WO2001078765A2 - Prophylaxe und therapie von diabetes mellitus 1 mit hilfe proteolytischer enzyme - Google Patents

Prophylaxe und therapie von diabetes mellitus 1 mit hilfe proteolytischer enzyme Download PDF

Info

Publication number
WO2001078765A2
WO2001078765A2 PCT/EP2001/004346 EP0104346W WO0178765A2 WO 2001078765 A2 WO2001078765 A2 WO 2001078765A2 EP 0104346 W EP0104346 W EP 0104346W WO 0178765 A2 WO0178765 A2 WO 0178765A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
diabetes
cells
diabetes mellitus
type
protease
Prior art date
Application number
PCT/EP2001/004346
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2001078765A3 (de
Inventor
Karl Ransberger
Gerhard Stauder
Original Assignee
Mucos Pharma Gmbh & Co.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mucos Pharma Gmbh & Co. filed Critical Mucos Pharma Gmbh & Co.
Publication of WO2001078765A2 publication Critical patent/WO2001078765A2/de
Publication of WO2001078765A3 publication Critical patent/WO2001078765A3/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4873—Cysteine endopeptidases (3.4.22), e.g. stem bromelain, papain, ficin, cathepsin H
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4826—Trypsin (3.4.21.4) Chymotrypsin (3.4.21.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • the present invention relates to the use of proteolytic enzymes for the prophylaxis or therapy of type 1 diabetes mellitus.
  • Type 1 diabetes mellitus arises from an auto-aggression of the immune system against insulin-producing cells in the Langerhans Islands. This process goes unnoticed over the year. Only when about 70-80% of the insulin-producing ß cells are destroyed does the disease manifest itself with the typical insulin deficiency symptoms such as weight loss, increased thirst and urination ( Figure 1). Already in the early 1990s, T cells were isolated from the blood of freshly manifest type 1 diabetics who react specifically with an autoantigen from the membranes of insulin-producing cells. The 38 kD antigen was identified as "Imogen 38".
  • the insulin deficiency caused by the destruction of the insulin-producing cells leads to an increase in the blood sugar level (hyperglycaemia) and a consecutive excretion of glucose in the urine.
  • the prevalence of type 1 diabetes mellitus in the normal population in Europe is approximately 0.1 to 0.3%, with a steady increase in the incidence of diabetes in many countries in recent years.
  • the manifestation of diabetes takes place in the majority of cases around puberty, but in some patients the manifestation of diabetes only occurs later in life.
  • type 1 diabetes leads to the destruction of the insulin-producing cells, insulin therapy must be carried out after the clinical manifestation. Some of the patients experience a brief remission after initial insulin treatment, in which there is a reduced need for insulin. Insulin therapy can even be dispensed with for a few weeks in a small percentage of patients. Then the patients are dependent on insulin injections for life. With modern insulin therapies, a more or less normal life can be achieved for the patient, but with a still reduced life expectancy. The known complications of type 1 diabetes such as neuro-, Nephro-, retino- and angiopathy, probably cannot be completely avoided despite the consequent use of the current therapy options. This is especially true for children and adolescents, with their specific problems of growth and puberty.
  • the islet cell antibodies (ICA) are the best evaluated autoantibodies for the early detection of type 1 diabetes. These are detected using indirect immunofluorescence on human frozen sections. These are different autoantibodies that react against specific island proteins. Some autoantigens have been identified in recent years. A large percentage of the islet cell antibodies consist of antibodies against glutamate decarboxylase (GAD). Other antibodies are directed against insulin (insulin autoantibodies, AA), which are particularly predictive in children. Antibodies against the tyrosine phosphatases IA2 and IA2ß are also involved.
  • the pathogenesis of type 1 diabetes mellitus can be seen as a cascade graded from time, from which the possibilities for early detection can also be derived (FIG. 1).
  • FOG. 1 The pathogenesis of type 1 diabetes mellitus can be seen as a cascade graded from time, from which the possibilities for early detection can also be derived (FIG. 1).
  • a further prediabetic stage is a reduction in IV GTT (intravenous glucose tolerance test).
  • IV GTT intravenous glucose tolerance test
  • the criteria of manifest diabetes mellitus are met.
  • the present invention was based on the technical problem of specifying a further possibility for the prophylaxis or therapy of type 1 diabetes, the side effect profile being as low as possible.
  • the stated technical problem is solved by using at least one proteolytic enzyme for the prophylaxis and / or therapy of type 1 diabetes mellitus.
  • the change in the level of diabetes-specific autoantibodies such as GAD, IA2, ICA, AA, can be used.
  • the use of the hydrolytic enzymes slowed the increase in the autoantibodies mentioned compared to untreated control patients, or the occurrence of the autoantibodies could be prevented in the subjects treated according to the invention, while a number of risk patients from the negative control group developed in the course of the Time formed the autoantibodies mentioned.
  • the ratio of diabetes-promoting Th1 cytokines (IL12, TNF- ⁇ ) and diabetes-inhibiting Th2 cytokines (1L4 and IL1O) can be determined as alternative markers for the response of a patient to treatment with hydrolytic enzymes.
  • the factors mentioned can be determined using quantitative RT-PCR.
  • This marker also shows the response of the patients treated according to the invention to therapy with hydrolytic enzymes, in that the ratio of the cytokines mentioned shifts in favor of the diabetes-inhibiting cytokines.
  • the proteolytic enzyme is preferably selected from trypsin, chymotrypsin, bromelain and papain and combinations of the enzymes mentioned.
  • the enzymes used according to the invention can be isolated inexpensively from the following raw material, for example.
  • Bromelain is a proteolytically active enzyme from pineapple juice and can also be isolated from ripe fruit.
  • Papain is a proteolytic enzyme that is obtained from the milk juice of the unripe fleshy fruits of the Carica papaya melon tree. Pure papain is a crystalline polypeptide with a molecular weight of 23,350, which consists of a chain of 212 amino acid residues with 4 disulfide bridges. The sequence and spatial structure of the enzyme are known. Papain is used in a variety of ways:
  • papain is already used to support enzymatic digestion, for enzymatic wound cleaning and as an additive to denture cleaning agents.
  • papain preparations are also available carrier-bound to plastic polymers or agarose.
  • Papain is also a catalyst for the synthesis of oligopeptides been used.
  • Trypsin is a proteolytic enzyme that is also formed in the pancreas. It belongs to the serine proteases. Crystalline trypsin has a molecular weight of approx. 23,300, is soluble in water but not in alcohol, has an optimum activity at pH 7-9 and cleaves peptide chains specifically on the carboxy side of the basic amino acid residues L-lysine and L-arginine. The spatial structure of the 223 amino acid trypsin is known.
