DE10018980A1 - Prophylaxe und Therapie von Diabetes mellitus I mit Hilfe proteolytischer Enzyme - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung proteolytischer Enzyme zur Prophylaxe bzw. Therapie von Diabetes mellitus vom Typ I. Dabei erfolgt der Einsatz der proteolytischen Enzyme vorzugsweise im prädiabetischen Stadium.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung proteolytischer Enzyme zur Pro­ phylaxe bzw. Therapie von Diabetes mellitus vom Typ I.

Der Diabetes mellitus Typ I entsteht durch eine Autoaggression des Immunsystems gegen Insulin-produzierende Zellen in den Langerhans'schen Inseln. Dieser Pro­ zess läuft über Jahr unbemerkt ab. Erst wenn ca. 70-80% der Insulin- produzierenden β-Zellen zerstört sind, manifestiert sich die Erkrankung mit den typi­ schen Insulinmangelsymptomen wie Gewichtsabnahme, vermehrter Durst und Wasserlassen (s. Fig. 1). Bereits Anfang der 90er Jahre gelang die Isolierung von T-Zellen aus dem Blut von frisch-manifesten Typ I Diabetikern, die spezifisch mit einem Autoantigen aus den Membranen von Insulin-produzierenden Zellen reagie­ ren. Das 38 kD große Antigen wurde als "Imogen 38" identifiziert.

Der durch die Zerstörung der Insulin-produzierenden Zellen hervorgerufene Insulin- mangel führt zu einem Anstieg des Blutzuckerspiegels (Hyperglykämie) und einer konsekutiven Ausscheidung von Glukose im Urin. Die Prävalenz des Diabetes mel­ litus Typ I in der Normalbevölkerung beträgt in Europa ca. 0,1 bis 0,3%, wobei in den letzten Jahren ein kontinuierlicher Anstieg der Diabetesinzidenz in vielen Län­ dern beobachtet wurde. Die Diabetesmanifestation findet im größten Teil der Fälle um die Pubertät statt, jedoch kommt es bei einem Teil der Patienten erst im späte­ ren Leben zur Manifestation des Diabetes.

Da es beim Typ I Diabetes zu einer Zerstörung der Insulin-produzierenden Zellen kommt, muss nach der klinischen Manifestation eine Insulintherapie erfolgen. Bei einem Teil der Patienten kommt es nach initialer Insulinbehandlung zu einer kurz­ zeitigen Remission, in der ein reduzierter Insulinbedarf vorhanden ist. Bei einem kleinen Prozentsatz der Patienten kann sogar für einige Wochen auf eine Insulinthe­ rapie verzichtet werden. Anschließend sind die Patienten lebenslang auf Insulininjektionen angewiesen. Mit den modernen Insulintherapien ist für die Patienten ein mehr oder weniger normales Leben erreichbar, jedoch mit noch immer reduzierter Lebenserwartung. Die bekannten Folgeerkrankungen des Typ I Diabetes wie Neu­ ro-, Nephro-, Retino- und Angiopathie, können trotz konsequenter Ausschöpfung der gegenwärtigen Therapiemöglichkeiten wahrscheinlich nicht vollkommen vermie­ den werden. Dies gilt insbesondere für Kinder und Jugendliche, mit ihren spezifi­ schen Problemen des Wachstums und der Pubertät.

Die Ursache der Zerstörung der Insulin-produzierenden Zellen ist bisher nicht be­ kannt. Die Bedeutung genetischer Faktoren bei der Pathogenese des Diabetes mel­ litus Typ I ergibt sich aus einer Konkordanzrate von 30-40% bei eineiigen Zwillin­ gen. Besonders Gene im Bereich des HLA-Bereiches (HLA-DR3 und/oder 4) sind bei Typ I Diabetikern dominierend. Es wird postuliert, dass zusätzlich Umweltfakto­ ren an der Pathogenese des Typ I Diabetes beteiligt sind.

