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TECHNISCHES GEBIET
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Die
Erfindung betrifft die selektive Induktion des Zelltods durch Apoptose
und die Anwendbarkeit für die
Behandlung von Leukämien.
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QUERVERWEIS AUF VERWANDTE
ANMELDUNGEN
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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität der früher eingereichten, gleichzeitig
anhängigen "U.S. Provisional
Application" Nr.
60/047,642, welche am 22. Mai 1997 eingereicht worden ist.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Der
Zelltod erfolgt durch einen von zwei Mechanismen: Nekrose oder Apoptose.
Bei der Nekrose lysieren die Zellen und es werden Komponenten des
Zytosols freigesetzt. Die freigesetzten Komponenten des Zytosols
rufen schwere Entzündungsreaktionen
hervor. Die Apoptose führt
nicht zu der Freisetzung von Inhaltsstoffen des Zytosols, da die
Zellmembran intakt bleibt, auch wenn deren Oberflächeneigenschaften
sich möglicherweise
verändern.
Die Apoptose kann das Aufbrechen von Zellen zu apoptotischen Körpern, kugelförmigen Stücken von
Zellen, bei denen die Membran nach wie vor die Freisetzung von Inhaltsstoffen
des Zytosols verhindert, mit umfassen. Apoptotische Zellen und apoptotische
Körper
werden im Körper
durch phagozytäre
Zellen entfernt, von denen angenommen wird, dass sie die Notwendigkeit,
solche Zellen zu entfernen, durch die Veränderungen in der äußeren blattförmigen Struktur
der Membran, wobei Phosphatidylserin exponiert wird, erkennen. Die
Apoptose ruft typischerweise keine Entzündungsreaktionen auf die Weise,
wie eine Nekrose es tut, hervor, da in dem erstgenannten Falle die
Zellen durch Phagozytose entfernt werden, bevor der Inhalt des Zytosols
freigesetzt wird.
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Obwohl
Zellen, die eine Apoptose in vitro durchlaufen, anfänglich intakte
Zellmembranen haben, können
Zellen in fortgeschrittenen Stadien der Apoptose einen Verlust von
Membranintegrität
zeigen. Dieser Prozess wird manchmal als "sekundäre Nekrose" bezeichnet. Er kann beobachtet werden
aufgrund der Abwesenheit von phagozytären Zellen, die in vivo die
apoptotischen Zellen und Zellfragmente entfernt haben würden, bevor
sie nekrotisch werden konnten.
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Wenn
neoplastische (Tumor-) Zellen im Körper vorhanden sind, ist es
wünschenswert,
den Tod von solchen Zellen zu verursachen, ohne den Tod der normalen
Zellen, die der Patient benötigt,
um sein Leben aufrecht zu erhalten, zu verursachen. Es ist wünschenswert,
den Tod von neoplastischen Zellen durch Induktion von Apoptose zu
verursachen, so dass die Inhaltsstoffe des Zytosols der neoplastischen
Zellen nicht freigesetzt werden.
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Es
ist über
antineoplastische Arzneimittel berichtet worden, die Tumorzellen
durch Induktion von Apoptose töten.
Obwohl einige dieser Arzneimittel erfolgreich gewesen sind, einige
Krebsarten zu behandeln, ist auch bekannt geworden, dass die Arzneimittel
schwere Nebenwirkungen, wie Zytotoxizität gegenüber normalen Zellen durch störendes Eingreifen
in grundlegende zelluläre
Funktionen, wie Proteinsynthese oder DNA-Replikation, induzieren. Es ist über einige
Induktionsmittel von Apoptose bei Monozyten berichtet worden. Monozyten
des menschlichen Bluts können
beispielsweise eine Apoptose durchlaufen, wenn sie in Abwesenheit
von Serum oder stimulierenden Faktoren (was in vivo unmöglich erreicht
werden kann) kultiviert werden. Mangan et al., "Lipopolysaccharide, tumor necrosis factor-α, and IL-1β prevent
programmed cell death (apoptosis) in human peripheral blood monocytes", J. Immunol. 146:1541
(1991). Dieser Prozess benötigt
zwei bis drei Tage, damit ungefähr
50% der Monozyten apoptotisch werden (Mangan et al., "IL-4 enhances programmed
cell death (apoptosis) in stimulated human monocytes", J. Immunol. 148:1812
(1992)) und die Apoptose kann durch Lipopolysaccharid (LPS), Interleukin
(IL) -1 und den Tumornekrosefaktor α (TNFα) aufgeschoben werden. Zusätzlich kann
das entzündungshemmend
wirkende Zytokin IL-4 die Apoptose bei LPS-stimulierten Monozyten
verstärken.
Mangan, D.F., und Wahl, S.M., "Differential
regulation of human monocyte programmed cell death (apoptosis) by
chemotactic factors and pro-inflammatory cytokines", J. Immunol. 147:3408-3412
(1991). Apoptose ist auch bei mehreren unterschiedlichen Zellarten
durch die Verwendung einer Anzahl von Zytokinen induziert worden.
Jedoch hat die potentielle Verwendung von Zytokinen für die Behandlung
von Krebs in vivo Rückschläge erlitten,
da darüber
berichtet worden ist, dass sie verschiedene schädliche Wirkungen, einschließlich Schock,
Kreislaufkollaps und Tod, verursachen. Zusätzlich ist die
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Herstellung
von Zytokinen bis heute schwierig und teuer gewesen, da die Technik
der in vitro-DNA-Rekombination für
die Herstellung von Proteinen im großen Maßstab kein billiges Geschäft ist.
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Was
zu der komplizierten Natur der Leukämiebehandlung weiter beiträgt, ist
die Tatsache, dass es viele unterschiedliche Arten von Leukämie gibt.
Betrachtet man das Schema der Hämatopoiese
teilen sich pluripotente Stammzellen unter Bildung von entweder
lymphoiden Stammzellen oder myeloischen Stammzellen. Lymphozyten
werden ausgehend von lymphoiden Stammzellen produziert, während Monozyten
und Granulozyten, wie Neutrophile, Eosinophile und Basophile, ausgehend
von myeloischen Stammzellen produziert werden. Myeloische Stammzellen
erzeugen auch Erythrozyten und Megakaryozyten. Verschiedene Leukämien, die
aus diesen differenzierten Zellen resultieren, umfassen Lymphozyten-Leukämie, Monozyten-Leukämie und myeloische
Leukämie.
Behandlungsmethodiken und Prognose sind abhängig von der speziellen Art
der Leukämie
unterschiedlich.
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Myeloische
und Monozyten-Leukämien
sind besonders schwierig zu behandeln. Gegenwärtige Behandlungsmethoden haben
Linderung und keine Heilung erreicht. Es wird beispielsweise allgemein
angenommen, dass bei Patienten mit einer Monozyten-Leukämie eine
niedrige Heilungsrate von weniger als zehn Prozent besteht. Es ist
unmöglich,
eine wirkliche Remission zu erzielen, da der Ph-positive Klon im
Knochenmark weiter vorhanden ist, und intensive chemotherapeutische
Behandlungen, welche dazu ausgelegt sind, den Klon zu eliminieren
oder zu verringern, haben nur mäßige Verbesserungen
bei der Überlebensdauer
dieser Patienten bewirkt. Die gegenwärtige Chemotherapie ist dazu
ausgelegt, den Patienten für
lange Zeitspannen symptomlos zu halten, indem die Gesamtanzahl von
weißen
Blutkörperchen
innerhalb eines akzeptablen Bereichs gehalten wird.
