DE2158293A1 - Beständige Viruspräparation - Google Patents

Description

Dr. !ng. V/alter Abitz

Dr. Dieter F. Morf 24. MOV. 1971

Dr. Hans-A. Brauns . "4591

8MSnchen86, Pfenzenaueretf.28

MERCK & CO., INC. =

126 East Lincoln Avenue, Rahway, N.J. 07065,

V.St.A.

Beständige Viruspräparation

Die Erfindung betrifft eine Viruspräparation und ein Verfahren zur Gewinnung leb ens fälliger, beständiger, zellfreier Virci-. aus mit zellassoziierten Viren infizierten Zellen sowie die aus diesen erhaltenen Produkte, insbesondere ein Verfahren zur Extraktion zeilassoziierter Viren aus mit diesen Viren infizierten Zellen unter Aufrecbterhaltimg eines lebensfähigen Zustand es der Viren. Die Stoffsiisa;nmensetzungen von zellassoz-ii crt ein Virus gemäes der Ei.rirj.dang sind beständig u.ad be- "

sitzen ihre Wirkimgekraft selbst nach Lyophilisierung» Die» ViX'ur.zusaiTHüensetzinigen gernäss der Erfindung können somit langzeitig bei Kühlschranktenperatüren aufbewahrt und ohne den Aufwand, unirrbäiidlichcr Kühlung versandt worden. Angesichts der ?jGst?lnd'i gkeit dt.v VirussusauUiienfX-L'oUügen gemäps der Erfindung ir:t cn nöf;"J.ich, loborjt;- und infcktionsfähige ze.llassoziierte Viren zu erzeugen, die als i'^lüri:;c:hurjg3matorial verwc-.ndbar ,VOT₁O¹, c'i.a£- sich in bequemer wc.i r.v über- grosr.e Ent femur: gen νοι·,<:οηΓθη und liir-gsseitig bei Kühl pohranktc-mperaturen aufbe- V-ihvon lässt. Es ist geir:;i;-:s der Erfindur.g auch möglich, zell~

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assoziierte Viren aus Zellen zu extrahieren, in denen das Virus einer Attenuierung unterlag oder ein Virus von einem Stamm geringer Virulenz vorliegt, ,der antigenmässig in Beziehung zu einer speziellen Krankheit steht. Die so erhaltenen, zellfreien Viren können bei der Herstellung von Vaccinen zur Verhütung von Erkrankungen eingesetzt werden.

Viele der zeilassoziierten Viren sind auf Grund ihres anscheinend bestehenden, kausalen Zusammenhangs mit Vogelleukämie in jüngerer Zeit Gegenstand intensiver Untersuchung gewesen. In einer kürzlichen Veröffentlichung haben Witter u. a. (Avian Eis., H, 171 bis 184 (1969)) das Virus des Herpestyps zur Atiologie der Marekschen Krankheit genannt, einer ansteckenden Erkrankung von Küken, für die das Vorliegen lymphoider Tumore in verschiedenen Organen charakteristisch ist. Die Mareksche Krankheit ist auf-der ganzen Welt von grosser wirtschaftlicher Bedeutung, da sie stark anstekkend ist und in dem einen oder anderen Falle zu einer Sterblichkeit von Tierbeständen von 50 % ^er menr und einem hohen Prozentsatz an Verseuchung bei zur Fleischgewinnung geschlachtetem Geflügel geführt hat.

Auf Grund der Wichtigkeit, ein Mittel zur Bekämpfung der Marekschen Krankheit zu finden, ist es notwendig gewesen, in der Lage zu sein, die spezielle Causa der liranldieit zu lokalisieren, dann dieses Material zu isolieren und es gelenkten Versuchen zu unterwerfen in dem Bestreben, zu einen umfassenderen Verständnis der Hervorrufung der Krankheit zu gelangen. Bedauerlicherweise haben jedoch bisherige Versuche, das Virus aus mit der Marekschen Krankheit infizierten Zellen zu entfernen und isolieren, zu einem •vollständigen Verlust der Infektionskraft des Virus geführt. Die augenscheinliche Notwendigkeit, dass die zeilassoziierten Viren zur Erhaltung ihrer Lebensfähigkeit und Wirkungskraft intakt in den Zellen bleiben, hat bisher Arbeiten zur Isolierung der Viren für eine- detaillierte Untersuchung oder sux·

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Gewinnung einer Vaccine, deren Lyophilisierung und Aufbewahrung in einem zellfreien Zustand möglich ist, verhindert.

Die vorliegende Erfindung macht Suspensionen von zellassoziiertein Virus verfügbar, die zellfrei sind und eine erhöhte Beständigkeit und Wirkungskraft besitzen, insbesondere während Lyophilisierung oder wenn sie langzeitig gelagert werden oder sich langzeitig im Verfahren befinden, und stellt weiter stabilisierte Vaccinen zur Verfugung. Sie schafft ferner ein Mittel zur Stabilisierung von zeilassoziierten Viren, die aus infizierten Zellen extrahiert werden. Weitere Vorteile und Zweckangaben ergeben sich aus der f folgenden Beschreibung.

Gemäss der Erfindung werden Zellen, die mit einem zellassoziierten Virus infiziert sind, mit einem Stabilisator für das Virus vermischt und die infizierten Zellen einer genügenden Aufbrechung (Disruption, wie Zerspaltung, -Sprengung, -reissung, -schlagung) unterworfen, um die Zellen zu brechen bzw. deren Platzen zu bewirken, was zur Freisetzung des intakten, lebensfähigen Virus aus den Zellen führt. Die anfallende Suspension enthält ein lebensfähiges und beständiges, zellassoziiertes Virus, das seine Wirkungskraft für lange Zeit beibehält. Da zellassoziierte Viren gewöhn- g lieh bei Abtrennung von ihren Zellen ihre Lebensfähigkeit und Wirkungskraft verlieren, ist es überraschend, dass die Produkte gemäss der Erfindung, die zellfrei sind, weitaus lebensfähiger und wirkungskräftiger als Materialien sind, welche den Stabilisator nicht enthalten und aus der Zelle extrahiert werden. Ein anderer überraschender Vorteil liegt darin, dass eß son.?t im allgemeinen notwendig ist, viele Arten zellassoziiex'ter Viren zu gefrieren und sie auf extrem niedrigen Temperaturen zu halten, um eine maximale Beständigkeit während lagerung zu erreichen, während die Virusprodukte gemäss der iJrfindung gefroren laugzeitig bei we-

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sentlich höheren Temperaturen gehalten werden können, ohne dass ein wesentlicher Verlust an Lebensfähigkeit oder Wirkungskraft eintritt. Ferner können die lyophilisierten Produkte gemäss der Erfindung langzeitig bei Kühlschranktemperaturen aufbewahrt werden, ohne dass sich ein wesentlicher Verlust an Lebensfähigkeit oder Wirkungskraft einstellt.

