DE19726255C2 - Beeinflussung von Cytokinen durch proteolytische Enzyme und Rutosid - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beeinflus­ sung von Cytokinen durch proteolytische Enzyme und Rutosid sowie die Verwendung proteolytischer Enzyme zur Beeinflussung von Cytokinen.

Wichtige Stoffwechselstoffe bei der Auslösung diverser Krank­ heitszustände sind die Cytokine. Cytokine sind kleine Proteine mit Molekulargewichten von 8000 bis 30000, wobei jedes Cytokin eine eigene Aminosäuresequenz und Zelloberflächenrezeptoren auf­ weist. Sie werden von einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen hergestellt und wirken auf fast jedes Gewebe und Organsystem. Die Namen, die den verschiedenen Cytokinen gegeben wurden, fol­ gen keinem logischen System, sondern entsprechen vielmehr ihrer biologischen Eigenschaft. IL-1 und TNF (Tumornekrosefaktor) sind die primären proinflammatorischen Cytokine, und außerdem wirken diese zwei Cytokine in einer synergistischen Weise bei der In­ duktion von Entzündungen, Schock und Tod.

In den letzten 20 Jahren wurden auf Leukozyten des menschlichen Blutes mehr als 100 verschiedene Oberflächenmoleküle beschrie­ ben. Ihre Identifikation, Charakterisierung und Funktionsbe­ schreibung wurde insbesondere durch die Technik der Herstellung von monoklonalen Antikörpern beschleunigt. Definierte Oberflä­ chenmoleküle werden im allgemeinen in einer sog. CD-Nomenklatur ("cluster of differentiation") erfaßt.

Für einen Teil der Oberflächenmoleküle ist ihre Funktion bzw. ihr physiologischer Ligand bekannt. Für den Interleukin-2- Rezeptor (CD2S) z. B. ist das Interleukin-2 der natürliche Li­ gand. Auch andere Cytokine sind Liganden der Oberflächenmoleküle und werden daher von diesen beeinflußt.

Für verschiedene Oberflächenmoleküle von Leukozyten und En­ dothelzellen ist weiterhin beschrieben, daß sie durch Immunme­ diatoren in ihrer Antigendichte reguliert werden. So wird durch γ-Interferon die Expressionsdichte des Entzündungsmarkers HLA-DR auf Monozyten sowie des Adhäsionsmoleküls CD54 (ICAM-1) auf En­ dothelzellen gesteigert.

Bei bestimmten Infektionen oder Krebserkrankungen kommt es zu einer Verschiebung von in Homöostase befindlichen verschiedenen Subpopulationen von Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten. Normalerweise ist der Organismus in der Lage, im Prozeß einer Genesung die Verteilungsgleichgewichte der Subpopulationen wie­ der herzustellen.

Bei chronischen Erkrankungen, insbesondere bei Autoimmunerkran­ kungen und der damit verbundenen permanenten Belastung des Im­ munsystems (z. B. durch Immunkomplexe und im Zusammenhang mit chronisch persistierenden Virusinfektionen wie AIDS), kommt es im Verlauf der Erkrankung zu einer vom Organismus nicht mehr kompensierbaren Verschiebung sowohl der Gleichgewichte der Zell­ populationen als auch der Expressionsdichte einiger spezifischer Antigene. Allgemein spricht man hier von einer unkontrollierten Aktivierung des Immunsystems.

Nach dem bisherigen Kenntnisstand erhärtet sich die Annahme, daß die Modulation von Zelloberflächenmolekülen des Immunsystems ein besonderes Feld der "Medikation" darstellen könnte.

Der vorliegenden Erfindung lag daher daß technische Problem zu­ grunde, ein Verfahren zur Beeinflußung von Cytokinen anzugeben.

Diese Aufgabe wird durch die in Anspruch 1 angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Gemäß Anspruch 1 ist die Verwendung von mindestens einem proteo­ lytischen Enzym und Rutosid zur Beeinflußung von Cytokinen vor­ gesehen.

Die durch das bzw. die proteolytischen Enzyme modulierten Im­ munglobuline zeichnen sich dadurch aus, daß deren Bindungsfähig­ keit für die Komplementkomponente C1q erniedrigt ist. Dies gilt für natürliche C1q-bindende Immunglobuline (Subklassen IgG1, IgG2, IgG3, IgM und teilweise IgA).