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Es
ist dementsprechend wünschenswert,
ein neues Mittel zu finden, das selektiv die Apoptose von Monozyten-,
myeloischen und Leukämie-Zellen
bewirken kann, ohne schwere Nebenwirkungen, die die Verabreichung
von traditionellen chemotherapeutischen Mitteln begleiten, zu verursachen.
Es ist jetzt herausgefunden worden, dass eine bekannte Zusammensetzung,
Taurolidin, für
die Induktion von Apoptose in Monozyten- und myeloischen Zellen verwendet werden
kann.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Graph, welcher die Expression von Gewebefaktor (TF) durch Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierte
mononukleäre
Zellen des peripheren Bluts (PBMC) und die Zelllinie Mono Mac 6
(MM6) zeigt. PMBC wurden in einer Konzentration von 1,5 × 107 Zellen/ml (leere Quadrate) oder 5,6 × 105 Zellen/ml (ausgefüllte Quadrate) in AIM-V, ergänzt mit
0,01% Rinderkälberserum
(AIM-V+0,01% BCS), kultiviert. Nach Behandlung mit 10 ng/ml LPS
wurden zu den angegebenen Zeitpunkten Proben für einen ELISA gesammelt. Die Daten
(Mittelwert + Standardabweichung aus Proben, welche vierfach bestimmt
wurden) stammen aus einem repräsentativen
Experiment. In diesem Experiment exprimierten nicht-induzierte MM6-Zellen
160 pg TF pro 1 × 106 Zellen, während induzierte PBMC weniger
als 1 pg TF pro 1 × 106 Zellen exprimierten.
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2A und 2B sind
Graphen, die die Taurolidin-Hemmung der LPS-induzierten TF-Expression durch
Monozytenzellen, wie durch Assayprozeduren bestimmt, zeigen. 2A repräsentiert
MM6-Zellen; 2B repräsentiert PBMC. Die Zellen wurden
mit LPS (gestrichelte Balken: 100 ng/ml LPS in RPMI, ergänzt mit
10% BCS (RPMI+10% BCS); ausgefüllte
Balken: 10 ng/ml in AIM-V+0,01% BCS) in Gegenwart von variierenden
Konzentrationen von Taurolidin oder mit einer Vehikel-Verdünnung äquivalent
zu jener, die Zellen erfahren, welche 100 μg/ml Taurolidin erhielten, induziert.
Nach vier Stunden wurden die Zellen gesammelt und Lysate für einen
TF-ELISA hergestellt. Die Daten sind als Prozent des TF-Antigens,
gemessen in mit LPS allein (kein Taurolidin oder Vehikel) behandelten
Zellen, ausgedrückt.
Die Experimente wurden mit doppelt erstellten Proben ausgeführt und
wurden wenigstens dreimal wiederholt. Die gezeigten Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung
von allen Experimenten.
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3A und 3B sind
Graphen, die die Taurolidin-Inhibition der LPS-induzierten Expression
von Gewebenekrosefaktor α (TNFα) durch Monozyten-Zellen,
wie durch Assayverfahren bestimmt, zeigen. 3A repräsentiert
MM6-Zellen; 3B repräsentiert PBMC. Die Zellen wurden
mit LPS (gestrichelte Balken: 100 ng/ml LPS in RPMI+10% BCS; ausgefüllte Balken:
10 ng/ml in AIM-V+0,01% BCS) in Gegenwart von variierenden Konzentrationen
von Taurolidin induziert. Nach vier Stunden wurden die Zellüberstände für einen TNFα-ELISA gesammelt.
Die Daten sind als Prozent der TNFα-Konzentrationen, gemessen in
mit LPS allein (kein Taurolidin oder Vehikel) be handelten Zellkulturen,
ausgedrückt.
Die Experimente wurden mit doppelt erstellten Proben ausgeführt und
wurden wenigstens dreimal wiederholt. Die in 3A gezeigten
Werte stammen aus einem repräsentativen
Experiment. Die in 3B gezeigten Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung
von drei Experimenten.
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4A und 4B sind
Graphen, welche die Zelllebensfähigkeit
und Vermehrungsraten nach einer Taurolidin-Behandlung, wie durch
Assayverfahren bestimmt, zeigen. MM6-Zellen wurden mit Taurolidin
behandelt, wie in 3 beschrieben. Nachdem
Aliquots für
den Lactatdehydrogenase (LDH)-Assay gesammelt worden waren, wurde
der Rest der Kultur mittels "Hank's balanced salt solution" (HBSS) gespült und in
RPMI+10%BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen von Trypanblau-negativen
Zellen, welche in 4A aufgeführt sind, und die gesamte Zellzahl,
welche in 4B aufgeführt ist, wurden danach täglich aufgezeichnet
(wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung
erfolgte). Die Bedingungen waren keine Behandlung (leere Quadrate);
50 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte
Quadrate); 25 μg/ml Taurolidin
(leere Kreise); und Vehikel allein (ausgefüllte Kreise). Die Zellen wurden
subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von 6 × 105 Zellen/ml erreicht hatten. Die Daten sind
Mittelwerte ± Standardabweichung
von drei Experimenten.
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5A und 5B zeigen
Zelllebensfähigkeit
und Vermehrungsraten für
die MM6-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative
Zellen bzw. als % der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01%
BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt.
Nachdem Aliquots für
den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur
mittels HBSS gespült
und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen
von Trypanblau-negativen Zellen (5A) und
die gesamte Zellzahl (5B) wurden danach täglich aufgezeichnet
(wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung
erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise);
25 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte
Kreise); 50 μg/ml
Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte Quadrate);
und Träger
allein (ausgefüllte
Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt
und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen
ausgedrückt.
Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (5B).
Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von
6 × 105 Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung
von drei Experimenten.
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6A und 6B zeigen
Zelllebensfähigkeit
und Vermehrungsraten für
die K562-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative
Zellen bzw. als % der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01%
BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt.
Nachdem Aliquots für
den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur
mittels HBSS gespült
und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen
von Trypanblau-negativen Zellen (6A) und
die gesamte Zellzahl (6B) wurden danach täglich aufgezeichnet
(wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung
erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise);
25 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte
Kreise); 50 μg/ml
Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte Quadrate);
und Träger
allein (ausgefüllte
Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt
und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen
ausgedrückt.
Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (6B).
Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von
6 × 105 Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung
von drei Experimenten.
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7A und 7B zeigen
Zelllebensfähigkeit
und Vermehrungsraten für
die HL-60-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative
Zellen bzw. als % der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01%
BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt.
Nachdem Aliquots für
den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur
mittels HBSS gespült
und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen
von Trypanblau-negativen Zellen (7A) und
die gesamte Zellzahl (7B) wurden danach täglich aufgezeichnet
(wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung
erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise);
25 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte
Kreise); 50 μg/ml
Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte Quadrate);
und Träger
allein (ausgefüllte
Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt
und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen
ausgedrückt.
Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (7B).
Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von
6 × 105 Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung
von drei Experimenten.
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8A und 8B zeigen
Zelllebensfähigkeit
und Vermehrungsraten für
die REH-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative
Zellen bzw. als % der Zellzahl. Zellen wurden 4 hin AIM-V + 0,01%
BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt.
Nachdem Aliquots für
den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur
mittels HBSS gespült
und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen
von Trypanblau-negativen Zellen (8A) und
die gesamte Zellzahl (8B) wurden danach täglich aufgezeichnet
(wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung
erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise);
25 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte
Kreise); 50 μg/ml
Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte Quadrate);
und Träger
allein (ausgefüllte
Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt
und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen
ausgedrückt.
Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (8B).
Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von
6 × 105 Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung
von drei Experimenten.
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9A und 9B zeigen
Zelllebensfähigkeit
und Vermehrungsraten für
die Jurkat-Zelllinie nach einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative
Zellen bzw. als % der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01%
BCS mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolidin behandelt.
Nachdem Aliquots für
den LDH-Assay gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur
mittels HBSS gespült
und in RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen
von Trypanblau-negativen Zellen (9A) und
die gesamte Zellzahl (9B) wurden danach täglich aufgezeichnet
(wobei die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung
erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise);
25 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte
Kreise); 50 μg/ml
Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte Quadrate);
und Träger
allein (ausgefüllte
Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt
und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen
ausgedrückt.
Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (9B).
Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie eine Konzentration von
6 × 105 Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung
von drei Experimenten.
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10A und 10B zeigen
Zelllebensfähigkeit
und Vermehrungsraten für
die ECV304-Zelllinie nach
einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative Zellen bzw.
als der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01% BCS mit verschiedenen
Konzentrationen von Taurolidin behandelt. Nachdem Aliquots für den LDH-Assay
gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur mittels HBSS gespült und in
RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen von Trypanblau-negativen
Zellen (10A) und die gesamte Zellzahl
(10B) wurden danach täglich aufgezeichnet (wobei
die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung
erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise);
25 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte
Kreise); 50 μg/ml
Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte Quadrate);
und Träger
allein (ausgefüllte
Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt
und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen
ausgedrückt.
Diese Werfe befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (10B). Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie
eine Konzentration von 6 × 105 Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung
von drei Experimenten.
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11A und 11B zeigen
Zelllebensfähigkeit
und Vermehrungsraten für
die GM5387-Zelllinie nach
einer Taurolidin-Behandlung als % Trypanblau-negative Zellen bzw.
als der Zellzahl. Zellen wurden 4 h in AIM-V + 0,01% BCS mit verschiedenen
Konzentrationen von Taurolidin behandelt. Nachdem Aliquots für den LDH-Assay
gesammelt worden waren, wurde der Rest der Kultur mittels HBSS gespült und in
RPMI + 10% BCS ohne Taurolidin resuspendiert. Die Zahlen von Trypanblau-negativen
Zellen (11A) und die gesamte Zellzahl
(11B) wurden danach täglich aufgezeichnet (wobei
die Messung am Tag 1 unmittelbar nach der vierstündigen Taurolidin-Behandlung
erfolgte). Die Bedingungen waren: keine Behandlung (leere Kreise);
25 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte
Kreise); 50 μg/ml
Taurolidin (leere Quadrate); 100 μg/ml
Taurolidin (ausgefüllte Quadrate);
und Träger
allein (ausgefüllte
Dreiecke). Unter jeder Bedingung wurden die Verdopplungszeiten bestimmt
und als Prozentsatz der Verdopplungsrate von unbehandelten Zellen
ausgedrückt.
Diese Werte befinden sich rechts von den Vermehrungskurven in (11B). Die Zellen wurden subkultiviert, wenn sie
eine Konzentration von 6 × 10
Zellen/ml erreichten. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung
von drei Experimenten.
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12A, 12B, 12C und 12D sind
durchflusszytometrische Analysen, welche Veränderungen bei der Zellmorphologie
nach einer Taurolidin-Behandlung zeigen. MM6 und PBMC wurden drei
Stunden mit Taurolidin behandelt und dann wurden behandelte und
unbehandelte Kontrollzellen für
die Durchflusszytometrie weiterverarbeitet. Monozyten wurden in
PBMC-Proben durch Anfärbung
mit FITC-konjugiertem anti-CD14
und Lymphozyten durch FITC-konjugierten anti-CD3 und PE-konjugierten
anti-CD19 identifiziert. 12A repräsentiert
unbehandelte MM6-Zellen; 12B repräsentiert
MM6-Zellen, die mit 50 μg/ml
Taurolidin behandelt worden sind; 12C repräsentiert
unbehandelte PBMC; und 12D repräsentiert
PBMC, welche mit 75 μg/ml
Taurolidin behandelt worden sind. M = Monozyten; L = Lymphozyten.
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13 ist
ein Agarosegel, welches die DNA-Fragmentierung in Reaktion auf eine
Taurolidin-Behandlung, wie durch Assayverfahren bestimmt, zeigt.
MM6-Zellen wurden mit Taurolidin oder Vehikel in RPMI+10% BCS vier
Stunden inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und die DNA mit niedrigem
Molekulargewicht extrahiert, wie nachfolgend beschrieben. C = Kontrollzellen
ohne Taurolidin- oder Vehikel-Behandlung; T = behandelt mit 50 μg/ml Taurolidin;
V = behandelt mit Vehikel allein; und MW = Molekulargewichtsmarker.
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14A und 14B sind
terminale Desoxytransferase-vermittelte Desoxyuridintriphosphat-Biotin-Nick-Endmarkierungsassay
(TUNEL)-Analysen von Kontrollzellen bzw. Taurolidin-behandelten
PBMC. Zellen wurden mit 100 μg/ml
Taurolidin sechs Stunden inkubiert und für die TUNEL-Analyse weiterverarbeitet,
wie nachfolgend angegeben. Parallele Proben wurden mit FITC-konjugiertem
anti-CD14 und Propidiumiodid (PI), wie nachfolgend beschrieben,
angefärbt.
Pro Probe wurden zehntausend Ereignisse aufgezeichnet. Das TUNEL-Signal
(x-Achse) ist ein Maß für die DNA-Fragmentierung,
wobei FSC (y-Achse) sich auf die Zellgröße bezieht. TUNEL-negative
Lymphozyten werden durch das Rechteck R1 eingeschlossen, während TUNEL-negative
Monozyten (CD14-positive
Zellen) durch das Rechteck R2 eingeschlossen werden. Die vertikale
Linie gibt die Abgrenzung zwischen TUNEL-negativen und TUNEL-positiven
Zellen an. In den sechs Stunden-Proben gab es nur minimale Anzahlen
von PI-positiven Zellen (siehe Tabelle IV).