Die Erfindung erstreckt sich allgemein auf zellassoziierte Viren und speziell auf Virusmaterialien, in Trockenform oder wässriger Form, die Infektionsvermögen besitzen oder sich zur Bildung von Vaccinen durch vorherige Attenuierung des Virus nach an sich bekannten Techniken oder durch Einsatz eines Virus, das antigenmässig in Beziehung zur einer speziellen Krankheit steht, verwenden lassen. Z. B. ist es bekannt, dass attenuiertes Lebendvirus des Herpes-Typ-Virus der Marekschen Krankheit, d. h. der Stamm HPBS-16, sich zur Immunisierung gegen die Mareksche Krankheit verwenden lässt (wie von Churchill u. a., J. Gen. Virol, 4, 577 bis 564 (1969), und Nature, 221, 744 bis 747 (1969), gezeigt). Es ist auch bekannt, dass Vaccination mit dem Stamm ¥G-126 des Truthahn-Herpes-Virus einen Schutz gegen Mareksche Krankheit ergibt.

Die Erfindung ist auf diese Weise auf zellassoziierte Viren allgemein anwendbar, einschliesslich virulenter Lebendviren, attenuierter Lebendviren, Lebendviren, die antigenmässig in Beziehung zur Marekschen Krankheit stehen, und abgetöteter Viren. Zur Erläuterung kann dienen, dass eine kleine Gruppe der vielen zeilassoziierten Viren, auf die sich die vorliegende Erfindung erstreckt, von den Herpesviren Gruppe B gebildet wird, wie den von Melnick in J. Immunol, 92, 595 bis 601 (1964) beschriebenen, worauf hierzu verwiesen sei. Einige der bevorzugten zellassoziierten Viren für die Zwecke der Erfindung sind Varicella-Herpes-Zoster-Virus, Cytomegalovirus, Burkitt-Lymphom-Virus, Lucke-Tumor-Virus,

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Truthahn-Herpes-Virus und das Virus der liarekschen Krankheit. Die Erfindung ist zur Erläuterung nachfolgend unter· spezieller Hervorhebung zellfreier Präparationen zeilassoziierter Viren und deren Erzeugung beschrieben, aber die Erfindung umfasst stabilisierte, zellfreie Präparationen zeilassoziierter Viren allgemein, einschliesslich attenuü-erter Viren und in Antigenbeziehung stehender Viren, die sich als Vaccinen eignen.

Die Stabilisatoren bzw. stabilisierenden Medien für die Zvrecke der Erfindung umfassen Jegliche Substanz oder Kombination von Substanzen, die eine Schutzwirkung für das " Virus haben. (Diese Schutzwirkung hat, zumindest zum Teil, einen solchen Charakter, dass der Stabilisator einen hohen Titer des Virus während und/oder nach der Aufbrechung der Zellen aufrechterhält.) Hierzu geeignete Materialien.sind proteinhaltige Materialien, wie Albumin oder Casein. Die von dem zellfreien Virus gebildete Zusammensetzung und diese Stabilisatoren werden vorzugsx^eise in Verbindung mit einem stärkehaltigen Material eingesetzt, was besonders gilt, wenn die Zusammensetzungen zu lyophilisieren sind. Die Zusammensetzung kann auch andere Hilfsstoffe, wie Puffer, enthalten. AIs eine brauchbare und wirtschaftlich praktikable Albaminquelle hat sich Kindsserum erwiesen, und Magermilch stellt ' (J eine bequeme Cäseinquelle dar. Naturgemäss können als Stabilisator auch andere Quellen proteinhaltiger Materialien Verwendung finden.

Der Anteil des proteirihaltigen Stabilisators, der mit den infizierten Zellen zu Stabilißierungszweckeii zu dispergieren ist, variiert in Abhängigkeit von der Dichte des zellförinigen Materials, der relativen Konzentration des vorliegenden Virus und anderen ähnlichen Faktoren. Im Interesse eines bequemen Arbeitens gibt man den Stabilisator zu dem ζ eilförmigen Material in ü'prci eines trocknen Pulvers oder einer

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verdünnten, wässrigen Lösung unter gründlichem Mischen "bei niedrigen Temperaturen hinzu, um eine homogene Suspension " des zellförmigen Materials in dein Stabilisator zu erhalten.

Im allgemeinen wird das infizierte zellförmige Material in einer wässrigen Lösung suspendiert, in welcher das proteinhaltige Material in derart niedrigen Konzentrationen wie etwa 0,1 % (bezogen auf Gewicht/Volumen) gelöst ist. Die Gewicht/Volumen-Basis bedeutet das Trockengewicht (g) proteinhaltigen Materials zum Flüssigvolumen (ml) der Lösung, in welcher das zellförmige Material suspendiert ist. Auch niedrigere Konzentrationen des Stabilisators, wie 0,05 Gew./Vol.%, können Anwendung finden, um eine fluide, homogene Suspension zu erhalten. Auch Konzentrationen des proteinhaltigen Materials von etwa 1 Gew./Vol.?» sind akzeptabel. Die Erfindung umfasst auch die Anwendung höherer Konzentrationen, solange nur das proteinhaltige Material.im wesentlichen im wässrigen Medium gelöst ist. Wie die vorstehenden Ausführungen zeigen, hat die Konzentration des proteinhaltigen Materials auf Gew./Vol.-Basis somit solche Werte, dass eine homogene Suspension des zellförmigen Materials iii dem Stabilisator erhalten wird.

Bex der praktischen Durchführung der Erfindung kann es ervrünscht sein, die Konzentration des zellförmigen Materials einzustellen, um spezielle Virustiter zu erzielen. Die Schutzwirkung des proteinhaltigen Stabilisators jedoch unterliegt keiner wesentlichen Modifizierung, solange die Konzentration (in Gew./Vol.%) im wesentlichen der obigen Beschreibung entspricht. ■ . .

Es hat sich gezeigt, dass in den Fällen, in denen die zellfreie Viruspräparation zu lyophilisieren ist, eine Zugabe einer starkederivathaltigen Verbindung oder Mischung solcher Verbindungen zu der fluiden Präparation vor dem Trocknen-

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die Wirkungskraft der trocknen, zellfreien Viruspräparation in einem hohen Grade bewahrt oder aufrechterhält. Das Stärkederivat kann getrennt zu der zellfreien Präparation oder vor der ZeHbrechbehandlung mit dem obengenannten Stabilisator zugesetzt werden. Es sind praktißch alle Stärkederivate in Kombination mit dem proteinhaltigen Material einsetzbar. Z. B. kann man mit dem proteinhaltigen Material zur Bewahrung oder Aufrechterhaltung der Wirkungskraft der trocknen, zellfreien Viruspräparation, besonders während der Lyophilisierung dieser Präparationen, die Stärkehydrolysate, wie Rohrzucker (Sucrose), Dextran oder Traubenzucker (Glucose), vereinigen. Als Stärkederivat bevorzugt wird Bohrzucker. In dieser Beziehung kann die Konzentration des Stärkederivates derart geringe Werte \*i.e etwa 2 Gew./Vol.% (g Stärkederivat, Trockenbasis, je ml wässriger Lösung) haben, um hohe Titer der zellfreien Präparation während Lyophilisierung aufrechtzuerhalten* Die Erfindung umfasst aber auch die Anwendung höherer Konzentrationen. Eine direkte Beziehung der Konzentration proteinhaltigen Materials zur Konzentration des Stärkederivates im Sinne der Erzielung trockner Präparationen von zellfreiem Virus von hohem Titer besteht nicht. So ergibt für eine homogene Suspendierung einer zellfreies Virus enthaltenden Präparation jegliche homogene, suspendierende Menge an Stabilisator (und Jegliche !!enge an Stärkederivat mit derart geringen Vierten wie etwa 2 Gev./ Vol.% odex" mehr) eine wirksame Bewahrung der Wirkungskraft der Präparationen. ■ .

