EP0918537A1 - Beeinflussung von cytokinen durch proteolytische enzyme - Google Patents

Beeinflussung von cytokinen durch proteolytische enzyme

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EP0918537A1
EP0918537A1 EP98934985A EP98934985A EP0918537A1 EP 0918537 A1 EP0918537 A1 EP 0918537A1 EP 98934985 A EP98934985 A EP 98934985A EP 98934985 A EP98934985 A EP 98934985A EP 0918537 A1 EP0918537 A1 EP 0918537A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
enzymes
cytokines
trypsin
cells
enzyme
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98934985A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gerhard Stauder
Karl Ransberger
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Mucos Pharma GmbH and Co
Original Assignee
Mucos Pharma GmbH and Co
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Filing date
Publication date
Application filed by Mucos Pharma GmbH and Co filed Critical Mucos Pharma GmbH and Co
Publication of EP0918537A1 publication Critical patent/EP0918537A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
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    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4873—Cysteine endopeptidases (3.4.22), e.g. stem bromelain, papain, ficin, cathepsin H
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/02—Local antiseptics
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Definitions

  • the present invention relates to a method for influencing cytokines by proteolytic enzymes and the use of proteolytic enzymes for influencing cytokines.
  • cytokines are important metabolic substances in triggering various disease states. Cytokines are small proteins with molecular weights of 8,000 to 30,000, with each cytokine having its own amino acid sequence and cell surface receptors. They are made from a variety of different cell types and act on almost every tissue and organ system. The names given to the various cytokines do not follow a logical system, but rather correspond to their biological properties. IL-1 and TNF (tumor necrosis factor) are the primary pro-inflammatory cytokines, and moreover, these two cytokines act in a synergistic manner in inducing inflammation, shock and death.
  • interleukin-2 receptor e.g. interleukin-2 is the natural ligand.
  • Other cytokines are also ligands of the surface molecules and are therefore influenced by them.
  • Certain infections or cancers result in a shift in various subpopulations of lymphocytes, granulocytes and monocytes in homeostasis. Normally the organism is able to restore the distributional equilibria of the subpopulations in the process of recovery.
  • the present invention was therefore based on the technical problem of specifying a method for influencing cytokines.
  • the use of at least one proteolytic enzyme and optionally rutoside is provided for influencing cytokines.
  • the immunoglobulins modulated by the proteolytic enzyme or enzymes are distinguished by the fact that their binding capacity for the complement component C1q is reduced. This applies to natural C1 q-binding immunoglobulins (subclasses IgG1, IgG2, IgG3, IgM and partly IgA).
  • the changed C1 q binding capacity is - without being bound by any theory - probably caused by a change in the conformation of the C H 2 domain due to the action of the enzyme.
  • the conformational change can either be caused directly by an enzyme-induced change in the C H 2 domain, or the proteolytic enzymes cause a structural change in the regions adjacent to the C H 2 domain, and these changes influence the conformation of the C H 2 domain. Domain.
  • trypsin, bromelain, papain and optionally rutin or a combination thereof is used as the proteolytic enzyme.
  • the enzymes used according to the invention can be isolated inexpensively from the following raw materials.
  • Bromelain is a proteolytically active enzyme from the pineapple juice and can also be isolated from ripe fruit.
  • Papain is a proteolytic enzyme obtained from the milk sap of the immature, meaty fruits of the Carica Papaya melon tree.
  • Pure papain is a crystalline polypeptide with an MG. from 23350 consisting of a chain of 212 amino acid residues with 4 disulfide bridges; Sequence and spatial structure are known.
  • Papain is used in many different ways: due to its protein-splitting properties as "meat tenderizer” or “short salt”, for clarifying beer, for bread and hard biscuit production, in leather preparation, in the textile industry for degassing silk and for preventing wool matting, in the tobacco industry for quality improvement, for the recovery of silver from used photographic material, furthermore in bacteriology for the extraction of peptone.
  • papain is already used to support enzymatic digestion, for enzymatic wound cleaning and as an additive to denture cleaning agents.
  • papain preparations are also available bound to plastic polymers or agarose. Papain has also been used as a catalyst for the synthesis of oligopeptides.
  • Trypsin is a proteolytic enzyme that is also formed in the pancreas and is already used therapeutically in conjunction with other enzymes. It belongs to the serine proteinases. Crystalline trypsin has a MW of approx. 23300, is soluble in water but not in alcohol, has an optimum activity at pH 7-9 and cleaves peptide chains specifically on the carboxy side of the basic amino acid residues L-lysine and L-arginine. The spatial structure of the 223 amino acid trypsin is known.