Ziel vieler Studien der vergangenen Jahre war es, die chronische Entzündung der Insulin-produzierenden Zellen vor der Manifestation des Diabetes zu erkennen. Für die Frühdiagnostik im sogenannten Prädiabetesstadium haben sich verschiedene Autoantikörper als prädiktiv erwiesen. Die Inselzellantikörper (ICA) sind die am besten evaluierten Autoantikörper für die Früherkennung des Typ I Diabetes. Diese werden mittels indirekter Immunfluoreszenz an menschlichen Gefrierschnitten nachgewiesen. Es handelt sich hierbei um verschiedene Autoantikörper, die gegen spezifische Inselproteine reagieren. Einige Autoantigene wurden in den vergange­ nen Jahren identifiziert. So bestehen die Inselzellantikörper zu einem großen Pro­ zentsatz aus Antikörpern gegen die Glutamatdecarboxylase (GAD). Weitere Anti­ körper sind gegen Insulin gerichtet (Insulinautoantikörper, IAA), die besonders bei Kindern einen hohen prädiktiven Wert haben. Ferner sind Antikörper gegen die Ty­ rosinphosphatasen IA2 und IA2β beteiligt.

Bei bisherigen Bemühungen zur Prävention des Diabetes mellitus Typ I wurde bei­ spielsweise eine Immunintervention zum Zeitpunkt der Manifestation des Diabetes mellitus versucht. Dabei wurde durch eine Behandlung mit Cyclosporin A die Re­ missionsphase nach Manifestation von Diabetes erhöht und verlängert. Jedoch gin­ gen diese Remissionen trotz Fortführung der immunsepressiven Therapie spätes­ tens nach 2-3 Jahren verloren. Da es sich bei Cyclosporin A um eine der poten­ testen immunsupressiven Substanzen handelt, ist davon auszugehen, dass zum Zeitpunkt der Manifestation des Diabetes mellitus die Inselzellreserve zu gering ist, um eine Heilung des Diabetes zu erreichen. Aus diesem Grund sind die Bemühun­ gen einer Diabetesprävention in den letzten Jahren auf die prädiabetische Phase gerichtet worden. Hierzu gehört die "Deutsche Nikotinamid-Interventionsstudie (DENIS)" bei der das B-Vitamin Nikotinamid bei Geschwistern im Alter von 3-12 Jahren von Kindern mit einem Typ I Diabetes erprobt wurde. Eine Wirksamkeit von Nikotinamid auf die Pathogenese des Typ I Diabetes konnte jedoch nicht nachge­ wiesen werden. Im Rahmen der "Europäischen-Nikotinamid-Intzerventionsstudie (ENDIT)" werden erstgradige Verwandte von Typ I Diabetikern bis zum 40. Lebens­ jahr mit Nikotinamid behandelt. Bei weiteren Studien wird die frühe subkutane und orale Insulintherapie bei Probanden mit Inselzellantikörpern und einer gestörten in­ travenösen Glucosetoleranz getestet.

Die Pathogenese des Diabetes mellitus Typ I kann als eine zeitlich abgestufte Kas­ kade betrachtet werden, aus der sich auch die Möglichkeiten der Früherkennung ableiten lassen (s. Fig. 1). Auf der Basis einer genetischen Disposition, die im Be­ reich der HLA-DR- und -DQ-Gene lokalisiert wird, kommt es zum Auftreten von Autoantikörpern. Als ein weiteres prädiabetisches Stadium wird eine Reduktion des i.v.GTT (intravenöser Glukosetoleranztest) angesehen. Bei dem pathologischen Ausfall des oGTT (oraler Glukosetoleranztest) oder Nachweis einer Hyperglykämie sind die Kriterien eines manifesten Diabetes mellitus erfüllt.

Da mit den zur Zeit zur Verfügung stehenden diagnostischen Mitteln Diabetes mel­ litus vom Typ I nicht mit 100%iger Sicherheit vorhergesagt werden kann, erfordert eine Behandlung von Kindern, Jugendlichen und jungen Erwachsenen, die nur zu einem Teil an einem Diabetes erkranken werden, dass nur Medikamente mit einem geringstmöglichen Nebenwirkungsprofil eingesetzt werden.

Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, eine weitere Möglichkeit der Prophylaxe bzw. Therapie von Typ I Diabetes anzugeben, wobei ein möglichst geringes Nebenwirkungsprofil auftreten sollte.

Das genannte technische Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwen­ dung von mindestens einem proteolytischen Enzym zur Prophylaxe und/oder The­ rapie von Diabetes mellitus Typ I.

