated control dogs show the typical symptoms of a congestion infection. The distemper virus is detected by the complement fixation reaction.
Daily exposure to hepatitis contagiosa canis
Vit-us:
14 days after being infected with the distemper virus, all vaccinated dogs are infected with a canine-pathogenic hepatitis contagiosa canis virus using infection controls. All vaccinated dogs remain healthy afterwards and show no symptoms suggestive of contagious hepatitis canis. The infection controls, on the other hand, develop a fever of hepatitis contagiosa canis and eventually die. Canis contagious hepatitis is determined by the autopsy findings and the detection of the virus in the complement fixation reaction.
Practical trial:
The vaccine produced according to the invention was tested under practical conditions. 292 dogs were vaccinated subcutaneously with 1 dose each by 9 different examiners. The vaccinees were observed for local and general tolerance of the vaccines. In addition, serum samples were taken from some of the vaccinees before and 4 weeks after vaccination for testing for virus-neutralizing antibodies.
The vaccine proved to be well tolerated and suitable for immunization and did not lead to any noteworthy side effects. The serum samples always contained a considerable amount of antibodies that neutralize congestion virus, which confirms the excellent effectiveness of the vaccines.