DE69636790T2

DE69636790T2 - Interferon-beta gegen knochenerkrankungen

Info

Publication number: DE69636790T2
Application number: DE69636790T
Authority: DE
Inventors: Nobutaka Ida; Tomohiko Suzuki; Emi Kumagai
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1995-07-25
Filing date: 1996-07-25
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2016-07-26
Also published as: DE69636790D1; EP1416282A3; JP4066460B2; EP1416282A2; CA2200879A1; EP0783891A1; EP0783891A4; WO1997004799A1; EP1759708A1; EP0783891B1; US20050180954A1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Interferon β als ein Medikament für Knochenfunktionsstörungen. Das Medikament wird für die Vorbeugung oder Heilung von Knochenfunktionsstörungen verwendet, die durch verschiedene Ursachen wie physische oder metabolische Ursachen und durch maligne Tumore hervorgerufen werden. Die vorliegende Erfindung schließt auch die Verwendung von Interferoninduktoren als ein Medikament für die Vorbeugung und Heilung von Knochenfunktionsstörungen ein.
Hintergrund
Knochen sind in Vertebraten wichtige Gewebe, welche den Körper stützen. Im Gegensatz zu dem Bild ihrer äußeren Erscheinung wiederholen Knochen aktiv den Knochenabbau durch Osteoklasten und die Knochenbildung durch Osteoblasten, wobei die Homöostase ihrer Morphologie und physischen Stärke, basiedernd auf dem ausgezeichnetem Gleichgewicht zwischen beiden, erreicht wird. Wenn dieses Gleichgewicht verloren geht, werden verschiedene Knochenfunktionsstörungen verursacht. In den letzten Jahren ist Osteoporose besonders ein großes medizinisches und soziales Problem (H. Orimo und H. Ozawa, „Graphically Shown Osteoporosis", MEDICAL VIEW, 1990). Osteoporose tritt nicht notwendigerweise auf, wenn die Osteoklastenakivität unnormal hoch ist, sondern tritt sogar auch zum Beispiel auf, wenn die Osteoklastenaktivität gering ist und die Knochenbildung geringer ist. Die Osteoporose schließt den hohen Typ mit hohem Umsatz, in welchem sowohl die Knochenresorption als auch die Knochenbildung aktiv sind, und den geringen Typ mit geringem Umsatz ein, in welchem sowohl die Knochenresorption als auch die Knochenbildung inaktiv sind. Der Erstere wird auch Typ I genannt und tritt häufig bei Frauen nach der Menopause auf, und der Letztere wird auch Typ II genannt und tritt häufig bei älteren Leuten unabhängig vom Geschlecht auf. Folglich ist das, was wichtig ist, das relative Gleichgewicht zwischen der Knochenbildung und der Osteoklastenaktivität, und das Gleichgewicht spiegelt sich letztlich in dem Knochenvolumen und der Knochenstärke wider. Deshalb wird angenommen, dass es als für die Therapie von Knochenfunktionsstörungen wirksam ist, die von einer Verminderung der Knochenmineraliendichte gegenüber einer relativen Zunahme der Knochenbildungsrate in Bezug auf die Knochenresorptionsrate oder gegenüber einer relativen Verminderung der Knochenresorptionsrate in Bezug auf die Knochenbildungsrate begleitet werden.
In dem Knochenresorptionsprozess spielen die Osteoklasten die wichtigste Rolle (Baron, R. et al., Bone and Mineral Res., 2, 175–243, Elsevier, New York, 1984). Zusätzlich zu den physiologischen Ursachen wie Menopause und Alterung werden Knochenfunktionsstörungen durch verschiedene physikalische, chemische und biologische Ursachen sowie durch unbekannte Ursachen hervorgerufen, welche die Proliferation, die Differenzierung oder die Expression von Funktionen von diesen Zellen beeinflussen, um so das relative Gleichgewicht zwischen der Knochenresorption und der Knochenbildung zu stören. Die Funktionsstörungen, in welchen das relative Gleichgewicht zwischen der Knochenresorption und der Knochenbildung gestört ist, schließen krebsähnliche Erkrankungen wie Knochenmetastasen des Lungenkrebs, Mammakarzinoms oder Nierenkrebs und multiples Myelom; metabolische Knochenfehlfunktionen wie die Paget'sche Krankheit, Rachitits, Osteomalazie, Marmorknochenkrankheit (Osteopetrose), Osteoarthritis und Osteogenesis imperfecta; Erkrankungen, die mit hormonalen Funktionsstörungen zusammen hängen wie das Cushing-Syndrom und Hyperparathyroidismus; Autoimmunerkrankungen wie rheumatoide Arthritis; und Parodontalerkrankungen wie eine Alveolarknochenfunktionsstörung ein. Osteoblasten sind mononukleare Zellen, die sich aus unreifen Mesenchymzellen, die aus dem Mesoderm abstammen, differenzieren. Da Osteoblasten, die von dem Knochengewebe von Versuchstieren abgetrennt wurden, die Eigenschaft haben sich in vitro zu teilen und zu proliferieren, sind eine Zahl von Zelllinien etabliert worden. Beispiele für solche etablierten Zelllinien schließen MC3T3-E1 (Sudo, H. et al., J. Cell Biol., 96, 191, 1983), ROS17/2, UMR106 (Fraser, J. D. et al., J. Biol. Chem., 263, 911, 1988) und RCT-3 (Hearth, J. K. et al., Endocrinology, 124, 3060, 1988) ein.
Osteoklasten sind multinukleäre Riesenzellen (Wergedal, J. E., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 134, 244, 1970, Clark, S. E. et al., J. Bone Mineral Res., 4, 399, 1989), die als Merkmale haben, dass sie Calcitoninrezeptoren haben (Warshawsky, H. D. et al., J. Cell Biol., 85, 682, 1980, Nicholson, G. C. et al., J. Clin. Invest., 78, 355, 1986) und bei der Knochenresorption das Kalzium ionisieren, das in der Knochenmatrix enthalten ist, und das Kalzium zu der Körperflüssigkeit transportieren (Blair, H. C. et al., Science, 245, 855, 1989). Embryologisch werden Osteoklasten durch die Differenzierung aus Knochenmarkszellen gebildet. Es ist bekannt, dass osteoklastenähnliche Zellen, welche die grundlegenden Eigenschaften von Osteoklasten wiedergeben, durch die Kultivierung von mononuklearen Knochenmarks- oder Milzzellen in der Anwesenheit von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ oder Prostagladin E₂ gebildet werden (Takahashi, N. et al., Endocrinology, 122, 1373, 1988, Udagawa, N. et al., Endocrinology, 125, 1805, 1989).
Interferon (nachstehen mit „IFN" abgekürzt) ist ein Protein, das verschiedene physiologische Aktivitäten aufweißt, einschließlich antiviraler und antitumoraler Aktivitäten. Interferon wird nun in α-, β- und γ-Typen klassifiziert, abhängig von den Unterschieden in der Entdeckungsgeschichte, Struktur und den physiochemischen Eigenschaften. Zum Beispiel wird IFNα hauptsächlich von Leukozyten, lymphoblastoiden Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und dergleichen; IFNβ hauptsächlich von Fibroblastenzellen; und IFNγ hauptsächlich von T-Zellen und NK-Zellen hergestellt. Es sind jetzt alle diese IFN-Typen kommerziell als Antitumormittel oder als ein Mittel für die Behandlung von Hepatitis erhältlich und werden klinisch für den Menschen verwendet. Da die Verabreichung von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ oder Calcitonin an Patienten, die an Osteoporose leiden, die Blutspiegel an IFNα erhöhen (Shiozawa, S. et al., Gerontol., 35, 305, 1989), wurde eine gewisse Verbindung nahe gelegt (T. Fujita, Clinical Calcium, 2, 852, 1992). Es wurde über die Bildungshemmung von osteoklastenähnliche Zellen durch verschiedene rekombinante IFNα in humanen Nabelschnurblutzellen in vitro berichtet (K. Anai et al., Nihon-Kotsutaisha-Gakkai Zassi (in japanisch) Band 9, 238, 1991). Ferner wurde berichtet, dass die Verabreichung von humanem rekombinantem IFNα an Patienten, die an Hepatitis C leiden, die Spiegel von Urin-Deoxypyridinolin senkt (H. Yoshida et al., Nihon-Kotsutaisha-Gakkai Zassi, Band 12, 215, 1994), was ein Index für die Osteoklastenaktivität ist, oder das Knochenvolumen erhöht (M. Kawakatsu et al., Nihon-Kotsutaisha-Gakkai Zassi, Band 12, 234, 1994). Auf der anderen Seite jedoch wurde auch berichtet, dass die Verabreichung von humanem rekombinantem IFNα an Patienten, die an Hepatitis C leiden, das Knochenvolumen der Patienten überhaupt nicht beeinflusst (T. Tanaka et al., Japanese Journal of Gastroenterology, Band 91, Gegenstand 0–423, 1994). Folglich ist die Beurteilung von IFNα ein Chaos. Das chaotische Stadium über die Existenz von Wirkungen ist auch aus den grundlegenden Untersuchungen ersichtlich.