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15A, 15B und 15C zeigen eine TUNEL-Analyse von mit Taurolidin
in Vollblut behandelten PBMC, für
Kontrollzellen, Taurolidin-behandelte Zellen bzw. Anisomycinbehandelte
Zellen. Die Zellen wurden mit 500 μg/ml Taurolidin 4 h inkubiert,
in frischem Medium resuspendiert, zwei Stunden weiter inkubiert und
für die
TUNEL-Analyse weiterverarbeitet. Parallele Proben wurden mit FITC-konjugiertem
anti-CD14 und PI angefärbt,
wie hier beschrieben. Es wurden zehntausend Ereignisse pro Probe
aufgezeichnet. Das TUNEL-Signal (x-Achse) ist ein Maß für die DNA-Fragmentierung,
wobei FSC (y-Achse) sich auf die Zellgröße bezieht. TUNEL-negative
Lymphozyten werden durch das Rechteck R1 eingeschlossen, während TUNEL-negative
Monozyten (CD14-positive Zellen) durch das Rechteck R2 eingeschlossen
werden. R3 schließt
die TUNEL-positive Population von Zellen ein. Es gab minimale Anzahlen
von PI-positiven Zellen in den 6 Stunden-Proben (siehe Tabelle VI).
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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Taurolidin
(Taurolin; Tauroline; 4,4'-Methylenbis(perhydro-1,2,4-thiadiazin-1,1-dioxid)
wird zum ersten Mal für
eine Verwendung für
die Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Patienten, welche
an Monozyten- und/oder myeloischen Leukämien leiden, offenbart. Taurolidin
wird durch Injektion in Lösung
(intravenös oder
intraperitoneal) an betroffene Patienten in einer Menge, welche
wirksam ist, um Apoptose von Monozyten- und/oder myeloischen Zellen zu bewirken,
verabreicht. Dementsprechend werden die an der Monozyten- oder myeloischen
Leukämie-Erkrankung
beteiligten Zellen angegriffen und sterben via Apoptose.
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Es
ist über
Taurolidin als ein nützliches
Mittel für
andere Anwendungen berichtet worden und dementsprechend stehen in
vitro- und klinische Daten bezüglich
dessen physiologischen Wirkungen zur Verfügung, auch wenn es keine früheren Berichte über dessen
Verwendung als ein Apoptose-Induktionsmittel bei Monozyten, Granulozyten
oder Leukämie-Zellen
gibt. Nach einer zweistündigen
Behandlung mit 5 mg/ml Taurolidin wurde über keine toxischen Wirkungen
auf Epithelzellen berichtet (Gorman et al., "Reduced adherence of microorganisms
to human mucosal epithelial cells following treatment with taurolin,
a novel antimicrobial agent", J.
Appl. Bacteriol. 62:315 (1987)) und frühere Untersuchungen an Monozyten
berichteten, dass Taurolidin offensichtlich nicht-toxisch ist, da
es keine Zunahme der LDH-Freisetzung durch Zellen nach einer 24-stündigen Taurolidin-Behandlung
gab. Bedrosian et al., "Taurolidine,
an analogue of the amino acid taurine, suppresses interleukin 1
and tumor necrosis factor synthesis in human peripheral blood mononuclear
cells", Cytokine
3:568 (1991); Dofferhoff et al., "The release of endotoxin from antibiotic-treated
Escherichia coli and the production of tumour necrosis factor by
human monocytes",
J. Antimicrob. Chemother. 31:373 (1991).
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In
früheren
Berichten über
andere Anwendungen von Taurolidin, wie für ein Mittel zur Behandlung
von Septikämie,
reichen die bei einer klinischen Verwendung erzielten Plasmakonzentrationen
von Taurolidin (oder von dessen anfänglichem Metaboliten) von 20
bis 100 μg/ml
bei septischen Patienten oder normalen Freiwilligen. Browne, M.K., "Pharmacological and
clinical studies with taurolin".
In Taurolin, Ein Neues Konzept zur Antimikrobiellen Chemotherapie
Chirurgischer Infektionen, Brückner,
W.L., und Pfirrmann, R.W. (Hrsg.), München-Wien-Baltimore, Urban & Schwarzenberg,
S. 3, 1985; Nitsche et al., "Investigations
of endotoxin inactivation in plasma. Preliminary results of a controlled
randomized study on taurolidine as a supplementary therapeutic agent
in septicemia".
In Emergency Surgery Trends, Techniques, Results. Proceedings of
the 7th International Congress of Emergency
Surgery, Schweiberer, L., und Eitel, F. (Hrsg.), München, Zuckschwerdt, S.
185, 1985). Die Taurolidin-Behandlung bei Menschen ist nicht mit
Toxizität
in Zusammenhang gebracht worden, sogar wenn septische Patienten
bis zu 20 Gramm für
2-5 aufeinanderfolgende Tage erhielten. Willatts et al., "Effect of the antiendotoxic
agent, taurolidine, in the treatment of sepsis syndrome: a placebocontrolled double-blind
trial", Crit. Care
Med. 23:1033 (1995); Johnston et al., "Taurolin for the prevention of parenteral nutrition
related infection: antimicrobial activity and longterm use", Clin. Nutrition
12:365 (1993).
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Es
ist festgestellt worden, dass Konzentrationen von Taurolidin im
Bereich von 50 bis 100 μg/ml
innerhalb von sechs Stunden eine Apoptose bei 75% der Monozyten
des peripheren Bluts, welche in Kulturmedium inkubiert wurden, induzierte.
Ferner induzierten 100 μg/ml
Taurolidin innerhalb von sechs Stunden eine Apoptose bei 92% der
Granulozyten, die in Kulturmedium inkubiert wurden. Bevorzugte therapeutische
Dosierungen für
eine Behandlung von Leukämien
sind ungefähr
10 bis ungefähr
500 mg/kg Körper gewicht.
Am meisten bevorzugt ist eine Dosis, die zu einer Konzentration
von 200 μg/ml
im Plasma führt,
was typischerweise ungefähr
150 mg/kg Körpergewicht
ist.
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Taurolidin
kann intravenös
oder intraperitoneal verabreicht werden. Für eine Behandlung der verschiedenen
Leukämien
wird eine wirksame Menge von Taurolidin, um eine Apoptose der betroffenen
Zellen zu bewirken, verwendet und kann durch periodisch ausgeführte Tests
an Proben des Bluts des Patienten überwacht werden, bei welchen
Zellen hinsichtlich Anzeichen für
eine Apoptose unter Verwendung einer beliebigen Technik, wie einer
TUNEL-Analyse, DNA-Fragmentierung oder mit anderen geeigneten Apoptose-Markern,
beobachtet werden können.
-
In
unseren Untersuchungen wurde Taurolidin in Form einer 2 %-igen (Gew./Vol.)
Lösung
in einem Vehikel, welches 2% Dextrose und 5% Polyvinylpyrrolidin
enthielt, verwendet. Eine Lösung,
welche aus dem Vehikel allein bestand, wurde von Wallace Laboratories
(Cranbury, NJ) für
die Herstellung einer Vehikel-Kontrolle erhalten. Reagenzien und
Materialien wurden erhalten, wie folgt: Histopaque, Propidiumiodid
(PI), Lactatdehydrogenase (LDH)-Kit, Thromboplastin aus Kaninchenhirn,
Anisomycin und Dimethylsulfoxid (DMSO) von Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MO); 6% Dextran 70 in 0,9% NaCl (6% Dextran) von McGaw, Inc.
