DE69825440T2

DE69825440T2 - VERWENDUNG VON TAUROLIDINE ZUR Herstellung eines Arzneimittels zur BEHANDLUNG VON LEUKÄMIEN

Info

Publication number: DE69825440T2
Application number: DE69825440T
Authority: DE
Inventors: H. James MORRISSEY; Anne Hamik
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 1997-05-22
Filing date: 1998-05-22
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2018-05-23
Also published as: AU7590698A; CA2290537C; US6303596B1; ATE272404T1; CA2290537A1; DE69825440D1; AU734460B2; EP0983069A1; EP0983069B1; WO1998052572A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft die selektive Induktion des Zelltods durch Apoptose und die Anwendbarkeit für die Behandlung von Leukämien.
QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der früher eingereichten, gleichzeitig anhängigen "U.S. Provisional Application" Nr. 60/047,642, welche am 22. Mai 1997 eingereicht worden ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Zelltod erfolgt durch einen von zwei Mechanismen: Nekrose oder Apoptose. Bei der Nekrose lysieren die Zellen und es werden Komponenten des Zytosols freigesetzt. Die freigesetzten Komponenten des Zytosols rufen schwere Entzündungsreaktionen hervor. Die Apoptose führt nicht zu der Freisetzung von Inhaltsstoffen des Zytosols, da die Zellmembran intakt bleibt, auch wenn deren Oberflächeneigenschaften sich möglicherweise verändern. Die Apoptose kann das Aufbrechen von Zellen zu apoptotischen Körpern, kugelförmigen Stücken von Zellen, bei denen die Membran nach wie vor die Freisetzung von Inhaltsstoffen des Zytosols verhindert, mit umfassen. Apoptotische Zellen und apoptotische Körper werden im Körper durch phagozytäre Zellen entfernt, von denen angenommen wird, dass sie die Notwendigkeit, solche Zellen zu entfernen, durch die Veränderungen in der äußeren blattförmigen Struktur der Membran, wobei Phosphatidylserin exponiert wird, erkennen. Die Apoptose ruft typischerweise keine Entzündungsreaktionen auf die Weise, wie eine Nekrose es tut, hervor, da in dem erstgenannten Falle die Zellen durch Phagozytose entfernt werden, bevor der Inhalt des Zytosols freigesetzt wird.
Obwohl Zellen, die eine Apoptose in vitro durchlaufen, anfänglich intakte Zellmembranen haben, können Zellen in fortgeschrittenen Stadien der Apoptose einen Verlust von Membranintegrität zeigen. Dieser Prozess wird manchmal als "sekundäre Nekrose" bezeichnet. Er kann beobachtet werden aufgrund der Abwesenheit von phagozytären Zellen, die in vivo die apoptotischen Zellen und Zellfragmente entfernt haben würden, bevor sie nekrotisch werden konnten.
Wenn neoplastische (Tumor-) Zellen im Körper vorhanden sind, ist es wünschenswert, den Tod von solchen Zellen zu verursachen, ohne den Tod der normalen Zellen, die der Patient benötigt, um sein Leben aufrecht zu erhalten, zu verursachen. Es ist wünschenswert, den Tod von neoplastischen Zellen durch Induktion von Apoptose zu verursachen, so dass die Inhaltsstoffe des Zytosols der neoplastischen Zellen nicht freigesetzt werden.
Es ist über antineoplastische Arzneimittel berichtet worden, die Tumorzellen durch Induktion von Apoptose töten. Obwohl einige dieser Arzneimittel erfolgreich gewesen sind, einige Krebsarten zu behandeln, ist auch bekannt geworden, dass die Arzneimittel schwere Nebenwirkungen, wie Zytotoxizität gegenüber normalen Zellen durch störendes Eingreifen in grundlegende zelluläre Funktionen, wie Proteinsynthese oder DNA-Replikation, induzieren. Es ist über einige Induktionsmittel von Apoptose bei Monozyten berichtet worden. Monozyten des menschlichen Bluts können beispielsweise eine Apoptose durchlaufen, wenn sie in Abwesenheit von Serum oder stimulierenden Faktoren (was in vivo unmöglich erreicht werden kann) kultiviert werden. Mangan et al., "Lipopolysaccharide, tumor necrosis factor-α, and IL-1β prevent programmed cell death (apoptosis) in human peripheral blood monocytes", J. Immunol. 146:1541 (1991). Dieser Prozess benötigt zwei bis drei Tage, damit ungefähr 50% der Monozyten apoptotisch werden (Mangan et al., "IL-4 enhances programmed cell death (apoptosis) in stimulated human monocytes", J. Immunol. 148:1812 (1992)) und die Apoptose kann durch Lipopolysaccharid (LPS), Interleukin (IL) -1 und den Tumornekrosefaktor α (TNFα) aufgeschoben werden. Zusätzlich kann das entzündungshemmend wirkende Zytokin IL-4 die Apoptose bei LPS-stimulierten Monozyten verstärken. Mangan, D.F., und Wahl, S.M., "Differential regulation of human monocyte programmed cell death (apoptosis) by chemotactic factors and pro-inflammatory cytokines", J. Immunol. 147:3408-3412 (1991). Apoptose ist auch bei mehreren unterschiedlichen Zellarten durch die Verwendung einer Anzahl von Zytokinen induziert worden. Jedoch hat die potentielle Verwendung von Zytokinen für die Behandlung von Krebs in vivo Rückschläge erlitten, da darüber berichtet worden ist, dass sie verschiedene schädliche Wirkungen, einschließlich Schock, Kreislaufkollaps und Tod, verursachen. Zusätzlich ist die
Herstellung von Zytokinen bis heute schwierig und teuer gewesen, da die Technik der in vitro-DNA-Rekombination für die Herstellung von Proteinen im großen Maßstab kein billiges Geschäft ist.
Was zu der komplizierten Natur der Leukämiebehandlung weiter beiträgt, ist die Tatsache, dass es viele unterschiedliche Arten von Leukämie gibt. Betrachtet man das Schema der Hämatopoiese teilen sich pluripotente Stammzellen unter Bildung von entweder lymphoiden Stammzellen oder myeloischen Stammzellen. Lymphozyten werden ausgehend von lymphoiden Stammzellen produziert, während Monozyten und Granulozyten, wie Neutrophile, Eosinophile und Basophile, ausgehend von myeloischen Stammzellen produziert werden. Myeloische Stammzellen erzeugen auch Erythrozyten und Megakaryozyten. Verschiedene Leukämien, die aus diesen differenzierten Zellen resultieren, umfassen Lymphozyten-Leukämie, Monozyten-Leukämie und myeloische Leukämie. Behandlungsmethodiken und Prognose sind abhängig von der speziellen Art der Leukämie unterschiedlich.
Myeloische und Monozyten-Leukämien sind besonders schwierig zu behandeln. Gegenwärtige Behandlungsmethoden haben Linderung und keine Heilung erreicht. Es wird beispielsweise allgemein angenommen, dass bei Patienten mit einer Monozyten-Leukämie eine niedrige Heilungsrate von weniger als zehn Prozent besteht. Es ist unmöglich, eine wirkliche Remission zu erzielen, da der Ph-positive Klon im Knochenmark weiter vorhanden ist, und intensive chemotherapeutische Behandlungen, welche dazu ausgelegt sind, den Klon zu eliminieren oder zu verringern, haben nur mäßige Verbesserungen bei der Überlebensdauer dieser Patienten bewirkt. Die gegenwärtige Chemotherapie ist dazu ausgelegt, den Patienten für lange Zeitspannen symptomlos zu halten, indem die Gesamtanzahl von weißen Blutkörperchen innerhalb eines akzeptablen Bereichs gehalten wird.
Es ist dementsprechend wünschenswert, ein neues Mittel zu finden, das selektiv die Apoptose von Monozyten-, myeloischen und Leukämie-Zellen bewirken kann, ohne schwere Nebenwirkungen, die die Verabreichung von traditionellen chemotherapeutischen Mitteln begleiten, zu verursachen. Es ist jetzt herausgefunden worden, dass eine bekannte Zusammensetzung, Taurolidin, für die Induktion von Apoptose in Monozyten- und myeloischen Zellen verwendet werden kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Graph, welcher die Expression von Gewebefaktor (TF) durch Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierte mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) und die Zelllinie Mono Mac 6 (MM6) zeigt. PMBC wurden in einer Konzentration von 1,5 × 10⁷ Zellen/ml (leere Quadrate) oder 5,6 × 10⁵ Zellen/ml (ausgefüllte Quadrate) in AIM-V, ergänzt mit 0,01% Rinderkälberserum (AIM-V+0,01% BCS), kultiviert. Nach Behandlung mit 10 ng/ml LPS wurden zu den angegebenen Zeitpunkten Proben für einen ELISA gesammelt. Die Daten (Mittelwert + Standardabweichung aus Proben, welche vierfach bestimmt wurden) stammen aus einem repräsentativen Experiment. In diesem Experiment exprimierten nicht-induzierte MM6-Zellen 160 pg TF pro 1 × 10⁶ Zellen, während induzierte PBMC weniger als 1 pg TF pro 1 × 10⁶ Zellen exprimierten.
2A und 2B sind Graphen, die die Taurolidin-Hemmung der LPS-induzierten TF-Expression durch Monozytenzellen, wie durch Assayprozeduren bestimmt, zeigen. 2A repräsentiert MM6-Zellen; 2B repräsentiert PBMC. Die Zellen wurden mit LPS (gestrichelte Balken: 100 ng/ml LPS in RPMI, ergänzt mit 10% BCS (RPMI+10% BCS); ausgefüllte Balken: 10 ng/ml in AIM-V+0,01% BCS) in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von Taurolidin oder mit einer Vehikel-Verdünnung äquivalent zu jener, die Zellen erfahren, welche 100 μg/ml Taurolidin erhielten, induziert. Nach vier Stunden wurden die Zellen gesammelt und Lysate für einen TF-ELISA hergestellt. Die Daten sind als Prozent des TF-Antigens, gemessen in mit LPS allein (kein Taurolidin oder Vehikel) behandelten Zellen, ausgedrückt. Die Experimente wurden mit doppelt erstellten Proben ausgeführt und wurden wenigstens dreimal wiederholt. Die gezeigten Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von allen Experimenten.