Die geänderte C1q-Bindungsfähigkeit wird - ohne an eine Theorie gebunden zu sein - vermutlich durch eine Konformationsänderung der C_H2-Domäne aufgrund der Enzymeinwirkung verursacht. Dabei kann die Konformationsänderung entweder durch eine enyzmatisch verursachte Änderung unmittelbar in der C_H2-Domäne hervorgerufen werden, oder die proteolytischen Enzyme bewirken eine Struktu­ ränderung in den der C_H2-Domäne benachbarten Bereichen, und diese Änderungen beeinflussen die Konformation der C_H2-Domäne.

Die Behandlung von Neutrophilen mit proteolytischen Enzymen re­ duzierte deutlich die Expression z. B. des Rezeptors III für den Fc-Bereich von IgG und beeinflußt offenbar auch die Anzahl von Fcγ-R-II auf der Zelloberfläche. Es wird dabei die Bindung von IgG bedeckten Erytrozyten an Neutrophile verstärkt; ferner wird auch ihre Fähigkeit, IgG-vermittelte Funktionen, wie z. B. die antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität und Chemolumines­ zenz, die durch IgE induziert werden, verstärkt. Diese Reaktio­ nen sind komplett abhängig von Fcγ-R-II.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain, Papain und Rutosid verwendet oder eine Kombination derselben.

Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme lassen sich kostengünstig aus den folgenden Rohmaterialien isolieren.

Bromelain ist ein proteolytisch wirksames Enzym aus dem Preßsaft der Ananas und kann auch noch aus reifen Früchten isoliert wer­ den.

Papain ist ein proteolytisches Enzym, das aus dem Milchsaft der unreifen, fleischigen Früchte des Melonenbaums Carica Papaya ge­ wonnen wird. Reines Papain ist ein kristalines Polypeptid mit einem MG. von 23350, das aus einer Kette von 212 Aminosäurere­ sten mit 4 Disulfid-Brücken besteht; Sequenz und Raumstruktur sind bekannt. Papain wird vielfältig eingesetzt: Aufgrund seiner Protein-spaltenden Eigenschaft als "Fleischzartmacher" oder "Mürbesalz", zum Klären von Bier, zur Brot- und Hartkeksherstel­ lung, in der Lederzubereitung, in der Textil-Industrie zum Ent­ basten von Seide und zur Verhinderung von Wollverfilzung, in der Tabak-Industrie zur Qualitätsverbesserung, zur Rückgewinnung von Silber aus verbrauchtem photographischem Material, ferner in der Bakteriologie zur Pepton-Gewinnung. In der Medizin dient Papain bereits zur Unterstützung der enzymatischen Verdauung, zur en­ zymatischen Wundreinigung und als Zusatz zu Zahnprothese-Reini­ gungsmitteln. Für Spezialzwecke werden Papain-Präparate auch an Kunststoffpolymere oder Agarose trägergebunden angeboten. Papain ist auch als Katalysator zur Synthese von Oligopeptiden verwen­ det worden.

Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das ebenfalls im Pankreas gebildet wird und in Verbindung mit anderen Enzymen bereits the­ rapeutisch eingesetzt wird. Es gehört zu den Serin-Proteinasen. Kristallines Trypsin hat ein MG von ca. 23300, ist in Wasser, nicht aber in Alkohol löslich, besitzt ein Wirkungsoptimum bei pH 7-9 und spaltet Peptid-Ketten spezifisch Carboxy-seitig der basischen Aminosäurereste L-Lysin und L-Arginin. Die räumliche Struktur des aus 223 Aminosäuren bestehenden Trypsins ist be­ kannt.

Eine besonders gute Wirksamkeit zeigt sich bei der Verwendung einer Kombination der Enzyme Bromelain, Papain und/oder Trypsin. Neben der bemerkenswerten und unerwarteten Wirkung dieser Enzyme hat die kombinierte Verwendung der genannten Enzyme weiterhin den Vorteil, daß auch bei einer Langzeitanwendung keine schädi­ genden Nebenwirkungen auftreten.

Weiterhin ist zusätzlich Rutosid dem Medikament beigemischt. Ru­ tosid ist ein Glycosid, das zu den Flavonoiden gehört.

Eine besonders gute Wirksamkeit hat die kombinierte Verwendung von 20 bis 100 mg Bromelain, 40 bis 120 mg Papain und 10 bis 50 mg Trypsin pro Dosiseinheit.

Ganz besonders bevorzugt ist eine Kombination von 90 mg Brome­ lain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid × 3H₂O.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Kombina­ tion von 48 mg Trypsin, 90 mg Bromelain und 100 mg Rutosid × 3H₂O verwendet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden 10 bis 100 mg, besonders bevorzugt 100 mg Rutosid × 3H₂O pro Dosiseinheit verwendet.