(Irvine, CA); RPMI, "Eagle's minimum essential
medium" (MEM) und "Hank's balanced salt solution" (HBSS) von Mediatech,
Inc. (Hendon, VA); Medium M199 von BioWhittaker, Inc. (Walkersville,
MD); Rinderkälberserum
(BCS) von HyClone Laboratories, Inc. (Logan, UT); 25% humanes Serumalbumin
(HSA) von den American Red Cross Blood Services (Washington, D.C.);
AIM-V-Medium von Gibco BRL (Grand Island, NY); LPS (E. coli 0111:B4)
und Rinderserumalbumin (Fettsäurenfrei)
von Calbiochem Corp. (La Jolla, CA); FITC-konjugierte anti-CD14-Antikörper, FITC-konjugierter
anti-CD3/PE-konjugierter anti-CD19-Simultest und PE-konjugierter
anti-CD16 von Becton Dickinson (Parsippany, NJ); und das TUNEL-Assaysystem
(In Situ Cell Death Detection Kit) von Boehringer Mannheim (Indianapolis,
IN).
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Zahlreiche
Zelllinien sind untersucht worden und sind in Tabelle I aufgelistet.
MM6-Zellen, welche
von dem peripheren Blut eines Patienten mit akuter Monoblastenleukämie (M5)
abgeleitet worden sind, waren ein großzügiges Geschenk von Dr. H. Ziegler
Heitbrock. Die K562-Zelllinie, welche aus Zellen aus der Flüssigkeit im
Pleuraraum eines Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie im Blastenschub
entwickelt wor den ist, wurde von der American Type Culture Collection
(ATCC) (Rockville, MD) erhalten. K562-Zelllen können induziert werden, so dass
sie zu Vorstufen der Monozyten-, Granulozyten- und Erythrozyten-Reihe
differenzieren. NL-60-Zellen, welche ausgehend von Leukozyten des
peripheren Bluts eines Patienten mit akuter Promyelozytenleukämie entwickelt
worden sind, wurden von der ATCC erhalten. HL-60-Zellen präsentieren
Oberflächenrezeptoren
und reagieren mit zytochemischen Anfärbereagenzien, weiche für Granulozytenzellen
spezifisch sind. REH-Zellen, welche von Zellen von einer akuten
Lymphoblastenleukämie
abstammen, wurden von der ATCC erhalten. REH-Zellen haben einen
nicht-T,nicht-B-Phänotyp.
Jurkat ist eine humane leukämische T-Zelllinie,
welche von der ATCC erhältlich
ist. ECV304, eine spontan transformierte unsterbliche Endothelzelllinie,
welche aus menschlicher Nabelschnur abgeleitet worden ist, wurde
von der ATCC erhalten. Die humane Fibroblastenzelllinie GM5387,
welche aus Gewebe, welches durch eine fötale Lungenbiopsie erhalten
worden ist, abgeleitet worden ist, wurde von dem NIGMS Human Genetic
Mutant Cell Repository erhalten.
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Tabelle
1. Getestete Zelllinien
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Alle
Zellen wurden in einer 5% CO2 enthaltenden
Atmosphäre
bei 37°C
kultiviert. MM6-Zellen
wurden in RMPI, ergänzt
mit 10% BCS, 2 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamycin (RPMI + 10%
BCS) kultiviert. In einigen Experimenten wurden MM6-Zellen einmal
mit HBSS ohne Ca++ oder Mg++ und
einmal mit AIM-V gespült,
bevor sie schließlich
in AIM-V, ergänzt
mit 0,01% BCS (AIM-V + 0,01% BCS) resuspendiert wurden. Es ist gezeigt
worden, dass AIM-V die Langzeitkultur von Makrophagen unterstützt (Helsinki
et al., "Long-term
cultivation of functional human macrophages in teflon dishes with
serum-free media",
J. Leuk. Biol. 44:111 (1988)) und in den vorliegenden Experimenten
behielten in AIM-V kultivierte MM6-Zellen wenigstens zehn Tage lang hohe
Lebensfähigkeit
und zeigten Vermehrungsraten, die nur geringfügig langsamer waren als bei
Zellen, die in mit 10% BCS ergänztem
RPMI kultiviert wurden. AIM-V wurde mit einer geringen Menge BCS
(0,01%) ergänzt,
um eine Quelle für
LPS-bindendes Protein, welches die Reaktion von Monozytenzellen-
auf LPS verstärkt,
bereitzustellen. Ulevitch, R.J., und Tobias, P.S., "Recognition of endotoxin
by cells leading to transmembrane signaling", Curr. Opin. Immunol. 6:125 (1994).
HL-60, REH und Jurkat wurden in RPMI, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem
fötalem
Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamycin, kultiviert.
ECV304 wurden in M199, ergänzt
mit 10% FBS, mM L-Glutamin
und 50 μg/ml
Gentamycin, kultiviert. GM5387 wurde in MEM, ergänzt mit 20% FBS, 2 mM L-Glutamin
und 50 μg/ml
Gentamycin, kultiviert.
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Mononukleäre Zellen
des humanen peripheren Bluts (PBMC) wurden aus heparinisiertem Blut
durch Zentrifugation unter Verwendung von Histopaque wie anhand
der Instruktionen des Herstellers isoliert. Die isolierten PBMC
wurden in RPMI, ergänzt
mit 10% BCS, suspendiert und wurden unmittelbar danach in Experimenten
verwendet. Wie durch Durchflusszytometrie bestimmt wurde, bestanden
PBMC typischerweise aus 11 ± 2%
Monozyten und 80 ± 13%
Lymphozyten, wobei die restlichen zytometrischen Ereignisse hinsichtlich
der Größe mit Plättchen und
Zellaggregaten konsistent sind.
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Humane
Granulozyten wurden aus heparinisiertem Blut durch Verdünnen des
Bluts 1:1 mit 6% Dextran, um die roten Blutkörperchen zu sedimentieren,
dann Zentrifugieren, um Leukozyten-reiches Plasma zu erhalten, isoliert.
Die übrigen
roten Blutkörperchen
wurden durch 20-sekündige
Inkubation mit 0,2% NaCl lysiert. Nach der Lyse wurde NaCl bis zu
einer Endkonzentration von 0,9% zugesetzt, die Probe wurden zentrifugiert
und das Zellpellet in HBSS, enthaltend 0,5% HSA, resuspendiert.
Die Zellsuspension wurde mit einem gleichen Volumen Histopaque (Sigma)
unterschichtet. Nach einer Zentrifugation blieben die PBMC oberhalb der
Histopaque-Schicht, während
die Granulozyten sedimentiert worden waren. Die Reinheit der gesammelten Granulozyten
wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von PE-konjugiertem
anti-CD19 bestimmt.
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Gewebefaktor- und TNFα-Expression
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Die
Induktion der Expression von Gewebefaktor (TF) durch bakterielle
LPS wurde in zahlreichen Zelllinien, einschließlich mononukleären Zellen
des humanen peripheren Bluts, der humanen Monozytenzelllinie Mono
Mac 6 (MM6) und Granulozyten, gezeigt. Die Induktion der Expression
von Gewebefaktor wurde durch Behandlung mit Taurolidin blockiert.