3A und 3B sind Graphen, die die Taurolidin-Inhibition der LPS-induzierten Expression von Gewebenekrosefaktor α (TNFα) durch Monozyten-Zellen, wie durch Assayverfahren bestimmt, zeigen. 3A repräsentiert MM6-Zellen; 3B repräsentiert PBMC. Die Zellen wurden mit LPS (gestrichelte Balken: 100 ng/ml LPS in RPMI+10% BCS; ausgefüllte Balken: 10 ng/ml in AIM-V+0,01% BCS) in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von Taurolidin induziert. Nach vier Stunden wurden die Zellüberstände für einen TNFα-ELISA gesammelt. Die Daten sind als Prozent der TNFα-Konzentrationen, gemessen in mit LPS allein (kein Taurolidin oder Vehikel) be handelten Zellkulturen, ausgedrückt. Die Experimente wurden mit doppelt erstellten Proben ausgeführt und wurden wenigstens dreimal wiederholt. Die in 3A gezeigten Werte stammen aus einem repräsentativen Experiment. Die in 3B gezeigten Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Experimenten.
4A und 4B sind Graphen, welche die Zelllebensfähigkeit und Vermehrungsraten nach einer Taurolidin-Behandlung, wie durch Assayverfahren bestimmt, zeigen. MM6-Zellen wurden mit Taurolidin behandelt, wie in 3 beschrieben. Nachdem Aliquots für den Lactatdehydrogenase (LDH)-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur mittels "Hank's balanced salt solution" (HBSS) gespült und in RPMI+10%BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen von Trypanblau-negativen Zellen, welche in 4A aufgeführt sind, und die gesamte Zellzahl, welche in 4B aufgeführt ist, wurden danach täglich aufgezeichnet (wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung erfolgte). Die Bedingungen waren keine Behandlung (leere Quadrate); 50 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Quadrate); 25 μg/ml Taurolidin (leere Kreise); und Vehikel allein (ausgefüllte Kreise). Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von 6 × 10⁵ Zellen/ml erreicht hatten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Experimenten.
5A und 5B zeigen Zelllebensfähigkeit und Vermehrungsraten für die MM6-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative Zellen bzw. als % der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01% BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt. Nachdem Aliquots für den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur mittels HBSS gespült und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen von Trypanblau-negativen Zellen (5A) und die gesamte Zellzahl (5B) wurden danach täglich aufgezeichnet (wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise); 25 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Kreise); 50 μg/ml Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Quadrate); und Träger allein (ausgefüllte Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen ausgedrückt. Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (5B). Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von 6 × 10⁵ Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Experimenten.
6A und 6B zeigen Zelllebensfähigkeit und Vermehrungsraten für die K562-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative Zellen bzw. als % der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01% BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt. Nachdem Aliquots für den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur mittels HBSS gespült und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen von Trypanblau-negativen Zellen (6A) und die gesamte Zellzahl (6B) wurden danach täglich aufgezeichnet (wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise); 25 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Kreise); 50 μg/ml Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Quadrate); und Träger allein (ausgefüllte Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen ausgedrückt. Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (6B). Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von 6 × 10⁵ Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Experimenten.
7A und 7B zeigen Zelllebensfähigkeit und Vermehrungsraten für die HL-60-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative Zellen bzw. als % der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01% BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt. Nachdem Aliquots für den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur mittels HBSS gespült und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen von Trypanblau-negativen Zellen (7A) und die gesamte Zellzahl (7B) wurden danach täglich aufgezeichnet (wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise); 25 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Kreise); 50 μg/ml Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Quadrate); und Träger allein (ausgefüllte Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen ausgedrückt. Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (7B). Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von 6 × 10⁵ Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Experimenten.
8A und 8B zeigen Zelllebensfähigkeit und Vermehrungsraten für die REH-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative Zellen bzw. als % der Zellzahl. Zellen wurden 4 hin AIM-V + 0,01% BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt. Nachdem Aliquots für den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur mittels HBSS gespült und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen von Trypanblau-negativen Zellen (8A) und die gesamte Zellzahl (8B) wurden danach täglich aufgezeichnet (wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise); 25 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Kreise); 50 μg/ml Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Quadrate); und Träger allein (ausgefüllte Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen ausgedrückt. Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (8B). Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von 6 × 10⁵ Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Experimenten.
9A und 9B zeigen Zelllebensfähigkeit und Vermehrungsraten für die Jurkat-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative Zellen bzw. als % der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01% BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt. Nachdem Aliquots für den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur mittels HBSS gespült und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen von Trypanblau-negativen Zellen (9A) und die gesamte Zellzahl (9B) wurden danach täglich aufgezeichnet (wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise); 25 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Kreise); 50 μg/ml Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Quadrate); und Träger allein (ausgefüllte Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen ausgedrückt. Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (9B). Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von 6 × 10⁵ Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Experimenten.
10A und 10B zeigen Zelllebensfähigkeit und Vermehrungsraten für die ECV304-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative Zellen bzw. als der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01% BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt. Nachdem Aliquots für den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur mittels HBSS gespült und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen von Trypanblau-negativen Zellen (10A) und die gesamte Zellzahl (10B) wurden danach täglich aufgezeichnet (wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise); 25 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Kreise); 50 μg/ml Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Quadrate); und Träger allein (ausgefüllte Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen ausgedrückt. Diese Werfe befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (10B). Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von 6 × 10⁵ Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Experimenten.
11A und 11B zeigen Zelllebensfähigkeit und Vermehrungsraten für die GM5387-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative Zellen bzw. als der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01% BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt. Nachdem Aliquots für den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur mittels HBSS gespült und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen von Trypanblau-negativen Zellen (11A) und die gesamte Zellzahl (11B) wurden danach täglich aufgezeichnet (wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise); 25 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Kreise); 50 μg/ml Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml Taurolidin (ausgefüllte Quadrate); und Träger allein (ausgefüllte Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen ausgedrückt. Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (11B). Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von 6 × 10 Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von drei Experimenten.
12A, 12B, 12C und 12D sind durchflusszytometrische Analysen, welche Veränderungen bei der Zellmorphologie nach einer Taurolidin-Behandlung zeigen. MM6 und PBMC wurden drei Stunden mit Taurolidin behandelt und dann wurden behandelte und unbehandelte Kontrollzellen für die Durchflusszytometrie weiterverarbeitet. Monozyten wurden in PBMC-Proben durch Anfärbung mit FITC-konjugiertem anti-CD14 und Lymphozyten durch FITC-konjugierten anti-CD3 und PE-konjugierten anti-CD19 identifiziert. 12A repräsentiert unbehandelte MM6-Zellen; 12B repräsentiert MM6-Zellen, die mit 50 μg/ml Taurolidin behandelt worden sind; 12C repräsentiert unbehandelte PBMC; und 12D repräsentiert PBMC, welche mit 75 μg/ml Taurolidin behandelt worden sind. M = Monozyten; L = Lymphozyten.
13 ist ein Agarosegel, welches die DNA-Fragmentierung in Reaktion auf eine Taurolidin-Behandlung, wie durch Assayverfahren bestimmt, zeigt. MM6-Zellen wurden mit Taurolidin oder Vehikel in RPMI+10% BCS vier Stunden inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und die DNA mit niedrigem Molekulargewicht extrahiert, wie nachfolgend beschrieben. C = Kontrollzellen ohne Taurolidin- oder Vehikel-Behandlung; T = behandelt mit 50 μg/ml Taurolidin; V = behandelt mit Vehikel allein; und MW = Molekulargewichtsmarker.
14A und 14B sind terminale Desoxytransferase-vermittelte Desoxyuridintriphosphat-Biotin-Nick-Endmarkierungsassay (TUNEL)-Analysen von Kontrollzellen bzw. Taurolidin-behandelten PBMC. Zellen wurden mit 100 μg/ml Taurolidin sechs Stunden inkubiert und für die TUNEL-Analyse weiterverarbeitet, wie nachfolgend angegeben. Parallele Proben wurden mit FITC-konjugiertem anti-CD14 und Propidiumiodid (PI), wie nachfolgend beschrieben, angefärbt. Pro Probe wurden zehntausend Ereignisse aufgezeichnet. Das TUNEL-Signal (x-Achse) ist ein Maß für die DNA-Fragmentierung, wobei FSC (y-Achse) sich auf die Zellgröße bezieht. TUNEL-negative Lymphozyten werden durch das Rechteck R1 eingeschlossen, während TUNEL-negative Monozyten (CD14-positive Zellen) durch das Rechteck R2 eingeschlossen werden. Die vertikale Linie gibt die Abgrenzung zwischen TUNEL-negativen und TUNEL-positiven Zellen an. In den sechs Stunden-Proben gab es nur minimale Anzahlen von PI-positiven Zellen (siehe Tabelle IV).
15A, 15B und 15C zeigen eine TUNEL-Analyse von mit Taurolidin in Vollblut behandelten PBMC, für Kontrollzellen, Taurolidin-behandelte Zellen bzw. Anisomycinbehandelte Zellen. Die Zellen wurden mit 500 μg/ml Taurolidin 4 h inkubiert, in frischem Medium resuspendiert, zwei Stunden weiter inkubiert und für die TUNEL-Analyse weiterverarbeitet. Parallele Proben wurden mit FITC-konjugiertem anti-CD14 und PI angefärbt, wie hier beschrieben. Es wurden zehntausend Ereignisse pro Probe aufgezeichnet. Das TUNEL-Signal (x-Achse) ist ein Maß für die DNA-Fragmentierung, wobei FSC (y-Achse) sich auf die Zellgröße bezieht. TUNEL-negative Lymphozyten werden durch das Rechteck R1 eingeschlossen, während TUNEL-negative Monozyten (CD14-positive Zellen) durch das Rechteck R2 eingeschlossen werden. R3 schließt die TUNEL-positive Population von Zellen ein. Es gab minimale Anzahlen von PI-positiven Zellen in den 6 Stunden-Proben (siehe Tabelle VI).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Taurolidin (Taurolin; Tauroline; 4,4'-Methylenbis(perhydro-1,2,4-thiadiazin-1,1-dioxid) wird zum ersten Mal für eine Verwendung für die Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Patienten, welche an Monozyten- und/oder myeloischen Leukämien leiden, offenbart. Taurolidin wird durch Injektion in Lösung (intravenös oder intraperitoneal) an betroffene Patienten in einer Menge, welche wirksam ist, um Apoptose von Monozyten- und/oder myeloischen Zellen zu bewirken, verabreicht. Dementsprechend werden die an der Monozyten- oder myeloischen Leukämie-Erkrankung beteiligten Zellen angegriffen und sterben via Apoptose.