Das heißt, es wurde berichtet, dass murines IFN die Knochenresorption in vitro hemmt, die durch parathyroide Hormone in einem Knochen-Organkultursystem induziert wurde (Jilka, R. L. und Hamilton, J. W., Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 553, 1984). Auf der anderen Seite ist auch berichtet worden, dass die Verabreichung von murinem INF an Mäuse, in welche eine dekalzifizierte Knochenmatrix subkutan transplantiert wurde, überhaupt keine Wirkungen in vivo ergibt (Nilsson, O. S. et al., J. Interferon Res., 4, 135, 1984). Das IFN, welches in diesen beiden Experimenten verwendet wurde, war eine Mischung aus IFNα und IFNβ. Ferner ist berichtet worden, dass IFNα überhaupt nicht gegen eine rheumathoide Arthritis wirksam ist (Kajandahl, A. et al., Lancet, Band i, 984, 1979), und es gibt sogar einen Bericht, der auf einem Nachteil von IFN besteht, das heißt, er berichtet, dass IFN eine experimentelle Synovitis und im Menschen Autoimmunerkrankungen induziert (Rosenbach, T. O. et al., Clin. Rheumatol., 3, 361–364, 1984). Folglich ist die Beurteilung von IFN an sich noch nicht festgelegt und über die Existenz von Wirkungen vin IFNβ allein ist gar nichts bekannt.
Der wesentliche Teil von dem Grund, warum es unklar ist, ob eine Wirkung von IFN auf den Knochenstoffwechsel existiert oder nicht, ist die Speziesspezifität von IFN. Vornehmlich, im Gegensatz zu IFNα, hat IFNβ eine starke Speziesspezifität. Deshalb muss eine Beurteilung der Wirkung von IFNβ gemacht werden, wobei das IFNβ von dem Tier der Spezies von Interesse verwendet wird. Wie oben erwähnt wird die Zu- und Abnahme des Knochenvolumens letztendlich durch die relative Stärke der Wirkung auf das Knochenbildungs- und das Knochenresorptionssystem bestimmt, wobei die korrekte Beurteilung von IFNβ nur durch ein vergleichendes Experiment auf das genau und wissenschaftlich kontrollierte Knochenresorptions- und Knochenbildungssystem unter Verwendung des IFNβs von der Tierspezies von Interesse erreicht werden kann. Die vorliegenden Erfinder bestehen darauf, dass es für die Entwicklung eines Medikaments gegen Knochenfunktionsstörungen unabkömmlich ist, Beurteilungen sowohl für das Knochenbildungssystem als auch das Knochenresorptionssystem zu machen. Die Richtigkeit dieser Meinung wird konkret durch das unten beschriebene Beispiel, welches IFNγ einsetzt, gezeigt werden.
Die Berichte über IFNγ sind unter den Berichten über den Einfluss von IFN auf den Knochenstoffwechsel am häufigsten. Die meisten der Berichte verwenden die Hemmung der Bildung von osteoklastenähnlichen Zellen aus Knochenmarkszellen in dem experimentellen System, das von Takahashi et al. etabliert wurde, wobei die Hemmung durch die Stimulation mittels Bradykinin (Lerner, U. H. et al., Agents and Actions, 32, 305, 1991), Forskolin, Choleratoxin (Lerner, U. H. et al., J. Bone Min. Res., 6, 551, 1991), Interleukin 1 (Foffmann, O. et al., Biochem. Biophys, Res. Commun., 143, 38, 1987) oder 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ (Gowen, M. et al., J. Bone Min. Res., 1, 469, 1986) erreicht wird. Vor diesen Berichten ist die Wirkung von IFNγ auf den Knochenstoffwechsel bereits in einer Patentanmeldung veröffentlicht worden (M. Peterlik, japanische Patentanmeldung Nr. 61-123862). Wenn die Beurteilung basierend auf dem Standpunkt gemacht wird, dass die Beurteilung in dem Knochenresorptionssystem allein ausreichend ist, dann sollte die Hemmung der Bildung von Osteoklasten die Abnahme des Knochenvolumens vermindern oder anhalten oder das Knochenvolumen vergrößern, da die Osteoklasten die Knochenresorption durchführen, so dass die Erfindung, die auf die Verwendung von IFNγ als ein Medikament für die Verbesserung des Knochenvolumens gerichtet ist, als vollständig angesehen werden oder kann leicht geschlussfolgert werden. Die Wahrheit war jedoch das Gegenteil. Es ist berichtet worden, dass die Verabreichung von IFNγ keine therapeutische Wirkungen gegen eine Osteopenie hat (nach Stedman's Medical Dictionary, 2. überarbeitete Auflage, Medical View Co., Ltd., 1988, Osteopenie bedeutet die Deposition von Kalzium oder eine Verminderung in der Knochendichte), verringert aber das Knochenvolumen, und es wird nahe gelegt, dass der Grund dafür möglicherweise die Depositionshemmung von Knochenmineral ist (Mann, G. N., et al., Endocrinology, 135, 1077, 1994). Ferner enthüllte die letztere Untersuchung ironischerweise, dass IFNγ, das eine stark hemmende Wirkung auf die Osteoklastenbildung hat, eine ausgezeichnete therapeutische Wirkung gegen die Marmorknochenkrankheit hat, bei welcher die Förderung oder Aktivierung der Knochenresorption durch die Bildung von Osteoklasten für die Therapie oder die Linderung von dieser Erkrankung in sowohl Tieren (Rodriguez, R. M. et al., Pediatrics Res., 33, 384, 1993) als auch Menschen (Lydon Key, Jr. L. et al., New Engl. J. Med., 332, 1544, 1995) benötigt wird.
Folglich muss, damit es ein wirksames Medikament für die Therapie von Knochenfunktionsstörungen ist, vorzugsweise von Knochenfunktionsstörungen, die eine Zunahme des Knochenvolumens benötigen, die Tatsache, dass das Medikament oder die Substanz eine Hemmung der Knochenresorption aufweist unzureichend ist, und aber die Tatsache, dass das Medikament oder die Substanz das Knochenbildungssystem (Proliferation, Differenzierung und Mineralisierung von Osteoblasten) überhaupt nicht oder nur leicht hemmt, oder vorzugsweise die Tatsache, dass das Medikament das Knochenbildungssystem aktiviert, erwiesen sein. Tatsächlich gelangten die vorliegenden Erfinder durch die Lösung des unten beschriebenen Problems zu einer Schlussfolgerung, die der oben erwähnten Beobachtung von Nilsson et al. entgegen steht (J. Interferon Res. 4, 125, 1984), dass die Verabreichung von Maus-IFN für die Knochenbildung in Mäusen überhaupt nicht wirksam ist. Das heißt, die vorliegenden Erfinder vervollständigten die vorliegende Erfindung, indem sie die Wirkung für die Förderung der Knochenbildung nachwiesen, um so das Knochenvolumen wieder herzustellen, welches einst in den Modelltieren für Knochenfunktionsstörungen verringert war.