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Für die Induktion
der TF- oder TNFα-Expression
wurden MM6-Zellen oder PBMC entweder in RMPI, ergänzt mit
10% BCS, oder in AIM-V + 0,01% BCS kultiviert und durch Zugabe von
LPS bis zu Endkonzentrationen von 10 bis 100 ng/ml stimuliert. Mit
Taurolidin behandelte Zellen erhielten Endkonzentrationen von 10 bis
100 μg/ml
Taurolidin, wobei parallele Kulturen entweder kein Taurolidin oder
eine vergleichbare Verdünnung
mittels des Vehikels allein erhielten. Ausgenommen, wenn angegeben,
wurden Taurolidin und LPS zu den Zellkulturen gleichzeitig zugegeben.
Für die
TF-Bestimmung wurden Zellen und Kulturmedien zusammen durch Zugabe
von Triton X-100 (1% Endkonzentration) und EDTA (7 mmol/l Endkonzentration)
behandelt und die resultierenden Lysate durch ELISA gemessen. Rezaie,
A.R., et al. "Expression
and purification of a soluble tissue factor fusion protein with
an epitope for an unusual calcium-dependent antibody", Protein Expression and
Purification 3:453 (1992). Für
die TNFα-Bestimmung
wurden Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 250 × g entfernt
und die Überstände wurden
durch ELISA gemessen. Houston et al., "Endothelial cells and extracellular
calmodulin inhibit monocyte tumor necrosis factor release and augment
neutrophil elastase release", J.
Biol. Chem. 272:11778-11785 (1997). Um zu untersuchen, ob Taurolidin
mit der ELISA-Messung von TF interferierte, wurde Taurolidin zu
Lysaten von Zellen, die zuvor nicht mit dem Arzneimittel behandelt
worden waren, hinzugesetzt. Taurolidin hatte keine Auswirkung auf
die Messung der TF-Konzentrationen.
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Eine
Anzahl von früheren
Untersuchungen hat gezeigt, dass Monozyten des peripheren Bluts
auf eine LPS-Stimulierung durch Expression von TF ansprechen, wobei
die maximale Expression typischerweise vier bis sechs Stunden nach
der LPS-Behandlung auftritt. Schwartz et al., "Murine lymphoid procoagulant activity induced
by bacterial lipopolysaccharide and immune complexes is a monocyte
prothrombinase",
J. Exp. Med. 155:1464 (1982); Gregory et al., "Regulation of tissue factor gene expression
in the monocyte procoagulant response to endotoxin", Mol. Cell Biol
9:2752 (1989). Darüber hinaus
sind Monozyten der einzige Zelltyp, der in PBMC-Präparaten
vorhanden ist, der in der Lage ist, TF zu exprimieren. Wenn sie
in AIM-V + 0,01% BCS kultiviert wurden, reagierten MM6-Zellen und
PBMC in einer ähnlichen
Weise auf eine LPS-Stimulation (1). Für MM6-Zellen
wurde eine maximale TF-Expression mit 10 ng/ml LPS erzielt, was
zu einer 11-fachen Induktion der TF-Expression verglichen mit nicht-stimulierten
Zellen führte.
Für PBMC
war die maximale TF-Expression > 30-mal
höher als
bei nicht-stimulierten
Zellen. Wenn MM6-Zellen in RPMI + 10% BCS kultiviert wurden, wurden ähnliche
Zeitabläufe
der LPS-induzierten TF-Expression beobachtet, obwohl die maximale
Induktion der TF-Expression mit 100 ng/ml LPS erzielt wurde, was
zu einer 4,3-fachen
Induktion der TF-Expression verglichen mit nicht-stimulierten Zellen
führte.
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Es
wurde die Fähigkeit
von Taurolidin, die LPS-induzierte TF-Expression in MM6 und PBMC
zu hemmen, untersucht. Taurolidin blockierte in Konzentrationen
von 50 μg/ml
oder höher
die Induktion der TF-Expression in MM6-Zellen durch LPS vollständig, während Vehikel
allein (verwendet in einer Verdünnung
vergleichbar zu jener von 100 μg/ml
Taurolidin) keine Wirkung hatte (2A). Niedrigere
Konzentrationen von Taurolidin (10 oder 25 μg/ml) hatten wenig oder keine
Wirkung auf die TF-Expression durch MM6-Zellen. Die TF-Expression durch LPS-stimulierte
PBMC wurde ebenfalls durch Taurolidin gehemmt (2B),
obwohl geringfügig
höhere
Konzentrationen erforderlich waren (d.h. es wurden 75 μg/ml Taurolidin
für eine
vollständige Hemmung
der TF-Expression benötigt,
verglichen mit 50 μg/ml
für MM6-Zellen).
Taurolidin zeigte eine ähnliche Wirksamkeit
bei der Blockierung der TF-Expression, wenn MM6-Zellen oder PBMC
in entweder RPMI + 10% BCS oder in AIM-V + 0,01% BCS kultiviert
wurden.
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Es
ist vorgeschlagen worden, dass einige der immunmodulatorischen Wirkungen
von Taurolidin von dessen Abbauprodukt, Taurin, resultieren. William
et al., "Taurolidine,
an antilipopolysaccharide agent, has immunoregulatory properties
that are mediated by the amino acid taurine", J. Leuk. Biol. 58:299 (1995). Dementsprechend
führten
wir, um diesen potentiellen Wirkungsmechanismus von Taurolidin zu
untersuchen, Experimente wie oben unter Verwendung von Taurin in
einer Konzentration von 44 μg/ml
(hinsichtlich der molaren Konzentration äquivalent zu jener, die aufgrund
des vollständigen
Abbaus von 50 μg/ml
Taurolidin erzeugt würde)
und höher
aus. Taurin hatte keine Wirkung auf die TF-Expression durch MM6-Zellen,
sogar bei Konzentrationen bis zu 0,5 mg/ml. Ein anderer vorgeschlagener
Wirkungsmechanismus von Taurolidin erfolgt über eine direkte Inaktivierung
von LPS. Pfirrmann, R.W., "Taurolin:
Ein neues Konzept zur antimikrobiellen Chemotherapie chirurgischer
Infektionen Einführung
und Übersicht". In Taurolin, Ein
Neues Konzept zur Antimikrobiellen Chemotherapie Chirurgischer Infektionen,
Brückner,
W.L., und Pfirrmann, R.W., (Hrsg.), München-Wien-Baltimore, Urban & Schwarzenberg,
S. 3, 1985. Dementsprechend wurde untersucht, ob die Vorinkubation von
Zellen mit Taurolidin deren nachfolgende Reaktion auf die LPS-Stimulation
beeinflussen würde
oder nicht. Es wurden ähnliche
Verringerungen bei der TF-Expression beobachtet, wenn Zellen 100 μg/ml Taurolidin
dreißig
Minuten vorab ausgesetzt, gespült
und dann LPS ausgesetzt wurden, verglichen mit Experimenten, in
denen Taurolidin und LPS gleichzeitig zugesetzt wurden. Folglich
war ein direkter Kontakt zwischen Taurolidin und LPS nicht erforderlich,
damit Taurolidin die nachfolgende Induktion der TF-Expression durch
LPS blockieren konnte.
