DE2158293B2

DE2158293B2 - Lebende Herpes-Viren der Gruppe B enthaltende Vaccine und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2158293B2
Application number: DE2158293A
Authority: DE
Inventors: Bruce Wixson Calnek; Stephen Ballinger Hitchner
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1970-11-25
Filing date: 1971-11-24
Publication date: 1979-01-25
Also published as: FI49522B; AR196979A1; CH581193A5; PH11064A; IL37849A0; AU3442071A; IT1035519B; DK130796C; BE775747A; IL37849A; DE2158293A1; FR2115379B1; BR7107679D0; FI49522C; GB1374123A; NL7115348A; DK130796B; IE35695B1; JPS5750477B1; IE35695L

Description

Es ist bekannt, normalerweise nicht zellassoziierte Viren mit Albumin oder Casein zu stabilisieren.

Es ist aber bisher nicht gelungen, stabile, zellfreie Viruspräparate aus Viren, die nur in zellassoziiertem ju Zustand lebensfähig sind, herzustellen.

Viele zellassoziierte Viren stehen anscheinend in Zusammenhang mit Vogelleukämie und sind daher in jüngerer Zeit Gegenstand von intensiven Untersuchungen gewesen. Es wird beispielsweise auf das Virus der r> Marekschen Krankheit verwiesen, einer ansteckenden Erkrankung von Küken, bei der in verschiedenen Organen lymphoide Tumore auftreten; vgl. Witter u.a., Avian Dis., 13, 171 bis 184 (1969). Die Mareksche Krankheit ist auf der ganzen Welt von großer wirtschaftlicher Bedeutung, da sie stark ansteckend ist und in Tierbeständen eine Sterblichkeit von über 50 Prozent und einen hohen Grad an Verseuchung bei zur Fleischgewinnung geschlachtetem Geflügel hervorrufen kann. Bisher ist es nicht gelungen, das Virus der 4-, Marekschen Krankheit aus infizierten Zellen zu entfernen und zu isolieren und daraus eine Vaccine mit lebenden Viren herzustellen. Derartige Versuche haben immer zu einem vollständigen Verlust der Infektionskraft des Virus geführt. ,0

Bisher war es also nötig, zellassoziierte Viren zusammen mit den Zeller bei extrem niedrigen Temperaturen, beispielsweise in flüssigem Stickstoff einzufrieren, urr. eine bestmögliche bigerfähigkeit dieser Viren zu erreichen. ->■->

Aufgabe der Erfindung ist es, eine stabile Vaccine mit einem Gehalt an lebenden Herpes-Viren der Gruppe B zur Verfügung zu stellen, bei der die Viren in zellfreiem Zustand vorliegen.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentan- w> Sprüchen definiert.

Auch bei Kenntnis der Tatsache, daß normalerweise nicht zellassoziierte Viren init Albumin oder Casein stabilisiert werden können, war es überraschend, daß ein normalerweise zeilassoziierter Virus außerhalb der b-> Zellen überhaupt lebensfähig sein würde. Oie Stabilisierung beruht erfindungsgemäß nicht nur auf einer Verlängerung von auch ohne Zellen lebensfähigen Viren, sondern darauf, daß Viren, die normalerweise ohne Zellen überhaupt nicht lebensfähig sind, erst die Lebensfähigkeit in zellfreiem Zustand ermöglicht wird. Somit wird erfindungsgemäß eine bisher unbekannte Eigenschaft der bekannten Stabilisatoren ausgenutzt.

Die Vaccinen der Erfindung sind beständig und behalten ihre Wirksamkeit auch nach Lyophilisierung. Sie können bei Kühlschranktemperaturen aufbewahrt und ohne umständliche Kühlung versandt werden. Angesichts der Beständigkeit der erfindungsgemäßen Viruspräparate ist es möglich, lebens- und infektionsfähige zellassoziierte Viren zu erzeugen, die als bequem handhabbares Forschungsmaterial verwendbar sind. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, zellassoziierte Viren aus Zellen zu extrahieren, in denen das Virus abgeschwächt worden ist oder in denen ein Virus von einem Stamm geringer Virulenz vorliegt, der antigenmäßig in Beziehung zu einer speziellen Krankheit steht Die so erhaltenen zellfreien Viren können bei der Herstellung von Vaccinen zur Verhütung von Erkrankungen eingesetzt werden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird durch das Aufbrechen der Zellen eine Freisetzung des intakten, lebensfähigen Virus bewirkt, dessen Lebensfähigkeit durch die erfindungsgemäßen Zusätze gewährleistet wird.

Die erfindungsgemäßen Präparate können in Trokkenform oder in wäßriger Form vorliegen, wobei, wie bereits erwähnt, die Viren vorher nach an sich bekannten Verfahren abgeschwächt sein können. Beispielsweise kann das Herpes-Virus der Marekschen Krankheit, d.h. der Stamm H PRS-16 zur Immunisierung gegen die Mareksche Krankheit verwendet werden; vgl. C h u r c h i 11 u. a., J. Gen. Viral., 4,564 bis 577 (1969), und Nature, 221, 744 bis 747 (1969). Auch die Impfung mit dem Staiiim FC-126 des Truthahn-Herpes-Virus ergibt einen Schutz gegen die Mareksche Krankheit.