Offenbarung der Erfindung
Nach der vorliegenden Erfindung, basierend auf der relativen Beurteilung des sowohl genau kontrollierten Knochenresorptionssystems als auch Knochenbildungssystems, wobei IFNβ verwendet wurde, frei von der Unklarheit über die Substanz, wird die Verwendung von IFNβ, welches für die Verwendung in der Industrie und der Medizin nützlich ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von einem gestörten relativen Gleichgewicht zwischen der Knochenresorption und der Knochenbildung bereit gestellt, worin die Knochenfunktionsstörung eine Osteoporose, eine metabolische Knochenfunktionsstörung, hormonelle Knochenfunktionsstörung, Parodontalerkrankungs-verwandte Knochenfunktionsstörung, eine Knochenfraktur oder Hyperkalzämie ist. Ferner, basierend auf den Entdeckungen während des Verlaufs zur Vervollständigung der vorliegenden Erfindung, wird die Verwendung von IFNβ für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von einem gestörten relativen Gleichgewicht zwischen der Knochenresorption und der Knochenbildung durch die vorliegende Erfindung bereit gestellt, worin die Knochenfunktionsstörung eine Osteoporose, eine metabolische Knochenfunktionsstörung, hormonelle Knochenfunktionsstörung, Parodontalerkrankungs-verwandte Knochenfunktionsstörung, eine Knochenfraktur oder Hyperkalzämie ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die hemmenden Wirkungen von murinem IFNβ und γ gegen die Bildung von osteoklastenähnlichen Zellen. Die Knochenmarkszellen stammen aus Mausen des ddY-Stamms.
2 zeigt die hemmenden Wirkungen von murinem IFNβ und γ gegen die Bildung von osteoklastenähnlichen Zellen. Die Knochenmarkszellen stammen aus Mausen des C 57 BL/6-Stamms.
3 zeigt die Wirkungen von murinem IFNβ und γ auf die Proliferation von murinen osteoblastischen MC3T3-E1-Zellen.
4 zeigt die Unterschiede zwischen den Wirkungen von murinem IFNβ und γ auf die Mineralisierung von murinen osteoblastischen MC3T3-E1-Zellen.
5 zeigt die Menge an Kalzium, das aus den kazifizierten Foki aus murinen osteoblastischen MC3T3-E1-Zellen extrahiert wurde, die mit dem murinen IFN behandelt wurden.
6 zeigt die Menge an anorganischem Phosphor, der aus den kazifizierten Foki aus murinen osteoblastischen MC3T3-E1-Zellen extrahiert wurde, die mit dem murinen IFN behandelt wurden.
7 zeigt die Wirkung auf die Förderung der Mineralisierung in murinen osteoblastischen MC3T3-E1-Zellen durch die häufige Verabreichung von murinem IFNβ.
8 zeigt die Wirkung zur Wiederherstellung des Knochenvolumens von Mausen durch die Verabreichung von IFNβ, deren Knochenvolumen durch eine Ovariektomie verringert wurde.
9 zeigt die hemmende Wirkung durch die Verabreichung von murinem IFNβ auf die Knochenresorption, die durch die Ovariektomie vergrößert wurde.
10 zeigt die Veränderung in den Körpergewichten der Mause während des Experiments, in welchem murines IFNβ verabreicht wurde.
Besten Ausführungsformen der Erfindung
Um die Unklarheit über die Substanz zu eliminieren verwendeten die vorliegenden Erfinder hoch reines murines IFN. Zu diesem Zweck ist die Herstellung im großen Stil durch gentechnische Techniken, gefolgt von der Aufreinigung des Produkts, ein guter Weg. Die Details zu diesem Verfahren sind berichtet worden (Murines IFNα: Shaw, G. D. et al., Nucleic Acids Research, 11, 556–573, 1982; Murines IFNβ: Higashi, Y. et al., J. Biol. Chem., 258, 9522, 1983, Senda, T. et al., Proc. Japan, Acad., 66, Ser. B, 77, 1990; Murines IFNγ: Gray, P. W. und Goeddel, D. V., Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 5842, 1983). Es ist unnötig zu sagen, dass natürlich vorkommendes murines IFN ohne irgendein Problem verwendet werden kann, wenn es ausreichend gereinigt ist. In den Beispielen der vorliegenden Erfindung wurde als das murine IFNα ein kommerziell erhältliches Produkt verwendet (Lot. B 13010, 10⁶ Einheiten/ml/Fläschchen, Calbiochem-Novabiochem International, San Diego, CA). Als das murine IFNγ wurde ein Standardprodukt, Lot 254F3, 2,06 × 10⁶ Einheiten/ml, verwendet, das von Genentech, San Francisco, CA, bereitgestellt wurde. Als das murine IFNβ wurde eine Produkt Lot M-0034, 10⁷ Einheiten/ml/Fläschchen verwendet, hergestellt von Toray Industries, Inc. Über das Verfahren zur Herstellung des murinen IFNβ durch gentechnische Techniken sowie das Verfahren zur Aufreinigung des erhaltenen Produkts ist im Detail berichtet worden (Tanaka, T. et al., J. Interferon Res., 6, 429, 1986, Matsuda, S. et al., J. Interferon Res., 6, 519, 1986). Da hochreine murine IFNe auch kommerziell von anderen Herstellern erhältlich sind (z.B., Hycult biotechnology, Paesel GmbH, Cosmo Bio and Genzyme), können alternativ auch diese Interferone verwendet werden.
Um die Unklarheit in den biologischen Beurteilungen zu eliminieren, befasste man sich quantitativ mit den relativen Aktivitäten der Zellen in dem Knochenbildungs- und dem Knochenresorptionssystem von derselben Spezies, vorzugsweise von demselben Stamm, wobei der Misstand im Stand der Technik überkommen werden konnte. Das heißt, selbst wenn Versuchstiere derselben Spezies verwendet werden, unterschiedet sich die Antwort auf verschiedene Hormone stark von Stamm zu Stamm, so dass es notwendig ist die relative Wirksamkeit auf das Knochenresorptionssystem-Knochenbildungssystem unter Verwendung desselben Stamms zu untersuchen. Zum Beispiel ist bekannt, dass die Verminderungsraten des Knochenvolumens durch eine Ovariektomie in Mäusen, die ein Modell für eine Typ I-Osteoporose sind, deutlich unterschiedlich sind, abhängig von dem Stamm (T. Hosaka, ANITEX, Band 5, 243, 1992). Folglich verglichen die vorliegenden Erfinder genau und quantitativ die Wirkungen auf die Osteoblasten, die für das Knochenbildungssystem verantwortlich sind, und die Osteoklasten, die für das Knochenresorptionssystem verantwortlich sind, wobei hochreines murines IFN verwendet wurde und die Osteoblasten und Osteoklasten aus demselben Mausstamm stammten.
Als ein Ergebnis hemmt IFNβ sehr stark die Bildung von Osteoklasten. Auf der anderen Seite hemmt IFNβ nicht wesentlich jegliche Proliferation, Differenzierung und Mineralisierung von Osteoblasten, und IFNβ fördert sogar die Mineralisierung, abhängig von den Bedingungen. Die vorliegenden Erfinder enthüllten diese Fakten zum ersten Mal, wodurch sie die vorliegende Erfindung vervollständigten. Die vorliegenden Erfinder bestätigten die starke Hemmung der Bildung von Osteoklasten durch IFNγ. Wie auch immer, zusätzlich enthüllten die vorliegenden Erfinder zum ersten Mal, dass IFNγ stark die Mineralisierung in dem Knochenbildungssystem in dem einfachen in vitro System hemmt, das Osteoblasten allein enthielt. Dieses Ergebnis erklärt gut das oben erwähnte Ergebnis der Osteoidbildung bei einer Mineralisierungsfunktionsstörung durch IFNγ in vitro (Mann, G. N. et al., Endocrinology, 135, 1077, 1994). Die Mineralisierung ist ein unentbehrlicher Prozess für die Fertigstellung von Knochengeweben, welche harte Gewebe sind. Folglich haben die vorliegenden Erfinder bewiesen, dass die Eigenschaft von IFNβ der von IFNγ für die Verbesserung des Knochenvolumens stark bevorzugt ist, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wird.