Es ist über Taurolidin als ein nützliches Mittel für andere Anwendungen berichtet worden und dementsprechend stehen in vitro- und klinische Daten bezüglich dessen physiologischen Wirkungen zur Verfügung, auch wenn es keine früheren Berichte über dessen Verwendung als ein Apoptose-Induktionsmittel bei Monozyten, Granulozyten oder Leukämie-Zellen gibt. Nach einer zweistündigen Behandlung mit 5 mg/ml Taurolidin wurde über keine toxischen Wirkungen auf Epithelzellen berichtet (Gorman et al., "Reduced adherence of microorganisms to human mucosal epithelial cells following treatment with taurolin, a novel antimicrobial agent", J. Appl. Bacteriol. 62:315 (1987)) und frühere Untersuchungen an Monozyten berichteten, dass Taurolidin offensichtlich nicht-toxisch ist, da es keine Zunahme der LDH-Freisetzung durch Zellen nach einer 24-stündigen Taurolidin-Behandlung gab. Bedrosian et al., "Taurolidine, an analogue of the amino acid taurine, suppresses interleukin 1 and tumor necrosis factor synthesis in human peripheral blood mononuclear cells", Cytokine 3:568 (1991); Dofferhoff et al., "The release of endotoxin from antibiotic-treated Escherichia coli and the production of tumour necrosis factor by human monocytes", J. Antimicrob. Chemother. 31:373 (1991).
In früheren Berichten über andere Anwendungen von Taurolidin, wie für ein Mittel zur Behandlung von Septikämie, reichen die bei einer klinischen Verwendung erzielten Plasmakonzentrationen von Taurolidin (oder von dessen anfänglichem Metaboliten) von 20 bis 100 μg/ml bei septischen Patienten oder normalen Freiwilligen. Browne, M.K., "Pharmacological and clinical studies with taurolin". In Taurolin, Ein Neues Konzept zur Antimikrobiellen Chemotherapie Chirurgischer Infektionen, Brückner, W.L., und Pfirrmann, R.W. (Hrsg.), München-Wien-Baltimore, Urban & Schwarzenberg, S. 3, 1985; Nitsche et al., "Investigations of endotoxin inactivation in plasma. Preliminary results of a controlled randomized study on taurolidine as a supplementary therapeutic agent in septicemia". In Emergency Surgery Trends, Techniques, Results. Proceedings of the 7^th International Congress of Emergency Surgery, Schweiberer, L., und Eitel, F. (Hrsg.), München, Zuckschwerdt, S. 185, 1985). Die Taurolidin-Behandlung bei Menschen ist nicht mit Toxizität in Zusammenhang gebracht worden, sogar wenn septische Patienten bis zu 20 Gramm für 2-5 aufeinanderfolgende Tage erhielten. Willatts et al., "Effect of the antiendotoxic agent, taurolidine, in the treatment of sepsis syndrome: a placebocontrolled double-blind trial", Crit. Care Med. 23:1033 (1995); Johnston et al., "Taurolin for the prevention of parenteral nutrition related infection: antimicrobial activity and longterm use", Clin. Nutrition 12:365 (1993).
Es ist festgestellt worden, dass Konzentrationen von Taurolidin im Bereich von 50 bis 100 μg/ml innerhalb von sechs Stunden eine Apoptose bei 75% der Monozyten des peripheren Bluts, welche in Kulturmedium inkubiert wurden, induzierte. Ferner induzierten 100 μg/ml Taurolidin innerhalb von sechs Stunden eine Apoptose bei 92% der Granulozyten, die in Kulturmedium inkubiert wurden. Bevorzugte therapeutische Dosierungen für eine Behandlung von Leukämien sind ungefähr 10 bis ungefähr 500 mg/kg Körper gewicht. Am meisten bevorzugt ist eine Dosis, die zu einer Konzentration von 200 μg/ml im Plasma führt, was typischerweise ungefähr 150 mg/kg Körpergewicht ist.
Taurolidin kann intravenös oder intraperitoneal verabreicht werden. Für eine Behandlung der verschiedenen Leukämien wird eine wirksame Menge von Taurolidin, um eine Apoptose der betroffenen Zellen zu bewirken, verwendet und kann durch periodisch ausgeführte Tests an Proben des Bluts des Patienten überwacht werden, bei welchen Zellen hinsichtlich Anzeichen für eine Apoptose unter Verwendung einer beliebigen Technik, wie einer TUNEL-Analyse, DNA-Fragmentierung oder mit anderen geeigneten Apoptose-Markern, beobachtet werden können.
In unseren Untersuchungen wurde Taurolidin in Form einer 2 %-igen (Gew./Vol.) Lösung in einem Vehikel, welches 2% Dextrose und 5% Polyvinylpyrrolidin enthielt, verwendet. Eine Lösung, welche aus dem Vehikel allein bestand, wurde von Wallace Laboratories (Cranbury, NJ) für die Herstellung einer Vehikel-Kontrolle erhalten. Reagenzien und Materialien wurden erhalten, wie folgt: Histopaque, Propidiumiodid (PI), Lactatdehydrogenase (LDH)-Kit, Thromboplastin aus Kaninchenhirn, Anisomycin und Dimethylsulfoxid (DMSO) von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO); 6% Dextran 70 in 0,9% NaCl (6% Dextran) von McGaw, Inc. (Irvine, CA); RPMI, "Eagle's minimum essential medium" (MEM) und "Hank's balanced salt solution" (HBSS) von Mediatech, Inc. (Hendon, VA); Medium M199 von BioWhittaker, Inc. (Walkersville, MD); Rinderkälberserum (BCS) von HyClone Laboratories, Inc. (Logan, UT); 25% humanes Serumalbumin (HSA) von den American Red Cross Blood Services (Washington, D.C.); AIM-V-Medium von Gibco BRL (Grand Island, NY); LPS (E. coli 0111:B4) und Rinderserumalbumin (Fettsäurenfrei) von Calbiochem Corp. (La Jolla, CA); FITC-konjugierte anti-CD14-Antikörper, FITC-konjugierter anti-CD3/PE-konjugierter anti-CD19-Simultest und PE-konjugierter anti-CD16 von Becton Dickinson (Parsippany, NJ); und das TUNEL-Assaysystem (In Situ Cell Death Detection Kit) von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN).
Zahlreiche Zelllinien sind untersucht worden und sind in Tabelle I aufgelistet. MM6-Zellen, welche von dem peripheren Blut eines Patienten mit akuter Monoblastenleukämie (M5) abgeleitet worden sind, waren ein großzügiges Geschenk von Dr. H. Ziegler Heitbrock. Die K562-Zelllinie, welche aus Zellen aus der Flüssigkeit im Pleuraraum eines Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie im Blastenschub entwickelt wor den ist, wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) erhalten. K562-Zelllen können induziert werden, so dass sie zu Vorstufen der Monozyten-, Granulozyten- und Erythrozyten-Reihe differenzieren. NL-60-Zellen, welche ausgehend von Leukozyten des peripheren Bluts eines Patienten mit akuter Promyelozytenleukämie entwickelt worden sind, wurden von der ATCC erhalten. HL-60-Zellen präsentieren Oberflächenrezeptoren und reagieren mit zytochemischen Anfärbereagenzien, weiche für Granulozytenzellen spezifisch sind. REH-Zellen, welche von Zellen von einer akuten Lymphoblastenleukämie abstammen, wurden von der ATCC erhalten. REH-Zellen haben einen nicht-T,nicht-B-Phänotyp. Jurkat ist eine humane leukämische T-Zelllinie, welche von der ATCC erhältlich ist. ECV304, eine spontan transformierte unsterbliche Endothelzelllinie, welche aus menschlicher Nabelschnur abgeleitet worden ist, wurde von der ATCC erhalten. Die humane Fibroblastenzelllinie GM5387, welche aus Gewebe, welches durch eine fötale Lungenbiopsie erhalten worden ist, abgeleitet worden ist, wurde von dem NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository erhalten.
Tabelle 1. Getestete Zelllinien
Alle Zellen wurden in einer 5% CO₂ enthaltenden Atmosphäre bei 37°C kultiviert. MM6-Zellen wurden in RMPI, ergänzt mit 10% BCS, 2 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamycin (RPMI + 10% BCS) kultiviert. In einigen Experimenten wurden MM6-Zellen einmal mit HBSS ohne Ca⁺⁺ oder Mg⁺⁺ und einmal mit AIM-V gespült, bevor sie schließlich in AIM-V, ergänzt mit 0,01% BCS (AIM-V + 0,01% BCS) resuspendiert wurden. Es ist gezeigt worden, dass AIM-V die Langzeitkultur von Makrophagen unterstützt (Helsinki et al., "Long-term cultivation of functional human macrophages in teflon dishes with serum-free media", J. Leuk. Biol. 44:111 (1988)) und in den vorliegenden Experimenten behielten in AIM-V kultivierte MM6-Zellen wenigstens zehn Tage lang hohe Lebensfähigkeit und zeigten Vermehrungsraten, die nur geringfügig langsamer waren als bei Zellen, die in mit 10% BCS ergänztem RPMI kultiviert wurden. AIM-V wurde mit einer geringen Menge BCS (0,01%) ergänzt, um eine Quelle für LPS-bindendes Protein, welches die Reaktion von Monozytenzellen- auf LPS verstärkt, bereitzustellen. Ulevitch, R.J., und Tobias, P.S., "Recognition of endotoxin by cells leading to transmembrane signaling", Curr. Opin. Immunol. 6:125 (1994). HL-60, REH und Jurkat wurden in RPMI, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamycin, kultiviert. ECV304 wurden in M199, ergänzt mit 10% FBS, mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamycin, kultiviert. GM5387 wurde in MEM, ergänzt mit 20% FBS, 2 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamycin, kultiviert.
Mononukleäre Zellen des humanen peripheren Bluts (PBMC) wurden aus heparinisiertem Blut durch Zentrifugation unter Verwendung von Histopaque wie anhand der Instruktionen des Herstellers isoliert. Die isolierten PBMC wurden in RPMI, ergänzt mit 10% BCS, suspendiert und wurden unmittelbar danach in Experimenten verwendet. Wie durch Durchflusszytometrie bestimmt wurde, bestanden PBMC typischerweise aus 11 ± 2% Monozyten und 80 ± 13% Lymphozyten, wobei die restlichen zytometrischen Ereignisse hinsichtlich der Größe mit Plättchen und Zellaggregaten konsistent sind.