Beispiele für Herpes-Viren der Gruppe B, die in den erfindungsgemäßen Vaccinen enthalten sein können, werden von M e 1 η i c k in J. Immunol., 92, 595 bis 601 (1964), beschrieben. Beispiele für derartige zellassoziierte Viren sind Varicella-Herpes-Zoster-Virus,Cytomegalovirus, Burkitt-Lymphom-Virus, Lucke-Tumor-Virus, Truthahn-Herpes-Virus und das Virus der Marekschen Krankheit.

Die Vaccinen enthalten vorzugsweise zusätzlich ein Stärkederivat, insbesondere dann, wenn die Präparate zur Lyophilisation vorgesehen sind. Ferner können auch andere Hilfsstoffe, wie Puffer enthalten sein. Als brauchbare und wirtschaftlich zweckmäßige Albuminquelle hat sich Rinderserum erwiesen. Magermilch stellt eine zweckmäßige Caseinquelle dar. Der Stabilisatoranteil, der mit den infizierten Zellen zu Stabilisisierungszwecken zu dispergieren ist, variiert in Abhängigkeit von der Dichte des zellförmigen Materials, der relativen Konzentration des vorliegenden Virus unf anderen ähnlichen Faktoren. Zweckmäßigerweise wird der Stabilisator dem Zellmaterial in Form eines trockenen Pulvers oder einer verdünnten, wäßrigen Lösung unter gründlichem Mischen bei niedrigen Temperaturen zugesetzt, um eine homogene Suspension des zellförmigen Materials im Stabilisator zu erhalten.

Vorzugsweise wird das infizierte zellförmige Material in einer wäßrigen Lösung suspendiert, in der der Stabilisator in einer Konzentration von etwa 0,1 Gew./Vol.-% gelöst ist. Auch Stabilisatorkonzentrationen von etwa 1 Gew./Vol.-% sind akzeptabel. Auch höhere Konzentrationen können angewandt werden,

solange der Stabilisator im wesentlichen im wäßrigen Medium gelöst ist Generell wird die Stabilisatorkonzentration so gewählt, daß eine homogene Suspension des zellförmigen Materials im Stabilisator erhalten wird.

In der Praxis kann es erwünscht sein, die Konzentration des zellförmigen Materials zur Erzielung spezieller Virustiter einzustellen. Die Schutzwirkung des Stabilisators unterliegt dabei keiner wesentlichen Veränderung, solange die angegebenen Konzentrationen im wesentlichen eingehalten werden.

Wie bereits erwähnt, bewirkt in Fällen, bei denen das zellfreie Viruspräparat zur Lyophilisation vorgesehen ist, die Zugabe eines Stärkederivats zum flüssigen Präparat vor dem Trocknen, daß die Aktivität des trockenen, zellfreien Viruspräparats in hohem Maße aufrechterhalten wird.

Das Stärkederivat kann getrennt zum zellfreien Präparat oder vor dem Aufbrechen der Zellen mit dem Stabilisator zugesetzt werden. Es sind praktisch alle Stärkederivate in Kombination mit dem Stabilisator einsetzbar. Beispiele dafür sind Stärkehydrolysate, wie Rohzucker (Saccharose), Dextran oder Traubenzucker (Glucose). Besonders bevorzugt wird Rohrzucker. Eine direkte Beziehung der Konzentration des Stabilisators zur Konzentration des Stärkederivats im Hinblick auf die Erzielung von trockenen, zellfreien Viruspräparaten von hohem Titer besteht nicht.

Gegebenenfalls kann der Stabilisator PufferzusätZ' in ausreichender Menge enthalten, um einen relativ optimalen pH-Wert, vorzugsweise von 6,5 bis 7,5, für das Virus im Stabilisator aufrechtzuerhalten. Dementsprechend ist ein Gemisch aus Rinderalbumin, Rohrzucker und einem Puffer, wie einem Alkaliphosphat, ein brauchbarer Stabilisator. Gegebenenfalls kann auch ein Zusatz von Alkaliglutamaten erfolgen, der jedoch nicht notwendig ist, um die Aktivität und die Stabilisierungswirkung aufrechtzuerhalten.

Beispiele für andere Stabilisatorgemische neben Albumin oder Casein im Gemisch mit Rohrzucker sind:

a) Albumin und Rohrzucker,

b) Albumin,Rohrzuckerund Alkaliglutamate,

c) Casein und Rohrzucker,

d) Casein, Caseinhydrolysat und Traubenzucker,

e) Albumin, Rohrzucker und Alkaliphosphate,

f) Rinderalbumin, Rohrzucker, Alkaliphosphate und Alkaliglutamate,

g) Caseinhydrolysat und Traubenzucker und

h) Caseinhydrolysat, Rohrzucker, Alkaliphosphate und Alkaliglutamate.

Ein in der Praxis bevorzugter Stabilisator ist das allgemein als SPGA bekannte Gemisch (vgl. Bo ν a Γη ick u.a., ). Bact., 59, 509 bis 522 [1950]). Dieser Stabilisator enthält gelöst in 100 ml destilliertem Wasser 7,46 g Rohrzucker, 0,05 g Monokaliumphosphat, 0,16 g Dikaliumphosphat, 0,01 g Mononatriumglutamat und 1,0 g Rinderalbuminpulver. Ein Einsatz dieses SPGA-Stabilisators in einer Konzentration von 10 Gewichtsteilen pro 1 Teil zel'förmiges Material führt zu ausgezeichneten Ergebnissen. Auch in so hohen Konzentrationen, wie etwa 150 Gewichtsteilen, führt dieser Stabilisator zu zufriedenstellenden Ergebnissen. Diese Stabilisatorkonzentrationen liegen, wie ersichtlich, innerhalb der vorgenannten Bereiche.