Es ist unnötig zu sagen, dass die vorliegenden Erfinder wissen, dass die starke Hemmung durch IFNβ gegen die Bildung von Osteoklasten wirksam für die Vorbeugung und Behandlung von Knochenfunktionsstörungen verwendet werden kann, die mit Krebs zusammenhängen, so wie Knochenmetastasen von zum Beispiel einem Mammakarzinom, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Schilddrüsenkarzinom, Nierenkrebs, Kolonkrebs, Krebs des Verdauungstrakts, Ösophaguskrebs und der gleichen (Stoll, B. A., Bone Metastasis: Monitoring and Treatment, Raven Press, N. Y., 1983). Dies liegt daran, dass die Bildung und Entwicklung von knochenmetastatischen Foki von Tumoren eng mit der Zunahme und Aktivierung von Osteoklasten zusammenhängen (Galasco, C. B. S., Skeletal Metastases, Butterworths, Seiten 22–51, 1986). Deshalb ist es unnötig zu sagen, dass IFNβ wirksam für die Therapie von Hyperkalzämie (eine Form von tumorähnlichen Knochenfunktionsstörungen), die von Tumoren egleitet wird, verwendet werden kann. Die Tatsache, dass IFN stark die Bildung von Osteoklasten in vitro hemmt, und auf der anderen Seite nicht die Proliferation, Differenzierung und Mineralisierung von Zellen des Knochenbildungssystems behindert oder sogar die Mineralisierung, abhängig von den Bedingungen fördert, und die Tatsache, dass IFN in vivo die Knochenresorption hemmt und das Knochenvolumen vergrößert, welches einst in Modelltieren für Osteoporose verringert war, zeigen deutlich, dass die relativen Beurteilungen in sowohl dem Knochenresorptionssystem als auch dem Knochenbildungssystem unabkömmlich sind. Es spielt keine Rolle wie stark die Hemmung durch eine Substanz auf das Knochenresorptionssystem sein mag, dies allein verspricht nicht, dass die Substanz das Knochenvolumen vergrößert. Dies geht aus den hierin beschriebenen Experimenten, die IFNγ verwenden, und aus den berichteten Ergebnissen hervor (Mann, G. N. et al., Endocrinology, 135, 1077, 1994). Das heißt, selbst wenn die die hemmende Wirkung auf die Knochenresorption durch IFN entdeckt wird, es sei denn die Wirkung auf das Knochenbildungssystem ist nicht geklärt, ist die Erfindung vervollständigt, die auf die Verwendung von IFN als ein Medikament für die Vorbeugung und Behandlung von Knochenfunktionsstörungen gerichtet ist.
Die Unklarheit wurde als erstes durch die in vitro Tests in der vorliegenden Erfindung bewältigt, und die Erfindung wurde durch den Beweis in den in vivo-Tests vervollständigt. Ferner bewegt IFNβ den Körper vorwärts hin zu einer relativen Knochenbildung, und diese Wirkung zeigt sich markanter in dem Körper, in welchem das Knochenvolumen unnormal ist (z.B. Mäuse mit einer Ovariektomie, die postmenopausale Osteoporosemodelle sind und in den Beispielen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden), als in dem Körper, der das normale Knochenvolumen hat. Das heißt, wie in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschrieben, wies die Verabreichung von IFNβ mit einer Dosis von 10³ Einheiten/Kopf/Zeit an Mause, die eine Osteoporose durch eine Ovariektomie bekamen, eine vorbeugende Wirkung gegen einen weiteren Knochenvolumenverlust auf. Auf der anderen Seite, obwohl die Wirkung (knochenresorptionshemmende Wirkung), die die Exkretion von Urin-Deoxypyridinolin (nachstehend mit „D-Pyr" abgekürzt) hemmt, auch in der Scheinoperationsgruppe gezeigt ist, brachte dies nicht sofort eine starke Zunahme in dem Knochenvolumen der Mäuse. Dies ist möglicherweise auf Grund der Homöostase, die eine unnormale Zunahme des Knochenvolumens vorbeugt, und dadurch wird das Knochenvolumen so eingestellt, dass es nicht das Stadium wie bei der Marmorknochenkrankheit erreicht. Tatsächlich war das Trockenknochengewicht etwa dasselbe wie das der Kontrollgruppe, an welche eine physiologische Kochsalzlösung verabreicht wurde. Folglich wurde bewiesen, dass die Wirkung von IFNβ das Knochenvolumen zu vergrößern wirksamer in den Individuen gezeigt ist, die ein unnormal geringes Knochenvolumen haben (auf Grund von Funktionsstörungen oder einer gestörten Homöostase), als in den Individuen, die das normale Knochenvolumen haben.
Diese Tatsachen zeigen deutlich an, dass IFNβ sehr wirksam ist für die Vorbeugung und die Therapie von Knochenfunktionsstörungen, die ein unnormales Knochenvolumen im ganzen Knochengewebe oder einem Teil der Knochengewebe zeigen, wie metabolische Knochenfunktionsstörungen, hormonelle Knochenfunktionsstörungen, Osteoporose, Knochenbruch und Alveolarknochenfunktionsstörungen. Mit Blick auf die Wirkung, die durch die vorliegende Erfindung entdeckt wurde, ist es offensichtlich, dass IFN für Knochenfunktionsstörungen von Tieren, mit Ausnahme des Menschen, verwendet werden kann. Jedoch mit Blick auf die Speziesspezifität von IFN ist es bevorzugt das IFN zu verwenden, das von derselben Spezies stammt wie das zu behandelnde Tier. In den letzten Jahren sind die Umgebungen für die Aufzucht von Begleittieren wie Hunden und Katzen sehr viel verbessert worden. Das heißt, es werden sehr fortschrittliche medizinische Technologien auf die Tiere angewendet, und es ist Futter vorherrschend, das gut ausbalancierte Nährstoffe enthält. Als ein Ergebnis steigen die Alter der Begleittiere mehr und mehr an. Die verschiedenen Knochenfunktionsstörungen, einschließlich jener im Zahnbereich, der gealterten Tiere sind jenen des Menschen überraschend ähnlich. Folglich können die IFNe aus verschiedenen Tieren für die Vorbeugung und Behandlung von metabolischen Knochenfunktionsstörungen, hormonellen Knochenfunktionsstörungen, Osteoporose, Knochenfraktur und Alveolarknochenfunktionsstörungen von den entsprechenden Tieren verwendet werden.
Das IFN, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann IFNβ oder der Konsensustyp oder Hybridtyp ein, der die Aminosäuresequenz von IFNβ enthält, und kann ein natürlich vorkommendes, durch gentechnische Techniken oder chemische Synthese hergestelltes IFN sein.
Für die Herstellung von natürlich vorkommendem IFNβ werden vorzugsweise Fibroblasten sowie dafür etablierte Zelllinien eingesetzt. In den Fällen, wo IFN durch gentechnische Techniken hergestellt wird, können als Wirtszellen Säugetierzellen wie CHO-Zellen (Chinesische Hamsterovarzellen) und Maus-C127-Zellen; Zellen von Insekten wie Seidenraube und Barathra; und Zellen von Mikroorganismen wie E. coli, B. subtilis und Hefe eingesetzt werden. Ferner können Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen, Ziege, Schaf, Schwein, Rind und der gleichen eingesetzt werden.