Humane Granulozyten wurden aus heparinisiertem Blut durch Verdünnen des Bluts 1:1 mit 6% Dextran, um die roten Blutkörperchen zu sedimentieren, dann Zentrifugieren, um Leukozyten-reiches Plasma zu erhalten, isoliert. Die übrigen roten Blutkörperchen wurden durch 20-sekündige Inkubation mit 0,2% NaCl lysiert. Nach der Lyse wurde NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,9% zugesetzt, die Probe wurden zentrifugiert und das Zellpellet in HBSS, enthaltend 0,5% HSA, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit einem gleichen Volumen Histopaque (Sigma) unterschichtet. Nach einer Zentrifugation blieben die PBMC oberhalb der Histopaque-Schicht, während die Granulozyten sedimentiert worden waren. Die Reinheit der gesammelten Granulozyten wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von PE-konjugiertem anti-CD19 bestimmt.
Gewebefaktor- und TNFα-Expression
Die Induktion der Expression von Gewebefaktor (TF) durch bakterielle LPS wurde in zahlreichen Zelllinien, einschließlich mononukleären Zellen des humanen peripheren Bluts, der humanen Monozytenzelllinie Mono Mac 6 (MM6) und Granulozyten, gezeigt. Die Induktion der Expression von Gewebefaktor wurde durch Behandlung mit Taurolidin blockiert.
Für die Induktion der TF- oder TNFα-Expression wurden MM6-Zellen oder PBMC entweder in RMPI, ergänzt mit 10% BCS, oder in AIM-V + 0,01% BCS kultiviert und durch Zugabe von LPS bis zu Endkonzentrationen von 10 bis 100 ng/ml stimuliert. Mit Taurolidin behandelte Zellen erhielten Endkonzentrationen von 10 bis 100 μg/ml Taurolidin, wobei parallele Kulturen entweder kein Taurolidin oder eine vergleichbare Verdünnung mittels des Vehikels allein erhielten. Ausgenommen, wenn angegeben, wurden Taurolidin und LPS zu den Zellkulturen gleichzeitig zugegeben. Für die TF-Bestimmung wurden Zellen und Kulturmedien zusammen durch Zugabe von Triton X-100 (1% Endkonzentration) und EDTA (7 mmol/l Endkonzentration) behandelt und die resultierenden Lysate durch ELISA gemessen. Rezaie, A.R., et al. "Expression and purification of a soluble tissue factor fusion protein with an epitope for an unusual calcium-dependent antibody", Protein Expression and Purification 3:453 (1992). Für die TNFα-Bestimmung wurden Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 250 × g entfernt und die Überstände wurden durch ELISA gemessen. Houston et al., "Endothelial cells and extracellular calmodulin inhibit monocyte tumor necrosis factor release and augment neutrophil elastase release", J. Biol. Chem. 272:11778-11785 (1997). Um zu untersuchen, ob Taurolidin mit der ELISA-Messung von TF interferierte, wurde Taurolidin zu Lysaten von Zellen, die zuvor nicht mit dem Arzneimittel behandelt worden waren, hinzugesetzt. Taurolidin hatte keine Auswirkung auf die Messung der TF-Konzentrationen.
Eine Anzahl von früheren Untersuchungen hat gezeigt, dass Monozyten des peripheren Bluts auf eine LPS-Stimulierung durch Expression von TF ansprechen, wobei die maximale Expression typischerweise vier bis sechs Stunden nach der LPS-Behandlung auftritt. Schwartz et al., "Murine lymphoid procoagulant activity induced by bacterial lipopolysaccharide and immune complexes is a monocyte prothrombinase", J. Exp. Med. 155:1464 (1982); Gregory et al., "Regulation of tissue factor gene expression in the monocyte procoagulant response to endotoxin", Mol. Cell Biol 9:2752 (1989). Darüber hinaus sind Monozyten der einzige Zelltyp, der in PBMC-Präparaten vorhanden ist, der in der Lage ist, TF zu exprimieren. Wenn sie in AIM-V + 0,01% BCS kultiviert wurden, reagierten MM6-Zellen und PBMC in einer ähnlichen Weise auf eine LPS-Stimulation (1). Für MM6-Zellen wurde eine maximale TF-Expression mit 10 ng/ml LPS erzielt, was zu einer 11-fachen Induktion der TF-Expression verglichen mit nicht-stimulierten Zellen führte. Für PBMC war die maximale TF-Expression > 30-mal höher als bei nicht-stimulierten Zellen. Wenn MM6-Zellen in RPMI + 10% BCS kultiviert wurden, wurden ähnliche Zeitabläufe der LPS-induzierten TF-Expression beobachtet, obwohl die maximale Induktion der TF-Expression mit 100 ng/ml LPS erzielt wurde, was zu einer 4,3-fachen Induktion der TF-Expression verglichen mit nicht-stimulierten Zellen führte.
Es wurde die Fähigkeit von Taurolidin, die LPS-induzierte TF-Expression in MM6 und PBMC zu hemmen, untersucht. Taurolidin blockierte in Konzentrationen von 50 μg/ml oder höher die Induktion der TF-Expression in MM6-Zellen durch LPS vollständig, während Vehikel allein (verwendet in einer Verdünnung vergleichbar zu jener von 100 μg/ml Taurolidin) keine Wirkung hatte (2A). Niedrigere Konzentrationen von Taurolidin (10 oder 25 μg/ml) hatten wenig oder keine Wirkung auf die TF-Expression durch MM6-Zellen. Die TF-Expression durch LPS-stimulierte PBMC wurde ebenfalls durch Taurolidin gehemmt (2B), obwohl geringfügig höhere Konzentrationen erforderlich waren (d.h. es wurden 75 μg/ml Taurolidin für eine vollständige Hemmung der TF-Expression benötigt, verglichen mit 50 μg/ml für MM6-Zellen). Taurolidin zeigte eine ähnliche Wirksamkeit bei der Blockierung der TF-Expression, wenn MM6-Zellen oder PBMC in entweder RPMI + 10% BCS oder in AIM-V + 0,01% BCS kultiviert wurden.
Es ist vorgeschlagen worden, dass einige der immunmodulatorischen Wirkungen von Taurolidin von dessen Abbauprodukt, Taurin, resultieren. William et al., "Taurolidine, an antilipopolysaccharide agent, has immunoregulatory properties that are mediated by the amino acid taurine", J. Leuk. Biol. 58:299 (1995). Dementsprechend führten wir, um diesen potentiellen Wirkungsmechanismus von Taurolidin zu untersuchen, Experimente wie oben unter Verwendung von Taurin in einer Konzentration von 44 μg/ml (hinsichtlich der molaren Konzentration äquivalent zu jener, die aufgrund des vollständigen Abbaus von 50 μg/ml Taurolidin erzeugt würde) und höher aus. Taurin hatte keine Wirkung auf die TF-Expression durch MM6-Zellen, sogar bei Konzentrationen bis zu 0,5 mg/ml. Ein anderer vorgeschlagener Wirkungsmechanismus von Taurolidin erfolgt über eine direkte Inaktivierung von LPS. Pfirrmann, R.W., "Taurolin: Ein neues Konzept zur antimikrobiellen Chemotherapie chirurgischer Infektionen Einführung und Übersicht". In Taurolin, Ein Neues Konzept zur Antimikrobiellen Chemotherapie Chirurgischer Infektionen, Brückner, W.L., und Pfirrmann, R.W., (Hrsg.), München-Wien-Baltimore, Urban & Schwarzenberg, S. 3, 1985. Dementsprechend wurde untersucht, ob die Vorinkubation von Zellen mit Taurolidin deren nachfolgende Reaktion auf die LPS-Stimulation beeinflussen würde oder nicht. Es wurden ähnliche Verringerungen bei der TF-Expression beobachtet, wenn Zellen 100 μg/ml Taurolidin dreißig Minuten vorab ausgesetzt, gespült und dann LPS ausgesetzt wurden, verglichen mit Experimenten, in denen Taurolidin und LPS gleichzeitig zugesetzt wurden. Folglich war ein direkter Kontakt zwischen Taurolidin und LPS nicht erforderlich, damit Taurolidin die nachfolgende Induktion der TF-Expression durch LPS blockieren konnte.
Taurolidin hemmte die LPS-induzierte Sekretion von TNFα durch MM6-Zellen und PBMC (3). MM6-Zellen waren geringfügig empfindlicher gegenüber Taurolidin, da die maximale Hemmung mit 75 μg/ml Taurolidin erhalten wurde, während 100 μg/ml Taurolidin erforderlich waren, um die TNFα-Sekretion durch PBMC maximal zu hemmen. Für MM6-Zellen war die Konzentrationsabhängigkeit der Taurolidin-Hemmung zweiphasig, wobei hohe Konzentrationen die TNFα-Expression stark hemmten und mittlere Konzentrationen (insbesondere 25 μg/ml) die TNFα-Sekretion bedeutend stimulierten. Taurin hatte in einer Konzentration von 44 μg/ml keine Wirkung auf die TNFα-Expression durch MM6-Zellen.
Eine Behandlung von Monozyten des peripheren Bluts oder kultivierten MM6-Zellen mit Taurolidin hemmte die Induktion von TF in Reaktion auf LPS stark. Die Expression von TF ist eine wichtige Effektorfunktion von aktivierten Monozyten bei Sepsis, und frühere Studien haben insbesondere gezeigt, dass blockierende Antikörper gegen TF Paviane vor den tödlichen Wirkungen von intravenösen E. coli in einem Tiermodell für den gramnegativen septischen Schock schützen können (Taylor et al., "Lethal E. coli septic shock is prevented by blocking tissue factor with monoclonal antibody", Circ. Shock 33:127 (1991)) und die Koagulopathie, welche mit einer LPS-Injektion in Schimpansen verbunden ist, lindern können (Levi et al., "Inhibition of endotoxin-induced activation of coagulation and fibrinolysis by pentoxifylline or by a monoclonal anti-tissue factor antibody in chimpanzees", J. Clin. Invest. 93:114 (1994)). Dementsprechend ist die Fähig keit von Taurolidin, die Induktion von TF in Monozyten zu blockieren, ein wichtiger Aspekt von dessen klinischer Wirksamkeit bei der Behandlung von Sepsis.