Als Indikator für die erfolgreiche Behandlung des Typ I Diabetes mit den hydrolyti­ schen Enzymen kann die Veränderung des Spiegels an Diabetes-spezifischen Au­ toantikörpern, wie GAD, IA2, ICA, IAA, herangezogen werden. Der Einsatz der hydrolytischen Enzyme führte in zahlreichen Fällen zu einer Verlangsamung des Anstiegs der genannten Autoantikörpern im Vergleich zu unbehandelten Kontrollpa­ tienten, bzw. das Auftreten der Autoantikörper konnte bei den erfindungsgemäß be­ handelten Probanden verhindert werden, während eine Anzahl der Risikopatienten aus der negativen Kontrollgruppe im Verlaufe der Zeit die genannten Autoantikörper bildete. Als alternative Marker für das Ansprechen eines Patienten auf die Behand­ lung mit hydrolytischen Enzymen kann das Verhältnis von Diabetes-fördernden Th1- Zytokinen (IL12, TNF-α) und Diabetes-inhibierenden Th2-Zytokinen (IL4 und IL10) bestimmt werden. Die genannten Faktoren können mittels quantitativer RT-PCR bestimmt werden. Auch dieser Marker zeigt das Ansprechen der erfindungsgemäß behandelten Patienten auf die Therapie mit hydrolytischen Enzymen, indem sich das Verhältnis der genannten Zytokine zugunsten der Diabetes-inhibierenden Zyto­ kine verschiebt.

Vorzugsweise wird das proteolytische Enzym ausgewählt aus Trypsin, Chy­ motrypsin, Bromelain und Papain sowie Kombinationen aus den genannten Enzy­ men.

Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme lassen sich beispielsweise kostengüns­ tig aus dem folgenden Rohmaterial isolieren.

Bromelain ist ein proteolytisch wirksames Enzym aus Presssaft der Annanas und kann auch aus reifen Früchten isoliert werden.

Papain ist ein proteolytisches Enzym, das aus dem Milchsaft der unreifen fleischi­ gen Früchte des Melonenbaums Carica papaya gewonnen wird. Reines Papain ist ein kristallenes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 23.350, das aus einer Kette von 212 Aminosäureresten mit 4 Disulfidbrücken besteht. Die Sequenz und die Raumstruktur von dem Enzym sind bekannt. Papain wird vielfältig eingesetzt: auf Grund seiner Protein-spaltenden Eigenschaft als "Fleischzartmacher" oder "Mürbesalz", zum Klären von Bier, zur Brot- und Hartkeksherstellung, in der Leder­ zubereitung, in der Textilindustrie, zum Entbasten von Seide und zur Verhinderung von Wollverfilzung, in der Tabakindustrie zur Qualitätsverbesserung und zur Rück­ gewinnung von Silber aus verbrauchtem fotographischen Material, ferner in der Bakteriologie zur Peptongewinnung. In der Medizin dient Papain bereits zur Unter­ stützung der enzymatischen Verdauung, zur enzymatischen Wundreinigung und als Zusatz zu Zahnprothese-Reinigungsmitteln. Für Spezialzwecke werden Papainprä­ parate auch an Kunststoffpolymere oder Agarose trägergebunden angeboten. Pa­ pain ist auch als Katalysator zur Synthese von Oligopeptiden verwendet worden.

Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das ebenfalls im Pankreas gebildet wird. Es gehört zu den Serinproteasen. Kristallines Trypsin hat ein Molekulargewicht von ca. 23.300, ist in Wasser, nicht aber in Alkohol, löslich und besitzt ein Wirkungsoptimum bei pH 7-9 und spaltet Peptidketten spezifisch auf der Carboxy-Seite der basischen Aminosäurereste L-Lysin und L-Arginin. Die räumliche Struktur des aus 223 Amino­ säuren bestehenden Trypsins ist bekannt.

Chymotrypsin wird ebenfalls in Pankreas gebildet. Es gehört ebenfalls zu den Se­ rinproteasen. Das bestuntersuchte α-Chymotrypsin besitzt ein Molekulargewicht von ca. 25.000 und umfasst 245 Aminosäuren.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Flavonoide (Flavonglyco­ side) als zusätzliche Wirksubstanz eingesetzt. Diese Substanzklasse ist im Pflan­ zenreich weit verbreitet und kann daraus isoliert werden. Besonders bevorzugt ist Rutosid (Rutin).