Das so hergestellte IFNβ kann gereinigt werden, indem die der Kulturüberstand der Zellen, der Insektenextrakt, der Bakterienextrakt oder der Körperextrakt verschiedenen Chromatographien zugeführt wird. Es kann irgendeine Chromatographie eingesetzt werden, solange sie eine Affinität zu IFNβ hat. Zum Beispiel können Säulen, die Silica oder Kalziumphosphat als ein Adsorbtionsmittel enthalten; Säulen, die Heparin, Färbemittel oder ein hydrophobes Mittel als einen Liganden haben; Metall-Chelat-Säulen; Ionenaustauschersäulen; und Gelpermeationssäulen eingesetzt werden.
Beispiele für diese schließen fast alle Träger ein, die für eine parenterale Verabreichung geeignet sind, wie Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Ringerlösung, Hanksche Lösung und Glukoselösung sowie Lösungen aus Laktose, Dextrose, Ethanol, Glycerol, Albumin und der gleichen. Diese Zusammensetzungen können andere Zusätze wie Stabilisatoren, Antioxidantien, antibakterielle Mittel, Antiseptika, Pufferungsmittel, oberflächenaktive Mittel und der gleichen je nach Bedarf enthalten. Ferner kann, um grippeähnliche Symptome vorzubeugen oder zu lindern, ein entzündungshemmendes Medikament in der IFN-Rezeptur umfasst sein. Der Zusatz oder die Kombination aus Zusätzen können angemessen aus jenen oben beschriebenen ausgewählt werden, abhängig von der jeweiligen Rezeptur des Medikaments, obwohl, es ist unnötig dies zu sagen, die Zusätze nicht auf die oben beschriebenen beschränkt sind.
Der Verabreichungsweg ist nicht eingeschränkt und wird abhängig von der Funktionsstörung, die zu behandeln ist, geeignet ausgewählt. Das Medikament kann oral; parenteral oder systemisch, das heißt subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, intravaginal, intrarektal oder durch eine intravenöse Injektion; und/oder intranasal und/oder intrapullomal verabreicht werden. Ferner kann abhängig von der Funktionsstörung, die zu behandeln ist, ein System mit verzögerter Freisetzung des dauerhaften Typs wie eine osmotische Pumpe (z.B. eine Alzet-Osmotische-Pumpe, Alzet Corporation, Palo Alto, CA) ausgewählt werden.
Wenn das Medikament intranasal oder intrapullomal verabreicht wird, kann das Medikament in Form einer Lösung oder eines Pulvers durch eine medizinisch akzeptable Vorrichtung formuliert werden, die feine Lösungstropfen oder ein feines Pulver herstellt. Ferner kann das IFN entsprechend der vorliegenden Erfindung für die topikale Anwendung formuliert sein. Zum Beispiel kann das Medikament direkt in die zu behandelnde Stelle infundiert werden, oder es kann ein Träger, der eine verzögerte Freisetzung des Medikaments erlaubt, direkt an der zu behandelnde Stelle eingebettet werden. Beispiele für solche Träger schließen Hydrogele, Polylaktatsäure- und Kollagenmatrizes ein. In den Fällen, in denen eine Kollagenmatrix eingesetzt wird, die von einem Tier abstammt, mit Ausnahme von einem Menschen, wird es bevorzugt Atelokollagen (wie Zyderm, Kollagen Corp., Palo Alto, CA) zu verwenden, in welchem die Antigenität des Kollagens deletiert ist. Ferner kann auch Hydroxyapatitkalziumphosphat (z.B. HA-TCP, Zimmer Inc. Warsaw, IN) als ein geeigneter Träger verwendet werden, das für die topikale Rekonstruktion von Knochen im Bereich der orthopädischen Operation und im Zahnbereich verwendet wird. Noch weiter kann in Fällen, in welchen grippeähnliche Symptome wie Fieber erwartet werden oder tatsächlich auftreten ein entzündungshemmendes Medikament auch in Kombination mit IFN ohne Problem verwendet werden, um die Symptome vorzubeugen oder zu lindern.
Die genaue Dosis für das IFN entsprechend der vorliegenden Erfindung variiert abhängig vom Alter, Körpergewicht und Geschlecht des Patienten; sowie vom Typ, den Merkmalen und Stadium der Funktionsstörung. Deshalb wird die genaue Dosis nicht im Voraus bestimmt und durch den Mediziner festgelegt. Jedoch ist gewöhnlich die geeignete Dosis für die systemische Verabreichung pro Tag pro Person etwa 10 000 Einheiten bis etwa 10 000 000 Einheiten und die geeignete Dosis für die Topikale Verabreichung gewöhnlich etwa 10 000 Einheiten bis 3 000 000 Einheiten.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun durch Beispiele davon beschrieben werden. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass die Beispiele nur für illustrative Zwecke dargelegt sind und die vorliegende Erfindung nicht auf die Beispiele begeschränkt ist.
Beispiel 1
Wirkung auf die Bildung von osteoklastenähnlichen Zellen von Mäusen des ddY-Stamms
1) Verfahren zur Herstellung und Kultivierung von Knochenmarkszellen
Es wurden Knochenmarkszellen in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Takahashi et al (Takahashi, N. et al., Endocrinology, 122, 1373, 1988) hergestellt. Es wurden männliche Mäuse des ddY-Stamms im Alter von 7 Wochen bis zum Tod unter Etheranästhesie ausgeblutet und Femur und Tibia der Hinterbeine aus jeder Maus entnommen. Die Bindegewebe auf den Oberflächen der Knochen wurden vorsichtig entfernt und beide Enden jedes Knochens mit einer Schere abgeschnitten. Die Knochenmarkszellen wurden in α-Minimalmedium (α-MEM, α Minimum Essential Medium, Nissui Pharmceuticals Co.) suspendiert, das 10% Präkolostrum neugeborenes Kälberserum (Mitsubishi Chemical, nachstehend mit „JCS" abgekürzt) enthielt, und die Suspension wurde durch eine 25G Nadel ausgestoßen, die auf eine Spritze aufgesetzt war, um die Suspension in einen Zentrifugationsröhrchen zu sammeln. Die gesammelte Suspension wurde durch die Zentrifugation in demselben Medium bei 2000 rpm bei 4°C für 5 Minuten gewaschen. Die präzipitierten Zellen wurden in dem oben genannten Medium dispergiert und das Waschen mittels Zentrifugation zweimal wiederholt, wodurch die Knochenmarkszellen aufbereitet wurden. Es wurde murines IFN-α (nachstehend mit „MuIFNα" abgekürzt), Lot. B13010, 10⁶ Einheiten/ml/Fläschchen (Calbiochem-Novabiochem International, San Diego, CA), murines IFN-β (nachstehend mit „MuIFNβ" abgekürzt), Lot M-0034, 10 Einheiten/ml/Fläschchen (Toray Industries, Inc.) beziehungsweise murines IFN-γ (nachstehend mit „MuIFNγ" abgekürzt), Lot 254F3, 2,06 × 10⁶ Einheiten/ml (Genentech, CA) in 10% JCS-haltigen α-MEM (Nissui Pharmaceuticals Co.) in der gewünschten Konzentration gelöst. Es wurde aktives Vitamin D₃ (1α,25-Dihydroxyvitamin D₃, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., nachstehend mit „Vit D₃" abgekürzt) in argongesättigtem Ethanol gelöst und die erhaltene Lösung wurde so verdünnt, dass die Ethanolendkonzentration von 0,1% in allen Kultursystemen erhalten wurde.