Um zu bestimmen, ob Taurolidin die LPS-induzierte TF-Expression in PBMC in deren nativem Milieu, d.h. Vollblut, hemmen würde, wurde ein Gewebefaktor-Aktivitätsassay ausgeführt. LPS (10 ng/ml) und Taurolidin (100-500 μg/ml) oder gleiche Verdünnungen des Taurolidin-Vehikels wurden zu 5 ml-Aliquots von heparinisiertem Blut hinzugesetzt und das Blut wurde in 50 ml-Zentrifugenröhrchen bei 37°C, welche auf einem horizontal rotierenden Apparat mit 120 Upm rotierten, inkubiert. Nach 4 h wurden PBMC aus dem Blut unter Verwendung von Histopaque, wie zuvor beschrieben, gereinigt. Zellen wurden durch 3 Einfrier-Auftau-Zyklen lysiert und als Quelle für TF in Gerinnungsassays verwendet. Für diese Assays wurden 50 μl Lysat (mit 2 × 10⁷ Zellen/ml) zu 50 μl gepooltem normalem humanem Plasma hinzugesetzt, 30 Sekunden bei 37°C inkubiert, dann wurden 50 μl 25 mM CaCl₂ zugesetzt und die Gerinnselbildung wurde unter Verwendung eines Diagnostica Stago-ST4-Koagulometers bestimmt. Der Proteingehalt der Zellproben wurde durch den Bicinchoninsäureassay (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) bestimmt und verwendet, um die Gerinnungsdaten zu normalisieren. Es wurde eine Standardkurve mit Descyto-TF, rekonstituiert in PS/PC-Vesikeln gemäß der Methode von Mimms et al. (Mimms et al., "Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside", Biochemistry 20:833-840 (1981)), erstellt. Eine Einheit von TF wurde als jene, welche eine Gerinnselbildung nach 50 Sekunden Inkubation mit CaCl₂ bewirkte, definiert. Die TF-Aktivitätsassays wurden an LPS-induzierten PBMC nach 4 h Behandlung in Vollblut ausgeführt. Ein Dosis-Wirkungs-Effekt von Taurolidin auf Monozyten-TF wird in Tabelle II veranschaulicht. Taurolidin verringerte in einer Konzentration von 100 μg/ml die TF-Aktivität um 12%; 200 μg/ml verringerten die Aktivität um ungefähr 60% und eine Behandlung mit 500 μg/ml Taurolidin führte zu einem Verlust von ungefähr 75% der TF-Aktivität. Dementsprechend wurden, wenn die PBMC mit Vollblut behandelt wurden, bei Vergleich mit PBMC in Kulturmedium höhere Taurolidin-Konzentrationen benötigt, um TF zu hemmen. Ferner waren niedrigere Konzentrationen von Taurolidin erforderlich, um die TF-Expression herunterzuregeln, als sie benötigt wurden, um eine Apoptose zu induzieren, wie nachfolgend beschrieben wird.
Zusätzlich zu deren Rolle bei der Pathologie von Sepsis ist die TF-Expression auf der Oberfläche von Leukämiezellen (insbesondere akute myeloische Leukämien (AML) und akute Lymphoblastenleukämien (ALL)) mit schweren Koagulopathien bei Leukämiepatienten verbunden (Bauer et al., "Tissue factor gene expression in acute myeloblastic leukemia", Thromb. Res. 56:425-430 (1989); Hair et al., "Tissue factor expression in human leukemia cells", Leuk. Res. 20:1-11 (1996); und Tanaka, M. und Yamanishi, H., "The expression of tissue factor antigen and activity on the surface of leukemic cells", Leuk. Res. 17:103-111 (1993). Diese Koagulopathien können lebensbedrohliche thrombotische und Blutungsepisoden wie auch die Entwicklung von disseminierter intravasaler Koagulation (DIC) umfassen. Darüber hinaus können Episoden von Thrombose und DIC bei solchen Leukämiepatienten durch Chemotherapie induziert werden. Die Fähigkeit von Taurolidin, die Expression von TF durch Leukämiezellen zu verringern (exemplifiziert durch die MM6-Zelllinie), sollte dementsprechend hilfreich sein, um die Inzidenz und Schwere von Koagulopathien bei Leukämiepatienten sogar bei Dosen, die die Leukämiezellen nicht töten, zu verringern.
Tabelle II. Wirkung einer Taurolidin-Behandlung auf die Gerinnung Aktivität von LPS-induzierten PBMC
Wirkung von Taurolidin auf Zelllebensfähigkeit und -vermehrungsraten
Apoptose ist eine kontrollierte Form des Zelltods, welche durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass weder Ausgangszellen noch apoptotische Körper hinsichtlich der Membranen permeabel werden. Diese Charakteristik unterscheidet die Apoptose von einer Nekrose, bei welcher der Zelltod das Aufbrechen von Zellmembranen mit umfasst. Die Bestimmung der Apoptose wurde ausgeführt durch Bestimmen der Integrität der Zellmembranen von verschiedenen Zelllinien, kontinuierliche Langzeitkultivierung von Zellen nach einer Taurolidin-Behandlung, um die Vermehrungsrate und die Membranpermeabilität nach einer Taurolidin-Behandlung zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass Taurolidin Apoptose anstelle von Nekrose von Leukämiezellen verursacht.
Bei diesen Experimenten wurde die Integrität von Zellmembranen nach einer Taurolidin-Behandlung durch Trypanblau-Ausschluss und durch Messen der Freisetzung von LDH in MM6-, K-562-, HL-60- und REH-Zellen bestimmt. Da BCS signifikante Mengen von LDH enthält, wurden diese Experimente an Zellen ausgeführt, die in AIM-V + 0,01 BCS kultiviert wurden. Eine vierstündige Behandlung von Zellen wurde in 0,01% BCS enthaltendem AIM-V ausgeführt, um einen nachfolgenden LDH-Assay ohne Interferenz aufgrund des BCS (welche auftritt, wenn normales Kulturmedium, welches 10% BCS enthält, verwendet wird) zu ermöglichen. Dementsprechend wurden MM6-Zellen (5 × 10⁵ Zellen/ml) mit Taurolidin vier Stunden in AIM-V + 0,01% BCS behandelt, wonach ein Aliquot von dieser Zellsuspension für eine Messung der LDH-Freisetzung entfernt wurde. Ein paralleles Aliquot von Zellen wurde durch drei Zyklen von Einfrieren/Auftauen lysiert und die freigesetzte LDH-Menge wurde als 100% angenommen. Die übrigen Zellen wurden in HBSS gespült und in Vermehrungsmedium für eine Messung der Vermehrungsraten resuspendiert.
Nach einer mikroskopischen Untersuchung von MM6-Kulturen, welche vier Stunden mit 100 μg/ml Taurolidin behandelt worden waren, erschienen die Zellen kleiner als Kontrollzellen zu sein, und es wurde beobachtet, dass die Kulturen zahlreiche kleine, kugelförmige Körper enthielten, die Trypanblau ausschlossen. Im Rahmen einer Untersuchung wurde die Integrität der Zellmembran durch Messung der LDH-Freisetzung in PBMC und MM6-Zellen, welche in AIM-V + 0,01% BCS kultiviert wurden, bestimmt. Nach einer Behandlung mit 0 bis 50 μg/ml Taurolidin für vier Stunden reichten die LDH-Konzentrationen in den behandelten Kulturen von 6 bis 9% von jenen von durch Einfrie ren/Auftauen lysierten Zellen (Mittelwerte aus drei separaten Experimenten), was sich nicht signifikant von LDH-Konzentrationen in Kulturen, die nicht mit Taurolidin behandelt worden waren, unterschied. Zusätzlich waren nach einer vierstündigen Behandlung Kontroll- und mit Taurolidin behandelte Zellen in gleichem Maße in der Lage, Trypanblau auszuschließen (4A, Tag 1). Wenn jedoch Taurolidin-behandelte MM6-Zellen gespült und in Vermehrungsmedium resuspendiert wurden, wurden 65% der 50 μg/ml Taurolidin ausgesetzten Zellen an dem Tag nach der Behandlung Trypanblau-positiv (4A, Tag 2), was anzeigt, dass die Plasmamembran permeabel geworden war. Im Gegensatz dazu waren nur 5% der unbehandelten ("Kontrolle") und mit Vehikel behandelten Zellen Trypanblau-positiv. Zellen, die mit 50 μg/ml Taurolidin vier Stunden behandelt worden waren, vermehrten sich nicht, wenn sie in Vermehrungsmedium zurückgegeben wurden, während Zellen, die mit Vehikel allein oder mit 25 μg/ml Taurolidin behandelt worden waren, ähnliche Vermehrungsraten zu jenen, die bei unbehandelten Zellen beobachtet wurden, zeigten (4B). Im Rahmen einer anderen Untersuchung wurden K-562-, HL-60- und REH-Zellen nach einer vierstündigen Behandlung mit Taurolidin getestet und die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefasst.
Tabelle III. Ergebnisse von einer vierstündigen Behandlung mit Taurolidin
Mit 50 μ/ml Taurolidin behandelte HL-60-Zellen. In diesen Proben war die im Kulturmedium vorhandene LDH 8,3 ± 2,3% von jener, welche durch vollständig lysierte Zellen freigesetzt wurde, verglichen mit 2,3 ± 0,8%, welche in Kontrollkulturen gemessen wurden. Alle Proben von allen anderen Zelllinien zeigten LDH-Konzentrationen, die ≤ 7% von lysierten Zellproben waren (n = 3). Nach einer vierstündigen Behandlung wurden die Zellen gespült und in Vermehrungsmedium zurückgegeben und hinsichtlich Lebensfähigkeit und Vermehrung über die folgenden 3 Tage überwacht. Es wurden Konzentrationen von Taurolidin von 25 μg/ml bis 100 μ/ml verwendet, um Unterschiede bei der Empfindlichkeit von Zelllinien gegenüber Taurolidin hervorzuheben. Der Trypanblau-Assay von allen Proben war am Tag 1 (nach 4 Stunden Behandlung) äquivalent zu der Kontrolle, was anzeigt, dass eine Taurolidin-Behandlung keine schnelle Permeabilität von Zellmembranen bewirkte, was nahelegt, dass diese Verbindung keine Zellnekrose bewirkte. Über die folgenden Tage zeigten jedoch alle von Leukämien abgeleiteten Zelllinien eine fortschreitende Permeabilität für Trypanblau nach einer Behandlung mit Taurolidin-Konzentrationen von 50 μg/ml oder höher mit der Ausnahme von K562-Zellen (5A, 6A, 7A, 8A und 9A). MM6-, K562- und Jurkat-Zellen zeigten keine Zunahme der Trypanblau-Anfärbung nach einer Behandlung mit 25 μg/ml Taurolidin, während HL-GO- und REH-Zellen empfindlicher waren. Wie erläutert, ist eine am Ende auftretende Permeabilität von Zellmembranen bei einer in vitro-Apoptose unvermeidlich. K562-Zellen zeigten eine Hemmung der Vermehrung nach einer Taurolidin-Behandlung mit 50 μg/ml oder mehr, wie dies die anderen von Leukämien abgeleiteten Zelllinien taten (5B, 6B, 7B, 8B und 9B). Zelllinien zeigten unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber Taurolidin in Hinblick auf die Zellvermehrung, wobei K562- und Jurkat-Zellen am wenigsten beeinflusst wurden und die HL-60-Vermehrung nach einer Taurolidin-Behandlung am stärksten gehemmt wurde.