  • Chymotrypsin is also produced in the pancreas. It is also a serine protease. The best-researched ⁇ -chymotrypsin has a molecular weight of approximately 25,000 and comprises 245 amino acids.
  • flavonoids flavone glycosides
  • flavonoids flavone glycosides
  • Rutoside rutin
  • 20-100 mg bromelain, 40-120 mg papain and 10-50 mg trypsin per dose unit e.g. B. tablet used.
  • 10-100 mg, particularly preferably 100 mg of rutoside times 3 H 2 O are used per dose unit.
  • a combination of 90 mg bromelain, 120 mg papain and 100 mg rutoside x 3 H 2 0 is used per dose unit.
  • a particularly preferred embodiment consists of the combination of 90 mg bromelain, 48 mg trypsin and 100 mg rutoside x 3 H 2 0 per dose unit. This combination is used e.g. B. sold under the name "Phlogenzym” by Mucos Pharma GmbH & Co. in Germany.
  • the dose unit can also contain all customary auxiliaries or carriers.
  • auxiliaries and carriers come, for. B. lactose, magnesium stearate, stearic acid, talc, methacrylic acid, copolyme sat type A, shellac, Makrogel 6000, dibutyl phthalate, vanillin, titanium dioxide, white clay, polyindone, yellow wax and Carnauba wax in question.
  • the hydrolytic enzymes are used in patients in the pradiabetic state, which is characterized by the first appearance of antibodies against islet cells (ICA) and other autoimmune markers, such as antibodies against GAD65, tyrosine phosphatase IA2 or insulin.
  • ICA islet cells
  • other autoimmune markers such as antibodies against GAD65, tyrosine phosphatase IA2 or insulin.
  • Figure 1 shows the pathogenesis of type I diabetes mellitus as a cascade graded in time.
  • FIG. 2 shows the cytokine analysis of an autoreactive T cell clone by ELISPOT, which reacts with GAD 65.
  • the autoreactive T cell clone PM1 # 11 was unstimulated (medium), nonspecifically stimulated (PMA-Jonomycin) and specifically stimulated (autoantigen GAD 65) with regard to the production of IFN ⁇ , IL-4 and IL-10 in the absence (1st column ) and the presence of protease mixture 1 (2nd column) and protease mixture 2 (3rd column).
  • Figure 3 shows the effect of protease treatment on antigen-specific T cell proliferation.
  • the percentage inhibition in the presence of the protease is compared with the proliferation in the absence of the protease.
  • the maximum protease concentration was reduced for GAD65 and IA2-reactive T cell clones after reaching piatos with these clones.
  • FIG. 4 shows the effect of the protease treatment on the non-specific stimulation of a T cell clone. The percentage inhibition in the presence of the protease is shown compared to the proliferation in the absence of the protease.
  • Figure 5 shows the effect of pre-incubation with proteases on T cell proliferation.
  • the proliferative response after pre-incubation of each T cell clone or the antigen-presenting B cell line is shown here.
  • the protease concentration was 50 ⁇ g / ml during the pre-incubation.
  • Glucosuria can be determined using conventional test strips, such as Diabur-Test 5,000, Boehringer Mannheim, Germany. If the result is positive, blood glucose is also determined. The glucose can be determined, for example, with the glucose analyzer Glucometer Elite, Bayer Diagnostics, Kunststoff, Germany. Determination of GAD-specific autoantibodies
  • a GAD radioimmunoassay was carried out according to the method of Wiest-Ladenburger, U. et al., Diabetes, Volume 56, page 565 (1997).
  • recombinant human S 35 GAD65 and S 35 -GAD67 are produced using a coupled transcription-t-translation system from Promega, Madison, Wisconsin, USA.
  • Expression plasmids containing the cDNAs of rGAD65 or rGAD67 were used as templates for the transcription. Labeled proteins were separated from unincorporated S 35 methionine using Sephadex G25 (Pharmacia, Uppsala in Sweden). 5 ⁇ l serum is incubated in duplicate with 15,000 cpm radioactive protein at 4 ° C.
  • Protein-A-Sepharose is added and after one hour antibody-bound GAD is separated from unbound GAD by washing in microtiter plates with a membrane bottom (Millipore, Eschborn, Germany). The counted decays per minute (cpm) were determined in a ß counter.
  • T cell clones Three independent T cell clones were isolated from two newly diagnosed type 1 diabetes patients and one pre-diabetic person whose clinical manifestation occurred 4 years after isolation (1-3).
  • T and B lymphocytes were treated with the proteases trypsin, bromelain, papain, chymotrypsin and mixtures thereof (protease mixture 1: trypsin, bromelain, chemotrypsin and papain in a ratio of 24: 45: 1: 60; protease mixture 2 : Trypsin and bromelain 1: 2) co-cultivated in a concentration of 50 ⁇ g / ml.
  • the cells were incubated with monoclonal antibodies which are directed against the cell surface molecules CD3, CD11a, CD20, CD25, CD40, CD44, CD54, CD58, CD80 and CD86, and with FITC-labeled anti-mouse IgG as described (4) , colored.
  • the analyzes were carried out on the FACS Calibur FACS device (Becton & Dickinson, San Jose, California).
  • the T cells were stimulated with irradiated autologous or in the HLA-DR-matching PBMC in the culture medium (RPM1 1640, 10% human pooled serum) or with IL-2, PHA or specific autoantigens and synthetic peptide epitopes thereof (1-3).
  • the proteases were added in a dose range of 3.1-100 ⁇ g / ml. After 3 days of incubation, 3 H-thymidine in RPMI 1640 medium was added to each well and the cultures were harvested to determine radioactivity. Pre-incubation experiments were carried out with 100 ⁇ g / ml proteases over 18 hours. The cells were then washed and stimulated as described above.
  • the effect of the proteases on the cytokine production profile of autoreactive T cells was examined using the GAD65-specific T cell clone, since this clone shows a Th-O / Th-2 cytokine profile in response to the detection of GAD65 (2).
  • the interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) production which was nonspecifically induced in response to PMA / ionomycin was not influenced by the protease treatment (FIG. 2).
  • the IL-4 release was doubled, while the IL-10 production was halved in the presence of the protease mixtures.
  • the autoantigen-specific release of IFN- ⁇ was completely inhibited, while the IL-4 and IL-10 responses were unaffected. This shows the selective effect of the proteases on the autoantigen-specific reactivity.
  • the PHA-dependent stimulation was only inhibited at protease concentrations higher than 50 ⁇ g / ml (FIG. 4 B).
  • the Inhibitory effect could not be explained by antigen proteolysis, since the GAD65-specific T cell clone and the IA-2-specific T cell clone could be inhibited to different degrees in their response to peptide epitopes (FIGS. 3 B and C).
  • No effect on the immunogenicity of the autoantigens and peptides was found after the pretreatment with proteases with subsequent heat inactivation of the enzymes before addition to the cell cultures.
  • Separate pre-incubation studies of T cells and antigen-presenting cells showed that the inhibitory effect was predominantly triggered on APC (FIG. 5 A).
  • T-cell clones from a type-1 diabetes patient respond to insulin secretory granule proteins. Nature 345: 632.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung proteolytischer Enzyme zur Prophylaxe bzw. Therapie von Diabetes mellitus vom Typ 1. Dabei erfolgt der Einsatz der proteolytischen Enzyme vorzugsweise im prädiabetischen Stadium.