Die erfindungsgemäßen Produkte werden zweckmäßigerweise unter keimfreien Bedingungen unter Verwendung von Bestandteilen, die vorher bakterienfrei eemacht worden sind, behandelt bzw. verarbeitet.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Sofern nichts anderes angegeben ist, sind die Konzentrationen der Bestandteile in Gew7Vol.-% ausgedrückt.

Virusstämme

In den Beispielen werden drei stark zellassoziierte Herpes-Virus-Stämme verwendet Es handelt sich um den Truthahn-Herpes-Virus-Stamm FC-126, den JM-Stamm der Marekschen Krankheit und den GA-Stamm der Marekschen Krankheit

a) Das ]M-Stamm-Virus der Marekschen Krankheit ist stark zellassoziiert und steht antigenmäßig in Beziehung zum Herpes-Virus von Truthähnen, ist aber von infektionsfähigen Laryngitis-Tracheitis- und Entenvirus-Enteritisviren verschieden. Dieses Virus ist als JM-Stamm bezeichnet und unbeschränkt bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C, hinterlegt und deren bleibender Virensammlung unter ATCC-VR-Nr. 585 einverleibt worden. Es wurde ferner bei der Aufbewahrungsstelle der Cornell University hinterlegt und deren Sammlung einverleibt, in der es unter der Zugangsnummer RT-711 verfügbar ist. Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung und der Charakteristiken des JM-Stammes haben Sevoian u. a., Vet. Med., 57,500 bis 501 (1962), gegeben.

b) DerTruthahn-Herpesvirus-Stamm FC-126 ist stark zellassoziiert und steht antigenmäßig in Beziehung zu dem Virus der Marekschen Krankheit bei Küken. Er übt beim Impfen von 1 Tag alten Küken, die anschließend mit dem Virus der Marekschen Krankheit infiziert werden, eine Schutzwirkung aus.

Das Herpesvirus ist als FC-126 (HVT) bezeichnet und unbeschränkt bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C, hinterlegt und deren bleibender Virensammlung unter ATCC-VR-Nr. 584 einverleibt worden. Ferner erfolgte seine Hinterlegung bei der Aufbewahrungsstelle der Cornell University, in deren Sammlung es unter Zugangsnummer RT-720 verfügbar isi. Eine mehr ins einzelne gehende Beschreibung des Stamms geben Witter u.a., Am.J.Vet.Res., 31, 525 bis 538 (1970), und Okazaki u.a., Avian Dis., 14, 413 bis 429 (1970).

c) Auch das GA-Stamm-Virus der Marekschen Krankheit ist stark zellassoziiert. Dieses Virus ist als GA-Stamm bezeichnet und unbeschränkt bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C, hinterlegt und deren bleibender Sammlung unter ATCC-VR-Nr. 624 einverleibt worden. Eine Hinterlegung erfolgte auch bei der Aufbewahrungsstelle der Cornell University, bei der es unter Zugangsnummer RT-743 verfügbar ist. Eine detaillierte Beschreibung des GA-Stamms und seiner Herstellung findet sich in E i d s ο η u. a., Avian Dis. 12, 467 bis 475 (1968).

Beispiel 1

Für die folgenden Versuche 1 bis 3 wurde das oben beschriebene Virus des JM-Stammes eingesetzt, das nach folgender Methode aus zwei Hautansätzen frisch getöteter Küken gewonnen wurde, die mit dem JM-Stamm-Virus der Marekschen Krankheit infiziert worden waren: Hautstreifen, von denen die Federn an der Oberfläche abgeschnitten worden waren, wurden im Gew./Vo!.-Verhältnis von 1 : 5 oder 1:10 mit phosphat-

gepufferter Salzlösung (pH 6,8) gemischt, kleingehackt, 5 Min. in einem Mischer homogenisiert und 2 Min. mit einem Zeübrechgerät bei einer Leistungseinstellung auf 7 (26 bis 32 mA) mit Ultraschall behandelt, worauf die Suspension durch Schleudern bei 650 χ g geklärt und die überstehenden Anteile bei —65° C gefroren wurden. Die Produkte waren als von lebensfähigen Zellen frei zu beurteilen. In Versuch 1 bis 3 wurden die Virussuspensionen aufgetaut und dann — nach den verschiedenen, nachfolgend beschriebenen Behandlungen — in 1- oder 2-ml-Anieilen wieder gefroren oder lyophilisiert.

Für Versuch 4 bis 8 wurde eine etwas andere Methode gewählt. Als Quellen für JM-, GA- und FC-126-Viren dienten stark infizierte (CPE über 75%) 50-mm-Petrischale-Kulturen. Beide Stämme des Virus der Mareksehen Krankheit wurden in Kükennieren-Kulturen gezüchtet. Bei den Ansätzen 643 und 659 wurde das Truthahn-Herpesvirus in Kükennieren-Zellen gezüchtet Bei Ansatz 654 wurde das Truthahn-Herpesvirus in Kükenembryo-Fibroblasten gezüchtet Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und pro Kultur mit 2 ml (Versuch 6), 2,5 ml (Versuche 4, 5 und 7) oder 5 ml (Versuch 8) eines von zwei Suspendiermedien ersetzt. Die Zellen wurden mit einem Stab mit Gummifahne freigeschabt und die Ernten von 4 oder 5 Kulturen (1 Kultur pro Behandlung in Versuch 8) vereinigt. Jede Suspension wurde 2 Min. beschallt, und aliquote 1-ml-Anteile wurden bei -65⁰C gefroren oder lyophilisiert.