Wenn gewünscht, kann der Stabilisator kleine Pufferzusätze in genügender Menge enthalten, um einen relativ optimalen pH-Wert, z. B. von 6,5 bis 7,5, für das Virus in dem Stabilisator aufrechtzuerhalten. Dementsprechend ist eine Mischung von Riijdsalbumin, Rohrzucker und eines Puffers, wie die Alkaliphosphate, ein brauchbarer Stabilisator. Auch ein Zusatz

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von Alkaliglutaniaten kann erfolgen, ist aber nicht notwendig, um die Wirkungskraft und den Stabilisierungseffekt auf die Präparation des zellfreien Virus zu bewahren»

Zu anderen Mischungen, die sich über Albumin oder Casein mit Rohrzucker hinaus als brauchbare Stabilisatoren erweisen, gehören solche von Albumin, Rohrzucker und Alkaliglutaniaten, Casein, H-Z-Amin -(N-Z-AmIn ist ein Sammeibegriff für Gaseinhydrolysate) und Alkaliglutamaten und N-Z-Amin, Rohrzucker, Alkaliphosphaten und Alkaliglutaniaten. Einen bevorzugten Stabilisator für die praktische Durchführung der Erfindung stellt eine allgemein als SPGA bekannte Mischung dar, ein von Bovarnick u«, a., J. Batst., /*Jä, 509 bis 522 (1.950), beschriebener Stabilisator, der in 100 ml destilliertem Wasser gelöst 7,^-6 g Rohrzucker, 0,05 g Monokaliumpliosphat, 0,16 g Dikaliumphösphat, 0,01 g Mononatriumglutamat und 1,0 g Rindsalbuminpulver enthält. Ein Einsatz des obigen SPGA-Stabilisators in einer Konzentration von etwa 10 Gew.teilen je Teil ζellförmiges Material hat ausgezeichnete Ergebnisse erbracht. Auch derart hohe Konzentrationen dieses Stabilisators wie von etwa 15O Gew.teilen haben zu zufriedenstellenden Ergebnissen geführt. Wie ersichtlich, liegen die jeweiligen Konzentrationen des proteinhaltigen Materials und des Stärkederivates des SPGA-Stabilisators in den obengenannten Bereichen. ' :"■

Die Erfindung umfasst auch hochwirksame, trocloie, stabilisierte Produkte, die sich in zweckentsprechender Weise aus den obengenannten, 'fIiessfähigen Produkten durch herkömmliche j an sich bekannte Trocknung.gmethoden, wie Gefriertrocknung oder Lyophilisierung, erzielen lassen. Die Erfindung umfasst somit nicht nur fluide, wässrige, zellfreie Viruspräparationen und Veccinen, sondern auch trockne, nichtwässrige Produkte, wie die durch Trocknen der obengenannten, "fli ess fähigen Präpa-. rationen herstellbaren Produkte.

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Entsprechend der herkömmlichen Praxis werden die Produkte gemäss der Erfindung zweckmässig .bei keimfreien Bedingungen unter Einsatz von Komponenten behandelt bzw. verarbeitet, die zuvor bakterienfrei gemacht wurden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Wenn nicht anders gesagt, ist die Konzentration der Bestandteile in Gew./Vol.% ausgedrückt.

Virusstamme

Zur Erläuterung der Erfindung sind drei stark zellassoziierte \ Herpesvirus-Stämme verwandt worden.. Diese Virusstämme wurden als Truthahn-Herpesvirus Stamm i'C-126, als JM-Stamm der Marekschen Krankheit und als GA-Stamm der Marekschen Krankheit identifiziert. .

a) Das JM-ßtamm-Virus der Marekschen Krankheit ist stark zellassoziiert und steht antigenmässig in Beziehung zum Herpesvirus von Truthähnen, ist aber von infektionsfähigen

- Laryngitis-Tracheitis- und Entenvirus-Enteriti.sviren verschieden. Dieses Virus ist als JM-Stamm bezeichnet und unbeschränkt bei der American Type Culture Collection, •Washington, D. C.,' hinterlegt und deren bleibender Viren- g Sammlung unter ATCC-VE-Hr. 585 einverleibt worden. Es wurde ferner bei der Aufbewahrungsstelle der Cornell University hinterlegt und deren Sammlung einverleibt, in der es unter der Zugangsnummer RT-711 verfügbar ist. Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung und der Charakteristxken des JM^Btarnines haben ßevoian u. a., Vet. Med., j3£, 500 bis 501 (1962), gegeben, worauf hierzu verwiesen sei.

b) Der Truthahri-Herpesvirue.-Stamm l''C-126 ist stark zeilassoziiert und steht antigenmässig in Beziehung zu dem Virus der Fiarekschen Krankheit bei Küken.· Er ist seiner Beschreibung nach beim Einimpfen in 1 Tag alte Küken und

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anschliessen.de Infizierung mit dem Virus der Marekschen Krankheit gegen die letztere schutzfähig. Das Herpesvirus ist als FC-126 (HVT) bezeichnet und anbeschränkt bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C., hinterlegt und deren bleibender Virensammlung unter ATCC-VR-Nr. ^t% einverleibt worden.. Ferner erfolgte seine Hinterlegung bei der Aufbewahrungsstelle der Cornell University, in deren Sammlung es unter Zugangsnummer ET-720 verfügbar ist. Eine mehr ins einzelne gehende Beschreibung des Stamms enthalten Witter u.a., Am. J. Vet. Res., J51, 525 bis 538 (1970), und Okazaki u. a., Avian Bis., 14, 413 "bis 429 (1970), worauf hierzu verwiesen sei

c) Auch das GA-Stamm-Virus der Marekschen Krankheit ist stark zeilassoziiert. Dieses Virus ist als GA-Stamm bezeichnet und unbeschränkt bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C. hinterlegt und deren bleibender Sammlung unter ATCC-VR-Nr . 624 einverleibt worden. Eine Hinterlegung erfolgte auch bei der Aufbewahrungsstelle der Cornell University, bei der es unter Zugangsnummer RT-743 verfügbar ist. Eine detaillierte Beschreibung des GA-Stamias und seiner Herstellung findet sich in Eidson u.a., Avian Dis. , 1,2, 467 bis 475 (1968), worauf hierzu verwiesen sei.

