KR840000906B1 - 감보로 생독 백신의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

감보로 생독 백신의 제조방법

본 발명은 감보로 생독백신의 제조방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 전염성 활액낭병 바이러스(Infectious Bursal Disease Virus, 이후 IBDV라 함)에 의해 발생하는 닭의 감보로병(Gumboro Disease 또는 Infections Bursal Disease : 이후 IBD라 한다) 예방용 감보로 생독백신의 신규 제조방벙에 관한 것이다.

감보로병은 1962년 코스그로부(Cosgove)에 의해 처음으로 알려지게된 질병이다. 그후 전세계에서 이병이 존재하고 있음이 확인되었고, 우리나라에서는 1979년에 가축위생연구소의 연구팀에 의해 50% 이상의 닭이 감염되어 있음이 황인되었다.

이와같이 전 세계적으로 존재하면서도 확인되지 않은 것은 이 질병 자체가 닭에 어떤 뚜렷한 임상증상은 보이지 않고 병아리의 면역계통기관 즉, 활액낭, 홍선, 비장 그리고 편도선의 끝부분에 많이 증식하여 이들 장기에 있는 임파구를 파괴시키고 결과적으로는 현저한 면역억제 효과만을 나타내어, 모든 예방약에 대한 효과를 없애줌으로서 다른 질병에 잘 걸리게하여 막대한 경제적 손실을 갖어오는 질병있어기 때문이다.

외국에서는 이 질병은 예방하기 위하여 불활화백신(사독백신)과 생독백신이 개발되어 상응되고 있으나, 우리나라에서는 아직 수입에 의존하고 있는 실정이고,단지 불활화 백신에 대한 연구가 이루어지고 있을 뿐이다. 그러나 불활화백신은 제조경비가 막대하게 들고, 백신접종 경비가 많이들며, 시술(접종)하기가 불편할 뿐만 아니라, 면역효과 역시 사독백신 단일만으로는 만족할만한 것이 못되어 대단위 양계장의 전계군에 적용하기에는 힘든 실정이어서, 본 발명자들은 면역효과가 뚜렷하고, 생산 경비가 적게들며, 시술이 간편한 생독백신을 개발하기 위한 연구를 거듭하여 본 발명을 완성하게 되었다.

외국의 공지감보로 생독백신 제조방법은 종독을 발육란에 접종할때 난황 또는 양막강내에 접종하여 백신을 제조하였으나, 이와같은 방법은 바이러스의 증식상태가 똑같은 바이러스량을 접종하였을때 log10^1·6-log10^3·5EID₅₀/㎖ (Egg Infectious Dose : 계람감염가) 밖에는 증식하지 않아 결국 많은 백신재료 (무군종란)를 요구하게 하여 제조경비를 증가시키고, 백신의 바이러스함유량은 log10^5·0EID₅₀/㎖까지 올리기 위하여 많은량의 바이러스를 접종하게 됨으로 접종사(24시간이내 죽는 것) 또는 중사(채독전까지 죽는 것)의 비율을 높임으로 제조상의 문제점이 있었다.

그러나 본 발명자들은 바이러스 접종부위를 장뇨막(Chorio Auantonic Mem -brane, 이후 CAM이라 함)상에 함으로서 난황에 접종하는 것보다 100배 이상의 바이러스를 증식시켜백신 제조시 제조경비를 줄이고, 백신의 효력을 완전하게 함으로 중간제품의 폐기(버림)을 막고, 용적이 적은 병에 많은 수의 닭을 예방(사독백신은 500㎖병에 500마리분을 넣을 수 있으나, 본 제품은 10㎖병에 1,000마리분을 넣을 수 있음)시킬수 있는 백신을 제조함으로 접종을 더욱 간편하게 하였다.