  • Rutoside can also be added to the medication.
  • Rutoside is a glycoside that belongs to the flavonoids. The combined use of 20 to 100 mg bromelain, 40 to 120 mg papain and 10 to 50 mg trypsin per dose unit is particularly effective.
  • a combination of 90 mg bromelain, 120 mg papain and 100 mg rutoside x 3H 2 O is very particularly preferred.
  • a combination of 48 mg trypsin, 90 mg bromelain and 100 mg rutoside x 3H 2 0 is used.
  • 10 to 100 mg, particularly preferably 100 mg of rutoside x 3 H 2 0 are used per dose unit.
  • the medicament can furthermore contain all customary auxiliaries and / or carriers.
  • Auxiliaries and carriers include e.g. Lactose, magnesium stearate, stearic acid, talc, methacrylic acid, copolymer type A, Shellack, Makrogol 6000, di-butyl phthalate, vanillin, titanium dioxide, white clay, polyindone, yellow wax and camauba wax.
  • the invention further relates to the additional use of ⁇ 2 -Macroglobulin ( ⁇ 2 -M).
  • ⁇ 2 -M is one of the most important inhibitors of proteinases. 2 -M reacts with a variety of endopeptidases. The reaction of ⁇ 2 -M with the respective proteinase usually takes place in such a way that ⁇ 2 -M is subject to a change in conformation after it has come into contact with the proteinase and then holds it in the molecule. The enzyme inhibition is based on steric hindrance, although the active center of the enzyme remains functional.
  • ⁇ 2 -M contributes to immunomodulation by influencing cytokines.
  • the invention further relates to a method for influencing cytokines, the cytokines being brought into contact with one or more proteolytic enzymes and optionally rutoside.
  • the RPMI 1640 cell culture medium was used with the following additives: NaHC03 ( biochrom, 2 g / 1); L-glutamine (biochrom, 2 mM), Na pyruvate (biochrom,
  • phythaemagglutinin M biologicalchrome, 5 ⁇ g / ml
  • ⁇ -interferon 100 U / ml
  • Freshly isolated, human, peripheral, mononuclear blood cells were used as targets for the enzymes to be examined. After the usual isolation using Ficoll, the cells were washed several times and used fresh in the experiments. Neutrophil granulocytes were also isolated from fresh citrate blood. Here, the lymphocytes / monocytes were separated using a 2-stage Ficoll gradient.
  • Monoclonal antibodies were used for the specific recognition of the surface structures of the leukocytes. These recognize on the corresponding each have a defined epitope, which occurs only once in the structure of the antigens examined by us.
  • Overview 1 shows the surface markers examined, the monoclonal antibodies and the analyzed target cells.
  • the freshly isolated and prepared cells were incubated with the enzymes bromelain, papain and trypsin (pharmaceutical ingredients from Mucos) with the concentrations given in the legends of the tables and figures.
  • bromelain papain: trypsin, based on 40 ⁇ g / ml, “BPT”).
  • Three enzyme concentrations (40, 10, 2.5 ⁇ g / ml) were examined. The incubation took place in serum-free medium at 37 ° C.
  • proteases were set up immediately before the incubations. 0.01% sodium acid was contained in the cell culture media. This addition prevents the cells from during the incubation process or the washing process. would express receptor molecules again. After washing out the cell culture medium, the cells can be reactivated (not demonstrated).
  • a corresponding fluorescence-conjugated isotype control was carried out for each subclass of the monoclonal antibodies.
  • This is mouse immunoglobulin, with which the capacity of the non-specific binding of the target cells is determined by flow cytometry.
  • the evaluation and analysis of the data was carried out independently of the measurement process on the flow cytometer using device-specific software.
  • the histograms of the controls ie the untreated cell samples, were compared with the histograms of the enzyme-treated cells.
  • the raw representation comprises an optically spectacular, but relatively confusing histogram, in which various individual measurements are shown superimposed on one another.
  • the effect of the enzymes can be made optically transparent compared to the reference. For these investigations, it is not the percentage of a subpopulation of the total leukocyte population that is the measured variable, but rather the relative receptor density, which is shown as the fluorescence intensity.
  • data can be derived which reflect the relative fluorescence intensity of the individual measurement. This is a measure of the relative receptor or surface molecule density in a measured cell population.
  • the bar graphs show the media of relative fluorescence in a logarithmic representation. Compared to the reference, the reduction in the density of the respective surface molecule as a function of the enzyme concentration can be represented.
  • the tables contain the data from independent experiments.