Beispiel 1

Für die folgenden Versuche 1 bis 3 wurde das oberibeschriebene Virus des JM-Stammes eingesetzt, das nach folgender Methode aus zwei Hautansätzen frisch getöteter Küken geironnen wurde, die mit dem JM-Stamm--Virus der Marekschen Krankheit infiziert worden waren: Hautstreifen, von denen die Federn an der Oberfläche abgeschnitten worden waren, wurden im Gew./-VoI.-Verhältnis von 1 : 5 oder 1 : 10 mit phosphatgepufferter Salzlösung (pH 6,8) gemischt,*gehackt, 5 Min. auf einem Mischer (der Bauart "Sorvall Omni-Mixer" der Ivan Sorvall, χ klein

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Inc., Norwalk, Conn.) homogenisiert und 2 Mn. mit einem Zellbrechgerät der Bauart "Sonifer Cell Disrupter", Modell V 140 D (der Heat Systems-Ultrasonics, Inc., Plainview, Long Island, N.Y-.) bei einer Leistungseinstellüng auf 7 (26 bis 32 mA) beschallt, worauf die Suspensionen durch Schleudern bei 650 χ g geklärt und die überstehenden Anteile /bei -65° C gefroren wurden. Die Produkte waren als von Ie-' bensfähigen Zellen frei zu beurteilen* In Versuch 1 biß 3 wurden die Virussuspensionen aufgetaut und dann - nach den verschiedenen, nachfolgend beschriebenen Behandlungen — in 1- oder 2-ml-Anteilen wieder gefroren oder lyöphilisiert.

Έϋ,ν Versuch 4 bis 8 wurde eine etwas andere Methode gewählt, Als Quellen für JM-, GA- und FC-126-Viren dienten stark infizierte (CPE über 75 %) 50-mm-Petrischalp-Kulturen. Beide Stämme des Virus des Marekschen Krankheit wurden in Kükeriniere-Kultur gezüchtet. Bei den Ansätzen 643 und 659 wurde das Truthahn-Herpesvirus in Kükennie^e-Zellen gezüchtet. Bei Ansatz 654 wurde das Truthahn-Herpesvirus in Küken'embryoi'ibroblasten gezüchtet. Die überstehende !flüssigkeit wurde verworfen und pro Kultur mit 2 ml (Versuch 6), 2,5 ml (Versuche 4, 5 und 7) oder 5 *nl (Versuch 8) eines von zwei Suspendiermedien ersetzt. Die Zellen wurden mit einem Stab mit Gummifahne freigeschabt und die Ernten von 4 oder 5 Kultu- ^ ren (1 Kultur pro Behandlung in Versuch 8) vereinigt. Jede , ™ Suspension wurde 2 Min. beschallt, und aliquote 1-ml-Anteile wurden bei -65° C gefroren oder lyöphilisiert.

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Zellen von anderen Kulturen wurden nach auf die Beinahrung ganzer Zellen ausgelegten Techniken und mit Dimethylsulfoxid als Schutzmittel nach der von Spencer u. a., Avian Dis» ^H_-, 274 bis 287 (1967) beschriebenen Methode geerntet und bei -65 C gefroren. "

In Versuch 9 und 10 wurde eine Suspension von mit HVT infi-

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zierten KükenSiabryo-Fibroblasten eingesetzt, die als "Debendganzzellen bei -196° G gefroren worden waren und aufgetaut· und im Verhältnis von 1 ; 30 (Versuch 9) oder 1 : 40 (Versuch 10) in verschiedenen Suspeiidierflüssigkeiten (vergl. Tabelle III) verdünnt wurden. 5-ώ.Ι-Anteile wurden 1 Mn. beschallt, und aliquote 1-ml-Anteile wurden bei -*65° G gefroren oder lyophilisiert.

Stabilisatoren und Verdünnungsmittel

Im ersten Versuch wurden folgende lösungen eingesetzt:

1. 20 % Traubenzucker. ·

2. Magermilch-Stabilisator» bestehend mm 8- °/& nichtfet%er Trockenmilch und 2 % N-E-Jmin des Typs AS (Sheffield : Chemical, Norwich, M. Y*)- in öörensen-Puffer von pH 6,-2 zuzüglich 5 %_ Traubenzübker*

3. Stabilisator SPüA (von Bovarnick u. a. in J. Bact., £2>, '509 bis- 522 (1950) beschrieben, wozu hierauf verwiesen eel); die Mischung enthielt 0,218 Mol Rohrzucker, 0,0038 Mol Monokaliumphosphat, 0,0072 Mol Bikaliumphoßphat, 0,0049 Mol Mononätriumglutamat und 1 % Eindsalbumi'npülver.

4. SPG-NB-Aain, eine mit der Abänderung dem SPGA entsprechende Formulierung, dass das Kindsalbumin durch 1 % N-Z-Amin Typ B (pankreatischer Gaseinaufechluss) ersetzt war.

Der pH-Wert der AFerschiedenen Lösungen variierte zwischen etwa 6,2 und 7,0, was ein für seine Freiheit von wesentlichen Auswirkungen auf den Virustiter bekannter Bereich ist. Im zweiten und dritten Versuch wurden zusätzliche Tests mit SPGA-Stabilisator durchgeführt.

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In Versuch 4 bis 8.wurden zwei Lösungen eingesetzt, nämlich phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) von pH 6,8 und SPGA.

Pur Versuch 9 und 10 wurden in Phosphatpuffer (0^0038 Mol MonokaIiumphosphat und 0,002? Mol Dikaliumphosphat) angesetzt:

a) 0,218 Mol Rohrzucker (S)

b) 0,0049 Mononatriumglutamat (G)

c) S und G

d) 1 % Id-ndsalbuminpulver (A) . .

e) A und S

f) A und G . i

g) A, G, S

h) 8 % nichtfette Trockenmilch, 2 % H-Z-Amin Typ AS

i) 8 % niehtf et'te Trockenmilch; . ·.

Ferner wurden eingesetzt:

a) unverdünntes Binds fetal serum (Bi¹S)

b) 15 % BFS in Gewebekultur-Mediuin. Ur. 99 (M199) ,

c) 10 °/o Dime'thylsulfoxid und 10 % Tryptosephosphat-Brühe in M199 . ■"■"-·

In allen Versuchen wurden lyophilisierte Proben mib destilliertem Wasser rekonstituiert ("wiederhergestellt")· - - ä

Lyophilisierunp-

Die Lyophilisierung erfolgte in einem Gefriertrockner (Bauart "Virtis" Hodell ϋΰΜ-15 der Virtis Co,, Inc., Gardiner, Ν.Ύ.). '

Proben in 5-wl-Serumflaschen" mit gespaltenen Guhirtistöpsein. vnmJcu. in einem getreunten mechanischen Gefriergerät bei -65° C voi'p;ofro->reu oder auf den gekühlten Tellern des Gefriertrockner;:; bei -GO⁰ C gefroren. Hach 24 ßtd. Trocknen unter Vakuum, bei 58° C unter Wärmezufuhr zu den Trockiiertellern erfolgte :

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eine zusätzliche Trocknung von etwa 15 Std. Dauer bei einer Teilertemperatür von 21° C. Die Flaschen wurden unter Vakuum verschlossen und bei 4° C bis zur Virusbewertung aufbewahrt, die 1 bis 10 Tage nach der Virusverarbeitung erfolgte.