IBD (Infectious Bursal Disease) 바이러스분리;

본 발명자들은 식욕이 감퇴되고 침울하며, 수양성하리가 있는 3주령 전후의 병아리를 야외에서 수집하여, 활액낭의 출혈, 수포, 종대(Swelling), 위축등이 인정되는 것만을 각 개체별로 채취하였다. 채취된 활액낭을 각 개체별로 조직을 마쇄하고 생리 식염수로 30%액을 만들어 1,500rpm으로 5분간 원심하여 지두여과기(손의 힘으로 눌러서 여과하는 주사기 형태의 소형 여과기)로 여과해 검사시까지-20℃에서 보관하면서 사용하였다. 가검여액(상기와 같은 만든 액체)의 일부를 10배 회석하여 원액부터 10만배까지 10일령의 SPF(Specific Phethogen Free : 특정전염병이 없는) 발육난의 장뇨막(CAM)상에 0.2㎖씩 접종하여 2-5일 사이에 바이러스에 에해 죽은 계란의 태아를 무균적으로 채취하여 20%유제(마쇄기로 갈아서 부유시킴)하여 -20℃에 보관하였다.

IBD항혈청 제조 ;

SPF관을 부화시켜 격리된 청결한 계사에서 병아리를 사용하고 4주령, 6주령, 8주령에 Vineland회사 감보로불활화 백신과 Intervet회사의 감보로 불활화 백신은 각각 접종하고 12주령에 채혈하여 항혈청을 제조하였다.

IBD바이러스의 순수분리 ;

IBD항혈청과 11개의 가검 재료를 동량 혼합하여 37℃에서 1시간 감작시킨 후 다시 4주령의 병아리에 2주간격으로 3회 접종하여 IBD바이러스외의 바이러스에 대한 항혈청을 제조하여 11개의 가검재료를 다시 중화하여 10일령의 SPF발육란에 접종하고 2-5일 사이에 바이러스에 의해 죽은 계란의 태아를 무균적으로 채취하여 3종의 가검재료(IBD 바이러스)를 작성하였다.

교차중화시험 ;

3종의 가검재료(IB 215, IB 2137, IB 2193이라고 명함)에 대한 항혈청을 IBD항혈청 제조방법과 같이 제조하여 Vineland 항혈청, Intervet항혈청과 교차중화시험을 실히하였다. 교차중화시험은 G.W. Wood 등의 AGPT (Agar Gel Difution Test) 방법을 사용하였다. 그 결과 3종의 가검재료는 모두 교차 중화시험 양성으로 나타나 분리된 가검재료는 순수한 IBD 바이러스임이 증명되었다.

분리한 IBD 바이러스의 순환 ;

IB 215, IB 2137, IB 2193을 계태아 섬유아세포에 3일간격으로 연속 계대하여 65대까지 바이러스를 계대하였다. 계대된 바이러스의 명칭을 IBD 215, IBD 2137, IBD 2193이라 명명하고 이에 대한 병원성, 민역원성, 바이러스 중식성등을 조사하였다.

병아리에 대한 병원성조사 ;

IBD 215를 10일령의 SPF 발육난의 장뇨막상에 3대 계대하여 태아와 장뇨맥을 무균적으로 채추하여 유제하고 SPGG (Shaccarose, Phosphate, Gulutamin, Gelatin) 보조제를 가하여 동결 건조하여 시험을 실시하였다. 이 종독의 바이러스 함유량은 log10^5·25TCID₅₀/㎖ (Tissue Culsture Infectious Dose : 조직배양감염가)있으며, 종말 판정점에서의 태아병별(피부의 총출혈, 간의 병별)을 인정할 수 있었다.

건조 종독을 3일령의 SPF 병아리에 log10^3·5EID₅₀/㎖를 눈에 접종하고 접종후 7일에 활액낭(F낭)의 위축상태를 검사한 결과 대조군(정상)과 차이를 발견할 수 없었다.

종독의 병원성 복귀검사 ;

종독을 SPF 병아리에 접종하여 접종 7일후 F낭을 채취하여 유제원심 처리하여 다시 병아리에 5대 계대하여도 F낭의 위축등 임상증상을 관찰할 수 없었다.

병아리에 대한 면역원성조사 ;

종독 IBD₂₁₅바이러스를 3대계대(전체 71대)하여 시험백신을 제조하여 병아리에 대한 면역원성을 조사하였다. 이 시험백신의 바이러스 함유량은 log10^2·8EID₅₀/dose이었다.

IBD 항체음성분 SPF란에서 부화된병아리에 생후 7일령에 1차접종을, 생후 14일령에 2차 접종을 하고 28일령에 IB 215 바이러스(log10^3·5EID₅₀/㎖)를 점안 공격접종(Virus Challenge)하여 접종 7일후 F낭의 변화를 관찰한 결과 대조군 5수는 모두 F낭의 위축 및 중출력을 관찰할 수 있었으나, 백신접종군 10수는 모두 정상을 유지하고 있었다.