  • the donor numbers are only valid for the respective table and cannot be transferred to other tables. If, for example, a value of 40% is given in the table, this means that in this antigen 40% of all surface molecules are changed by the enzyme in such a way that the specific monoclonal antibody no longer recognizes its epitope. If no reduction is observed, the value "0" appears in the tables. The percentage given thus expresses the enzyme performance against the individual antigens. Values up to 20% are not considered relevant in individual cases.
  • the data were evaluated using non-linear regression.
  • the median of the fluorescence intensity versus the enzyme concentration used and the reference are correlated with one another, and from this the amount of enzyme can be calculated which leads to a 50% reduction in the relative fluorescence intensity or in the structure of the changed receptor density.
  • Figure I CD2 modulation by proteases; The median of the relative fluorescence intensity is given; Target cells: lymphocytes.
  • the positive control (reference) are untreated cells that were incubated with the monoclonal antibody specific for CD2.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype. The incubation time with the enzymes was 60 min.
  • the data from donor 1 (see Tab. 1) are shown as the mean of double determinations and standard deviation.
  • FIG. 2 CD4 (epitope Leu3a) modulation by proteases; The median of the relative fluorescence intensity is given; Target cells: lymphocytes.
  • the positive control (reference) are untreated cells that were incubated with the monoclonal antibody specific for CD4.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype. The incubation time with the enzymes was 60 min.
  • the data from donor 2 (see Tab. 2) are shown as the mean of double determinations and standard deviation.
  • Figure 3 CD4 (Epitope OKT4 and Leu3a) modulation by trypsin; The median of the relative fluorescence intensity is given; Target cells: lymphocytes.
  • the positive control (reference) are untreated cells that were incubated with the monoclonal antibody specific for CD4.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype. The incubation on time with the enzymes was 60 min.
  • the data from a donor (see Table 3) are shown as the mean of double determinations and standard deviation.
  • Figure 4 CD25 modulation by proteases; The median of the relative fluorescence intensity is given; Target cells: PHA blasts.
  • the positive control (reference) are untreated cells that were incubated with the monoclonal antibody specific for CD25.
  • the negative controls are untreated cells incubated with the antibody isotype. The incubation time with the enzymes was 60 min.
  • the data from donor 1 are shown as the mean of duplicate determinations and standard deviation.
  • Figure 5 Reduction of the Leu3a antigen density by trypsin. Freshly isolated human peripheral, mononuclear blood cells were incubated with trypsin in the serum-free medium, then washed and labeled with the monoclonal antibody anti-Leu3a. The reduction in the relative fluorescence density of CD4 in the lymphocyte population is the measure of enzyme activity. The half-effect concentration of trypsin compared to the epitope Leu3a of CD4 is calculated using the fitted curve.
  • Table 1 CD2 modulation by proteases; Target cells: lymphocytes. The percentage reduction in the median of the relative fluorescence intensity, which is a measure of the enzyme performance, is given. The incubation time with the enzymes was 60 min. The results of three experiments with cells from three different donors are shown.
  • CD4 epitopope Leu3a modulation by proteases
  • Target cells lymphocytes.
  • the percentage reduction in the median of the relative fluorescence intensity, which is a measure of the enzyme performance, is given.
  • the incubation time with the enzymes was 60 min. The results of two experiments with cells from two different donors are shown.
  • Table 3 Modulation of the CD4 epitopes Leu3a and OKT4 by trypsin; Target cells: lymphocytes. The percentage reduction in the median of the relative fluorescence intensity, which is a measure of the enzyme performance, is given. The incubation time with the enzymes was 60 min. The data from a donor are shown. Enzyme epitope 40 ⁇ g / ml 20 ⁇ g / ml 10 ⁇ g / ml
  • Table 4 CD25 modulation by proteases; Target cells: lymphocytes, monocytes, NK cells. The percentage reduction in the median of the relative fluorescence intensity, which is a measure of the enzyme performance, is given. The incubation time with the enzymes was 60 min. The results of two experiments with cells from two different donors are shown. The cells were mitogen stimulated for 3 days prior to the experiment.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym zur Beeinflussung von Cytokinen. Bevorzugte proteolytische Enzyme sind Trypsin, Bromelain und Papain. Ausserdem kann Rutosid verwendet werden.

Description

Beeinflussung von Cytokinen durch proteolytische Enzyme
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beeinflussung von Cytokinen durch proteolytische Enzyme sowie die Verwendung proteolytischer Enzyme zur Beeinflussung von Cytokinen.