2) Beurteilung der Fähigkeit Osteoklasten zu bilden
Es wurde die Zahl der lebensfähigen Knochenmarkszellen unter Verwendung eines Trypanblau-Exklusionstests gezählt, und die Knochenmarkszellen wurden mit α-MEM, das 10% JCS, 10^–8 M Vit D₃, 10^–7 M Dexamethason enthielt, auf eine Populationsdichte von 1,5 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt, und von der resultierenden Suspension wurde anschießend in jedes Loch einer 24-Loch-Platte die Menge von 0,45 ml/Loch gegeben. In jedes Loch wurden 50 μl des Medium zugegeben, das unterschiedliche IFN-Konzentrationen enthielt, um ein Volumen von 0,5 ml/Loch zu bilden und es wurde mit der Kultivierung begonnen. Alle drei Tage wurden 0,4 ml des Kulturmedium aus jedem Loch entfernt und 0,4 ml frisches Medium (das oben gewähnte Medium, das die entsprechende IFN-Konzentration enthielt) zugegeben. Am 8. Tag vom Beginn der Kultivierung an wurde das Medium entfernt und die Zellen mit einer Mischlösung aus Ethylalkohol und Diethylether (1:1) fixiert und mit Tartrat-resistenter saurer Phosphatase (TRAF) gefärbt, gefolgt von dem Auszählen der TRAP-positiven multinukleären Zellen mit einem Phasenkonstrastmikroskop. 1 zeigt die Ergebnisse. Sowohl das MuIFNβ als auch das MuIFNγ, das zu jedem oben genannten System zugegeben wurde, hemmte stark die Bildung von osteoklastenähnliche Zellen. Jede Säule in der Figur zeigt den Mittelwert und Standartfehler von 4 Fällen. Es wurde für beide IFNe eine deutliche Dosisabhängikeit beobachtet. Die hemmende Wirkung von IFNγ war stärker als die von IFNβ. Das heißt, dass die Hemmkonzentration IC₅₀ von IFNγ nicht mehr als 0,1 Einheiten/ml und die von IFNβ 0,2 Einheiten/ml war.
Beispiel 2
Wirkung auf die Bildung von osteoklastenähnlichen Zellen von Mäusen des C 57 BL/6-Stamms
Anstelle der Mäuse des ddY-Stamms wurden männliche Mäuse des C 57 BL/6-Stamm mit einem Alter von 7 Wochen verwendet. Die Mäuse wurden bis zum Tod unter Etheranästhesie ausgeblutet und Femur und Tibia der Hinterbeine aus jeder Maus entnommen. Die Bindegewebe auf den Oberflächen der Knochen wurden vorsichtig entfernt und beide Enden jedes Knochens mit einer Schere abgeschnitten. Die Knochenmarkszellen wurden in α-MEM suspendiert, das 10% JCS enthielt, und die Suspension wurde durch eine 25G Nadel ausgestoßen, die auf eine Spritze aufgesetzt war, um die Suspension in einen Zentrifugationsröhrchen zu sammeln. Die gesammelte Suspension wurde durch die Zentrifugation in demselben Medium bei 2000 rpm bei 4°C für 5 Minuten gewaschen. Die präzipitierten Zellen wurden in dem oben genannten Medium dispergiert und das Waschen mittels Zentrifugation zweimal wiederholt. Die Bildung von osteoklastenähnlichen Zellen wurde durch dasselbe Verfahren gemessen wie in Beispiel 1. Als eine Ergebnis, wie in dem Fall mit den Mäusen des ddY-Stamms, hemmte sowohl MuIFNβ als auch MuIFNγ stark die Bildung von osteoklastenähnlichen Zellen aus Knochenmarkszellen von Mäusen des C 57 BL/6-Stamms. 2 zeigt die Ergebnisse. Die IC₅₀-Werte der Bildungshemmung von osteoklastenähnlichen Zellen durch MuIFNβ und MuIFNγ waren 0,1 Einheiten/ml beziehungsweise 1,5 Einheiten/ml. Jede Säule in der Figur zeigt den Mittelwert und Standartfehler von 4 Fällen.
Beispiel 3
Wirkung auf die Proliferation von murinen Osteoblasten (in vitro einzelne Verabreichung)
Es wurden murine osteoblastenähnliche MC3T3-E1-Zellen, die aus C 57 BL/6-Mäusen (Kodoma et al., Jap. J. Oral Biol., 23, 899, 1982) stammen, mit PBS (–) gewaschen und die Zellen durch die Inkubation in PBS (–) dissoziiert, das 0,1% Pronase (Aktinase E, Kaken Pharmaceuticals Co.) enthielt, gefolgt von der Dispersion der Zellen in αMEM, das 10% JCS und 50 μg/ml L-Ascorbinsäure (ASA) enthielt. Die Fähigkeit die Proliferation von Zellen zu fördern wurde wie folgt beurteilt. Das heißt, die MC3T3-E1-Zellen wurden in jedes Loch einer 24-Lochplatte (Corning) mit einer Menge von 5000 Zellen/Loch gegeben. Dann wurde jede IFN-Verdünnung zu jedem Loch mit einer Menge von 0,1 ml/Loch zugegeben, und es wurde mit der Kultivierung begonnen. Am Tag 2 wurde das Medium entfernt und die jeweilige IFN-Verdünnung mit einer Menge von 0,5 ml/Loch zugegeben (Gesamtflüssigkeitsmenge: 0,5 ml/Loch). Am Tag 6 wurde das Medium entfernt und die Zellen mit PBS (–) gewaschen und eine gemischte Enzymlösung mit 0,1% Pronase/0,1% Kollagenase zu jedem Loch mit einer Menge von 200 μl/Loch zugegeben und anschließend eine Reaktion bei 37°C für 15 Minuten ermöglicht. Dann wurde αMEM, das 10% fötales Kälberserum (Gibco, nachstehend mit „FCS" abgekürzt) enthielt, mit einer Menge von 300 μl/Loch zugegeben, um die Zellen darin zu dispergieren, und die Zahl der Zellen wurde mit einem Coulter-Counter gezählt.
Die Wirkungen auf die Zellproliferation sind 3 gezeigt. Jede Säule in der Figur zeigt den Mittelwert und Standartfehler von 4 Fällen. Beide murine IFNe zeigten sehr schwache oder im Wesentlichen keine hemmenden Wirkungen auf die Proliferation von MC3T3-E1-Zellen. Obwohl mit MuIFNγ mit der Dosis von 1 Einheit/ml eine leichte Proliferationhemmung beobachtet wurde, ist die Dosisabhängigkeit gering, und die Hemmung war sogar mit der hohen Konzentration von 10 000 Einheiten/ml nur etwa 30%. Auf der anderen Seite hemmte das MuIFNβ sogar bei 10 000 Einheiten/ml überhaupt nicht.
Beispiel 4
Wirkungen auf die Differenzierungsfähigkeit und Mineralisierung von murinen Osteoblasten (in vitro einzelne Verabreichung)
Als die Parameter für die Beurteilung der Differenzierungsfähigkeit wurden die alkalische Phosphatase (ALPase) und die Mineralisierung eingesetzt. Der Nachweis der alkalischen Phosphatase, welche eine Marker für die Differenzierung von Osteoblasten ist, wurde am Tag 8 vom Beginn der Kultivierung an durch ein Färbeverfahren durchgeführt. Die Beurteilung der Mineralisierung wurde wie folgt durchgeführt. Das heißt die MC3T3-E1-Zellen wurden in jedes Loch einer 24-Lochplatte mit einer Menge von 50 000 Zellen/ml gegeben (10-fach in dem Fall von des anti-Zell-Tests in Beispiel 3). Am Tag 4, nachdem bestätigt wurde, dass die Zellen eine ausreichende Konfluenz erreicht hatten, wurde das Medium verworfen und frisches αMEM, das 10% JCS, 50 μg/ml L-Ascorbinsäure und 10 mM β-Glycerophosphat enthielt, mit einer Menge von 0,9 ml/Loch zugegeben, gefolgt von der Zugabe von Medium, das unterschiedliche IFN-Konzentrationen enthielt. Vier Tage später wurde das Medium durch IFN-freies Medium ersetzt und das Medium alle 4 Tage mit IFN-freiem Medium ersetzt. Am Tag 14 wurde eine Von-Kossa-Färbung durchgeführt, um die kalzifizierten Foki sichtbar zu machen. Die Expression der Aktivität der alkalischen Phosphatase, welche ein Differenzierungsmarker ist, ist ein unabkömmlicher Schritt für die anschließende Mineralisierung. Beide murinen IFNs hemmten nicht die Expression der Enzymaktivität, welche ein Differenzierungsmarker ist.