Description

Prophylaxe und Therapie von Diabetes mellitus 1 mit Hilfe proteolytischer Enzyme
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung proteolytischer Enzyme zur Prophylaxe bzw. Therapie von Diabetes mellitus vom Typ 1.
Der Diabetes mellitus Typ 1 entsteht durch eine Autoaggression des Immunsystems gegen Insulin-produzierende Zellen in den Langerhans'schen Inseln. Dieser Prozess läuft über Jahr unbemerkt ab. Erst wenn ca. 70 — 80 % der Insulin-produzierenden ß- Zellen zerstört sind, manifestiert sich die Erkrankung mit den typischen Insulinmangelsymptomen wie Gewichtsabnahme, vermehrter Durst und Wasserlassen (Figur 1). Bereits Anfang der 90er Jahre gelang die Isolierung von T-Zellen aus dem Blut von frisch-manifesten Typ 1 Diabetikern, die spezifisch mit einem Autoantigen aus den Membranen von Insulin-produzierenden Zellen reagieren. Das 38 kD große Antigen wurde als ,,lmogen 38" identifiziert.
Der durch die Zerstörung der Insulin-produzierenden Zellen hervorgerufene Insulinmangel führt zu einem Anstieg des Blutzuckerspiegels (Hyperglykämie) und einer konsekutiven Ausscheidung von Glukose im Urin. Die Prävalenz des Diabetes mellitus Typ 1 in der Normalbevölkerung beträgt in Europa ca. 0,1 bis 0,3 %, wobei in den letzten Jahren ein kontinuierlicher Anstieg der Diabetesinzidenz in vielen Ländern beobachtet wurde. Die Diabetesmanifestation findet im größten Teil der Fälle um die Pubertät statt, jedoch kommt es bei einem Teil der Patienten erst im späteren Leben zur Manifestation des Diabetes.
Da es beim Typ 1 Diabetes zu einer Zerstörung der Insulin-produzierenden Zellen kommt, muss nach der klinischen Manifestation eine Insulintherapie erfolgen. Bei einem Teil der Patienten kommt es nach initialer Insulinbehandlung zu einer kurzzeitigen Remission, in der ein reduzierter Insulinbedarf vorhanden ist. Bei einem kleinen Prozentsatz der Patienten kann sogar für einige Wochen auf eine Insulintherapie verzichtet werden. Anschließend sind die Patienten lebenslang auf Insulininjektionen angewiesen. Mit den modernen Insulintherapien ist für die Patienten ein mehr oder weniger normales Leben erreichbar, jedoch mit noch immer reduzierter Lebenserwartung. Die bekannten Folgeerkrankungen des Typ 1 Diabetes wie Neuro-, Nephro-, Retino- und Angiopathie, können trotz konsequenter Ausschöpfung der gegenwärtigen Therapiemöglichkeiten wahrscheinlich nicht vollkommen vermieden werden. Dies gilt insbesondere für Kinder und Jugendliche, mit ihren spezifischen Problemen des Wachstums und der Pubertät.
Die Ursache der Zerstörung der Insulin-produzierenden Zellen ist bisher nicht bekannt. Die Bedeutung genetischer Faktoren bei der Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 1 ergibt sich aus einer Konkordanzrate von 30 — 40 % bei eineiigen Zwillingen. Besonders Gene im Bereich des HLA-Bereiches (HLA-DR3 und/oder 4) sind bei Typ 1 Diabetikern dominierend. Es wird postuliert, dass zusätzlich Umweltfaktoren an der Pathogenese des Typ 1 Diabetes beteiligt sind.
Ziel vieler Studien der vergangenen Jahre war es, die chronische Entzündung der Insulin-produzierenden Zellen vor der Manifestation des Diabetes zu erkennen. Für die Frühdiagnostik im sogenannten Prädiabetesstadium haben sich verschiedene Autoantikörper als prädiktiv erwiesen. Die Inselzellantikörper (ICA) sind die am besten evaluierten Autoantikörper für die Früherkennung des Typ 1 Diabetes. Diese werden mittels indirekter Immunfluoreszenz an menschlichen Gefrierschnitten nachgewiesen. Es handelt sich hierbei um verschiedene Autoantikörper, die gegen spezifische Inselproteine reagieren. Einige Autoantigene wurden in den vergangenen Jahren identifiziert. So bestehen die Inselzellantikörper zu einem großen Prozentsatz aus Antikörpern gegen die Glutamatdecarboxylase (GAD). Weitere Antikörper sind gegen Insulin gerichtet (Insulinautoantikörper, AA), die besonders bei Kindern einen hohen prädiktiven Wert haben. Ferner sind Antikörper gegen die Tyrosinphosphatasen IA2 und IA2ß beteiligt.