Wichtige Stoffwechselstoffe bei der Auslösung diverser Krankheitszustände sind die Cytokine. Cytokine sind kleine Proteine mit Molekulargewichten von 8000 bis 30000, wobei jedes Cytokin eine eigene Aminosäuresequenz und Zelloberflä- chenrezeptoren aufweist. Sie werden von einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen hergestellt und wirken auf fast jedes Gewebe und Organsystem. Die Namen, die den verschiedenen Cytokinen gegeben wurden, folgen keinem logischen System, sondern entsprechen vielmehr ihrer biologischen Eigenschaft. IL-1 und TNF (Tumomekrosefaktor) sind die primären proinflammatorischen Cytokine, und außerdem wirken diese zwei Cytokine in einer synergistischen Weise bei der Induktion von Entzündungen, Schock und Tod.
In den letzten 20 Jahren wurden auf Leukozyten des menschlichen Blutes mehr als 100 verschiedene Oberflächenmoleküle beschrieben. Ihre Identifikation, Charakterisierung und Funktionsbeschreibung wurde insbesondere durch die Technik der Herstellung von monoklonalen Antikörpern beschleunigt. Definierte Oberflächenmoleküle werden im allgemeinen in einer sog. CD-Nomenklatur ("cluster of differentiation") erfaßt.
Für einen Teil der Oberflächenmoleküle ist ihre Funktion bzw. ihr physiologischer Ligand bekannt. Für den lnterleukin-2-Rezeptor (CD2S) z.B. ist das lnterleukin-2 der natürliche Ligand. Auch andere Cytokine sind Liganden der Oberflächenmoleküle und werden daher von diesen beeinflußt.
Für verschiedene Oberflächenmoleküle von Leukozyten und Endothelzellen ist weiterhin beschrieben, daß sie durch Immunmediatoren in ihrer Antigendichte reguliert werden. So wird durch γ-lnterferon die Expressionsdichte des Entzün- dungsmarkers HLA-DR auf Monozyten sowie des Adhäsionsmoleküls CD54 (ICAM-1 ) auf Endothelzellen gesteigert.
Bei bestimmten Infektionen oder Krebserkrankungen kommt es zu einer Verschiebung von in Homöostase befindlichen verschiedenen Subpopulationen von Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten. Normalerweise ist der Organismus in der Lage, im Prozeß einer Genesung die Verteilungsgleichgewichte der Subpopulationen wieder herzustellen.
Bei chronischen Erkrankungen, insbesondere bei Autoimmunerkrankungen und der damit verbundenen permanenten Belastung des Immunsystems (z.B. durch Immunkomplexe und im Zusammenhang mit chronisch persistierenden Virusinfektionen wie AIDS), kommt es im Verlauf der Erkrankung zu einer vom Organismus nicht mehr kompensierbaren Verschiebung sowohl der Gleichgewichte der Zellpopulationen als auch der Expressionsdichte einiger spezifischer Antigene. Allgemein spricht man hier von einer unkontrollierten Aktivierung des Immunsystems.
Nach dem bisherigen Kenntnisstand erhärtet sich die Annahme, daß die Modulation von Zelloberflächenmolekülen des Immunsystems ein besonderes Feld der "Medikation" darstellen könnte.
Der vorliegenden Erfindung lag daher daß technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur Beeinflußung von Cytokinen anzugeben.
Diese Aufgabe wird durch die in Anspruch 1 angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Gemäß Anspruch 1 ist die Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym und gegebenenfalls Rutosid zur Beeinflußung von Cytokinen vorgesehen. Die durch das bzw. die proteolytischen Enzyme modulierten Immunglobuline zeichnen sich dadurch aus, daß deren Bindungsfähigkeit für die Komplementkomponente C1q erniedrigt ist. Dies gilt für natürliche C1 q-bindende Immunglobuline (Subklassen lgG1 , lgG2, lgG3, IgM und teilweise IgA).
Die geänderte C1 q-Bindungsfähigkeit wird - ohne an eine Theorie gebunden zu sein - vermutlich durch eine Konformationsänderung der CH2-Domäne aufgrund der Enzymeinwirkung verursacht. Dabei kann die Konformationsänderung entweder durch eine enyzmatisch verursachte Änderung unmittelbar in der CH2- Domäne hervorgerufen werden, oder die proteolytischen Enzyme bewirken eine Strukturänderung in den der CH2-Domäne benachbarten Bereichen, und diese Änderungen beeinflussen die Konformation der CH2-Domäne.