Auf der anderen Seite wurde zwischen dem MuIFNβ und MuIFNγ bei dem Mineralisierungsprozess ein großer Unterschied beobachtet, wie es in 4 gezeigt ist. Das heißt, während die Mineralisierung ohne einen wesentlichen Einfluss sogar in der Anwesenheit von IFNβ fortschritt, zeigte IFNγ eine starke und dosisabhängige hemmende Wirkung auf die Mineralisierung. Die hemmende Wirkung drückte sich mit einer geringen Konzentration von 10 Einheiten/ml aus, und der IC₅₀-Wert der Mineralisierungshemmung war etwa 3–4 Einheiten/ml. Es ist unnötig zu sagen, dass für die vollständige Reparatur der Knochengewebe als harte Gewebe die Hemmung der Mineralisierung durch MuIFNγ nicht wünschenswert ist, so dass die Überlegenheit von IFNβ gegenüber IFNγ offensichtlich ist.
Beispiel 5
Quantifizierung von Kalzium und anorganischem Phosphor in kalzifizierten Foki von murinen Osteoblasten MC3T3-E1
Es wurde in jedes Loch einer 24-Lochplatte MC3T3-E1-Zellen mit einer Menge von 50 000 Zellen/Loch gegeben und bis zur Konfluenz kultiviert. Das Medium wurde entfernt und eine Menge von 0,9 ml/Loch frisches α-MEM zugegeben, das 10% JCS, 50 μg/ml L-Ascorbinsäure und 10 mM β-Glycerophosphat enthielt, gefolgt von der Zugabe von 0,1 ml/Loch Medium, das verschiedenen Konzentrationen von IFN enthielt. Das Medium wurde alle 4 Tage durch IFN-freies Medium ersetzt. Am Tag 14 wurde das Medium entfernt und die Zellen leicht mit Hankscher Lösung gewaschen. Es wurde wasserfreies Ethanol mit einer Menge von 1 ml/Loch zugeben und die Fixierung bei Raumtemperatur für 15 Minuten durchgeführt. Dann wurde das wasserfreie Ethanol durch die Menge von 1 ml/Loch frischem wasserfreiem Ethanol ersetzt und 5 Minuten später wurde jedes Loch an der Luft getrocknet. Dann wurde die Menge von 1 ml/Loch 1N Salzsäure zugeben und die Extraktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten durchgeführt. Der gesamte Inhalt jedes Lochs wurde in ein Eppendorfröhrchen überführt und bei 1800 × g bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Es wurde die Menge an Kalzium mittels dem Calcium C Test Wako^® und die Menge an anorganischem Phosphor mittels dem Phospha B Test Wako^® in dem Überstand gemessen. Obwohl eine leichte Hemmung der Kalziumdeposition bei der Zugabe von IFNβ beobachtet wurde, war der Grad gering und die Kalziumdeposition war sogar bei einer Konzentration von 1000 Einheiten/ml nur um 20% geringer als bei der Kontrolle. Auf der anderen Seite wies IFNγ eine dosisabhängige und starke Mineralisierungshemmung auf und die Kalziumdeposition war bei einer Konzentration von 1000 Einheiten/ml um 70% kleiner als bei der Kontrolle. Der IC₅₀-Wert war mit etwa 10 Einheiten/ml gering (5). Jeder Punkt in der Figur zeigt den Mittelwert und Standardfehler von 4 Fällen.
Die Mengen des aus den kalzifizierten Foki extrahierten anorganischen Phosphors sind in 6 gezeigt. Jeder Punkt in der Figur zeigt den Mittelwert von 4 Fällen. Die Mengen des extrahierten anorganischen Phosphors zeigten eine gute Korrelation mit den Kalziummengen. Die Menge des extrahierten anorganischen Phosphors für 1000 Einheiten/ml IFNβ war nur um etwa 20% kleiner als die der Kontrolle und der IC₅₀-Wert konnte nicht erhalten werden. Auf der anderen Seite war die Menge an extrahierten anorganischen Phosphor für 1000 Einheiten/ml IFNβ um etwa 80% kleiner als die der Kontrolle und der IC₅₀-Wert war etwa 10 Einheiten/ml, was sehr klein ist (6).
Beispiel 6
Wirkungen auf die Differenzierungsfähigkeit und Mineralisierung von murinen Osteoblasten (in vitro mehrfache Verabreichung)
Es wurde in jedes Loch einer 24-Lochplatte MC3T3-E1-Zellen mit einer Menge von 30 000 Zellen/Loch gegeben und bis zur Konfluenz kultiviert. Das Medium wurde entfernt und eine Menge von 0,9 ml/Loch frisches α-MEM zugegeben, das 10% JCS, 50 μg/ml L-Ascorbinsäure und 10 mM β-Glycerophosphat enthielt, gefolgt von der Zugabe von 0,1 ml/Loch Medium, das verschiedenen Konzentrationen von IFN enthielt. Das Medium wurde alle 4 Tage durch das Medium ersetzt, das die entsprechende IFN-Konzentration enthielt. Am Tag 9 nach der ersten Behandlung mit IFN wurde eine Von-Kossa-Färbung durchgeführt, um die kazifizierten Foki zu visualisieren. Als ein Ergebnis war, im Unterschied zu der einzelnen Verabreichung, durch die zweifache Verabreichung von IFN die Zahl der kazifizierten Foki und die Färbeintensität dosisabhängig erhöht (7).
Beispiel 7
Therapeutische Wirkung von murinem IFNβ gegen Osteoporose in einem Mausmodel
Es wurden weibliche Mäuse des ddY-Stamms mit einem Alter von 8 Wochen in 5 Gruppen aufgeteilt und das Experiment durchgeführt. Es wurde eine bilaterale Ovariektomie an den Mausen in 3 Gruppen und an den Mausen in 2 Gruppen wurde eine Scheinoperation durchgeführt. Danach wurden die Mause für 1 Monat mit einer normalen Diät aufgezogen, wodurch der Zustand der Oseoporose in den Gruppen mit einer Ovariektomie hergestellt wurde. Für dieses Modell ist bekannt, dass die Mause das Osteoporosestadium 2 bis 3 Wochen nach der Ovaiektomie erreichen (T. Hosaka, et al., ANITEX, Band 5, 243, 1992; Miyaura, C. et al., J. Bone Mineral Res., 10, 1365, 1995). Ab der dritten Woche von der Ovaiektomie ans wurde murines IFN einmal täglich und insgesamt 25mal subkutan verabreicht (100 μl/Kopf/Tag). Am Tag 30 von Beginn der Verabreichung an wurde unter Anästhesie für jede Maus das Körpergewicht gemessen, das Blut abgenommen, der Femur entnommen und das Tockenknochengewicht davon gemessen.