Zellen von anderen Kulturen wurden nach auf die Bewahrung ganzer Zellen ausgelegten Techniken und mit Dimethylsulfoxid als Schutzmittel nach der von Spencer u.a., Avian Dis., 11, 274 bis 287 (1967), beschriebenen Methode geerntet und bei -65°C gefroren.

In Versuch 9 und 10 wurde ein Suspension von mit HVT infizierten Kükenembryo-Fibroblasten eingesetzt, die als Leber.dganzzellen bei — 196° C gefroren worden waren und aufgetaut und im Verhältnis von 1 :30 (Versuch 9) oder 1 :40 (Versuch 10) in verschiedenen Suspendierflüssigkeiten (vgl. Tabelle III) verdünnt wurden. 5-nil-Anteile wurden 1 Min. beschallt, und aliquote 1-ml-Anteile wurden bei — 65°C gefroren oder lyophilisiert.

ist, daß er auf den Virustiter keine wesentlichen Auswirkungen hat Im zweiten und dritten Versuch wurden zusätzliche Tests mit SPGA-Stabilisator durchgeführt.

^r> In Versuch 4 bis 8 wurden zwei Lösungen eingesetzt, nämlich phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) vom pH-Wert 6,8 und SPGA.

Für Versuch 9 und 10 wurden in Phosphatpuffer (0,0038 Mol Monokaliumphosphat und 0,0027 Mol iu Dikaliumphosphat) angesetzt:

a) 0,218 Mol Rohrzucker (S),

b) 0,0049 Mononatriumglutamat (G),

c) S und G,

ι-j d) 1% Rindsalbuminpulver (A).

e) A und S,

f) A und G,

g) A, G, S,

h) 8% nichtfette Trockenmilch, 2% N-Z-Amin Typ

20 ^AS·

i) 8% nichtfette Trockenmilch.
Ferner wurden eingesetzt:

a) unverdünntes Rindsfetalserum (BFS),

b) 15% BFS in Gewebekultur-Medium Nr. 99 (M 199), ,- c) 10% Dimethylsulfoxid und 10% Tryptosephospha'.-BrüheinM 199.

In allen Versuchen wurden lyophilisierte Proben mit destilliertem Wasser rekonstituiert (hergerichtet).

JO

r> Lyophilisierung

Proben in 5-ml-Serumflaschen mit gespaltenen Gummistöpseln wurden in einem getrennten mechanischen Gefriergerät bei — 65°C vorgefroren oder auf den gekühlten Tellern des Gefriertrockners bei -6O⁰C gefroren. Nach 24 Std. Trocknen unter Vakuum bei 38°C unter Wärmezufuhr zu den Trocknertellern erfolgte eine zusätzliche Trocknung von etwa 15 Std. Dauer bei einer Tellertemperatur von 21⁰C. Die Flaschen wurden inter Vakuum verschlossen und bei 4°C bis zur Virusbestimmung aufbewahrt, die 1 bis 10 Tage nach der Virusverarbeitung erfolgte.

Stabilisatoren und Verdünnungsmittel

Im ersten Versuch wurden folgende Lösungen eingesetzt:

1. 20% Traubenzucker.

2. Magermilch-Stabilisator, bestehend aus 8% nichtfetter Trockenmilch und 2% Caseinhydrolysat in Sorensen-Puffer vom pH 6,2 zuzüglich 5% Traubenzucker.

3. Stabilisator SPGA (vgl. B ο ν a r η i c k u. a., J. Bact., 59, 509 bis 522 [1950]); die Mischung enthielt 0,218 Mol Rohrzucker, 0,0038 Mol Monokaliumphosphat, 0,0072 Mol Dikaliumphosphat, 0,0049 Mol Monona- _b() triumglutamat und 1% Rinderalbuminpulver.

4. SPG-Caseinhydrolysat, ein dem SPGA entsprechendes Präparat, bei dem das Rinderalbumin durch 1% pankreatisch aufgeschlossenes Casein ersetzt war. _h-,

Der pH-Wert der verschiedenen Lösungen variierte zwischen etwa 6.2 und 7.0. ein Bereich, von dem bekannt Virusbestimmungen

In allen Versuchen wurde jede Probe zwei abgetropften 24-Std.-Kükennieren-Kulturen unmittelbar nach dem Auftauen oder Rekonstituieren eingeimpft. Bei den aus infizierten Zellkulturen extrahierten Viren der Marekschen Krankheit wurden in dem einen oder anderen Falle zur Steigerung der Bestimmungsempfindlichkeit 0,2% Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugesetzt. Zur Sicherung einer Infektionsrate, die die Zählung einzelner Foki erlaubt, wurden in dem einen oder anderen Falle auch Zehnfachverdünnungen geimpft. Das Verdünnungsmittel entsprach dem Suspendiermedium. Die Zellkultur-Bewertung erfolgte nach der Methode von C a 1 η e k u. a., J. Nat. Cancer Instit., 45, 341 bis 351 (1970). Fokale Läsionen wurden 8 Tage (beim Virus der Marekschen Krankheil) oder 6 Tage (beim Truthahn-Herpesvirus) nach der Impfung gezählt. Unter Heranziehung der Fokuszahlen von zwei Wiederholungskulturen und des Verdünnungsfaktors wurde die Zahl der fokusbildenden Einheiten (FFU)/ml unverdünntes Virus Eeschätzt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den Tabellen I, Il und III zusammengestellt. Die Untersuchungen mit dem JM-Isolat des Virus der Marekschen Krankheit von Hautextrakten (Tabelle I) zeigten, daß

1. das Virusüberleben nach Lyophilisierung durch den Einsatz von 20% Traubenzucker als Stabilisator leicht verstärkt und durch SPGA oder SPG-Caseinhydrolysat deutlich verbessert wurde.