Die Behandlung von Neutrophilen mit proteolytischen Enzymen reduzierte deutlich die Expression z.B. des Rezeptors III für den Fc-Bereich von IgG und beeinflußt offenbar auch die Anzahl von Fcγ-R-Il auf der Zelloberfläche. Es wird dabei die Bindung von IgG bedeckten Erytrozyten an Neutrophile verstärkt; ferner wird auch ihre Fähigkeit, IgG-vermittelte Funktionen, wie z.B. die antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität und Chemolumineszenz, die durch IgE induziert werden, verstärkt. Diese Reaktionen sind komplett abhängig von Fcγ-R-Il.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain, Papain und gegebenenfalls Rutin verwendet oder eine Kombination derselben.
Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme lassen sich kostengünstig aus den folgenden Rohmaterialien isolieren.
Bromelain ist ein proteolytisch wirksames Enzym aus dem Preßsaft der Ananas und kann auch noch aus reifen Früchten isoliert werden. Papain ist ein proteolytisches Enzym, das aus dem Milchsaft der unreifen, fleischigen Früchte des Melonenbaums Carica Papaya gewonnen wird. Reines Papain ist ein kristalines Polypeptid mit einem MG. von 23350, das aus einer Kette von 212 Aminosäureresten mit 4 Disulfid-Brücken besteht; Sequenz und Raumstruktur sind bekannt. Papain wird vielfältig eingesetzt: Aufgrund seiner Proteinspaltenden Eigenschaft als "Fleischzartmacher" oder "Mürbesalz", zum Klären von Bier, zur Brot- und Hartkeksherstellung, in der Lederzubereitung, in der Tex- til-lndustrie zum Entbasten von Seide und zur Verhinderung von Wollverfilzung, in der Tabak-Industrie zur Qualitätsverbesserung, zur Rückgewinnung von Silber aus verbrauchtem photographischem Material, ferner in der Bakteriologie zur Pepton-Gewinnung. In der Medizin dient Papain bereits zur Unterstützung der enzymatischen Verdauung, zur enzymatischen Wundreinigung und als Zusatz zu Zahnprothese-Reinigungsmitteln. Für Spezialzwecke werden Papain-Präparate auch an Kunststoffpolymere oder Agarose trägergebunden angeboten. Papain ist auch als Katalysator zur Synthese von Oligopeptiden verwendet worden.
Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das ebenfalls im Pankreas gebildet wird und in Verbindung mit anderen Enzmen bereits therapeutisch eingesetzt wird. Es gehört zu den Serin-Proteinasen. Kristallines Trypsin hat ein MG von ca. 23300, ist in Wasser, nicht aber in Alkohol löslich, besitzt ein Wirkungsoptimum bei pH 7-9 und spaltet Peptid-Ketten spezifisch Carboxy-seitig der basischen Aminosäurereste L-Lysin und L-Arginin. Die räumliche Struktur des aus 223 Aminosäuren bestehenden Trypsins ist bekannt.
Eine besonders gute Wirksamkeit zeigt sich bei der Verwendung einer Kombination der Enzyme Bromelain, Papain und/oder Trypsin. Neben der bemerkenswerten und unerwarteten Wirkung dieser Enzyme hat die kombinierte Verwendung der genannten Enzyme weiterhin den Vorteil, daß auch bei einer Langzeitanwendung keine schädigenden Nebenwirkungen auftreten.
Weiterhin kann zusätzlich Rutosid dem Medikament beigemischt werden. Rutosid ist ein Glycosid, das zu den Flavonoiden gehört. Eine besonders gute Wirksamkeit hat die kombinierte Verwendung von 20 bis 100 mg Bromelain, 40 bis 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit.
Ganz besonders bevorzugt ist eine Kombination von 90 mg Bromelain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid x 3H2O.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Kombination von 48 mg Trypsin, 90 mg Bromelain und 100 mg Rutosid x 3H20 verwendet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden 10 bis 100 mg, besonders bevorzugt 100 mg Rutosid x 3 H20 pro Dosiseinheit verwendet.
Das Medikament kann weiterhin alle üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthalten.
Als Hilfs- und Trägerstoffe kommen z.B. Lactose, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talkum, Methacrylsäure, Copolymerisat Typ A, Shellack, Makrogol 6000, Di- butylphthalat, Vanillin, Titandioxid, weißer Ton, Polyindon, gelbes Wachs und Camaubawachs in Frage.