Bei bisherigen Bemühungen zur Prävention des Diabetes mellitus Typ 1 wurde beispielsweise eine Immuninteπ ention zum Zeitpunkt der Manifestation des Diabetes mellitus versucht. Dabei wurde durch eine Behandlung mit Cyclosporin A die Remissionsphase nach Manifestation von Diabetes erhöht und verlängert. Jedoch gingen diese Remissionen trotz Fortführung der immunsepressiven Therapie spätestens nach 2 — 3 Jahren verloren. Da es sich bei Cyclosporin A um eine der potentesten immunsupressiven Substanzen handelt, ist davon auszugehen, dass zum Zeitpunkt der Manifestation des Diabetes mellitus die Inselzellreserve zu gering ist, um eine Heilung des Diabetes zu erreichen. Aus diesem Grund sind die Bemühungen einer Diabetesprävention in den letzten Jahren auf die prädiabetische Phase gerichtet worden. Hierzu gehört die „Deutsche Nikotinamid-Intententionsstudie (DENIS)" bei der das B-Vitamin Nikotinamid bei Geschwistern im Alter von 3 — 12 Jahren von Kindern mit einem Typ 1 Diabetes erprobt wurde. Eine Wirksamkeit von Nikotinamid auf die Pathogenese des Typ 1 Diabetes konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Im Rahmen der „Europäischen-Nikotinamid-Intzerventionsstudie (ENDIT)" werden erstgradige Verwandte von Typ 1 Diabetikern bis zum 40. Lebensjahr mit Nikotinamid behandelt. Bei weiteren Studien wird die frühe subkutane und orale Insulintherapie bei Probanden mit Inselzellantikörpern und einer gestörten intravenösen Glucosetoleranz getestet.
Die Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 1 kann als eine zeitlich abgestufte Kaskade betrachtet werden, aus der sich auch die Möglichkeiten der Früherkennung ableiten lassen (Figur 1). Auf der Basis einer genetischen Disposition, die im Bereich der HLA-DR- und — DQ-Gene lokalisiert wird, kommt es zum Auftreten von Autoantikörpem. Als ein weiteres prädiabetisches Stadium wird eine Reduktion des i.v.GTT (intravenöser Glukosetoleranztest) angesehen. Bei dem pathologischen Ausfall des oGTT (oraler Glukosetoleranztest) oder Nachweis einer Hyperglykämie sind die Kriterien eines manifesten Diabetes mellitus erfüllt.
Da mit den zur Zeit zur Verfügung stehenden diagnostischen Mitteln Diabetes mellitus vom Typ 1 nicht mit 100 %iger Sicherheit vorhergesagt werden kann, erfordert eine Behandlung von Kindern, Jugendlichen und jungen Erwachsenen, die nur zu einem Teil an einem Diabetes erkranken werden, dass nur Medikamente mit einem geringstmöglichen Nebenwirkungsprofil eingesetzt werden.
Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, eine weitere Möglichkeit der Prophylaxe bzw. Therapie von Typ 1 Diabetes anzugeben, wobei ein möglichst geringes Nebenwirkungsprofil auftreten sollte.
Das genannte technische Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym zur Prophylaxe und/oder Therapie von Diabetes mellitus Typ 1. Als Indikator für die erfolgreiche Behandlung des Typ 1 Diabetes mit den hydrolytischen Enzymen kann die Veränderung des Spiegels an Diabetes-spezifischen Autoantikörpem, wie GAD, IA2, ICA, AA, herangezogen werden. Der Einsatz der hydrolytischen Enzyme führte in zahlreichen Fällen zu einer Verlangsamung des Anstiegs der genannten Autoantikörpem im Vergleich zu unbehandelten Kontrollpatienten, bzw. das Auftreten der Autoantikörper konnte bei den erfindungsgemäß behandelten Probanden verhindert werden, während eine Anzahl der Risikopatienten aus der negativen Kontrollgruppe im Verlaufe der Zeit die genannten Autoantikörper bildete. Als alternative Marker für das Ansprechen eines Patienten auf die Behandlung mit hydrolytischen Enzymen kann das Verhältnis von Diabetes-fördernden Th1- Zytokinen (IL12, TNF-α) und Diabetes-inhibierenden Th2-Zytokinen (1L4 und IL1O) bestimmt werden. Die genannten Faktoren können mittels quantitativer RT-PCR bestimmt werden. Auch dieser Marker zeigt das Ansprechen der erfindungsgemäß behandelten Patienten auf die Therapie mit hydrolytischen Enzymen, indem sich das Verhältnis der genannten Zytokine zugunsten der Diabetes-inhibierenden Zytokine verschiebt.
Vorzugsweise wird das proteolytische Enzym ausgewählt aus Trypsin, Chymotrypsin, Bromelain und Papain sowie Kombinationen aus den genannten Enzymen.
Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme lassen sich beispielsweise kostengünstig aus dem folgenden Rohmaterial isolieren.
Bromelain ist ein proteolytisch wirksames Enzym aus Presssaft der Annanas und kann auch aus reifen Früchten isoliert werden.
Papain ist ein proteolytisches Enzym, das aus dem Milchsaft der unreifen fleischigen Früchte des Melonenbaums Carica papaya gewonnen wird. Reines Papain ist ein kristallenes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 23.350, das aus einer Kette von 212 Aminosäureresten mit 4 Disulfidbrücken besteht. Die Sequenz und die Raumstruktur von dem Enzym sind bekannt. Papain wird vielfältig eingesetzt:
auf Grund seiner Protein-spaltenden Eigenschaft als ,, Fleischzartmacher" oder Mür- besalz", zum Klaren von Bier, zur Brot- und Hartkeksherstellung, in der Lederzubereitung, in der Textilindustrie, zum Entbasten von Seide und zur Verhinderung von Wollverfilzung, in der Tabakindustrie zur Qualitätsverbesserung und zur Rückgewinnung von Silber aus verbrauchtem fotographischen Material, ferner in der Bakteriologie zur Peptongewinnung. In der Medizin dient Papain bereits zur Unterstützung der enzymatischen Verdauung, zur enzymatischen Wundreinigung und als Zusatz zu Zahnprothese-Reinigungsmitteln. Für Spezialzwecke werden Papainprä- parate auch an Kunststoffpolymere oder Agarose trägergebunden angeboten. Papain ist auch als Katalysator zur Synthese von Oligopeptiden verwendet worden.
Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das ebenfalls im Pankreas gebildet wird. Es gehört zu den Serinproteasen. Kristallines Trypsin hat ein Molekulargewicht von ca. 23.300, ist in Wasser, nicht aber in Alkohol, löslich und besitzt ein Wirkungsoptimum bei pH 7-9 und spaltet Peptidketten spezifisch auf der Carboxy-Seite der basischen Aminosäurereste L-Lysin und L-Arginin. Die räumliche Struktur des aus 223 Aminosäuren bestehenden Trypsins ist bekannt.
Chymotrypsin wird ebenfalls in Pankreas gebildet. Es gehört ebenfalls zu den Serinproteasen. Das bestuntersuchte α-Chymotrypsin besitzt ein Molekulargewicht von ca. 25.000 und umfasst 245 Aminosäuren.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Flavonoide (Flavonglyco- side) als zusätzliche Wirksubstanz eingesetzt. Diese Substanzklasse ist im Pflanzenreich weit verbreitet und kann daraus isoliert werden. Besonders bevorzugt ist Rutosid (Rutin).
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden 20 — 100 mg Bromelain, 40 — 120 mg Papain und 10 — 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit, z. B. Tablette, verwendet.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden 10 — 100 mg, besonders bevorzugt 100 mg Rutosid mal 3 H20 pro Dosiseinheit verwendet. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Kombination von 90 mg Bromelain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid x 3 H20 pro Dosiseinheit eingesetzt.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform besteht aus der Kombination von 90 mg Bromelain, 48 mg Trypsin und 100 mg Rutosid x 3 H20 pro Dosiseinheit. Diese Kombination wird z. B. unter dem Namen „Phlogenzym" von der Firma Mucos Pharma GmbH & Co. in Deutschland vertrieben.
Die Dosiseinheit kann weiterhin alle üblichen Hilfs- oder Trägerstoffe enthalten.
Als Hilfs- und Trägerstoffe kommen z. B. Laktose, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talkum, Metacrylsäure, Copolyme sat Typ A, Schellack, Makrogel 6000, Dibu- tylphthalat, Vanillin, Titandioxyd, weißer Ton, Polyindon, gelbes Wachs und Car- naubawachs in Frage.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Einsatz der hydrolytischen Enzyme bei Patienten im pradiabetischen Zustand, der durch das erstmalige Auftreten von Antikörpern gegen Inselzellen (ICA) und andere Autoimmunmarker, wie Antikörper gegen GAD65, Tyrosinphosphatase IA2 oder Insulin gekennzeichnet ist.
Figur 1 zeigt die Pathogenese des Diabetes mellitus Typ I als eine zeitlich abgestufte Kaskade.
Figur 2 zeigt die Zytokin-Analyse eines autoreaktiven T-Zellklons durch ELISPOT, der mit GAD 65 reagiert. Der autoreaktive T-Zellklon PM1#11 wurde unstimuliert (Medium), unspezifisch stimuliert (PMA-Jonomycin) und spezifisch stimuliert (Autoantigen GAD 65) in Bezug auf die Produktion von IFNγ, IL-4 und IL-10 bei Abwesenheit (1. Säule) und Vorhandensein des Proteasegemisches 1 (2. Säule) und Proteasegemisches 2 (3. Säule).
Figur 3 zeigt die Wirkung der Protease-Behandlung auf die Antigen-spezifische T- Zell-Proliferation. Hierbei ist die prozentuale Hemmung bei Anwesenheit der Protease mit der Proliferation bei Abwesenheit der Protease verglichen. Die maximale Protease- Konzentration wurde für GAD65- und IA2-raktive T-Zellklone verringert, nachdem Piatos mit diesen Klonen erreicht wurden.
Figur 4 zeigt die Wirkung der Protease-Behandlung auf die unspezifische Stimulierung eines T-Zellklons. Hierbei ist die prozentuale Hemmung bei Anwesenheit der Protease verglichen mit der Proliferation bei Abwesenheit der Protease dargestellt.
Figur 5 zeigt die Wirkung der Vor-Inkubation mit Proteasen auf die T-Zell- Proliferation. Hierbei ist die proliferative Antwort nach Vor-Inkubation jedes T- Zellklons oder der Antigen-präsententierenden B-Zelllinie dargestellt. Die Protease- Konzentration betrug während der Vor-Inkubation 50 μg/ml.
a) Proliferative Antwort auf vollständiges Antigen, das von Antigen- präsentierenden Zellen prozessiert wurde;
b) Proliferative Antwort auf ein synthetisches Peptid-Epitop, das direkt von Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert wurde;
c) IL-2-abhängige Proliferation nach Vor-Inkubation der T-Zellen oder PHA- fähige Proliferation nach Vor-Inkubation der Antigen-präsentierenden Zellen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Bestimmung von Glukose in Harn