Virusbewertungen

In allen Versuchen wurde jede Probe zwei abgetropften 24-ßtd.-Eükenniere-Kulturen unmittelbar nach Auftauung öde.r Rekonstituierung eingeimpft. Bei den aus infizierten Zellkultui'en e^rbrahierten Viren der Marekschen Jlrankheit wurden in dem einen oder anderen Falle zur (Steigerung der Bewertungseinpfindlichkeit 0,2 % Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugesetzt. Zur Sicherung einer Infektionsgeschwindigkeit, welche die Zählung einzelner Foki erlaubt, wurden in dem einen oder anderen Falle auch Zehnfachverdünnungen geimpft. Das Verdünnungsmittel entsprach dem Suspendierinedium. Die Zellfcultur-Bewertung erfolgte nach der Methode von Calnek u.a., J. Nat. Cancer Instit., 4j?, 341 bis 351 (I9?u). Fokale Läsionen wurden 8 Tage (beim Virus der Marekschen Krankheit) oder 6 Tage (beim Truthahn-Herpesvirus) nach der Impfung gezahlt. Unter Heranziehung der Fokuszahlen von zwei Wiederholungskulturen und des Verdünnungsfaktors wurde die Zahl der fokusbildenden Einheiten (FFU)/ml unverdünrtes Virus geschätzt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den Tabellen I, II und 111 zusammengestellt. Die Untersuchungen mit dem JM-Isolat des Virus der iiarekschen Krankheit von Hautextrakten (Tabelle I) zeigten, dass . -

1. das Virusüberleben nach Lyophilisierung durch den Einsatz von 20 % Traubenzucker als »Stabilisator leicht verstärkt und durch SPGA oder SPG-IT-Z-AmIn deutlieh verbessert wurde-,

SPGÄ-Zusatz zu nichtlyophilisierten Virussuspensionen eine

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Titererhöhung von mehr als dem Zweifachen ergab und 3. die höchsten Titer von mit SPGA lyophilisierten Eroben erhalten wurden.

Aus den Versuchen mit Zellkultu-rursprung-Virus (Tabelle II) ist leicht zu ersehen, dass

1. beide Stämme des Virus der Marekschen Krankheit mit SPGA auf einen höheren Titer als mit PBS als ßUBpendiermedium extrahiert wurden,

2. wiederum die Lyophilisierung mit SPGA-Stabilisator für das Virus der Marekschen Krankheit erfolgreich verlief,

3. die Ausbeuten von mit extrahiertem iruthahn-HerpeBvirus λ infizierten Kulturen viel höher als diejenigen von mit Virus der Marekschen Krankheit.infizierten Kulturen waren,. wenngleich sich auch für dais zellassoziierte Infektionsvermögen ähnliche Titer ergaben, und 4-. für die Titer von mit PBS extrahiertem Trutliahn-Herpesvirus ähnliche Werte wie beim Einsatz von Zellkulturmedium zur Extraktion entsprechend der Beschreibung von Witter u.a.,' Am·. J-. Vet. fies. , JQ_x 525 bis 538 (197Ο> erhalten wurden.

Die SPGA-Extrakttiter betrugen oft das 50- bis 5Ofache derjenigen der PBS-Extrakte, und der tJberlebensproz ent satz nach Lyophilisierung betrug gewöhnlich 30 bis 40 % oder mehr im Vergleich mit unter 1 % bei den entsprechenden Extrakten.

In Versuch 2, 4, 6 und 7 erfolgten erneute Bewertungen des lyophilisierten Virus nach 17- t»is ^tägiger Lagerung bei 4- C. Die Virustiter erwiesen sich als gegenüber den bei den ursprünglichen Bewertungen erhaltenen unverändert.

Die Versuche 9 und 10 (Tabelle III) zeigten, dass Albumin allein oder zusammen mit Rohrzucker und/oder Glutamat einen brauchbaren Stabilisator für die Virusextraktion darstellt, aber der Kohrzucker-Zusatz von Vorteil ist, um die b'berlebensrate während Lyophilisiorung zu erhöhen. Auch nichtfette

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Trockenmilch allein oder in Kombination mit N-Z-Amin war ein brauchbarer Stabilisator für Extraktionen, und das Virus war lyophilisierbar. Andere Substanzen schienen während der Extraktion eine partielle Stabilisation zu ergeben (z. B. Eindsfetalserum, 10 % BFS in ItI99 oder 10-%-Dimethylsulfoxid-10-%-Tryptosephosphai£- Brühe in M199), waren ab erden obigen Materialien oder Kombinationen unterlegen.

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Tabelle I

Auswirkungen verschiedener Behandlungen und Stabilisatoren auf den Titer von aus Haut extrahiertem, ζellfreiem Stamm-JM-Herpesvirus der Marekschen Krankheit

Abkürzungen:

1"¹SU fokusbildende Einheiten

PBS phosphatgepufferte Salz

lösung (pH 6,8)

SI SPG

3PGA ) Stabilisatoren (vergl, 3PG-N-Z-Amin) Beschreibung)

nicht geprüft

Vei·- Behänd]unfc Unverdünntes Virus, Ι''Μ/ml

sue Virus- Verdünnungsmittel und nichtlyo— lyophilisiert/

ansatz Verdünnung philisiert mit Wasser

r ekon s ti t ui e r t

X-300 keines 2,800 100

20 % Traubenzucker; 1,680 690 1:2

Magermilch,

5 % Traubenzucker;

1:5 2,400 360

5,600 4,900

1 : 5 4,800 3,120

690 10

1,330 -480

2,160
2,880

■4,000 -

	X-311	SPGA; 1	: 5
		SPG-N-Z-	Amir
2	X-300	keincs
		SPGA; 1	: 5
3		keines
	PBS; 1 :	10
	SI-GA; 1	: 10

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-14591

Af

Tabelle II

Auswirkungen verschiedener Behandlungen und Stabilisatoren auf den Titer von zellfreien. Präparationen von Herpesvirus, JM- und GA-Stämme, der Marekschen Krankheit (IiI)HV) und Stamm-I'O-126-Truthahn-Herpesvirus (HVT), aus infizierten Zellkulturen extrahiert

Abkürzungen:

PBS

SPGA

ü'MJ

phosphatgepufferte Salzlösung Stabilisator
fokusbildende Einheiten nicht durchgeführt

Ver- Virusart und Behandlung such -stamm

MDHV(JM) ■

gefroren

lyophili-

siert

Verdünnungsmittel für Extraktion,

i'MJ/ml

Ganzζel1-

s u sp en si on PBS

1,000

120,

er

SPGA

820

MDIIV(GA)

gefroren

lyophili-

siert

94-,00O

170. 0^l

HVT(PC 126) gefroren lyophilisiert

68,000 1,370 398,000

0 125,000

HV¹I¹Ci¹C 126) gefroren lyophilisiert

190,000

910

147,000 72 jO

HVT(FC 126) gefroren lyophili-

sxe.ru

240 49,400 0

144,000 96,000

b) Bewertung unter Zusatz von 0,2 % EDTA zum Inokuluai

_BA0

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14591

2 ι 5 ο 2 9 3

Die Werte der folgenden Tabelle "beziehen sich auf Versuche, bei denen die Donatorzellen (Virusquelle) als Ganzzellsuspension mit Dimethylsulfoxid als Schutzmittel gefroren und dann aufgetaut, in Puffer gewaschen und schliesslich auf 1 : JO (Versuch 9) oder 1 : 40 (Versuch ΊΟ) verdünnt wurden, bevor die Extraktion in den verschiedenen Medien durch Bejschallung erfolgte.