Die Erfindung betrifft ferner die zusätzliche Verwendung von α2-Makroglobulin (α2-M). α2-M ist einer der wichtigsten Inhibitoren von Proteinasen. 2-M reagiert mit einer Vielzahl von Endopeptidasen. Die Reaktion von α2-M mit der jeweiligen Proteinase läuft in der Regel so ab, daß α2-M einer Konformationsänderung unterliegt, nachdem es in Kontakt mit der Proteinase gekommen ist und diese daraufhin im Molekül festhält. Die Enzyminhibition beruht auf einer sterischen Behinderung, obwohl das aktive Zentrum des Enzyms seine Funktion behält. Durch die Beeinflussung der Proteinase trägt α2-M zu einer Immunmodulation durch Beeinflussung von Cytokinen bei. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Beeinflussung von Cytokinen, wobei die Cytokine mit einem oder mehreren proteolytischen Enzymen und gegebenenfalls Rutosid in Kontakt gebracht werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung im einzelnen erläutern.
Beispiel 1
Material und Methoden
1. Material
Es wurde das Zellkulturmedium RPMI 1640 mit folgenden Zusätzen verwendet: NaHC03 (Biochrom, 2 g/1 ); L-Glutamin (Biochrom, 2 mM), Na-Pyruvat (Biochrom,
1 mM), NaN3 (Sigma, 0,01 %).
Im Falle einer Stimulation der Zellen wurde entweder Phythämagglutinin M (Biochrom, 5 μg/ml) oder γ-lnterferon (100 U/ml) eingesetzt. Die Stimulation der Zellen erfolgte dabei über 1-3 Tage mit Zusatz von 10 % fötalem Kälberserum (Biochrom).
Als Targets für die zu untersuchenden Enzyme wurden frisch isolierte, humane, periphere, mononukleäre Blutzellen (Citratblut) verwendet. Nach der üblichen Isolation mittels Ficoll wurden die Zellen mehrfach gewaschen und frisch bei den Experimenten eingesetzt. Neutrophile Granulozyten wurden ebenfalls aus frischem Citratblut isoliert. Hierbei erfolgte die Abtrennung von den Lympho- zyten/Monozyten mittels eines 2-Stufen-Ficoll-Gradienten.
2. Verwendete monoklonale Antikörper
Für die spezifische Erkennung der Oberflächenstrukturen der Leukozyten wurden monoklonale Antikörper verwendet. Diese erkennen auf den entsprechenden An- tigenen jeweils ein definiertes Epitop, welches bei den von uns untersuchten An- tigenen nur ein einziges Mal in der Struktur vorkommt. In Übersicht 1 sind die untersuchten Oberflächenmarker, die monoklonalen Antikörper sowie die analysierten Targetzellen dargestellt.
Übersicht 1: Analysierte Oberflächenmarker, verwendete monoklonale Antikörper und Targetzellen der Enzymbehandlung
1 Phycoerythrin, rote Fluoreszenz;
2 Fluoreszeinisothiocyanat, grüne Fluoreszenz;
3 Becton Dickinson, Heidelberg;
4 Ortho Diagnostics
3. Inkubationsbedinqunqen
Die frisch isolierten und aufbereiteten Zellen wurden mit den Enzymen Bromelain, Papain und Trypsin (Arzneimittel-Inhaltsstoffe der Fa. Mucos) mit den jeweils in den Legenden der Tabellen und Abbildungen angegebenen Konzentrationen inkubiert. Bei der Mischung der drei Enzyme entsprach das Mischungsverhältnis 22,7 : 15,5 : 11 ,9 (Bromelain : Papain : Trypsin, bezogen auf 40 μg/ml, "BPT"). Es wurden drei Enzymkonzentrationen (40, 10, 2,5 μg/ml) untersucht. Die Inkubation fand in serumfreiem Medium bei 37°C statt.
Die Proteasen wurden unmittelbar vor den Inkubationen angesetzt. In den Zellkulturmedien war 0,01 % Natriumacid enthalten. Durch diesen Zusatz werden die Zellen daran gehindert, während des Inkubationsprozesses oder der Waschvor- gänge Rezeptormoleküle erneut zu exprimieren. Nach dem Auswaschen des Zellkulturmediums sind die Zellen wieder aktivierbar (nicht demonstriert).
Nach entsprechender Inkubation der Zellen mit den jeweiligen Enzymen, Auswaschen der Enzyme und der Markierung mit monoklonalen Antikörpern (nach Angaben der Hersteller) wurde sofort die Analyse der Oberflächenmarker vorgenommen.
4. Analytische Durchflußcytometrie
Alle Untersuchungen zur Modulation von Zelloberflächenmolekülen wurden mittels analytischer Durchflußcytometrie (FACSCAN, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) unter Verwendung einer gerätespezifischen Software (Lysis I) durchgeführt. Bei entsprechender Einstellung des Gerätes sowie der Mitführung von Referenzen, d.h. Zellen, die ohne Enzyme aber in derselben Prozedur behandelt wurden, erfolgte die Messung.