Das Medikament kann weiterhin alle üblichen Hilfs- und/oder Trä­ gerstoffe enthalten.

Als Hilfs- und Trägerstoffe kommen z. B. Lactose, Magnesiumstea­ rat, Stearinsäure, Talkum, Methacrylsäure, Copolymerisat Typ A, Shellack, Makrogol 6000, Dibutylphthalat, Vanillin, Titandioxid, weißer Ton, Polyindon, gelbes Wachs und Carnaubawachs in Frage.

Die Erfindung betrifft ferner die zusätzliche Verwendung von α₂- Makroglobulin (α₂-M). α₂-M ist einer der wichtigsten Inhibitoren von Proteinasen. α₂-M reagiert mit einer Vielzahl von Endopepti­ dasen. Die Reaktion von α₂-M mit der jeweiligen Proteinase läuft in der Regel so ab, daß α₂-M einer Konformationsänderung unter­ liegt, nachdem es in Kontakt mit der Proteinase gekommen ist und diese daraufhin im Molekül festhält. Die Enzyminhibition beruht auf einer sterischen Behinderung, obwohl das aktive Zentrum des Enzyms seine Funktion behält. Durch die Beeinflussung der Pro­ teinase trägt α₂-M zu einer Immunmodulation durch Beeinflussung von Cytokinen bei.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein in vitro-Verfahren zur Be­ einflussung von Cytokinen, wobei die Cytokine mit einem oder meh­ reren proteolytischen Enzymen und Rutosid in Kontakt gebracht werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung im einzelnen erläu­ tern.

Beispiel 1 Material und Methoden 1. Material

Es wurde das Zellkulturmedium RPMI 1640 mit folgenden Zusätzen verwendet: NaHCO₃ Biochrom, 2 g/l); L-Glutamin (Biochrom, 2 mM), Na-Pyruvat (Biochrom, 1 mM), NaN₃ (Sigma, 0,01%).

Im Falle einer Stimulation der Zellen wurde entweder Phytohämag­ glutinin M (Biochrom, 5 µg/ml) oder γ-Interferon (100 U/ml) ein­ gesetzt. Die Stimulation der Zellen erfolgte dabei über 1-3 Tage mit Zusatz von 10% fötalem Kälberserum (Biochrom).

Als Targets für die zu untersuchenden Enzyme wurden frisch iso­ lierte, humane, periphere, mononukleäre Blutzellen (Citratblut) verwendet. Nach der üblichen Isolation mittels Ficoll wurden die Zellen mehrfach gewaschen und frisch bei den Experimenten einge­ setzt. Neutrophile Granulozyten wurden ebenfalls aus frischem Citratblut isoliert. Hierbei erfolgte die Abtrennung von den Lymphozyten/Monozyten mittels eines 2-Stufen-Ficoll-Gradienten.

2. Verwendete monoklonale Antikörper

Für die spezifische Erkennung der Oberflächenstrukturen der Leu­ kozyten wurden monoklonale Antikörper verwendet. Diese erkennen auf den entsprechenden Antigenen jeweils ein definiertes Epitop, welches bei den von uns untersuchten Antigenen nur ein einziges Mal in der Struktur vorkommt. In Übersicht 1 sind die untersuch­ ten Oberflächenmarker, die monoklonalen Antikörper sowie die analysierten Targetzellen dargestellt.

Übersicht 1: Analysierte Oberflächenmarker, verwendete monoklo­ nale Antikörper und Targetzellen der Enzymbehandlung

3. Inkubationsbedingungen

Die frisch isolierten und aufbereiteten Zellen wurden mit den En­ zymen Bromelain, Papain und Trypsin (Arzneimittel-Inhaltsstoffe der Fa. Mucos) mit den jeweils in den Legenden der Tabellen und Abbildungen angegebenen Konzentrationen inkubiert. Bei der Mi­ schung der drei Enzyme entsprach das Mischungsverhältnis 22,7 : 15,5 : 11,9 (Bromelain. Papain. Trypsin, bezogen auf 40 µg/ml, "BPT"). Es wurden drei Enzymkonzentrationen (40, 10, 2,5 µg/ml) untersucht. Die Inkubation fand in serumfreiem Medium bei 37°C statt.

Die Proteasen wurden unmittelbar vor den Inkubationen angesetzt. In den Zellkulturmedien war 0,01% Natriumacid enthalten. Durch diesen Zusatz werden die Zellen daran gehindert, während des In­ kubationsprozesses oder der Waschvorgänge Rezeptormoleküle erneut zu exprimieren. Nach dem Auswaschen des Zellkulturmediums sind die Zellen wieder aktivierbar (nicht demonstriert).