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Taurolidin
hemmte die LPS-induzierte Sekretion von TNFα durch MM6-Zellen und PBMC (3). MM6-Zellen waren geringfügig empfindlicher
gegenüber
Taurolidin, da die maximale Hemmung mit 75 μg/ml Taurolidin erhalten wurde,
während
100 μg/ml
Taurolidin erforderlich waren, um die TNFα-Sekretion durch PBMC maximal
zu hemmen. Für
MM6-Zellen war die Konzentrationsabhängigkeit der Taurolidin-Hemmung zweiphasig,
wobei hohe Konzentrationen die TNFα-Expression stark hemmten und
mittlere Konzentrationen (insbesondere 25 μg/ml) die TNFα-Sekretion
bedeutend stimulierten. Taurin hatte in einer Konzentration von 44 μg/ml keine
Wirkung auf die TNFα-Expression
durch MM6-Zellen.
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Eine
Behandlung von Monozyten des peripheren Bluts oder kultivierten
MM6-Zellen mit Taurolidin hemmte die Induktion von TF in Reaktion
auf LPS stark. Die Expression von TF ist eine wichtige Effektorfunktion
von aktivierten Monozyten bei Sepsis, und frühere Studien haben insbesondere
gezeigt, dass blockierende Antikörper
gegen TF Paviane vor den tödlichen
Wirkungen von intravenösen
E. coli in einem Tiermodell für den
gramnegativen septischen Schock schützen können (Taylor et al., "Lethal E. coli septic
shock is prevented by blocking tissue factor with monoclonal antibody", Circ. Shock 33:127
(1991)) und die Koagulopathie, welche mit einer LPS-Injektion in
Schimpansen verbunden ist, lindern können (Levi et al., "Inhibition of endotoxin-induced
activation of coagulation and fibrinolysis by pentoxifylline or
by a monoclonal anti-tissue factor antibody in chimpanzees", J. Clin. Invest.
93:114 (1994)). Dementsprechend ist die Fähig keit von Taurolidin, die
Induktion von TF in Monozyten zu blockieren, ein wichtiger Aspekt
von dessen klinischer Wirksamkeit bei der Behandlung von Sepsis.
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Um
zu bestimmen, ob Taurolidin die LPS-induzierte TF-Expression in
PBMC in deren nativem Milieu, d.h. Vollblut, hemmen würde, wurde
ein Gewebefaktor-Aktivitätsassay
ausgeführt.
LPS (10 ng/ml) und Taurolidin (100-500 μg/ml) oder gleiche Verdünnungen
des Taurolidin-Vehikels wurden zu 5 ml-Aliquots von heparinisiertem
Blut hinzugesetzt und das Blut wurde in 50 ml-Zentrifugenröhrchen bei
37°C, welche
auf einem horizontal rotierenden Apparat mit 120 Upm rotierten,
inkubiert. Nach 4 h wurden PBMC aus dem Blut unter Verwendung von
Histopaque, wie zuvor beschrieben, gereinigt. Zellen wurden durch
3 Einfrier-Auftau-Zyklen lysiert und als Quelle für TF in
Gerinnungsassays verwendet. Für
diese Assays wurden 50 μl
Lysat (mit 2 × 107 Zellen/ml) zu 50 μl gepooltem normalem humanem
Plasma hinzugesetzt, 30 Sekunden bei 37°C inkubiert, dann wurden 50 μl 25 mM CaCl2 zugesetzt und die Gerinnselbildung wurde
unter Verwendung eines Diagnostica Stago-ST4-Koagulometers bestimmt.
Der Proteingehalt der Zellproben wurde durch den Bicinchoninsäureassay
(Pierce Chemical Company, Rockford, IL) bestimmt und verwendet,
um die Gerinnungsdaten zu normalisieren. Es wurde eine Standardkurve
mit Descyto-TF, rekonstituiert in PS/PC-Vesikeln gemäß der Methode von
Mimms et al. (Mimms et al., "Phospholipid
vesicle formation and transmembrane protein incorporation using
octyl glucoside",
Biochemistry 20:833-840 (1981)), erstellt. Eine Einheit von TF wurde
als jene, welche eine Gerinnselbildung nach 50 Sekunden Inkubation
mit CaCl2 bewirkte, definiert. Die TF-Aktivitätsassays
wurden an LPS-induzierten PBMC nach 4 h Behandlung in Vollblut ausgeführt. Ein
Dosis-Wirkungs-Effekt
von Taurolidin auf Monozyten-TF wird in Tabelle II veranschaulicht.
Taurolidin verringerte in einer Konzentration von 100 μg/ml die
TF-Aktivität
um 12%; 200 μg/ml
verringerten die Aktivität
um ungefähr
60% und eine Behandlung mit 500 μg/ml
Taurolidin führte
zu einem Verlust von ungefähr
75% der TF-Aktivität.
Dementsprechend wurden, wenn die PBMC mit Vollblut behandelt wurden,
bei Vergleich mit PBMC in Kulturmedium höhere Taurolidin-Konzentrationen
benötigt,
um TF zu hemmen. Ferner waren niedrigere Konzentrationen von Taurolidin
erforderlich, um die TF-Expression
herunterzuregeln, als sie benötigt
wurden, um eine Apoptose zu induzieren, wie nachfolgend beschrieben
wird.
-
Zusätzlich zu
deren Rolle bei der Pathologie von Sepsis ist die TF-Expression
auf der Oberfläche
von Leukämiezellen
(insbesondere akute myeloische Leukämien (AML) und akute Lymphoblastenleukämien (ALL))
mit schweren Koagulopathien bei Leukämiepatienten verbunden (Bauer
et al., "Tissue
factor gene expression in acute myeloblastic leukemia", Thromb. Res. 56:425-430
(1989); Hair et al., "Tissue
factor expression in human leukemia cells", Leuk. Res. 20:1-11 (1996); und Tanaka,
M. und Yamanishi, H., "The
expression of tissue factor antigen and activity on the surface
of leukemic cells",
Leuk. Res. 17:103-111 (1993). Diese Koagulopathien können lebensbedrohliche
thrombotische und Blutungsepisoden wie auch die Entwicklung von disseminierter
intravasaler Koagulation (DIC) umfassen. Darüber hinaus können Episoden
von Thrombose und DIC bei solchen Leukämiepatienten durch Chemotherapie
induziert werden. Die Fähigkeit
von Taurolidin, die Expression von TF durch Leukämiezellen zu verringern (exemplifiziert
durch die MM6-Zelllinie), sollte dementsprechend hilfreich sein,
um die Inzidenz und Schwere von Koagulopathien bei Leukämiepatienten
sogar bei Dosen, die die Leukämiezellen
nicht töten,
zu verringern.