2. SPGA-Zusatz zu nichtlyophilisierten Virussuspensionen eine Titererhöhung von mehr als dem Zweifachen ergab und

3. die höchsten Titer von mit SPGA lyophilisierten Proben erhalten wurden.

Aus den Versuchen mit Viren aus Zellkulturen (Tabelle 11) ist leicht zu ersehen, daß

1. beide Stämme des Virus der Marekschen Krankheit mit SPGA auf einen höheren Titer als mil PBS als Suspendiermedium extrahiert wurden,

2. wiederum die Lyophilisierung mit SPGA-Stabilisator für das Virus der Marekschen Krankheit erfolgreich verlief,

3. die Ausbeuten von mit extrahiertem Truthahn-Herpesvirus infizierten Kulturen viel höher als diejenigen von mit Virus der Marekschen Krankheit infizierten Kulturen waren, wenngleich sich auch für das zellassoziierte Infektionsvermögen ähnliche Titer ergaben, und

4. für die Titer von mit PBS extrahiertem Truthahn-Herpesvirus ähnliche Werte wie beim Einsatz von Zcllkulturmedium zur Extraktion entsprechend der Beschreibung von W i 11 e r u. a., Am. J. Vet. Res., 31, 525 bis 538 (1970), erhalten wurden.
Die SPGA-Extrakttiter betrugen oft das 30- bis 50fache derjenigen der PBS-Extrakte, und der Überlebensprozentsatz nach Lyophilisierung betrug gewöhnlich 30 bis 40% oder mehr im Vergleich mit unter 1 % bei den entsprechenden Extrakten.

In Versuch 2, 4, 6 und 7 erfolgten erneute Bewertungen des lyophilisierten Virus nach 17- bis 44lägiger Lagerung bei 4°C. Die Virustiter erwiesen sich als gegenüber den bei den ursprünglichen Bewertungen erhaltenen unverändert.

Die Versuche 9 und !0 (Tabelle !!!) zeigten, daß Albumin allein oder zusammen mit Rohrzucker und/oder Glutamat einen brauchbaren Stabilisator für die Virusextraktion darstellt, aber der Rohrzucker-Zusatz von Vorteil ist, um die Überlebensrate während der Lyophilisierung zu erhöhen. Auch nichtfette Trockenmilch allein oder in Kombination mit Caseinhydrolysat war ein brauchbarer Stabilisator für Extraktionen, und das Virus war lyophilisierbar. Andere Substanzen schienen während der Extraktion eine partielle Stabilisation zu ergeben (z.B. Rindsfetalserum, 10% BFS in M 199 oder 10%-Dimethylsulfoxid-10%-Tryptosephosphate-Brühe in M 199), waren aber den obigen Materialien ode Kombinationen unterlegen.

Tabelle I

Auswirkungen verschiedener Behandlungen und Stabilisatoren auf den Titer von aus Haut extrahiertem, zellfreiem Stamm-JM-Herpesvirus der Marekschen Krankheit

Abkürzungen	fokusbildende Einheiten	nicht geprüft	6,8)	Virus, FFU/ml
FFU	phosphatgepufferte Salzlösung (pH	Behandlung		lyophilisiert/
PBS		Virusansatz Verdünnungsmittel und		mit Wasser
SPGA		Verdünnung		rekonstituiert
	SPG-Casein- Stabilisaloren (vergl. Beschreibung;			100
hydrolysat \|	X-300 keines	Unverdünntes	690
	20% Traubenzucker; 1: 2	nicht-	360
Versuch	Magermilch,	lyophilisiert
	5% Traubenzucker; 1:5		4,900
	SPGA; 1:5	2,800	3,120
	SPG-Caseinhydrolysat; 1:5	1,680	10
1	X-311 keines	2,400	480
	SPGA; 1 :5		-
	X-300 keines	5,600	-
	PBS; 1:10	4,800	—
		690
	SPGA: 1 :10	1,330
2		2,160
		2,880
3	4.000

ίο

Tabelle II

Auswirkungen verschiedener Behandlungen und Stabilisatoren auf den Titer von zellfreien Präparationen von Herpesvirus, JM- und G A-Stamme, der Marekschen Krankheit (MDHV) und Stamm-FC-no-Truthahn-Herpesvirus (HVT), aus infizierten Zellkulturen extrahiert Abkürzungen:

PBS	phosphatgepufferte Salzlösung	Behandlung	Verdünnungsmittel für	PBS	0	■	3,850")
SPGA	Stabilisator				910	Extraktion, FFU/ml	398,000
FFU	fokusbüdende Einheiten		Ganzzell-	120	5		125,000
-	nicht durchgeführt		susperision	0^b)	49,400	SPGA	147,000
Versuch	Virusart und	gefroren	58,000	170	0		72,000
	-stamm	lyophilisiert	-	0^b)		220	144,000
		gefroren	94,000	1,370		820")	96,000
		lyophilisiert	-		-
4	MDHV(JM)	gefroren	68,000
		lyophilisiert	-
5	MDHV(GA)	gefroren	190,000
		lyophilisiert	-
6	HVT(FC 126)	gefroren	240
		lyophilisiert	-
7	HVT(FC 126)	") Bewertung unter Zusatz von 0,2% EDTA zun	ι Inokulum.