Das Trocknen des Femurs wurde wie folgt durchgeführt. Das heißt der Femur wurde mit 2 ml 70% Ethanol pro entnommenem Femur bei Raumtemperatur für 24 Stunden fixiert und dann die angehängten Muskeln und Bindegewebe vorsichtig mit einer Zange und einem Operationsmesser mit einer ersetzbaren Klinge entfernt. Nachdem der Femur in frischem 70% Ethanol für 72 Stunden bei Raumtemperatur getränkt wurde, wurde der Femur in einem Heißwindgenerator (Koukensha Engineering Co., Tokyo) bei 55°C für 24 Stunden getrocknet. Das Gewicht des getrockneten Knochens wurde mit einer elektronischen Kraftwaage gemessen (Mettler AE50, Mettler Instruments AG, Switzerland). Das zu verabreichende murine IFN wurde auf die gewünschte Konzentration mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Während des Tests wurde der Urin der Mause in einem metabolischen Käfig (KN-645, Natsumeseisakusho, Tokyo) gesammelt und für die Aufbewahrung eingefroren. Der einen Gruppe, die der Scheinoperation unterworfen worden war, wurde, wurde physiologische Kochsalzlösung (Otsuka Pharmaceuticals Co.) verabreicht, und der anderen Gruppe, die der Scheinoperation unterworfen worden war, wurde murines IFNβ mit einer Dosis von 10⁵ Einheiten/Kopf/Zeit (für die Verwendung mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt) verabreicht. Der einen Gruppe, die der Ovariektomie unterworfen worden war, wurde eine physiologische Kochsalzlösung verabreicht und an den anderen zwei Gruppen, die der Ovariektomie unterworfen worden waren, wurde MuIFNβ mit einer Dosis von 10³ Einheiten/Kopf/Zeit beziehungsweise 10⁵ Einheiten/Kopf/Zeit verabreicht. 8 zeigt die Trockenknochengewichte. Die Ovariektomie, die ein Modell für die postmeopausale Osteoporose ist, verursachte eine deutliche Verminderung in dem Knochenvolumen in Mäusen. Die Verabreichung einer Dosis von 10⁵ Einheiten/Kopf/Zeit MuIFNβ stellte die normalen Knochenvolumenlevel wieder her, so dass MuIFNβ eine deutliche therapeutische Wirkung aufwies. Auf der anderen Seite wurden in den Gruppen, die der Scheinoperation unterworfen worden waren, sogar mit einer Dosis von 10⁵ Einheiten keine signifikante Zunahme in dem Knochenvolumen beobachtet.
Es ist gut bekannt, dass die Zu- und Abnahme der Menge an Urin-D-Pyr, das im Urin ausgeschieden wird und eine mit dem Knochenkollagen quervernetzte Substanz ist, ein ausgezeichneter Marker ist, der den Grad des Knochenkollagenabbaus widerspiegelt, das heißt den Grad der Knochenresorption (C. P. Jerome et al., Bone and Mineral, 19, 117–125, 1992). Zur Messung des Urin-D-Pyr wurde ein kommerziell erhältlicher Kit (PYRILINKS – D Aassay, METRA BIOSYSTEMS) verwendet. Die Menge an D-Pyr von den Mausen in jeder Gruppe, kompensiert mit der Menge an Urinkreatinin, ist in Woche 4 von der Verabreichung von MuIFNβ in 9 gezeigt. In der Gruppe, an welche die physiologische Kochsalzlösung verabreicht wurde, ist die Menge an D-Pyr, das ein Marker für die Knochenresorption ist, deutlich erhöht, während in den Gruppen, an welche das MuIFNβ mit einer Dosis von 10³ Einheiten/Kopf/Zeit beziehungsweise 10⁵ Einheiten/Kopf/Zeit verabreicht wurde, die Menge an ausgeschiedenem D-Pyr kleiner war, das heißt es wurde eine Hemmung der Knochenresorption beobachtet. Der Grad der Hemmung war etwa zu dem gleichen Level wie in der Gruppe, die der Scheinoperation unterworfen worden war und der physiologische Kochsalzlösung verabreicht wurde, das heißt etwa der gleiche Level wie der normale Wert im Urin. 10 zeigt die Veränderung im Körpergewicht vor und nach Beginn der MuIFNβ-Verabreichung. Obwohl es nicht in der Figur gezeigt ist war das Körpergewicht der Mause unmittelbar vor der Ovariektomie (3 Wochen vor dem Beginn der MuIFNβ-Verabreichung) 25,6 ± 0,18 g (n = 33) und das der Gruppe, die der Scheinoperation unterworfen werden sollte, 25,7 ± 0,36 g (n = 11), so dass die Körpergewichte der Gruppen etwa dieselben waren. Obwohl 2 Wochen nach der Opration, das heißt in der Woche 1 vor dem Beginn der IFN-Verabreichung, die Körpergewichte der Gruppen unterschiedlich waren, spiegelt dies die Zunahme in dem Körpergewicht auf Grund der Ovariektomie wider (Miyaura, C. et al., J. Bone Mineral Res., 10, 1365, 1995). Durch eine Autopsie nach dem Test wurde eine große Abnahme im Uterusgewicht der Gruppe mit der Ovariektomie bestätigt. Dies ist auch eine typische Reaktion auf Grund einer Ovariektomie (Miyaura, C. et al., J. Bone Mineral Res., 10, 1365, 1995). Durch die durchgehende Verabreichung von IFNβ über 4 Wochen mit einer Dosis, die eine therapeutische Wirkung aufweist, das heißt mit einer Dosis, mit der das Knochenvolumen vergrößert wird, wurde keine problematische Veränderung in dem Körpergewicht in irgendeiner Gruppe beobachtet.
Beispiel 8
Vergleich der Wirkungen von verschiedenen murinen IFNen auf die Hemmung der Bildung von murinen Osteoklasten
Die Wirkungen von den drei IFNen, das heißt von MuIFNβ, γ und α in Bezug auf die Fähigkeiten die Bildung von osteoklastenähnlichen Zellen aus Knochenmarkszellen in Mäusen des ddY-Stamms zu hemmen, wurden verglichen. Der Test wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Alle murinen IFNe hemmten die Bildung von osteoklastenählichen Zellen, und die Wirkung war in der Abfolge γ, β und α am stärksten. Die IC₅₀-Werte, die aus den dosisabhängigen Kurven davon bestimmt wurden, waren nicht mehr als 0,1 Einheiten/ml für IFNγ und etwa 0,9 Einheiten/ml für IFNβ, während der für IFNα 22,4 Einheiten/ml war. Folglich war die Aktivität von IFNα, die Bildung von Osteoklasten zu hemmen, etwa 1/20 von der von IFNβ und etwa nicht mehr als 1/100 von der von IFNγ.
Industrielle Anwendbarkeit
Wie oben durch die vorliegende Erfindung beschrieben wurde die relative Wirkung von IFNβ die Knochenbildung zu fördern in in vitro-Tests und in Tiertests nachgewiesen, so dass die Nützlichkeit von IFNβ als ein Medikament für die Behandlung und Vorbeugung von Knochenfunktionsstörungen gezeigt wurde. Vornehmlich die Entdeckung, dass die Wiederherstellung des Knochenvolumens durch IFNβ in vivo in den Individuen markanter ist, die unnormale Knochenvolumina haben, als in den Individuen, die normale Knochenvolumina haben, stellt einen großen Vorteil für die industrielle Verwendung von IFNβ als ein Medikament für die Behandlung von Knochenfunktionsstörungen bereit.
Ferner wurde die Möglichkeit entdeckt Interferoninduktoren als Medikamente für die Behandlung von Knochenfunktionsstörungen zu verwenden, was einen großen Vorteil für die industrielle Verwendung von IFNβ als ein Medikament für die Behandlung von Knochenfunktionsstörungen bereitstellt.

Claims

Verwendung von Interferon β für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Knochenfunktionsstörung, wobei das relative Gleichgewicht zwischen der Knochenresorption und Knochenbildung gestört ist, worin die Knochenfunktionsstörung eine Osteoporose, metabolische Knochenfunktionsstörung, hormonelle Knochenfunktionsstörung, Parodontalerkrankungs-verwandte Knochenfunktionsstörung, Knochenfraktur oder Hyperkalzämie ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das besagte Interferon β ein natürlich vorkommendes, ein Konsensustyp, ein Hybridtyp, der die Aminosäuresequenz von Interferon β enthält, oder ein rekombinanter Typ ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die besagte Osteoporose eine postmenopausale Osteoporose ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die besagte metabolische Knochenfunktionsstörung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Paget'schen Krankheit und Osteoarthritis.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die besagte hormonelle Knochenfunktionsstörung ein Cushing-Syndrom oder Hyperparathyroidismus ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die besagte Parodontalerkrankungsverwandte Knochenfunktionsstörung eine Alveolarknochenfunktionsstörung ist.