Nach entsprechender Inkubation der Zellen mit den jeweiligen En­ zymen, Auswaschen der Enzyme und der Markierung mit monoklonalen Antikörpern (nach Angaben der Hersteller) wurde sofort die Analy­ se der Oberflächenmarker vorgenommen.

4. Analytische Durchflußcytometrie

Alle Untersuchungen zur Modulation von Zelloberflächenmolekülen wurden mittels analytischer Durchflußcytometrie (FACSCAN, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) unter Verwendung einer gerätespezi­ fischen Software (Lysis I) durchgeführt. Bei entsprechender Ein­ stellung des Gerätes sowie der Mitführung von Referenzen, d. h. Zellen, die ohne Enzyme aber in derselben Prozedur behandelt wur­ den, erfolgte die Messung.

Für jede Subklasse der monoklonalen Antikörper wurde eine ent­ sprechende fluoreszenzkonjugierte Isotypenkontrolle mitgeführt. Hierbei handelt es sich um Maus-Immunglobulin, mit welchem die Kapazität der unspezifischen Bindung der Targetzellen flußcytome­ trisch erfaßt wird.

Pro Histogramm wurden 10000 Zellen gemessen. Die jeweilige Zell­ population wurde mit einem sogenannten "elektronischen Gate" se­ pariert, in dem sich dann mindestens 3500 Zellen befanden.

5. Darstellung der Ergebnisse

Die Auswertung und Analyse der Daten erfolgte unabhängig vom Meßvorgang auf dem Durchflußcytometer mittels einer gerätespezi­ fischen Software. Dabei wurden jeweils die Histogramme der Kon­ trollen, d. h. der unbehandelten Zellproben, mit den Histogram­ men der enzymbehandelten Zellen verglichen.

Die Rohdarstellung umfaßt ein optisch eindrucksvolles, aber re­ lativ unübersichtliches Histogramm, bei dem verschiedene Einzel­ messungen übereinander gelagert abgebildet sind. Hier läßt sich insbesondere die Wirkung der Enzyme im Vergleich zur Referenz optisch transparent machen. Für diese Untersuchungen ist nicht der prozentuale Anteil einer Subpopulation an der gesamten Leu­ kozytenpopulation die Meßgröße, sondern die relative Rezeptor­ dichte, die sich als Fluoreszenzintensität darstellt.

Aus diesen Histogrammen, die beispielhaft sind und illustrativen Charakter haben, lassen sich Daten ableiten, welche die relative Fluoreszenzintensität der Einzelmessung reflektieren. Diese ist ein Maß für die relative Rezeptor- oder Oberflächenmoleküldichte bei einer gemessenen Zellpopulation.

Die Säulengraphiken zeigen in logarithmischer Darstellung den Medien der relativen Fluoreszenz. Es läßt sich so gegenüber der Referenz die Reduktion der Dichte des jeweiligen Oberflächenmo­ leküls in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration darstellen.

In den Tabellen sind die Daten unabhängiger Experimente enthal­ ten. Die Nummern der Spender haben nur für die jeweilige Tabelle Gültigkeit und sind nicht auf andere Tabellen übertragbar. Wird in der Tabelle beispielsweise ein Wert von 40% angegeben, so bedeutet das, daß bei diesem Antigen 40% aller Oberflächenmole­ küle durch das Enzym so verändert ist, daß der spezifische mono­ klonale Antikörper sein Epitop nicht mehr erkennt. Wird keine Reduktion beobachtet, so erscheint in den Tabellen der Wert "0". Die angegebene Prozentzahl drückt somit die Enzymleistung gegen­ über den einzelnen Antigenen aus. Werte bis zu 20% werden im Einzelfall als nicht relevant angesehen.

Für eine Bewertung der Wirkung der Enzyme auf die einzelnen An­ tigene ist es günstig, einen geeigneten Vergleichsmaßstab zu wählen. Bis auf wenige Ausnahmen wurden alle Untersuchungen un­ ter standardisierten Inkubationsbedingungen durchgeführt. Damit kann für diese experimentellen Bedingungen die aus früheren For­ schungsberichten bekannte Halbeffektkonzentration angegeben wer­ den.

Zur Berechnung der Halbeffektkonzentration wurden die Daten mit­ tels nicht-linearer Regression ausgewertet. Der Median der Fluo­ reszenzintensität versus eingesetzter Enzymkonzentration und Re­ ferenz werden zueinander in Beziehung gesetzt, und daraus läßt sich die Menge an Enzym berechnen, die zu einer 50%igen Redukti­ on der relativen Fluoreszenzintensität bzw. der in der Struktur veränderten Rezeptordichte führt.