Die Bestimmung von Glukosurie kann mittels herkömmlicher Teststreifen, wie Diabur- Test 5.000, Boehringer Mannheim, Deutschland, durchgeführt werden. Bei einem positiven Befund wird dann zusätzlich Glukose in Blut bestimmt. Die Glukosebestimmung kann beispielsweise mit dem Glukoseanalysator Glucometer Elite, Bayer Diagnostics, München, Deutschland, erfolgen. Bestimmung GAD-spezifischer Autoantikörper
Hierzu wurde ein GAD-Radioimmunoassay gemäß dem Verfahren von Wiest- Ladenburger, U. et al., Diabetes, Band 56, Seite 565 (1997) durchgeführt. Hierzu wird rekombinantes humanes S35GAD65 und S35-GAD67 mittels eines gekoppelten Transkriptions-tTranslationssystems von Promega, Madison, Wisconsin, USA, hergestellt. Expressionsplasmide, enthaltend die cDNAs von rGAD65 oder rGAD67, wurden als Matrizen für die Transkription verwendet. Markierte Proteine wurden von nicht eingebautem S35-Methionin mittels Sephadex G25 (Pharmacia, Uppsala in Schweden) abgetrennt. 5 μl Serum wird in 2-facher Ausführung mit 15.000 cpm radioaktivem Protein bei 4°C übernacht inkubiert. Protein-A-Sepharose wird zugesetzt und nach einer Stunde wird Antikörper-gebundene GAD von ungebundenem GAD durch Waschen in Mikrotiterplatten mit einem Membranboden (Millipore, Eschborn, Deutschland) abgetrennt. Die gezählten Zerfälle pro Minute (cpm) wurden in einem ß- Zähler ermittelt.
Material und Methoden
T-Zell-Reagenzien
Drei voneinander unabhängige T-Zellklone wurden aus zwei frisch diagnostizierten Typ 1 Diabetes-Patienten und einer prä-diabetischen Person, deren klinische Manifestation 4 Jahre nach der Isolierung auftrat, isoliert (1 - 3).
FACS-Analyse
T- und B-Lymphozyten wurden 14 bzw. 2 Stunden mit den Proteasen Trypsin, Bromelain, Papain, Chymotrypsin und Gemischen davon (Proteasegemisch 1: Trypsin, Bromelain, Chemotrypsin und Papain in einem Verhältnis von 24 : 45 : 1 : 60; Proteasegemisch 2: Trypsin und Bromelain 1 : 2) in einer Konzentration von 50 μg/ml co-kultiviert. Die Zellen wurden mit monoklonalen Antikörpern inkubiert, die gegen die Zelloberflächenmoleküle CD3, CD11a, CD20, CD25, CD40, CD44, CD54, CD58, CD80 und CD86 gerichtet sind, und mit FITC-markiertem Anti-Maus-IgG, wie beschrieben (4), gefärbt. Die Analysen wurden auf der FACS Calibur FACS- Vorrichtung (Becton & Dickinson, San Jose, California) durchgeführt.
ELISPOT-Analyse
20000 T-Zellen des Klons PM1#11 und 50000 bestrahlte, in HLA-übereinstimmende Antigen-präsentierende Zellen, wurden mit Medium alleine, PMA/Ionomycin oder GAD65-Autoantigen 48 Stunden mit bzw. ohne 25 μg/ml des Proteasegemisches 1 bzw. des Proteasegemisches 2 vorinkubiert. Sodann wurden die nicht-adhärenten Zellen gewaschen und 3500 Zellen in die Näpfe von ELISA-Platten überführt, die mit hochaffinen monoklonalen Antkörpern gegen IL-4, IL-10 oder IFN-γ beschichtet waren, an die das produzierte Zytokin während der Inkubation bindet. Nach 4- stündiger Inkubation (IL-10 und IFN^y) oder übernacht (IL-4) wurden die Zellen lysiert und Zelltrümmer weggewaschen. Bereiche, an die das Zytokin gebunden war, wurden durch eine Kombination eines biotinylierten Antizytokin-Antikörpers und einen Goldmarkierten Anti-Biotin-Antikörper nachgewiesen. Schließlich wurde ein Silber- Verstärkungsreagens hinzugefügt, so dass sich schwarze Zonen („Flecken") ergaben, die die Orte der Zytokin-Sekretion anzeigen. Die Anzahl der Flecken und die Oberfläche wurden automatisch unter Verwendung der Olympus Micro-Imager- Software bestimmt.
T-Zellproliferation
Die T-Zellen wurden mit bestrahlten autologen oder im HLA-DR-übereinstimmenden PBMC im Kulturmedium (RPM1 1640, 10 % humanes gepooltes Serum) oder mit IL-2, PHA oder spezifischen Autoantigenen und synthetischen Peptidepitopen davon (1 - 3) stimuliert. Die Proteasen wurden in einem Dosisbereich von 3,1 - 100 μg/ml hinzugefügt. Nach 3-tägiger Inkubation wurde 3H-Thymidin in RPMI 1640-Medium jedem Napf hinzugefügt, und die Kulturen wurden zur Bestimmung der Radioaktivität geerntet. Vorinkubations-Experimente wurden mit 100 μg/ml Proteasen über 18 Stunden durchgeführt. Danach wurden die Zellen gewaschen und wie vorstehend beschrieben stimuliert.
Ergebnisse:
1. Zeiloberflächenanalyse
Die proteolytische Aktivität der verschiedenen Proteasen und Proteasengemische auf Zelloberflächenmoleküle wurde durch FACS-Analyse unter Verwendung einer Reihe von monoklonalen Antikörpern getrennt voneinander untersucht, wobei die monoklonalen Antikörper reaktiv waren mit CD3, CD11a, CD25, CD44, CD54 und CD58 auf T-Zellen und HLA-DR, CD20, CD40, CD44, CD54, CD58, CD80 und CD86 auf Antigen-präsentierenden B-Zellen (Tabelle 1). Tabelle 1: Beeinflussung der von der Expression von Zeiloberflächenmolekülen durch Protease-Behandlung (FACS-analyse)