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden 20-100 mg Bromelain, 40-120 mg Papain und 10-50 mg Trypsin pro Dosiseinheit, z. B. Tablette, ver­ wendet.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden 10-100 mg, besonders bevorzugt 100 mg Rutosid mal 3 H₂O pro Dosiseinheit verwendet.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Kombination von 90 mg Bromelain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid × 3 H₂O pro Dosiseinheit eingesetzt.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform besteht aus der Kombination von 90 mg Bromelain, 48 mg Trypsin und 100 mg Rutosid × 3 H₂O pro Dosiseinheit. Diese Kombination wird z. B. unter dem Namen "Phlogenzym" von der Firma Mucos Pharma GmbH & Co. in Deutschland vertrieben.

Die Dosiseinheit kann weiterhin alle üblichen Hilfs- oder Trägerstoffe enthalten.

Als Hilfs- und Trägerstoffe kommen z. B. Laktose, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talkum, Metacrylsäure, Copolymerisat Typ A, Schellack, Makrogel 6000, Dibu­ tylphthalat, Vanillin, Titandioxyd, weißer Ton, Polyindon, gelbes Wachs und Car­ naubawachs in Frage.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Einsatz der hydrolyti­ schen Enzyme bei Patienten im prädiabetischen Zustand, der durch das erstmalige Auftreten von Antikörpern gegen Inselzellen (ICA) und andere Autoimmunmarker, wie Antikörper gegen GAD65, Tyrosinphosphatase IA2 oder Insulin gekennzeichnet ist.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Bestimmung von Glukose in Harn

Die Bestimmung von Glukosurie kann mittels herkömmlicher Teststreifen, wie Dia­ bur-Test 5.000, Boehringer, Mannheim, Deutschland, durchgeführt werden. Bei ei­ nem positiven Befund wird dann zusätzlich Glukose in Blut bestimmt. Die Glukose­ bestimmung kann beispielsweise mit dem Glukoseanalysator Glucometer Elite, Bayer Diagnostics, München, Deutschland, erfolgen.

Bestimmung GAD-spezifischer Autoantikörper

Hierzu wurde ein GAD-Radioimmunoassay gemäß dem Verfahren von Wiest- Ladenburger, U. et al., Diabetes, Band 56, Seite 565 (1997) durchgeführt. Hierzu wird rekombinantes humanes S³⁵-GAD65 und S³⁵-GAD67 mittels eines gekoppelten Transkriptions-/Translationssystems von Promega, Madison, Wisconsin, USA, her­ gestellt. Expressionsplasmide, enthaltend die cDNAs von rGAD65 oder rGAD67 wurden als Matrizen für die Transkription verwendet. Markierte Proteine wurden von nicht eingebautem S³⁵-Metionin mittels Sephadex G25 (Pharmacia, Uppsala in Schweden) abgetrennt. 5 µl Serum wird in 2-facher Ausführung mit 15.000 cpm ra­ dioaktivem Protein bei 4°C übernacht inkubiert. Protein-A-Sepharose wird zuge­ setzt und nach einer Stunde wird Antikörper-gebundene GAD von ungebundenem GAD durchwaschen, in Mikrotiterplatten mit einem Membranboden (Millipore, Esch­ born, Deutschland) abgetrennt. Die gezählten Zerfälle pro Minute (cpm) wurden in einem β-Zähler ermittelt.

Claims (7)

1. Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym zur Prophylaxe und/oder Therapie von Diabetes mellitus Typ I.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als proteolyti­ sches Enzym Trypsin, Chymotrypsin, Bromelain oder Papain oder eine Kombi­ nation von mehreren dieser Enzyme verwendet wird.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zusätz­ lich ein Flavonoylglycosid, vorzugsweise Rutosid, verwendet wird.

4. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekenn­ zeichnet, dass 20-100 mg Bromelain, 40-120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit verwendet werden.

5. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, dadurch gekenn­ zeichnet, dass 90 mg Bromelain, 120 mg Papain, und 100 mg Rutosid pro Do­ siseinheit verwendet werden.

6. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, dadurch gekenn­ zeichnet, dass 90 mg Bromelain, 48 mg Trypsin und 100 mg Rutosid pro Dosis­ einheit verwendet werden.

7. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-6, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Prophylaxe des Diabetes mellitus Typ I im Stadium des Prä­ diabetes erfolgt.