Abb. 1: CD2-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: Lym­ phozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zel­ len, die mit dem für CD2 spezifischen monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubations­ zeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 (vgl. Tab. 1) als Mittelwert von Doppelbestimmun­ gen und Standardabweichung.

Abb. 2: CD4 (Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; An­ gegeben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensität; Tar­ getzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind un­ behandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen, monoklona­ len Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbe­ handelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 2 (vgl. Tab. 2) als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.

Abb. 3: CD4 (Epitope OKT4 und Leu3a)-Modulation durch Tryp­ sin; Angegeben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensi­ tät; Targetzellen: Lymphozyten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zellen, die mit dem für CD4 spezifischen mono­ klonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wur­ den. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Darge­ stellt sind die Daten von einem Spender (vgl. Tab. 3) als Mittel­ wert von Doppelbestimmungen und Standardabweichung.

Abb. 4: CD25-Modulation durch Proteasen; Angegeben ist der Median der relativen Fluoreszenzintensität; Targetzellen: PHA- Blasten. Die Positivkontrolle (Referenz) sind unbehandelte Zel­ len, die mit dem für CD25 spezifischen, monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Die Negativkontrolle sind unbehandelte Zellen, die mit dem Antikörper-Isotyp inkubiert wurden. Die Inkubations­ zeit mit den Enzymen betrug 60 min. Dargestellt sind die Daten von Spender 1 als Mittelwert von Doppelbestimmungen und Stan­ dardabweichung.

Abb. 5: Reduktion der Leu3a-Antigendichte durch Trypsin. Frisch isolierte humane periphere, mononukleäre Blutzellen wur­ den mit Trypsin im serumfreien Medium inkubiert, anschließend gewaschen und mit dem monoklonalen Antikörper anti-Leu3a mar­ kiert. Die Reduktion der relativen Fluoreszenzdichte von CD4 der Lymphozytenpopulation ist das Maß der Enzymaktivität. Die Hal­ beffektkonzentration von Trypsin gegenüber dem Epitop Leu3a von CD4 wird über die gefittete Kurve berechnet.

Ergebnisse

Tabelle 1: CD2-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lympho­ zyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von drei Experimenten mit Zellen von drei ver­ schiedenen Spendern dargestellt.

Tabelle 2: CD4(Epitop Leu3a)-Modulation durch Proteasen; Tar­ getzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen be­ trug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimenten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt.

Tabelle 3: Modulation der CD4-Epitope Leu3a und OKT4 durch Trypsin; Targetzellen: Lymphozyten. Angegeben ist die prozen­ tuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensi­ tät, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den Enzymen betrug 60 min. Es sind die Daten von einem Spender dargestellt.

Tabelle 4: CD25-Modulation durch Proteasen; Targetzellen: Lym­ phozyten, Monozyten, NK-Zellen. Angegeben ist die prozentuale Reduktion des Medians der relativen Fluoreszenzintensität, die ein Maß der Enzymleistung ist. Die Inkubationszeit mit den En­ zymen betrug 60 min. Es sind die Ergebnisse von zwei Experimen­ ten mit Zellen von zwei verschiedenen Spendern dargestellt. Vor dem Experiment wurden die Zellen 3 Tage mitogenstimuliert.

Tabelle 5: Berechnete Halbeffektkonzentration (µg/ml) von Brome­ lain, Papain, Trypsin und deren Kombination für die 50%ige Re­ duktion der Dichte von zellulären Oberflächenmolekülen. Die Enzyminkubation betrug 1 Stunde.

Claims (6)

1. Verwendung von mindestens einem proteolytischen Enzym zur Beeinflussung von Cytokinen, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Rutosid verwendet wird.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als proteolytisches Enzym Trypsin, Bromelain oder Papain oder eine Kombination von mehreren dieser Enzyme verwendet wird.

3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 120 mg Papain und 100 mg Rutosid × 3H₂O pro Dosiseinheit verwendet werden.

4. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß 90 mg Bromelain, 48 mg Trypsin und 100 mg Rutosid × 3H₂O pro Dosiseinheit verwendet werden.

5. Verwendung nach einem oder mehreren der vorstehend genannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich α₂-Makroglobulin verwendet wird.

6. in vitro-Verfahren zur Beeinflussung von Cytokinen, wobei die Cytokine mit einem oder mehreren proteolytischen Enzymen in Kontakt gebracht werden, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Rutosid verwendet wird.