Für jede Subklasse der monoklonalen Antikörper wurde eine entsprechende fluoreszenzkonjugierte Isotypenkontrolle mitgeführt. Hierbei handelt es sich um Maus- Immunglobulin, mit welchem die Kapazität der unspezifischen Bindung der Targetzellen flußcytometrisch erfaßt wird.
Pro Histogramm wurden 10 000 Zellen gemessen. Die jeweilige Zellpopulation wurde mit einem sogenannten "elektronischen Gate" separiert, in dem sich dann mindestens 3 500 Zellen befanden.
5. Darstellung der Ergebnisse
Die Auswertung und Analyse der Daten erfolgte unabhängig vom Meßvorgang auf dem Durchflußcytometer mittels einer gerätespezifischen Software. Dabei wurden jeweils die Histogramme der Kontrollen, d. h. der unbehandelten Zellproben, mit den Histogrammen der enzymbehandelten Zellen verglichen. Die Rohdarstellung umfaßt ein optisch eindrucksvolles, aber relativ unübersichtliches Histogramm, bei dem verschiedene Einzelmessungen übereinander gelagert abgebildet sind. Hier läßt sich insbesondere die Wirkung der Enzyme im Vergleich zur Referenz optisch transparent machen. Für diese Untersuchungen ist nicht der prozentuale Anteil einer Subpopulation an der gesamten Leukozytenpopulation die Meßgröße, sondern die relative Rezeptordichte, die sich als Fluoreszenzintensität darstellt.
Aus diesen Histogrammen, die beispielhaft sind und illustrativen Charakter haben, lassen sich Daten ableiten, welche die relative Fluoreszenzintensität der Einzelmessung reflektieren. Diese ist ein Maß für die relative Rezeptor- oder Oberflächenmoleküldichte bei einer gemessenen Zellpopulation.
Die Säulengraphiken zeigen in logarithmischer Darstellung den Medien der relativen Fluoreszenz. Es läßt sich so gegenüber der Referenz die Reduktion der Dichte des jeweiligen Oberflächenmoleküis in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration darstellen.
In den Tabellen sind die Daten unabhängiger Experimente enthalten. Die Nummern der Spender haben nur für die jeweilige Tabelle Gültigkeit und sind nicht auf andere Tabellen übertragbar. Wird in der Tabelle beispielsweise ein Wert von 40 % angegeben, so bedeutet das, daß bei diesem Antigen 40 % aller Oberflächenmoleküle durch das Enzym so verändert ist, daß der spezifische monoklonale Antikörper sein Epitop nicht mehr erkennt. Wird keine Reduktion beobachtet, so erscheint in den Tabellen der Wert "0". Die angegebene Prozentzahl drückt somit die Enzymleistuπg gegenüber den einzelnen Antigenen aus. Werte bis zu 20 % werden im Einzelfall als nicht relevant angesehen.
Für eine Bewertung der Wirkung der Enzyme auf die einzelnen Antigene ist es günstig, einen geeigneten Vergleichsmaßstab zu wählen. Bis auf wenige Ausnahmen wurden alle Untersuchungen unter standardisierten Inkubationsbedin- gungen durchgeführt. Damit kann für diese experimentellen Bedingungen die aus früheren Forschungsberichten bekannte Halbeffektkonzentration angegeben werden.
Zur Berechnung der Halbeffektkonzentration wurden die Daten mittels nichtlinearer Regression ausgewertet. Der Mediän der Fluoreszenzintensität versus eingesetzter Enzymkonzentration und Referenz werden zueinander in Beziehung gesetzt, und daraus läßt sich die Menge an Enzym berechnen, die zu einer 50%igen Reduktion der relativen Fluoreszenzintensität bzw. der in der Struktur veränderten Rezeptordichte führt.
Abbildung I: CD2-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD2 spezifischen monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 (vgl. Tab. 1 ) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 2: CD4 (Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen, monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 2 (vgl. Tab. 2) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 3: CD4 (Epitope OKT4 und Leu3a)-Modulation durch Trypsin; Angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubati- onszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von einem Spender (vgl. Tab. 3) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 4: CD25-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Mediän der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: PHA-Blasten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD25 spezifischen, monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.
Abbildung 5: Reduktion der Leu3a-Antigendichte durch Trypsin. Frisch isolierte humane periphere, mononukleäre Blutzellen wurden mit Trypsin im serumfreien Medium inkubiert, anschließend gewaschen und mit dem monoklonalen Antikörper anti-Leu3a markiert. Die Reduktion der relativen Fluoreszenzdichte von CD4 der Lymphozytenpopulation ist das Maß der Enzymaktivität. Die Halbeffektkonzentration von Trypsin gegenüber dem Epitop Leu3a von CD4 wird über die gefit- tete Kurve berechnet.