Die adhärenten Zelllinien ECV304 (Endothelzellen) und GM5387 (Fibroblasten) zeigten keine signifikante Zunahme der Trypanblau-Anfärbung von Zellen während einer viertägigen Kultivierung nach Taurolidin-Behandlung (10A und 11A). Die Proliferation von diesen Zellen war jedoch nach einer Behandlung mit 50 und 100 μg/ml Taurolidin gehemmt (10B und 11B).
Nachweis der Apoptose
Es wurde die Wirkung von Taurolidin auf Zelllinien von verschiedenen Linien in Hinblick auf eine Apoptose ausgewertet. Eine Behandlung mit wirksamen Mengen von Taurolidin führte zu einer Apoptose bei verschiedenen Monozyten-, Granulozyten- und zahlreichen Leukämie-Zelllinien, aber nicht bei Lymphozyten.
Nach einer Behandlung mit entweder Taurolidin oder der Vehikel-Lösung wurde der Zelltod auf eine von zwei Weisen bestimmt. Bei der ersten Methode wurde das für eine Apoptose charakteristische DNA-Fragmentierungsmuster nachgewiesen durch Extraktion der DNA mit niedrigem Molekulargewicht aus Zellen unter Verwendung eines Phosphat-Citrat-Puffers (Darzynkiewicz et al., "Assays of cell viability: discrimination of cells dying by apoptosis", Methods Cell Biol. 41:15 (1994)) und Unterwerfen der extrahierten DNA einer Agarose-Gelelektrophorese.
Bei der zweiten Methode wurde die DNA-Fragmentierung über einen TUNEL-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Bei dieser Methodik wurden 2 × 10⁶ Zellen mit 2% Paraformaldehyd fixiert, mit 0,1% Triton X-100/0,1% Citrat permeabilisiert, bei 37°C mit terminaler Desoxynukleotidyltransferase und FITC-dUTP inkubiert, gespült und durch Durchflusszytometrie analysiert. Ein verstärktes FITC-Signal zeigt eine Apoptose-spezifische DNA-Fragmentierung an. Gavriali et al., "Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation", J. Cell Biol. 119:493 (1992). Parallele Aliquots von nicht-fixierten Zellen wurden mit PI und FITC-konjugiertem anti-CD14 behandelt und durch Durchflusszytometrie analysiert, um Zellen mit permeablen Zellmembranen zu identifizieren (da PI an DNA bindet, aber aus Zellen mit intakten Plasmamembranen ausgeschlossen ist) und auch um die Zellspezifität des apoptotischen Signals zu bestimmen.
Für die durchflusszytometrische Analyse von Zellen wurde ein Becton-Dickinson FACSCalibur-Instrument verwendet. Die Bestimmung des Zelldurchmessers (Vorwärts-Streulicht; FCS) und der Granularität (Seitwärts-Streulicht; SSC) wurden an nicht-fixierten Zellen ausgeführt. Die Unterscheidung zwischen Lymphozyten und Monozyten wurde durch deren charakteristische Unterschiede in FSC und SSC ermöglicht und durch die Anfärbung von Monozyten mit FITC-markierten anti-CD14-Antikörpern und von Lymphozyten mit einer Kombination von FICT-konjugiertem anti-CD3 und PE-konjugiertem anti-CD19 bestätigt. Nach einer Inkubation mit Taurolidin (mit oder ohne gleichzeitige LPS-Behandlung) wurden die Zellen zweimal mittels Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, welche 0,1% Rinderserumalbumin (PBSA) enthielt, gespült und 1 × 10⁶ Zellen wurden in 0,1 ml PBSA resuspendiert. Nachdem 5 μl FITC-konjugierter anti-CD14 zugesetzt worden war, wurden Zellen im Dunkeln auf Eis 15 min inkubiert und dann bei 250 × g zentrifugiert. Zellen wurden in 500 μl PBSA, enthaltend 5 μg/ml PI, resuspendiert und einer Durchflusszytometrie unterworfen.
Taurolidin-behandelte MM6-Zellen und Monozyten des peripheren Bluts zeigten eine verringerte Zellgröße, wie durch eine Abnahme bei FSC und SSC veranschaulicht wird, wenn die Zellen durch Durchflusszytometrie analysiert wurden (12). Nach einer dreistündigen Behandlung mit Taurolidin zeigten MM6-Zellen eine ungefähr 30%-ige Abnahme bei FSC, wie dies Monozyten des peripheren Bluts nach einer sechsstündigen Behandlung taten. Diese morphologischen Veränderungen (verringerte Zellgröße und Auftreten von kugelförmigen Körpern) wurden von einer intakten Plasmamembran begleitet, was anzeigt, dass Taurolidin bei Monozytenzellen eine Apoptose induziert.
Apoptose ist mit einer Fragmentierung von genomischer DNA in den internukleosomalen Verknüpfungsregionen verbunden, was als eine charakteristische Leiter von DNA-Fragmenten nach einer Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden kann. Arends, M.J., und Wyllie, A.H., "Apoptosis: mechanisms and roles in pathology", Int. Rev. Exp. Path. 32:223 (1991). Dementsprechend wurde DNA mit niedrigem Molekulargewicht aus Taurolidin-behandelten MM6-Zellen extrahiert und einer Elektrophorese in Agarosegelen unterworten. Mit 50 μg/ml Taurolidin vier Stunden behandelte Zellen zeigten ein hervorstechendes Leitermuster von DNA-Fragmenten, während unbehandelte und mit Vehikel behandelte Zellen dies nicht taten (13). Diese Zellen waren nicht mit LPS behandelt worden; es wurden jedoch identische Ergebnisse festgestellt, wenn LPS während der Taurolidin-Behandlung anwesend war. Diese Ergebnisse unterstützen die Schlussfolgerung, dass Taurolidin eine Apoptose in MM6-Zellen induziert.
Um zu untersuchen, ob eine Taurolidin-Behandlung eine Apoptose in Monozyten des peripheren Bluts induzierte, wurde eine Technik, um die DNA-Fragmentierung auszuwerten, eingesetzt die auf gemischte Populationen von Monozyten und Lymphozyten angewendet werden konnte. Dementsprechend wurde eine TUNEL-Analyse an PBMC 3, 6 oder 24 h nach der Behandlung mit 25 oder 100 μg/ml Taurolidin ausgeführt. Aliquots von geernteten Zellen wurden auch mit FITC-konjugierten anti-CD14-Antikörpern und PI markiert, was eine Identifizierung von Monozyten (CD14-positive Zellen) und von Zellen mit beschädigten Zellmembranen (PI-positive Zellen) ermöglichte. Während relativ wenige der PBMC nach einer dreistündigen Inkubation TUNEL-positiv waren, war eine substantielle Population von TUNEL-positiven Zellen nach sechs Stunden Inkubation mit 100 μg/ml Taurolidin (Ereignisse rechts von der vertikalen Linie in 14) gleichzeitig mit einem starken Verlust von TUNEL-negativen Monozyten (Region R1 in 14; siehe auch Tabelle IV) leicht erkennbar. Dementsprechend waren nahezu 75% der Monozyten nach einer Behandlung mit 100 μg/ml Taurolidin für sechs Stunden TUNEL-positiv. Eine Bestätigung, dass die TUNEL-positiven Zellen Monozyten waren, wurde durch Anfärbung mit FITC-konjugiertem anti-CD14 erhalten. Niedrigere Dosen von Taurolidin (25 und 50 μg/ml) führten zu geringeren Ausmaßen von Apoptose-Induktion (Tabelle IV). Taurolidin-behandelte und Kontrollzellen zeigten äquivalent niedrige Konzentrationen von PI-positiven Zellen nach sechs Stunden, was anzeigt, dass die Zellmembranen zu diesem Zeitpunkt intakt blieben (Tabelle IV). Im Rahmen einer anderen Untersuchung, weiche in Tabelle V zusammengefasst ist, zeigten Taurolidinbehandelte polymorphkernige Zellen (Granulozyten) bei 100 μg/ml, MM6-Zellen (Monozytenleukämie-Zelllinie) bei 50 μg/ml und eine Zelllinie einer akuten myeloischen Leukämie (HL-60) bei 50 μg/ml ein hohes Ausmaß an Apoptose, wie durch den geringen Prozentsatz von % TUNEL-negativen Zellen angezeigt wird, und der geringe Prozentsatz von Propidiumiodid-positiven Zellen bestätigte, dass die behandelten Zellen intakt blieben.
Im Gegensatz zu deren Wirkung auf Monozyten induzierte eine Behandlung mit bis zu 100 μg/ml Taurolidin für sechs Stunden keine nachweisbare Apoptose bei der Lymphozyten-Population von PBMC, wobei im wesentlichen 100% der Zellen TUNEL-negativ blieben (14 und Tabelle IV).
Tabelle IV. Dosis-Wirkung von PBMC auf Taurolidin: 6-stündige Behandlung^a
Taurolidin induzierte in einer Konzentration von 100 μg/ml eine Apoptose von ungefähr 75% der gereinigten Monozyten des peripheren Bluts, wenn diese Zellen in Kulturmedium inkubiert wurden. Um jedoch das Milieu von Leukozyten in vivo besser nachzuahmen, wurde die Induktion der Apoptose in PBMC durch Taurolidin in Vollblut (mit Heparin-Antikoagulans versetzt) untersucht. Wie zuvor, wurde die Apoptose durch Messen des Verlusts von Monozyten aus einer TUNEL-negativen (keine DNA-Fragmentierung), CD14-positiven Population von Zellen, welcher gleichzeitig mit dem Auftreten einer TUNEL-positiven Population von Zellen auftrat, quantifiziert. Die Behandlung von PBMC in Vollblut führte zu einer Verschiebung der Taurolidin-Dosis-Wirkungs-Kurve. Konzentrationen von Taurolidin bis zu 200 μg/ml induzierten keine signifikante
Tabelle V. Induktion von Apoptose durch Taurolidin
Apoptose, wenn Zellen in Vollblut behandelt wurden (Tabelle VI und 15A). Jedoch führte Taurolidin in einer Konzentration von 500 μg/ml zum Auftreten einer Population von TUNEL-positiven Zellen (15B, Region 3) und zum Verlust von 70% der TUNEL-negativen Monozyten (Tabelle VI). Als Positivkontrolle für die Induktion von Apoptose wurden einige Zellen mit Anisomycin, einem Proteinsynthese-Inhibitor, von welchem bekannt ist, dass er Apoptose bei Monozyten induziert, behandelt. Die Anisomycin-Behandlung von PBMC in Vollblut führte auch zu einem Verlust von TUNEL-negativen Monozyten; jedoch wurden nach einer 6-stündigen Inkubation weniger TUNEL-positive Zellen nachgewiesen (15C, Region 3). Es gab keinen Hinweis auf eine signifikante Wirkung von entweder Taurolidin oder Anisomycin auf die Induktion von Apoptose bei Lymphozyten.