-19 -

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14591

Tabelle III

Auswirkungen verschiedener Stoffe im Suspendiermedium auf den Titer zellfreier Präparationen des Truthahn-Herpesvirus (HVT), Stamm FC 126, aus infizierten Zellkulturen extrahiert

Abkürzung:

fokusbildende Einheiten

Suspendiermedi um

Verdünnungsmittel für Extraktion^ FFU/ml

	Versuch	9	lyoplii- lisiert	Versuch 10	0
	gefro ren	0	gefro- lyophi- ren lisiert
Phosphatpuffer allein	10		0	durchgeführt
Materialien im Phosphat puffer:		0		durchgeführt
Rohrzucker (0,218 Mol) '.	•10	0 '	nicht	durchgeführt
■Glutamat (0,0049 Mol)	10	0	nicht	durchgeführt
Rohrzucker und Glutamat	10	25	nicht
Rindsalbumin (1 %)	5,500	nicht

Rindsalbumin und Rohrzucker

Rindsalbumin und Glutamat

Rindsalbumin, Rohrzukker und Glutamat (SPGA-Formuli erung)

Nichtfette Trockenmagermilch (8 ^c/o) und N-Z-Amin (2 %)

Nichtfette Trockenmagermilch (8 %)

Verschiedene

Nichtverdünntes Rindsfetalseriim (BFS)

BFS (15 ^c/o) in Gewebekulturniedium 199 (M199)

DimethylDUlfoxid (10 %) lind Tryp tos cpho spha tbrühe in M 199

5,950 1,200 nicht durchgeführt 1,925 75 nicht durchgeführt

5,650 560 2,400 1,520

2,760 85 nicht durchgeführt

nicht durchgeführt 840

110

100

50

0 nicht durchgeführt 0 nicht durchgeführt

0 nicht durchgeführt

209 8 24/1²O 74

/1²O 7~

Diese Ergebnisse-zeigen, dass sich hohe Ausbeuten an Virus der Marekschen Krankheit oder Truthahn-Herpesvirus durch Extraktion· in Gegenv/art von oder unter Verdünnung in Stabilisator für das Virus erzielen lassen und dass eine Lyophilisierung ohne wesentlichen Titerverlust durchgeführt v/erden kann. Ferner zeigen die obigen V/erte, dass die stabilen, zellfreien Vi rus suspensionen geraäss der Erfindung Titer von 1CK oder darüber im Falle der Viren der Marekschen Krankheit haben, und dass der Titer der 'Buspension des Truthahn-Herpesvirus 1Cr oder mehr beträgt.' Die Ergebnisse zeigen weiter, dass eine Extraktion in Gegenwart von Rindsfetalserum mit oder ohne Gewebekulturmedium zu einem Virus " von extrem niedrigem Titer führt, was einen nahezu vollständigen Verlust der Wirksamkeit als mögliche Vaccine zeigt= Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit in überraschender V/eise eine sehr wirksame Extraktion von zellassoziiertem Virus aus infizierten Zellen durch Einsatz der Proteine Albumin oder Casein wie auch von albumin- oder caseinbaltigen Materialien, wobei man jedes dieser auch in Kombination mit Zusatzstoffen, wie Rohrzucker und dergleichen, verwenden kann.

Die vorliegende, zur Freisetzung des intakten, lebensfähigen Virus aus den Zellen führende Aufbrecliung und »Spren- (| gung der Zellen ist sur Erläuterung mit dem vorliegenden Beispiel durch Beschallung erfolgt. Jedoch können naturgenuicü auch andere Techniken Anwendung finden, wie Gefrieren und V/iederauftauen, liedertemperatur-IIomogenisiereii und dergleichen. Die einzigen Kriterien des Extraktions-Verfahrens gerrii^s der Erfindung liegen darip, dass Aufbrechung und Bruch der .ZeH lon durchzuführen sind, wenn die Zellen in dem Stabilisator für das Virus dispergiert fjind, um das ζ ellfrei ü Virus in einem lebensfähigen Zustand zu erhalten.

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Beispiel.^

Es wurde das Wirkungsvermögen (Infektionskrafttiter) zellfreier Präparat!onen von mit Truthahn-Herpesvirus infizierten Zellen nach Schall-Schwingungsbeaufschlagung in Lösungen, die Rindsalbumin (Serumfraktion V) als Stabilisator in verschiedenen Konzentrationen enthielten, wie folgt bestimmt:

Es wurden Primärkulturen von Kükenembryo-iTbroblastenzeilen (GEF) mit dem Stamm KM 26. des Truthahn-Herpesvirus beimpft und nach Jtägiger Inkubation die infizierten Zellen in 210-Petrischalen (60 mm) nach herkömmlichen ii-ypsinierungstechniken geerntet, wobei die Ausbeute 1,4 χ Λ0 Zellen betrug. Die "gepackten" bzw, verdichteten Zellen, deren Volumen in diesem Zustand nach 10 Hin. Schleudern bei 1200 U/Fiin. etwa 3 ml betrug, wurden mit 60 ml Gewebekulturmedium (Medium 199 zuzüglich 10 % Tryptosephosphatbrühe) wieder suspendie3?t. »Sechs aliquote 10-ml-Anteile wurden in Röhrchen gegeben und erneut geschleudert, worauf das Zellvolumen im verdichteten Zustand etwa 0,5 ml/Röhrchen betrug. Das überstehende Gut wurde verworfen, und die infizierten ZeI-^ len wurden zur Erzielung einer Volurnenverdünnung von 1 : 5 (Vol./Vol.) wieder in 2,0 ml Phosphatpuffer suspendiert, der verschiedene Mengen an Albumin enthielt. Durch zusätzliche Verdünnung dieser Suspensionen wurden Volumenverhältnicse von 1 : 10 und 1 : 100 in den entsprechenden Verdünnungsmitteln hergestellt.

Jede Probe wurde 45 »Sek. schallschwingungsbeaufschlagt und dann sofort'in einem Stabilisator aus 6,7 V^J Rohrzucker und 1 % Eindsalbumin in Phosphatpuffer auf ein Volumenverhältuis von 1 : 10 verdünnt und bei -70° C gefroren.

Zur Bewertung wurden abgetropfte 24-Std.-Priaär-liulturcn von CEF-Z eil en mit lO-fach-Reihenverdüiniuiifjeii beimpft. 5 ΐ<'-»^<nach Inokulation wurden die I¹Ol;i gezählt.