병아리에 대한 IBD항체 검출 ;

SPF란에서 부화된 병아리에 7일령과 14일령에 백신을 접종하고 매월 AGPT 방법으로 항체 유무를 검사한 결과 6개월까지 50% 이상의 항체를 인정할 수 있었다.

이상과 같이 시험백신은 안정성 및 면역원성이 우수함을 증명할 수 있었으며, 이로서 닭의 감보로병을 예방하여 모든 양계용 백신의 효과를 정상화시켜 줌으로서 양계산업에 크게 공헌할 것으로 기대된다.

제조실시예

가. 종독제조

IBD 215 (65대) 바이러스를 SPF란의 CAM상에 3대계대하여 감염 태아조직을 유제동결 건조하여-30℃에 보관하였다.

나. 제조용 독주 제조

종독을 10일령의 SPF란 장뇨막상에 log10^3·0EID₅₀/㎖를 0.2㎖ 접종하고 37℃부란기내에서 72시간 배양한후 감염태아를 무균적으로 채취하여 동결건조하였다. 이 제조용 독주를-30℃ 냉장고에 보관하고 제조시마다 SPF란에 2대 계대하여 제조용 독주로 사용하였다.

다. 바이러스 접종

2대 계대된 제조용독주를 1500rpm에 5분간 원심하여 상층액을 생리식염수로 100배 회석하여 10일령 SPF발육난 장뇨막상에 0.2㎖씩 접종하였다.

라. 바리어스 채독

접종 96시간후 감염태아 및 장뇨막을 무균적으로 채취하였다.

마. 유제 및 분병

채취된 백신재료를 조직 쇄기로 분쇄하여 SPGG 보조제로 30% 유제하고 100목(눈목)의 신주망으로 여과하여 10㎖ 진공관 유리병에 3㎖씩 소분하여, 동결건조기에 급속 동결시키고 진공 건조하여 감압하에 봉전하여 백신을 제조하였다.

실험실시예

가. 세균검사 :

동물용 생물학적 제제 일반기준의 세균시험법에 준하여 실시하였다.

나. 미입바이러스 부정시험 :

IB 215 할혈청으로 백신을 중화하여 10일령의 SPF발육란 CAM상과 양막강내에 접종하고 접종 72시간후 양막강액에 대한 닭혈구 응집성, 태아의 변화, 장뇨막의 상태를 관찰하였으나, 어떠한 이상도 발견할 수 없었다.

다. 안전시험 :

IBDV항체 음성인 1주령 병아리에 시험백신을 야의량의 10배(음수 Drinking Water)시키고 2주간 관찰 하였으나, 어떠한 임상증상이나 해부소견의 이상을 발견할 수 없었다.

라. 바리어스 함유량 검사 :

10일령의 SPF발육난 장뇨막상에 시험백신을 10진 희석하여 10배부터 1,000만배까지 0.1㎖씩 장뇨막상에 접종하고 8일간 관찰하여 중지란의 병아태변 및 판정일의 태아병변으로 발육난에 대한 감염가로 바이러스 함유량을 측정하였다. 그 결과 시험백신은 log10^2·8EID₅₀/dose의 바이러스를 인정할 수 있었다.

마. 면역원성 시험 :

SPF란으로부터 부화된 7일령의 병아리 15수에 규정량(시험백신 1병을 1,000등분하여 1수분만)을 접종하고 접종 2주후 IB 215로 백신접종 2주후에 공격 접종하고 7일후 F낭의 변화를 관찰한 결과 대조군 5수 모두 F낭의 우축 및 충출혈을 관찰할 수 있었나, 백신 접종군은 모두 정상을 유지하고 있었다.

Claims (1)

1. 감보로 생독백신을 제조함에 있어서, 감보로 바이러스를 약독화시켜서 얻어진 종독을 SPF발육난의 장뇨막상에 접종하여 증식시키고 감염태아와 장뇨막을 채취하여 통상의 방법으로 분쇄, 유제화 및 동결 건조시켜서 감보로 생독백신을 제조하는 방법.