B. T-Zellen (1C6; Übernacht-Inkubation mit Proteasen)
CD3 CD11a CD25 CD44 CD54 CD58
Trypsin t — u = =
Brom. t = n = =
Pap. 4 t = = =
Chym. 1 t n n i
Gemisch 1 1 = = ψ = =
Gemisch 2 1 t z i z ~
B-Zellen (EBV-BLCL; 2 Stunden Inkubation mit Proteasen)
DR CD20 CD40 CD44 CD54 CD58 CD80 CD86
Trypsin l = — = 1 —
Brom. = = i i i =
Pap. n = = ^ 1 =
Chym. to = = i (4>) (1) = =
Gemisch 1 ι = = i (i) i =
Gemisch 2 1 = — | = = n. t. = Auf T-Zellen wurden CD3 und CD44 durch sämtliche Proteasen herunterreguliert, CD11a war hochreguliert und CD54 und CD58 unverändert. HLA-DR, CD44, CD54, CD58, CD80 auf B-Zellen wurden herunterreguliert durch die Proteasebehandlung, wohingegen die Expression von CD20, CD40 und CD86 unbeeinflusst war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die TCR-Expression und der Homing-Rezeptoren, ebenso wie die Rezeptoren für die Peptidpräsentation und Co-Stimulierung von B-Zellen durch die Proteasebehandlung beeinflusst wurden.
2. Zytokin-Produktion
Die Wirkung der Proteasen auf das Zytokin-Produktionsprofil von autoreaktiven T- Zellen wurde anhand des GAD65-spezifischen T-Zellklons untersucht, da dieser Klon ein Th-O/Th-2 Zytokinprofil als Antwort auf die Erkennung von GAD65 zeigt (2). Die als Antwort auf PMA/Ionomycin unspezifisch induzierte Interferon-γ (IFN-γ) Produktion wurde durch die Proteasebehandlung nicht beeinflusst (Figur 2). Im Gegensatz hierzu war die IL-4 Freisetzung verdoppelt, während die IL-10 Produktion bei Anwesenheit der Proteasegemische halbiert war. Die Autoantigen-spezifische Freisetzung von IFN- γ wurde vollständig gehemmt, während die IL-4 und IL-10 Antworten unbeeinflusst waren. Dies zeigt die selektive Wirkung der Proteasen auf die Autoantigen-spezifische Reaktivität.
3. Proliferationsexperimente
Die proliferativen Antworten einer Reihe von autoreaktiven T-Zellklonen unterschiedlicher Spezifität wurden untersucht (Figur 3 und 4). Ein T-Zellklon, der mit Insulin-sekretorischem Granula-Membranprotein reagiert, wurde in seiner Proliferation gegen ß-Zellmembran-Homogenat durch sämtliche untersuchten Proteasen spezifisch gehemmt. Bromelain war hierbei am wenigsten wirksam, jedoch immer noch in der Lage, die Proliferation um mehr als 80 % bei einer Konstitution von 25 μg/ml zu blockieren (Figur 3 A). Die IL-2-abhängige Proliferation war wesentlich weniger zu beeinflussen. Papain war hierbei nicht in der Lage überhaupt eine Wirkung zu zeigen, wohingegen Chymotrypsin ebenso wie die Proteasengemische die proliferative Antwort am wirksamsten hemmten (Figur 4 A). Die PHA-abhängige Stimulation wurde nur bei Protease-Konzentrationen höher als 50 μg/ml gehemmt (Figur 4 B). Der inhibitorische Effekt konnte nicht durch die Antigen-Proteolyse erklärt werden, da der GAD65-spezifische T-Zellklon und der IA-2-spezifιsche T-Zellklon in ihrer Antwort auf Peptidepitope in unterschiedlichem Ausmaß gehemmt werden konnten (Figur 3 B und C). Kein Effekt auf die Immunogenizität der Autoantigene und Peptide war nach der Vor-Behandlung mit Proteasen mit nachfolgender Hitze-Inaktivierung der Enzyme vor Zugabe zu den Zellkulturen feststellbar. Getrennte Vor-Inkubationsstudien von T- Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen zeigten, dass der inhibitorische Effekt vorherrschend auf APC ausgelöst wurde (Figur 5 A). Papain und die Proteasegemische waren am wirksamsten unabhängig von dem Prozessierungsbedarf durch die APC, da ähnliche Effekte unter Verwendung des synthetischen Peptidepitops gemessen wurden (Figur 5 B). Die Lebensfähigkeit sowohl der APC als auch der T-Zellen erschienen nicht beeinflusst, da die Antwort auf IL-2 nicht durch die Vorbehandlung mit Proteasen beeinflusst wurde (Figur 5 C).
Zitierte Literatur
1. Roep, B.O., S.D. Arden, S.D., De Vries, R.R.P. and Hutton, J.C. 1990. T-cell clones from a type-1 diabetes patient respond to insulin secretory granule proteins. Nature 345:632.
2. Schloot, N.C, Batstra, M., Duinkerken, G., De Vries, R.R.P., Dyrberg, T., Chaudhuri, A., Behan, P.O. and Roep, B.O. GAD65 reactive autoreactive T-cells in a non-diabetic Stiff-man syndrome patient. J. Autoimmun. 12, 289-296, 1999.
3. Hawkes, C.J., Schloot, N.C, Marks, J., Willemen, S.J.M., Drijfhout, J.W., Mayer, E.K., Christie, M.R. and Roep, B.O., 2000. T-cell lines reactive to an immunodominant epitope of the thyrosine phosphataselike autoantigen IA-2 in type 1 diabetes. Diabetes 49-356.
4. Douglas Petersen, L., Duinkerken, G., Bruining, G.J., van Lier, R., De Vries, R.R.P. and Roep, B.O., 1996. Increased numbers of in vivo activated T-cells in patients with recent onset diabetes mellitus. J. Autoimmun. 9:731.