Tabelle VI. Dosis-Wirkung von PBMC (in Vollblut) auf Taurolidin^a
Die Wirkung von Taurolidin auf Granulozyten wurde durch eine TUNEL-Analyse an Taurolidin-behandelten gereinigten Granulozyten untersucht. Diese Experimente wurden in Kulturmedium anstelle von Vollblut ausgeführt. Granulozyten wurden mit 100 μg/ml Taurolidin behandelt, da gezeigt worden war, dass diese Konzentration von Taurolidin für Monozyten des peripheren Bluts, welche in Kulturmedium behandelt werden, zur Apoptose führte. TUNEL-positive Granulozyten reichten in unbehandelten Proben von 2% bis 30% und variierten je nach Blutspender. Eine Taurolidin-Behandlung führte zur Apoptose bei 92% der Granulozyten innerhalb von 6 Stunden (Tabelle VII). Dementsprechend ist die apoptogene Wirkung von Taurolidin nicht spezifisch für Monozytenzellen.
Tabelle VII. Reaktion von Granulozyten auf 100 μg/ml Taurolidin^a
Im Rahmen einer anderen Untersuchung wurden TUNEL-Assays an allen Zelllinien 6 h, nachdem die Zellen anfänglich Taurolidin ausgesetzt worden waren (Zellen wurden 4 h behandelt, gespült und dann 2 weitere Stunden inkubiert, bevor der TUNEL-Assay ausgeführt wurde), ausgeführt. Für diese Experimente wurde die Wirkung von 100 μg/ml Taurolidin mit jener von 1 μg/ml Anisomycin, einem Proteinsynthese-Inhibitor, von dem gezeigt worden ist, dass er Apoptose bei Monozyten- (Kochi, S.K., und Collier, R.J., "DNA fragmentation and cytolysis in U937 cells treated with diphtheria toxin or other inhibitors of protein synthesis", Exp. Cell Res. 208:296-302 (1993)), Granulozyten- (Polverion, A.J., und Patterson, S.D., "Selective activation of caspases during apoptotic induction in HL-60 cells", J. Biol. Chem. 272:7013-7021 (1997)) und Epithelzelllinien (Liao et al., "Stress, apoptosis, and mitosis induce phosphorylation of human keratin 8 at Ser-73 in tissues and cultured cells", J. Biol. Chem. 272:17565-17573 (1997)) induziert, verglichen. Taurolidin und Anisomycin induzierten eine Apoptose in MM6-, HL-60- und Jurkat-Zellen (Tabelle VIII). MM6- und HL-60-Zellen wurden in ähnlicher Weise beeinflusst, mit > 80% TUNEL-positiven Zellen nach 6 h. Jurkat-Zellen waren weniger empfindlich mit ungefähr 50% Zellen, die induziert worden waren, eine Apoptose nach einer Taurolidin-Behandlung zu durchlaufen. Nach 6 h waren 73% der Anisomycin-behandelten REH-Zellen apoptotisch, wobei weniger als 20% der Taurolidin-behandelten REH-Zellen TUNEL-positiv waren. Jedoch zeigte ein Assay von Zellen 24 h nach der Behandlung an, dass Taurolidin Apoptose in REH-Zellen induziert (Tabelle IX), dass diese aber weniger schnell als bei einer Anisomycin-Behandlung auftritt, was nahelegt, dass diese beiden Mittel möglicherweise durch unterschiedliche Mechanismen wirken. K562- Zellen waren am widerstandsfähigsten gegen eine Apoptose mit weniger als10% TUNEL-positiven Zellen 6 h nach der Behandlung mit entweder Anisomycin oder Taurolidin. Nach 24 h wurde ein gewisses Ausmaß an Induktion von Apoptose gezeigt, wobei ungefähr 20% der Taurolidin-hehandelten K562 TUNEL-positiv wurden.
Tabelle VIII. Reaktion von Zelllinien auf Taurolidin und Anisomycin
Weniger als 0,1% der ECV304- oder GM5387-Zellen waren 6 h nach der Behandlung mit Taurolidin oder Anisomycin TUNEL-positiv (Tabelle VIII). Dementsprechend induziert keines dieser Agentien eine schnelle DNA-Fragmentierung in diesen Zelltypen. Es gab jedoch eine ungefähr 70%-ige Zunahme der Anzahl von Ereignissen von subzellularer Größe, aufgezeichnet durch Durchflusszytometrie nach Taurolidin-Behandlung dieser Zellen, was eine gewisse Wirkung von Taurolidin auf die Zellintegrität anzeigt. Diese Zellfragmente wurden durch Propidiumiodid nicht angefärbt, was damit übereinstimmt, dass sie apoptotische Körper sind.
Zusammengefasst, waren Konzentrationen von Taurolidin, die wirksam waren, die Induktion der TF- und TNFα-Expression in LPS-stimulierten Monozytenzellen zu hemmen, auch wirksam, Apoptose in diesen Zellen zu induzieren. Dies wurde durch Analyse der DNA-Fragmentierung von MM6-Zellen durch Agarose-Gelelektrophorese und durch TUNEL-Analyse von Monozyten des peripheren Bluts ermittelt. Die Induktion von Apoptose erfolgte relativ schnell, da sie innerhalb Tabelle IX. Reaktion von Zelllinien auf Taurolidin und Anisomycin. Apoptose 24 h nach der Behandlung^a
von vier bis sechs Stunden nach der Behandlung bei MM6-Zellen und Monozyten nachweisbar war. In diesem Zeitraster war eine DNA-Fragmentierung leicht nachweisbar bei Zellen, deren Plasmamembranen nach wie vor intakt waren. Gegen Ende nahm jedoch die Zellpermeabilität zu (d.h. 24 h nach der Behandlung mit Taurolidin). Dies ist wahrscheinlich auf eine "sekundäre Nekrose", ein unvermeidbares Ergebnis einer fortgeschrittenen in vitro-Apoptose, wo es kein System für Phagozytose und intrazellulären Abbau von apoptotischen Zellen gibt, zurückzuführen. Es ist jetzt herausgefunden worden, dass Taurolidin auch die Apoptose von Monozytenzellen, welche in Vollblut behandelt werden, induziert. Die wirksame Konzentration (500 μg/ml) ist das fünffache von jener, die benötigt wird, wenn gereinigte PBMC in Kulturmedium behandelt werden. Es ist vorgeschlagen worden, dass Metabolite von Taurolidin LPS inaktivieren und Bakterien abtöten durch Bildung von Vernetzungen zwischen primären Amin- und Hydroxylgruppen an LPS und bakteriellen Zellwänden. (Browne et al., "Taurolin, a new chemotherapeutic agent", J. Appl. Bacteriol. 41:363-368 (1976); Pfirrmann, R.W., "Tau rolin: ein neues Konzept zur antimikrobiellen Chemotherapie chirurgischer Infektionen Einführung und Übersicht". In Taurolin, ein neues Konzept zur antimikrobiellen Chemotherapie chirurgischer Infektionen, herausgegeben von Brückner, W.L., und Pfirrmann, R.W., München-Wien-Baltimore: Urban und Schwarzenburg; S. 3-23 (1985)). Wenn Taurolidin Apoptose durch ähnliche Mechanismen induziert, könnte eine Inkubation in Vollblut dessen Wirksamkeit verringern, indem eine hohe Konzentration von nicht-zellulären Substraten bereitgestellt wird. Tatsächlich ist darüber berichtet worden, dass Taurolidin mit Proteinen in Plasma und Serum reagiert (Jones et al., "A study of the stability of taurolidine in plasma and protein-free serum", Int. J. Pharm. 64:R1-R4 (1990)). Taurolidin verringert auch die TF-Aktivität von LPS-induzierten Monozyten, welche in Vollblut behandelt werden, wobei eine signifikante Verringerung bei Taurolidin-Konzentrationen, die so gering wie 200 μg/ml sind, festgestellt wird.
Taurolidin induziert sogar bei Konzentrationen (in Vollblut) bis zu 500 μg/ml kein signifikantes Ausmaß von Apoptose in Lymphozyten. Jedoch ist Taurolidin wenigstens so wirksam bei der Induktion von Apoptose bei Granulozyten, wie es bei Monozyten ist, wie durch TUNEL-Assays, welche an gereinigten Zellen, die in Kulturmedium behandelt wurden, ausgeführt wurden, gemessen wurde. Es ist darüber berichtet worden, dass sowohl Granulozyten als auch Monozyten, aber nur ein Bruchteil der Lymphozyten konstitutiv das Fas-Antigen exprimieren (Iwai et al., "Differential expression of bcl-2 and susceptibility to anti-Fas-mediated cell death in peripheral blood lymphocytes, monocytes, and neutrophils", Blood 84:1201-1208 (1994)) und dass eine Vernetzung des Fas an der Zelloberfläche die Weiterleitung von apoptotischen Signalen in Zellen hinein vermittelt (Itoh et al., "The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis", Cell 66:233-243 (1991)). Obwohl der Mechanismus, durch den Taurolidin Apoptose induziert, unbekannt ist, beeinflusst Taurolidin Monozyten und Granulozyten, aber nicht Lymphozyten.