Ergebnisse
Tabelle 1: CD2-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von drei Experimenten mit Zellen von drei verschiedenen Spendern dargestellt.
Enzym Nr. 40 μg/ml 10 μg/ml 2,5 μg/ml
Bromelain 1 11 ,1 17,9 17,4
2 6,1 12,2 14,3
3 0 0 0 Papain 1 22,4 21 ,4 34,7 2 5,4 9,5 17,0 3 0 0 0
Trypsin 1 75,7 73,6 73,0 2 83,7 21 ,1 0,7 3 96,3 85,4 50,9
BPT 1 71 ,9 54,7 38,2 2 74,1 8,8 18,4 3 94,8 72,6 25,2
Tabelle 2: CD4(Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimenten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt.
Enzym Nr. 40 μg/ml 10 μg/ml 2,5 μg/ml
Bromelain 1 24,6 0 0 2 16,2 0 0
Papain 1 2,5 3,2 0 2 0 0 5,7
Trypsin 1 99,3 93,0 64,1 2 99,4 96,2 57,5
BPT 1 98,3 49,3 23,0 2 99,4 79,2 20,2
Tabelle 3: Modulation der CD4-Epitope Leu3a und OKT4 durch Trypsin; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Daten von einem Spender dargestellt. Enzym Epitop 40 μg/ml 20 μg/ml 10 μg/ml
Trypsin Leu3a 98,5 96,7 87,1 OKT4 6,5 6,3 19,5 Epitop 5 μg/ml 2,5 μg/ml 1 ,25 μg/ml
Trypsin Leu3a 65,2 41 ,9 28,8 OKT4 13,3 10,8 9.3
Tabelle 4: CD25-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lymphozyten, Monozyten, NK-Zellen. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymieistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimenten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt. Vor dem Experiment wurden die Zellen 3 Tage mitogenstimuiiert.
Enzym Nr. 40 μg/ml 10 μg/ml 2,5 μg/ml
Bromelain 1 90,7 80,1 59,7 2 62,6 43,6 0
Papain 1 92,2 81 ,0 60,7 2 62,6 43,6 0
Trypsin 1 91 ,2 88,2 71 ,0 2 78,9 73,9 52,8
BPT 1 92,1 89,7 50,9 2 79,4 44,1 12,2
Tabelle 5: Berechnete Halbeffektkonzentration (μg/ml) von Bromelain, Papain, Trypsin und deren Kombination für die 50 %ige Reduktion der Dichte von zellulären Oberflächenmolekülen. Die Enzyminkubation betrug 1 Stunde. Enzyme CD2 CD43 CD254
Bromelain Halbeffektkonz. n w n w 18,4
Bereich2 14-23 Papain Halbeffektkonz.1 n w n w 12,4
Bereich2 11-14 Trypsin Halbeffektkonz.1 1 ,5 2,5 < 2,5
Bereich2 1-2 2,3-3,1 B-P-T5 Halbeffektkonz.1 9,3 16,4 16,0
Bereich2 7,5-14 15,5-18 13-19
1 berechnet aus Mittelwerten von 2 oder 3 unabhängigen Experimenten
2 minimaler und maximaler Wert, 95 % Konfidenzbereich = 1 δ, geschätzt
3 Modulation von CD4-Epitop Leu3a
4 auf stimulierten Zellen präsent
5 Mischung der Proteasen im Verhältnis 22,7 : 15,5 : 11 ,9 - Bromelain : Papain : Trypsin n w: nicht wirksam im untersuchten System (max. 40 μg Enzym/ml, 1 h Inkubation)

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym und gegebenenfalls Rutosid zur Beeinflussung von Cytokinen.
2. Vewendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain oder Papain oder eine Kombination von einem oder mehreren dieser Enzyme verwendet wird.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Rutosid verwendet wird.
4. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 20 bis 100 mg Bromelain, 40 bis 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit verwendet werden.
5. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid x 3 H20 pro Dosiseinheit verwendet werden.
6. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 48 mg Trypsin und 100 mg Rutosid x 3 H20 pro Dosiseinheit verwendet werden.
7. Verwendung gemäß einem oder mehreren der vorstehend genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich α2-Makroglobulin verwendet wird.
8. Verfahren zur Beeinflussung von Cytokinen, wobei die Cytokine mit einem oder mehreren proteolytischen Enzymen und gegebenenfalls Rutosid in Kontakt gebracht werden.
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