8	HVT(FC 126)

Die Werte der folgenden Tabelle beziehen sich auf und schließlich auf 1 :30 (Versuch 9) oder 1 :40

Versuche, bei denen die Donatorzellen (Virusquelle) als r> (Versuch 10) verdünnt wurden, bevor die Extraktion in

Ganzzellsuspension mit Dimethylsulfoxid als Schutzmit- den verschiedenen Medien durch Ultraschallbehand-

tel gefroren und dann aufgetaut, in Puffer gewaschen lungerfolgte.

Tabelle III

Auswirkungen verschiedener Stoffe im Suspendiermedium auf den Titer zellfreier Präparationen des Truthahn-Herpesvirus (HVT), Stamm FC 126, aus infizierten Zellkulturen extrahiert

Abkürzung:
FFU

fokusbüdende Einheiten

Suspendiermedium

Verdünnungsmittel für Extraktion, FFU/ml

Versuch 9 Versuch 10

gefroren lyophilisiert gefroren lyophilisiert

Phosphatpuffer allein

Materialien im PhosphatpufTer: Rohrzucker (0,218 Mol) Glutamat (0,0049 Mol) Rohrzucker und Glutamat Rindsalbumin (1%) Rindsalbumin und Rohrzucker Rindsalbumin und Glutamat Rindsalbumin, Rohrzucker und Glutamat (SPGA-Formulierung) Nichtfette Trockenmagermilch (8%) und N-Z-Amin (2%) Nichtfette Trockenmagermilch (8%)

10	0	nicht durchgeführt
10	0	nicht durchgeführt
10	0	nicht durchgeführt
3,500	25	nicht durchgeführt
3,950	1,200	nicht durchgeführt
1,925	75	nicht durchgeführt
5,650	560	2,400 1,520
2,760	85	nicht durchgeführt
nicht	durchgeführt	840 110

Fortset/ung

Suspendiermedium

Verdünnungsmillel Tür Extraktion, FFU/ml

Versuch 9 Versuch 10

gefroren lyophilisiert gefroren lyophilisiert

Verschiedene

Nichtverdünntes Rindsfetal- 100

serum (BFS)

BFS (15%) in Gewebekultur- 50

medium 199 (M 199)

Dimethylsulfoxid (10%) und 35

Tryptosephosphatbrühe in M 199

Diese Ergebnisse zeigen, daß sich hohe Ausbeuten an Virus der Marekschen Krankheit oder Truthahn-Herpesvirus durch Extraktion in Gegenwart von oder unter Verdünnung in Stabilisator für das Virus erzielen lassen und daß eine Lyophilisierung ohne wesentlichen Titerverlust durchgeführt werden kann. Ferner zeigen die obigen Werte, daß die stabilen, zellfreien Virussuspensionen gemäß der Erfindung Titer von 10³ oder darüber im Falle der Viren der Marekschen Krankheit haben, und daß der Titer der Suspension des Truthahn-Herpesvirus 10⁵ oder mehr beträgt. Die Ergebnisse zeigen weiter, daß eine Extraktion in Gegenwart von Rindsfetalserum mit oder ohne Gewebekulturmedium zu einem Virus von extrem niedrigem Titer führt, was einen nahezu vollständigen Verlust der Wirksamkeit als mögliche Vaccine zeigt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit in überraschender Weise eine sehr wirksame Extraktion von 0 0 0

nicht durchgeführt
nicht durchgeführt
nicht durchgeführt

zeilassoziiertem Virus aus infizierten Zellen durch Einsatz der Proteine Albumin oder Casein wie auch von albumin- oder caseinhaltigen Materialien, wobei man jedes dieser auch in Kombination mit Zusatzstoffen, wie Rohrzucker, verwenden kann.

Das zur Freisetzung des intakten, lebensfähigen Virus aus den Zellen führende Aufbrechen und Sprengen der Zellen ist zu Erläuterungszwecken im vorliegenden

2j Beispiel durch Ultraschallbehandlung erfolgt. Jedoch können naturgemäß auch andere Techniken Anwendung finden, wie Gefrieren und Wiederauftauen sowie Niedertemperatur-Homogenisieren. Die einzigen Kriterien des Extraktionsverfahrens gemäß der Erfindung

in liegen darin, daß das Aufbrechen und Brechen der Zellen durchzuführen sind, wenn die Zellen in dem Stabilisator für das Virus dispergiert sind, um das zellfreie Virus in einem lebensfähigen Zustand zu erhalten.