Die Spezifität der Fähigkeit von Taurolidin, Apoptose zu induzieren, wurde weiter untersucht, indem dessen Wirkungen auf verschiedene Leukämiezelllinien bestimmt wurden. Taurolidin war bei der Induktion von Apoptose am wirkungsvollsten bei Monozyten-(MM6) und Granulozyten- (HL-60) -leukämie-Zelllinien analog zu dessen starker Wirkung auf Monozyten des peripheren Bluts und Granulozyten. Taurolidin war jedoch auch in der Lage, Apoptose in einem signifikanten Anteil von Jurkat-Zellen, einer Lym phozytenleukämie-Zelllinie, zu induzieren. Ungefähr 50% von diesen Zellen wurden innerhalb von 6 Stunden Behandlung apoptotisch. Taurolidin induzierte unter ähnlichen Versuchsbedingungen keine Apoptose bei Lymphozyten des peripheren Bluts, was anzeigt, dass von Leukämien abgeleitete Zellen möglicherweise empfindlicher gegenüber Taurolidin sind als normale Zellen. Taurolidin war auch in der Lage, Apoptose in der Lymphoblastenzelllinie REH zu induzieren, obwohl der Prozess in diesen Zellen verglichen mit MM6 und HL-60 verzögert war.
Wie im Rahmen von früheren Untersuchungen festgehalten worden war (Evans et al., "Activation of the Abelson tyrosine kinase activity is associated with suppression of apoptosis in hemopoietic cells", Cancer Res. 53:1735-1738 (1993)) war die multipotente Zelllinie K562 relativ resistent gegen Apoptose. Anisomycin induzierte weniger als 10% von diesen Zellen, TUNEL-positiv zu werden. Taurolidin war etwas wirkungsvoller, da ungefähr 20% von diesen Zellen 24 h, nachdem die Behandlung begonnen worden war, TUNEL-positiv wurden.
Obwohl Taurolidin die Proliferation der Endothel- und Fibroblasten-Zelllinien hemmte, wurde ein tragfähiger Beweis für eine Induktion von Apoptose in diesen Zellen nicht erhalten. Die Taurolidin-Behandlung verursachte keinen messbaren Zelltod, wie durch die Tatsache gezeigt wurde, dass Zellen während der gesamten 4 Tage Kultivierung nach der Behandlung Trypanblau-negativ blieben. Zusätzlich zeigten diese Zellen keinen Hinweis auf eine Fragmentierung von DNA (TUNEL-Positivität), wenn sie 6 h nach der Behandlung dem Assay unterzogen wurden. Die DNA-Fragmentierung ist verwendet worden, um in Fibroblasten-Zelllinien auf Apoptose zu testen (Kim et al., "Plateledderived growth factor induces apoptosis in growth-arrested murine fibroblasts", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9500-9504 (1995)), einschließlich insbesondere des TUNEL-Assays (Gansauge et al., "The induction of apoptosis in proliferating human fibroblasts by oxygen radicals is associated with a p53- and p21^WAF1CIP1 induction", FEBS Letters 404:6-10 (1997)). Einige Fibroblasten-Zelllinien zeigten jedoch keinen DNA-Abbau und die Apoptose wurde durch Veränderungen in der Zellmorphologie und die Ablösung von Zellen von dem Kulturgefäß identifiziert (Boyle et al., "Apoptosis in C3H-10T1/2 cells: roles of intracellular pH, protein kinase C, and the Na+IH+ antiporter", J. Cell Biochem. 67:231-240 (1997)). Diese Untersuchungen untersuchten zusätzlich Zellen auf Hinweise auf Apoptose 24-48 h nach der Behandlung mit dem Apoptose bewirkenden Mittel.
Obwohl Beweise für eine DNA-Fragmentierung von Fibroblasten- oder Endothelzellen nicht gefunden wurden, enthüllte eine Analyse durch Durchflusszytometrie eine Zunahme der Zellfragmentierung.
Taurolidin induziert Apoptose bei Monozyten, Granulozyten und zahlreichen Leukämiezelllinien. Bei allen getesteten Zellen war es ein so effizientes Apoptose bewirkendes Mittel wie der Proteinsynthese-Inhibitor Anisomycin. Eine intravenöse Verabreichung von Taurolidin verursacht keine nachweisbaren Veränderungen bei den hämatologischen Variablen, einschließlich der Leukozytenzahl (Browne, M.K., "Pharmacological and clinical studies with taurolin". In Taurolin, Ein Neues Konzept zur Antimikrobiellen Chemotherapie Chirurgischer Infektionen, Brückner, W.L., und Pfirrmann, R.W. (Hrsg.), München-Wien-Baltimore, Urban & Schwarzenberg, S. 51-60 (1985); Browne et al., "A controlled trial of taurolin in established bacterial peritonitis", Surg. Gynecol Obstet. 146:721-724 (1978); und Williats et al., "Effect of the antiendotoxic agent, taurolidine, in the treatment of sepsis syndrome", Crit. Care Med. 23:1033-1039 (1995)). Taurolidin ermöglicht eine Behandlung für verschiedene Leukämieerkrankungen aufgrund seiner Fähigkeit, Apoptose in Leukämiezellen und Zellen in Vollblut zu induzieren, in Verbindung mit dem Fehlen einer generalisierten Toxizität in menschlichen Individuen.
Die Induktion von Apoptose in Monozytenzellen durch Taurolidin schien unabhängig von jeglichen Wirkungen, die das Arzneimittel auf LPS haben könnte, zu sein. Tatsächlich induzierte Taurolidin eine Apoptose in Monozytenzellen in Abwesenheit einer LPS-Behandlung. Dementsprechend haben wir zusätzlich zu dessen potentieller Nützlichkeit als Behandlung für Sepsis, über die zuvor von anderen berichtet worden ist, herausgefunden, dass Taurolidin ein sehr effektives, selektives Induktionsmittel von Apoptose in Monozyten- und myeloischen Zellen ist und bei der Behandlung von bestimmten Leukämien, einschließlich Monozyten- und myeloischen Leukämien, nützlich ist.
Beispiel 1: In vitro-Screeningtest für eine Taurolidin-Behandlung
Es wird ein in vitro-Screeningtest am Blut eines Patienten ausgeführt, um zu bestimmen, ob die Monozyten-, myeloischen und/oder Leukämiezellen auf eine Taurolidin-Therapie ansprechen würden, indem sie eine Apoptose zeigen.
Die Leukozyten des peripheren Bluts eines Patienten werden aus heparinisiertem Blut durch Zentrifugation unter Verwendung von Histopaque, Ficoll-Hypaque oder eine jegliche andere geeignete Methodik isoliert. Nach der Abtrennung werden die isolierten Leukozyten in RPMI + 10% BCS suspendiert. Aliquots der suspendierten Zellen werden mit 10-100 μg/ml Taurolidin 4-6 h behandelt. Mit der Vehikel-Lösung allein behandelte Zellen werden als Kontrollen verwendet. Das Vorliegen einer Apoptose wird als das Ausmaß von DNA-Fragmentierung unter Verwendung von entweder der Agarosegelelektrophorese oder des TUNEL-Assays gemessen. Ein hohes Ausmaß von Apoptose, welches in vitro bei den Leukämiezellen des Patienten beobachtet wird, zeigt eine günstige Prognose bei einer in vivo-Taurolidin-Behandlung an, während ein minimales Ausmaß von Apoptose nahelegt, dass eine alternative Therapie zu bevorzugen sein könnte.
Beispiel 2: In vivo-Taurolidin-Behandlung
Um die Anzahl von Monozyten- und/oder myeloischen Leukämiezellen zu verringern, wird ein Patient mit Monozyten- und/oder myeloischer Leukämie mit ungefähr 10 bis 500 mg/kg Körpergewicht Taurolidin, welches entweder intravenös oder intraperitoneal verabreicht wird, behandelt. Das Ansprechen des Patienten auf die Behandlung wird durch eine Abnahme der WBC-Zahl (Leukozytenzahl) und Untersuchung der Leukozyten des Patienten auf eine Abnahme der Leukämiezellen überwacht. Die Behandlung kann fortgesetzt werden, wenn nötig.
Beispiel 3: In vivo-Taurolidin-Behandlung, um Koagulopathien zu verringern
Um den Zustand erhöhter Gerinnung, welcher mit einer TF-Expression auf zirkulierenden Leukämiezellen verbunden ist, zu verringern, wird ein Patient mit Leukämie und einer damit verbundenen Koagulopathie mit ungefähr 10 bis 500 mg/kg Körpergewicht Taurolidin, welches entweder intravenös oder intraperitoneal verabreicht wird, behandelt. Zusätzlich kann die Behandlung vor oder gleichzeitig mit einer Standard-Krebs-Chemotherapie verabreicht werden, um die Inzidenz oder Schwere von thrombotischen Komplikationen zu verringern. Das Ansprechen des Patienten auf die Behandlung wird durch eine jegliche von verschiedenen hämatologischen Standard-Messgrößen für Hyperkoagulabilität oder DIC überwacht. Diese Messgrößen umfassen Verlängerung der Prothrombinzeit, erhöhte Konzentrationen von Fibrin-Abbauprodukten (FDP), erhöhte Konzentrationen von Fibrin-D-Dimer und Hypofibrinogenämie. Ein positives Ansprechen auf die Behandlung wird durch eine Rückkehr dieser Messgrößen in Richtung auf normale (Kontroll)-Niveaus angezeigt. Die Behandlung kann fortgesetzt werden, wenn erforderlich.

Claims

Verwendung von Taurolidin zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die Leukämiezellen apoptotisch werden lässt.
Verwendung von Taurolidin zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verminderung des hyperkoagulierbaren Zustands, der mit der TF-Expression auf Leukämiezellen einher geht, umfassend das in Kontakt bringen der Zellen mit einer wirksamen Menge Taurolidin.
Verwendung von Taurolidin zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der Hyperkoagulabilität, die mit der TF-Expression auf Leukämiezellen einher geht.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Leukämie dient.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für die intravenöse Verabreichung formuliert ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für die intraperitoneale Verabreichung formuliert ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für die intraperitoneale Verabreichung von 10 bis 500 mg Taurolidin pro kg Körpergewicht formuliert ist.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für die intraperitoneale Verabreichung von etwa 150 mg Taurolidin pro kg Körpergewicht formuliert ist.
Verfahren zur Überprüfung des Blutes von Leukämie-Patienten zur Bestimmung der Wirksamkeit einer Taurolidin-Behandlung, Schritte umfassend, bei denen man a) ein erstes Aliquot peripherer Blut-Leukozyten, die aus dem Blut eines Patienten isoliert wurden, mit einer Taurolidin-Lösung behandelt, um eine behandelte Zellsuspension zu bilden; b) ein zweites Aliquot der Leukozyten mit dem Taurolidin-Lösungsvehikel behandelt, um eine Kontroll-Zellsuspension zu bilden; und c) den Grad der Apoptose in der behandelten Zellsuspension und der Kontroll-Zellsuspension vergleicht.