Claims

Patentansprüche
1) Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym zur Prophylaxe und/oder Therapie von Diabetes mellitus Typ 1.
2) Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als proteolytisches Enzym Trypsin, Chymotrypsin, Bromelain oder Papain oder eine Kombination von mehreren dieser Enzyme verwendet wird.
3) Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich ein Flavonoylglycosid, vorzugsweise Rutosid, verwendet wird.
4) Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 — 3, dadurch gekennzeichnet, dass 20 — 100 mg Bromelain, 40 — 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit verwendet werden.
5) Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 — 4, dadurch gekennzeichnet, dass 90 mg Bromelain, 120 mg Papain, und 100 mg Rutosid pro Dosiseinheit verwendet werden.
6) Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 — 4, dadurch gekennzeichnet, dass 90 mg Bromelain, 48 mg Trypsin und 100 mg Rutosid pro Dosiseinheit verwendet werden.
7) Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 — 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Prophylaxe des Diabetes mellitus Typ 1 im Stadium des Prädiabetes erfolgt
PCT/EP2001/004346 2000-04-17 2001-04-17 Prophylaxe und therapie von diabetes mellitus 1 mit hilfe proteolytischer enzyme WO2001078765A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10018980.6 2000-04-17
DE10018980A DE10018980A1 (de) 2000-04-17 2000-04-17 Prophylaxe und Therapie von Diabetes mellitus I mit Hilfe proteolytischer Enzyme

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2001078765A2 true WO2001078765A2 (de) 2001-10-25
WO2001078765A3 WO2001078765A3 (de) 2002-04-11

Family

ID=7639036

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2001/004346 WO2001078765A2 (de) 2000-04-17 2001-04-17 Prophylaxe und therapie von diabetes mellitus 1 mit hilfe proteolytischer enzyme

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20020015698A1 (de)
DE (1) DE10018980A1 (de)
WO (1) WO2001078765A2 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040028675A1 (en) * 2001-12-07 2004-02-12 Zarlink Semiconductor Ab Compositions for the treatment of lupus
US20060101084A1 (en) * 2004-10-25 2006-05-11 International Business Machines Corporation Policy based data migration in a hierarchical data storage system

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996000082A1 (en) * 1994-06-24 1996-01-04 Cortecs Limited Medical use of bromelain
WO1997024138A2 (en) * 1995-12-29 1997-07-10 Cortecs (Uk) Limited Medical use of proteases
DE19726255A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Mucos Pharma Gmbh & Co Beeinflussung von Cytokinen durch proteolytische Enzyme
DE19847114A1 (de) * 1998-10-13 2000-04-20 Mucos Pharma Gmbh & Co Beeinflussung von hyperaktiven T-Zellen durch proteolytische Enzyme

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996000082A1 (en) * 1994-06-24 1996-01-04 Cortecs Limited Medical use of bromelain
WO1997024138A2 (en) * 1995-12-29 1997-07-10 Cortecs (Uk) Limited Medical use of proteases
DE19726255A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Mucos Pharma Gmbh & Co Beeinflussung von Cytokinen durch proteolytische Enzyme
DE19847114A1 (de) * 1998-10-13 2000-04-20 Mucos Pharma Gmbh & Co Beeinflussung von hyperaktiven T-Zellen durch proteolytische Enzyme

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TARGONI OLEG S ET AL: "Prevention of murine EAE by oral hydrolytic enzyme treatment." JOURNAL OF AUTOIMMUNITY, Bd. 12, Nr. 3, Mai 1999 (1999-05), Seiten 191-198, XP002181698 ISSN: 0896-8411 *
WIEST-LADENBURGER U ET AL: "Protease treatment delays diabetes onset in diabetes-prone nonobese diabetic (NOD) mice." INTERNATIONAL JOURNAL OF IMMUNOTHERAPY, Bd. 13, Nr. 3-4, 1997, Seiten 75-78, XP001031147 ISSN: 0255-9625 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001078765A3 (de) 2002-04-11
US20020015698A1 (en) 2002-02-07
DE10018980A1 (de) 2001-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Seeger et al. Synergistic interaction of macrophages and lymphocytes in antigen-induced transformation of lymphocytes
AT506095A1 (de) Verwendung von proteasen
Postlethwaite et al. Characterization of chemotactic activity produced in vivo by a cell-mediated immune reaction in the guinea pig
DE69634438T2 (de) Von humanem hitzeschockprotein 60 hergeleitete peptide zur behandlung von diabetis, entsprechende zusammensetzungen, verfahren und kits
Stone The genetic disease, hypoascorbemia: A fresh approach to an ancient disease and some of its medical implications
US5143903A (en) Method of treatment with tripeptide pharmaceutical compositions as immunomodulators
Wapshaw Pancreatic side-effects of morphine
Murray The search for insulin
Richards Jr et al. Effect of praziquantel on the eggs of Schistosoma mansoni, with a note on the implications for managing central nervous system schistosomiasis
Wrenshall et al. Initial changes in the blood sugar of the fasted anesthetized dog after alloxan
WO2001078765A2 (de) Prophylaxe und therapie von diabetes mellitus 1 mit hilfe proteolytischer enzyme
US6365192B1 (en) Bioactivating substance
Engwerda et al. An age-related decrease in rescue from T cell death following costimulation mediated by CD28
WO2001060385A1 (en) Novel use of polysaccharide from phellinus linteus for treating diabetes mellitus
DE19726255C2 (de) Beeinflussung von Cytokinen durch proteolytische Enzyme und Rutosid
Knight et al. Intensive immunosuppression in patients with disseminated sclerosis. III. Lymphocyte response in vitro.
Mosnaim et al. Plasma methionine enkephalin. Increased levels during a migraine episode
EP3842064A1 (de) Zusammensetzung zur behandlung oder prävention einer allergie oder einer allergischen reaktion
Herz On the effects of tannic acid on erythrocyte membrane acetylcholinesterase
Burch et al. The diagnosis and classification of menstrual disorders
Bonnyns et al. Lymphocytic thyroiditis and thyrotoxicosis
Cruchaud et al. The functions of human monocytes in normal subjects and in disorders associated with immune deficiency
KR102618074B1 (ko) 배암차즈기 추출물을 포함하는 스트레스 개선용 건강기능식품
US20220079999A1 (en) Antivenom compositions and uses thereof
Tewari et al. Prenatal ethanol studies on astrocytes

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

122 Ep: pct application non-entry in european phase