-22-20982A/107A

14591

Tabelle IV

Volumen-Verhältnis
der Zellen
zum Verdünnungs
mittel

Fokusbildende Einheiten/ml (x 10 ) nach Beschallung" in den Verdünnungsmitteln mit einem Gehalt an Albumin von

1 %

10

1: 100

5,5

(27,5)^a

1,*

0,17

Durchschnittliche Ausbeute
pro ml Zelle
im verdichteten.
Zustand,

FMJ χ 10⁶ 19,6

0,5 %

(27,5) 1,8

(18,0) 0,24-

(16,8) (24,0)

0,25 % 0,1 % 0,05

6,0

(30,0) 2,2

(21,6) 0,26

(26,4-)

5,5

(27,5) 2,8

(27,6)

0,28

(27,6)

2,3

(11,5) 1,0 (9,6) 0,14

(14,4)

23,2

26,0

27,6

11»..?

a) Kl anini erwerte geben die Zahl fokusbildender

Einheiten (x 106) p3?o ml Zelle im verdichteten Zustand an (Zahl pro ml χ Verdünnungsfairtor).

Wie die Werte von !Tabelle IV zeigen, erwies sich das Verhältnis der Zellen zum Verdünnungsmittel nicht als kritischer Faktor (die Ausbeuten entsprachen der Zahl vorliegender Viruszellen), und derart geringe Albuminmengen wie 0,1 Gew./Vol.% reichten aus, um eine Schutzwirkung auf das Virus derart zu ergeben, dass ein hoher Virustiter während und nach der Aufbrechbehandlung aufrechterhalten wurde.Auch ist zu ersehen, dass eine Konzentration von 0,05 % eine gewisse JÜchutswirkung ergab, Jedoch keine solche, wie die Konzentrationen von 0,1 bis 1,0 Gew./Vol.%.

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a»

Beispiel 3

Der folgende Versuch diente der Bestimmung des Überlebens von zellfreiem Iruthahn-Herpesvirus, das durch Schallschwingungsbeaufschlagung von infizierten, in einem der Stabilisatoren gemäss der Erfindung (Rohrzucker, Phosphatpuffer und Eindsalbumin) suspendierten CEF-Zellen extrahiert und dann nach Verdünnung auf 1 ; 10 in Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen an Rohrzucker und Rindsalbumin in Phosphatpuffer lyophilisiert wurde,

Mt Truthahn-Herpesvirus (Stamm FC-126, erhalten wie in Beispiel 2) infizierte CEF-Zeilen-Primärkultüren wurden in einem Stabilisator aus 7,6 % Rohrzucker und 1 % Rindsalbumin, Serumfraktion V, in Phosphatpuffer (SPA) im VoIurnenverhältnis von 1 Raumteil verdichtete Zellen auf 20 Raumteile SPA-Stabilisator verdünnt. Die Suspension viurde f,5 Min. schallschwingungsbeaufschlagt und dann übernacht bei -70° C gefroren. Nach Auftauen wurde die zellfreie Virussuspenslon in jeweils einem von vier Verdünnungsmitteln (10 % Rohrzucker, 10 % Rohrzucker plus 1 % Albumin, 1 % Albumin (jeweils in Phosphatpuffer) oder Phosphatpuffer allein) auf 1 : 10 verdünnt. Durch Vermischen der entsprechenden Mengen von in 10 % Rohrzucker plus Albumin verdünntem "Virus mit in nur Albumin verdünntem Virus wurden verschiedene Rohrzucker-Konzentrationen unter Beibehaltung der gleichen Albumin-Konzentrationen hergestellt. Weiter wurden ähnliche Mischungen von Virus in Rohrzucker oder Phosphatpuffer hergestellt, die alle auf Grund des Albumins in dem zur Herstellung der 1:10-Verdünnung eingesetzten Virusmaterial eine Albumin-Endkonzentration von 0,1 % hatten.

Jede Mischung wurde dann in aliquoten 1-nil-Antoilen lyophilisiert.

- 24 -

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Zur Bewertung wurde jede Ampulle mit 1 ml destilliertem Wasser rekonstituiert, worauf zur Beimpfung von abgetropften CEl'¹-24-Std.-Primär-Doppelkulturen Zehnfach-Verdünnungen hergestellt wurden. 5 Tage nach Beimpfung erfolgte eine Auszählung der i'oki und Errechnung der Zahl fokusbildender Elnheiten(FMJ)/ml für jede Probe. Ergebnisse:

Tabelle V

Rohrzucker- I'EU/ml in Eohrzuckerlösungen mit einem

Endkonzentra- Gehalt an Albumin von

tion, % ■ _{1)0 %} ^ _{Oj1 o/o}...

10 44,400 43,200

8 36,000 35,200

6 45,600 . 56,000

4- . 31,200 44,800

2 - 35,200 33,600

1 14,000 13,600

Diese Ergebnisse zeigen, dass derart geringe Rohrzucker- ■ Konzentrationen wie 2 Gew.% einen guten Schutz des zellassoziierten Virus während Lyophilisierung unabhängig davon ergaben, ob die Albumin-Konzentration 1,0 oder 0,1 Gew.% betrug. .

B c: i s ρ i e 1 4

Zur Aufzoigung der V/irksamke.it von lyophilisiertem, zellfroiem Truthaljn-He3T>esv:LruD (li'VT) als Vaccine zum Schutz von Küken gegen Mareksche Krankheit vmrden 1 Tag alte und 3 Wochen alte, empfänglicho Küken mit abgestuften Dosen des Vi.r-ufj geimpft und 20 oder 22 Tage später geimpfte und nichtgoirnpfte Küken mit virulentem Virus der Ilarekschen Krankhei f.; infiziert.

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It

Die Ergebnisse nennt die folgende Tabelle. A bedeutet Prüfung nach 20 Tagen ("Versuch 1) oder 22 Tagen (Versuch 2) nach Impfung und unter Bestimmung von HVT-Virämie mit frischen (Versuch 1) oder mit Dimethylsulfoxid als Schutzmittel gefrorenen (Versuch 2) Leukozytenfilm-Zellen (Buffy Coat Cells), und bei B wurde jedes Küken intraabdominal mit 10 000 I'ITJ JM-Virus-infizierter Zellen geimpft, wobei als empfänglich Küken eingestuft wurden, die 8 Wochen nach Impfung an Marekscher Krankheit eingingen bzw. eingegangen waren oder Grobläsionen durch dieselbe aufwieson.

- 26 209824/1074

Tabelle VI

Infektion mit virulentem Virus der Harekschen Krankheit und Infektionswiderstand bei mit lyophilisiertem, zellfreiem Truthahn-Herpesvirus (Stamm i'C-126) geimpften Küken

Ver- Alter such bei Impfung	Virus- Verdünnung	Dosis, PIU	Tests auf Infektion (A) mit HVT (por. ./betest.) Viramie Präei- pi tin	0/10	0/10	Eaipf anglichkeit für Infektion '(B) mit Virus cL Marekschen Krankheit (pos./infiz.)	• · *
				Ο/ΙΟ	0/10	Viram. Wicht- Küken viräm- Küken	« m «
1 1 Tag	1:50	6,000	9/9	ο/ίο,	Ö/10	« · ·
	1:500	600.	10/10	0/10	0/10	2/2
	1:5,000	. 60	' 9/9	0/10	1/9	9/9
	1:50,000	6	8/10	1/10	1/8	8 · ·
	—	keine	0/10	0/10	...	• · »
2 3 Wo chen	1:50	2,700	10/10	Ίο/10 ο/ίο	0/10	• · ·
	1:500	270	10/10	7/10	0/10	3/3
	1:5,000	27		0/10	0/9	8/10
	1:50,000 '	2,7	1/7
		keine	• * ·

+) ... = Keine Hühner in dieser Kategorie.