Beispiel 2

Es wurde das Wirkungsvermögen (Infektivitätstiter) zellfreier Präparationen von mit Truthahn-Herpesvirus infizierten Zellen nach Ultraschallbehandlung in Lösungen, die Rinderalbumin (Serumfnktion V) als Stabilisator in verschiedenen Konzentrationen enthielten, wie folgt bestimmt:

Es wurden Primärkulturen von Kükenembryo-Fibroblastenzellen (CEF) mit dem Stamm FC-126 des Truthahn-Herpesvirus beimpft. Nach 3tägiger Inkubation wurden die infizierten Zellen in 210-Petrischalen (60 mm) nach herkömmlichen Trypsinierungstechniken geerntet, wobei die Ausbeute 1,4 χ 10⁹ Zellen betrug. Die »gepackten« bzw. verdichteten Zellen, deren Volumen in diesem Zustand nach 10 Min. Schleudern bei 1200 U/Min, etwa 3 ml betrug, wurden mit 60 ml Gewebekulturmedium (Medium 199 zuzüglich 10% Tryptosephosphatbrühe) wieder suspendiert. Sechs aliquote 10-ml-Anteile wurden in Röhrchen gegeben und erneut geschleudert, worauf das Zellvolumen im verdichteten

Tabelle IV

Zustand etwa 0,5 ml/Röhrchen betrug. Das überstehende Gut wurde verworfen, und die infizierten Zellen wurden zur Erzielung einer Volumenverdünnung von 1 :5 (VoL/Vol.) wieder in 2,0 ml Phosphatpuffer suspendiert, der verschiedene Mengen an Albumin enthielt. Durch zusätzliche Verdünnung dieser Suspensionen wurden Volumenverhältnisse von 1 :10 und 1 :100 in den entsprechenden Verdünnungsmitteln hergestellt.

Jede Probe wurde 45 Sek. mit Ultraschall behandelt und dann sofort in einem Stabilisator aus 6,7% Rohrzucker und 1% Rinderalbumin in Phosphatpuffer auf ein Volumenverhältnis von 1:10 verdünnt und bei -70° C gefroren.

Zur Bewertung wurden abgetropfte 24-Std.-Primär-Kulturen von CEF-Zellen mit lOfach-Reihenverdünnungen beimpft. 5 Tage nach der Inokulation wurden die Foki gezählt.

55

Volumen-	Fokusbildende Einheiten/ml (X 10⁶) nach	einem Gehalt an	Ultraschallbehandlung	in den
Verhältnis	Verdünnungsmitteln mit		Aibumin von
der Zellen zum		0,25%
Verdünnungsmittel	1% 0,5%	0,1 %	0,05%

1:5
1:10

5,5
(27,5)^a)

1,4
(14,4)

5,5
(27,5)

1,8
(18,0)

6,0
(30,0)

2,2
(21,6)

5,5
(27,5)

2,8
(27,6)

2,3

(11,5)

1,0

(9,6)

Fortsetzung

Volumen- Fokusbildende Einheiten/ml (X IO⁽') nach Ultraschallbehandlung in den

Verhältnis Verdünnungsmitteln mit einem Gehalt an Albumin von

der Zellen zum

Verdünnungsmittel 1% 0,5% 0,25% 0,1% 0,05%

1 : 100	0,17 (16,8)	0,24 (24,0)	0,26 (26,4)	0,28 (27,6)	0,14 (14,4)
Durchschnittliche Ausbeute pro ml Zelle im verdich teten Zustand, FFU X 10''	19,6	23,2	26,0	27,6	11.8

^a) Klammerwerte geben die Zahl fokusbildender Einheiten (X 10⁶) pro ml Zelle im verdichteten Zustand an (Zahl pro ml X Verdünnungsfaktor).

Wie die Werte von Tabelle IV zeigen, erwies sich das Verhältnis der Zellen zum Verdünnungsmittel nicht als kritischer Faktor (die Ausbeuten entsprachen der Zahl vorliegender Viruszellen), und die geringe Albuminmenge von 0,1 Gew./Vol.-°/o reichte aus, um eine Schutzwirkung auf das Virus zu erzielen, so daß ein hoher Virustiter während und nach der Aufbrechbehandlung aufrechterhalten wurde. Auch ist zu ersehen, daß eine Konzentration von 0,05% eine gewisse Schutzwirkung ergab, jedoch keine solche, wie die Konzentrationen von 0,1 bis l,0Gew./Vol.-%.

Beispiel 3

Der folgende Versuch diente der Bestimmung des Oberlebens von zellfreiem Truthahn-Herpesvirus, das durch Ultraschallbehandlung von infizierten, in einem der Stabilisatoren gemäß der Erfindung (Rohrzucker, Phosphatpuffer und Rindsalbumin) suspendierten CEF-Zellen extrahiert und dann nach Verdünnung auf 1:10 in Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen an Rohrzucker und Rindsalbumin in Phosphatpuffer lyophilisiert wurde.

Mit Truthahn-Herpesvirus (Stamm FC-126, erhalten wie in Beispiel 2) infizierte CEF-Zellen-Primärkulturen wurden in einem Stabilisator aus 7,6% Rohrzucker und 1 % Rinderalbumin, Serumfraktion V, in Phosphatpuffer (SPA) im Volumenverhältnis von 1 Raumteil verdichtete Zellen auf 20 Raumteile SPA-Stabilisator verdünnt. Die Suspension wurde 1,5 Min. mit Ultraschall behandelt und dann über Nacht auf — 70⁰C eingefroren. Nach dem Auftauen wurde die zellfreie Virussuspension in jeweils einem von vier Verdünnungsmitteln (10% Rohrzucker, 10% Rohrzucker plus 1% Albumin, 1% Albumin (jeweils in Phosphatpuffer) oder Phosphatpuffer allein) auf 1 :10 verdünnt. Durch Vermischen der entsprechenden Mengen von in 10% Rohrzucker plus Albumin verdünntem Virus mit in nur Albumin verdünntem Virus wurden verschiedene Rohrzucker-Konzentrationen unter Beibehaltung der gleichen Albumin-Konzentrationen hergestellt Weiter wurden ähnliche Mischungen von Virus in Rohrzucker oder Phosphatpuffer hergestellt, die alle auf Grund des Albumins in dem zur Herstellung der 1 :10-Verdünnung eingesetzten Virusmaterial eine Albumin-Endkonzentration von 0,1% hatten.

Jede Mischung wurde dann in aliquoten 1-ml-Anteilen lyophilisiert.

Zur Bewertung wurde jede Ampulle mit 1 ml destilliertem Wasser rekonstituiert, worauf zur Beimpfung von angetropften CEF-24-Std.-Primär-Doppelkulturen Zehnfach-Verdünnungen hergestellt wurden. 5 Tage nach der Beimpfung erfolgte eine Auszählung der Foki und Errechnung der Zahl fokusbildender Einheiten (FFU)/ml für jede Probe. Ergebnisse:

Tabelle V

Rohrzucker-	FFU/ml in	Rohrzucker-	i von	0,1%
Endkonzentration. %	lösungen mit einem Gehalt	43,200
	an Albumir	35,200
	1.0%	56,000
10	44,400	44,800
8	36,000	33,600
6	45,600	13,600
4	31.200
2	35.200
1	14,000

Diese Ergebnisse zeigen, daß die geringe Rohrzukker-Konzentrationen von 2 Gew.-% einen guten Schutz des zellassoziierten Virus während der Lyophilisierung unabhängig davon ergaben, ob die Albumin-Konzentration 1,0 oder 0.1 Gew.-% betrug.

Beispiel 4

Zur Aufzeigung der Wirksamkeit von lyophilisiertem. zellfreiem Truthahn-Herpesvirus (HVT) als Vaccine zum Schutz von Küken gegen die Mareksche Krankheit wurden 1 Tag alte und 3 Wochen alte, empfängliche Küken mit abgestuften Dosen des Virus geimpft und 20 oder 22 Tage später geimpfte und nichtgeimpfte Küken mit virulentem Virus der Marekschen Krankheit infiziert

Die Ergebnisse nennt die folgende Tabelle. A bedeutet Prüfung nach 20 Tagen (Versuch 1) oder 22 Tagen (Versuch 2) nach Impfung und unter Bestimmung von HVT-Virämie mit frischen (Versuch 1) oder mit Dimethylsulfoxid als Schutzmittel gefrorenen (Versuch 2) Leukozytenfilm-Zellen (Buffy Coat Cells), und bei B wurde jedes Küken intraabdominal mit 10 000 FFU JM-Virus-infizierter Zellen geimpft wobei als empfänglich Küken eingestuft wurden, die 8 Wochen nach Impfung an Marekscher Krankheit eingingen bzw. eingegangen waren oder Grobläsionen durch dieselbe aufwiesen.

Tabelle VI

Infektion mit virulentem Virus der Marekschen Krankheit und Infektionswicierstand bei mit lyophilisiertem. zellfreiem Truthahn-Herpesvirus (Stamm FC-126) geimpften Küken

Versuch	Alter bei	Virus-	Dosis,	Tests auf Infektion (A)	(pos./getesL)	Empfänglichkeit für Infektion (B)	. Marekschen	Nichtviräm.-
	Impfung	Verdünnung	FFU	mit HVT		mit Virus d	Krankheit (pos./infiz.)	Küken
					Präcipitin
				Virämie		Viräm.
						Küken
					0/10	0/10	2/2
1	ITag	1:50	6,000	9/9	0/10	0/10	9/9
		1:500	600	10/10	0/10	1/9
		1:5,000	60	9/9	0/10	1/8	...
		1:50,000	6	8/10	0/10	. ..	...
		-	keine	0/10	1/10	0/10	3/3
2	3 Wochen	1:50	2,700	10/10	0/10	0/10	8/10
		1:500	270	10/10	0/10	0/9
		1 :5,000	27	10/10	0/10	i/7
		1 :50,000	2,7	7/10	0/10
		-	keine	0/10

*)... = Keine Hühner in dieser Kategorie.

Wie die Tabelle zeigt, waren derart geringe Dosen wie von 2,7 und 6 fokusbildenden Einheiten für die meisten der geimpften Küken und höhere Dosen bei allen Küken infektiös. Ferner ist zu ersehen, daß nahezu alle geimpften infizierten Küken einer starken Infizierung mit virulentem Virus der Marekschen Krankheit widerstanden, während nahezu alle nichtgeimpften Kontrolltiere bei identischer Infizierung eingingen.

Claims

Patentansprüche:

1. Lebende Herpes-Viren der Gruppe B enthaltende Vaccine, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Virus in zeilfreier Form und die Stabilisatoren Albumin, Casein und/oder Caseinhydrolysate in einer Konzentration von mindestens 0,05 Gew./ Vol.-°/o Trockengewicht/Lösung und gegebenenfalls ein Stärkederivat in einer Konzentration von mindestens 2 Gew7Vol.-% Trockengewicht/Lösung enthält

2. Vaccine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf den pH-Wertbereich von 6,5 bis 7,5 abgepuffert ist.

3. Verfahren zur Herstellung der Vaccine nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die mit dem Virus infizierten Zellen mit dem Stabilisator und gegebenenfalls mit dem Stärkederivat und/oder dem Pufferzusatz nach den Ansprüchen 1 und/oder 2 vor dem Aufbrechen der Zellen mischt und die Zellbruchstücke abtrennt.