Vie die Tabelle zeigt, waren derart geringe Dosen wie von 2,7 und 6 fokusbildenden üinheiten für die meisten der geimpften Küken und höhere 'Dosen bei allen Küken infektiös, i-eraer ist zu ersehen, dass nahezu alle q&~ impf ten infizierten Küken einer starken Infizierung mit virulentem Virus der llarekscheii Krankheit·widerstanden, während nahezu alle

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niclitgeinpften Kontrolltiere bei identischer Infizierung eingingen.

28 -

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Claims (1)

1. Pat ent a η s ρ rüch e

   1. Suspension enthaltend eine lebensfähige, beständige, zellfreie Präparation von zellassoziiertem' Virus von hohem Titer mit einem Gehalt an Stabilisator für das Virus, der eine Substanz oder eine Kombination von Substanzen umfasst, die auf das Virus eine zur Aufrecliterhaltung eines hohen Titers des Virus während und/oder nach Aufbrechung der Zellen genügende Schutzwirkung ausübt.

   2. Suspension nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zeilassoziierte Virus ein Herpesvirus Gruppe B ist.

   J. Suspension nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zeilassoziierte Virus ein Trirbhahn-Herpesvirus ist.

   4. Suspension nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Truthahn-Herpesvirus das I¹C-126-Jsolat von Truthahn-PIerpesvirus ist.

   5-= Suspension nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zellassoziierte Virus ein Isolat aus der Gruppe JM- und GA-Isolate von Herpcsvirus der Iferekschen Krankheit ist.

   6. Suspension enthaltend eine lebensfähige, beständige, zell freie Präparation von zeliassoziiertem Virus von hohem Titor mit einem Gehalt an Stabilisator für das Virus, der proteinhaltiges haterial aus der Gruppe Albumin und Casein umfaost und in einer zur JiL!dung einer homogenen Suspension der Präparation in dem Stabilisator genügenden Menge vorliegt.

   7- Suspension nach Ansijruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass

   - 29 -2098 24/1074

   3D

   der Stabilisator zusätzlich. Stärkederivat enthält.

   8. Suspension nach Anspruch 7j dadurch gekennzeichnet, dass das Stärkederivat Eohrzucker ist.

   9· Suspension nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator eine Mischung aus der Gruppe

   a) Albumin und Rohrzucker,

   b) Albumin, Rohrzucker und Alkaliglutaraate, .

   c) Casein und Rohrzucker,

   d) Casein, N-Z-Aiain und Trautanzucker,

   e) Albumin, Rohrzucker und Alkaliphosphate,

   f) Eindsalbumin, Rohrzucker, Alkaliphosphate und Alkaliglutamate,

   g) N-Z-Amiη und Traubenzucker und

   h) N-Z-Arain, Rohrzucker, Alkaliphosphate und Alkaliglutamate umfasst.

   10. Suspension nach. Anspruch. 6, dadurch, gekonnzeich.net, dass die Konzentration des proteinhaltigen !Materials mindestens etwa 0,1 Gew.#> beteägt.

   11. Suspension nach Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Stärkederivats mindestens etwa.

   2 Gew.% beträgt.

   12. Suspension enthaltend eine lebensfähige, beständige, zellfreie Präparation von. zellassoziiertem Virus in Porin von Isolat von Truthahn-Herpesvirus von hohem Titer mit einem Gehalt an Stabilisator für das Isolat, der proteinhaltiges Material aus der Gruppe Albumin und Casein umfasst, wobei die Konzentration des proteinhaltigen Materials in dera Stabilisator mindestens etwa 0,05 Gew./y beträgt.

   - 30 —

   BAD 209824/1074

   15· Suspension nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch einen zusätzlichen Gehalt des Stabilisators an Stärke-, derivat in einer Konzentration von mindestens etwa 2 G-ew.%.

   14. Suspension nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Stärkederivat Rohrzucker ist.

   15· Suspension enthaltend eine lebensfähige, beständige, zellfreie Präparation von zeilassoziiertem Virus in IOr.Ti von FC-126-Isolat von Truthahn-Herp es virus von hohem Titer mit einem'Gehalt an.Stabilisator für das Isolat, der proteinhaltiges Material aus der Gruppe Albumin und Casein umfasst, wobei die Konzentration des proteinhaltigen Materials in dem Stabilisator mindestens etwa 0,05 Gew.% beträgt.

   16. Suspension nach Anspruch 15, gekennzeichnet durch einen zusätzlxchen (rehalt des Stabilisator an Stärkederivat.

   17· Suspension nach Anspruch 16, dadu3?ch gekennzeichnet, dass das Stärkederivat Rohrzucker ist.

   18. Suspension nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Rohrzuckers mindestens etwa 2 Gcw.% beträgt.

   19- Lebensfähige, trockne, Tagerbes taiidi ge, zellfreie Vlruspräparation von hohem Titer, erhalten durch Lyophilisicren der Suspension gernäss einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15, insbesondere 1, 7, 9, 15 oder

   20. Verfahren zur !!einstellung einer beständigen Suspension von lebensfähigem, zellfreiem Virus von hohem Titer, dadurch gekennzeichnet, dass man

   209 824/107

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   a) mit zeilassoziiertem Virus infizierte Zellen mit einem Stabilisator für das Virus in zur Bildung einer homogenen Suspension der infizierten Zellen in dem Stabilisator genügenden Menge mischt und

   b) die homogene Suspension der infizierten Zellen in dem Stabilisator einer zum Bruch der Zellen genügenden Aufbrechung unterwirft, wodurch das intakte, lebensfähige Virus aus den Zellen freigesetzt wird.

   21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man zusätzlich das lebensfähige, zellfreie, in dem Stabilisator suspendierte Virus lyophilisiert.

   22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21» dadurch gekennzeichnet, dass man mit dem FC-126-Isolat des Truthahn-Herpesvirus infizierte Zellen einsetzt.

   25· Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stabilisator einsetzt, der eine Substanz oder Kombination von Substanzen umfasst, die auf das Virus eine zur Aufrechterhaltung eines hohen Titers des Virus während und/oder nach der Aufbrechung der Zellen genügende Schutzwirkung ausüben.

   24. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass iaan einen Stabilisator einsetzt, der Protein aus der Gruppe Albumin und Casein enthält.

   25· Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass man Stabilisator mit einem zusätzlichen Gehalt an Rohrzucker verwendet.

   26. Verfahren nach Anspruch 2J₁ dadurch gekennzeichnet, dass

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   man einen Stabilisator verwendet, der Rohrzucker, Pho phate, Glutamate und .Albumin enthält.

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