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Tabelle
II. Wirkung einer Taurolidin-Behandlung auf die Gerinnung Aktivität von LPS-induzierten
PBMC
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Wirkung von Taurolidin
auf Zelllebensfähigkeit
und -vermehrungsraten
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Apoptose
ist eine kontrollierte Form des Zelltods, welche durch die Tatsache
gekennzeichnet ist, dass weder Ausgangszellen noch apoptotische
Körper
hinsichtlich der Membranen permeabel werden. Diese Charakteristik
unterscheidet die Apoptose von einer Nekrose, bei welcher der Zelltod
das Aufbrechen von Zellmembranen mit umfasst. Die Bestimmung der
Apoptose wurde ausgeführt
durch Bestimmen der Integrität
der Zellmembranen von verschiedenen Zelllinien, kontinuierliche
Langzeitkultivierung von Zellen nach einer Taurolidin-Behandlung,
um die Vermehrungsrate und die Membranpermeabilität nach einer
Taurolidin-Behandlung zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass
Taurolidin Apoptose anstelle von Nekrose von Leukämiezellen
verursacht.
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Bei
diesen Experimenten wurde die Integrität von Zellmembranen nach einer
Taurolidin-Behandlung durch
Trypanblau-Ausschluss und durch Messen der Freisetzung von LDH in
MM6-, K-562-, HL-60- und REH-Zellen bestimmt. Da BCS signifikante
Mengen von LDH enthält,
wurden diese Experimente an Zellen ausgeführt, die in AIM-V + 0,01 BCS
kultiviert wurden. Eine vierstündige
Behandlung von Zellen wurde in 0,01% BCS enthaltendem AIM-V ausgeführt, um
einen nachfolgenden LDH-Assay ohne Interferenz aufgrund des BCS
(welche auftritt, wenn normales Kulturmedium, welches 10% BCS enthält, verwendet
wird) zu ermöglichen.
Dementsprechend wurden MM6-Zellen (5 × 105 Zellen/ml)
mit Taurolidin vier Stunden in AIM-V + 0,01% BCS behandelt, wonach
ein Aliquot von dieser Zellsuspension für eine Messung der LDH-Freisetzung
entfernt wurde. Ein paralleles Aliquot von Zellen wurde durch drei
Zyklen von Einfrieren/Auftauen lysiert und die freigesetzte LDH-Menge
wurde als 100% angenommen. Die übrigen
Zellen wurden in HBSS gespült
und in Vermehrungsmedium für
eine Messung der Vermehrungsraten resuspendiert.
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Nach
einer mikroskopischen Untersuchung von MM6-Kulturen, welche vier
Stunden mit 100 μg/ml Taurolidin
behandelt worden waren, erschienen die Zellen kleiner als Kontrollzellen
zu sein, und es wurde beobachtet, dass die Kulturen zahlreiche kleine,
kugelförmige
Körper
enthielten, die Trypanblau ausschlossen. Im Rahmen einer Untersuchung
wurde die Integrität
der Zellmembran durch Messung der LDH-Freisetzung in PBMC und MM6-Zellen,
welche in AIM-V + 0,01% BCS kultiviert wurden, bestimmt. Nach einer
Behandlung mit 0 bis 50 μg/ml
Taurolidin für
vier Stunden reichten die LDH-Konzentrationen
in den behandelten Kulturen von 6 bis 9% von jenen von durch Einfrie ren/Auftauen
lysierten Zellen (Mittelwerte aus drei separaten Experimenten),
was sich nicht signifikant von LDH-Konzentrationen in Kulturen,
die nicht mit Taurolidin behandelt worden waren, unterschied. Zusätzlich waren
nach einer vierstündigen
Behandlung Kontroll- und mit Taurolidin behandelte Zellen in gleichem
Maße in
der Lage, Trypanblau auszuschließen (4A, Tag
1). Wenn jedoch Taurolidin-behandelte MM6-Zellen gespült und in
Vermehrungsmedium resuspendiert wurden, wurden 65% der 50 μg/ml Taurolidin
ausgesetzten Zellen an dem Tag nach der Behandlung Trypanblau-positiv
(4A, Tag 2), was anzeigt, dass die Plasmamembran
permeabel geworden war. Im Gegensatz dazu waren nur 5% der unbehandelten
("Kontrolle") und mit Vehikel
behandelten Zellen Trypanblau-positiv. Zellen, die mit 50 μg/ml Taurolidin
vier Stunden behandelt worden waren, vermehrten sich nicht, wenn
sie in Vermehrungsmedium zurückgegeben
wurden, während
Zellen, die mit Vehikel allein oder mit 25 μg/ml Taurolidin behandelt worden
waren, ähnliche
Vermehrungsraten zu jenen, die bei unbehandelten Zellen beobachtet
wurden, zeigten (4B). Im Rahmen einer anderen
Untersuchung wurden K-562-, HL-60- und REH-Zellen nach einer vierstündigen Behandlung
mit Taurolidin getestet und die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefasst.
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Tabelle
III. Ergebnisse von einer vierstündigen
Behandlung mit Taurolidin
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Mit
50 μ/ml
Taurolidin behandelte HL-60-Zellen. In diesen Proben war die im
Kulturmedium vorhandene LDH 8,3 ± 2,3% von jener, welche durch
vollständig
lysierte Zellen freigesetzt wurde, verglichen mit 2,3 ± 0,8%,
welche in Kontrollkulturen gemessen wurden. Alle Proben von allen
anderen Zelllinien zeigten LDH-Konzentrationen, die ≤ 7% von lysierten
Zellproben waren (n = 3). Nach einer vierstündigen Behandlung wurden die
Zellen gespült
und in Vermehrungsmedium zurückgegeben
und hinsichtlich Lebensfähigkeit
und Vermehrung über
die folgenden 3 Tage überwacht.
Es wurden Konzentrationen von Taurolidin von 25 μg/ml bis 100 μ/ml verwendet,
um Unterschiede bei der Empfindlichkeit von Zelllinien gegenüber Taurolidin
hervorzuheben. Der Trypanblau-Assay von allen Proben war am Tag
1 (nach 4 Stunden Behandlung) äquivalent
zu der Kontrolle, was anzeigt, dass eine Taurolidin-Behandlung keine
schnelle Permeabilität
von Zellmembranen bewirkte, was nahelegt, dass diese Verbindung
keine Zellnekrose bewirkte. Über
die folgenden Tage zeigten jedoch alle von Leukämien abgeleiteten Zelllinien
eine fortschreitende Permeabilität
für Trypanblau
nach einer Behandlung mit Taurolidin-Konzentrationen von 50 μg/ml oder
höher mit
der Ausnahme von K562-Zellen (5A, 6A, 7A, 8A und 9A).
MM6-, K562- und Jurkat-Zellen zeigten keine Zunahme der Trypanblau-Anfärbung nach
einer Behandlung mit 25 μg/ml
Taurolidin, während
HL-GO- und REH-Zellen empfindlicher waren. Wie erläutert, ist
eine am Ende auftretende Permeabilität von Zellmembranen bei einer
in vitro-Apoptose unvermeidlich. K562-Zellen zeigten eine Hemmung
der Vermehrung nach einer Taurolidin-Behandlung mit 50 μg/ml oder
mehr, wie dies die anderen von Leukämien abgeleiteten Zelllinien
taten (5B, 6B, 7B, 8B und 9B).
Zelllinien zeigten unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber Taurolidin
in Hinblick auf die Zellvermehrung, wobei K562- und Jurkat-Zellen
am wenigsten beeinflusst wurden und die HL-60-Vermehrung nach einer
Taurolidin-Behandlung
am stärksten
gehemmt wurde.
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Die
adhärenten
Zelllinien ECV304 (Endothelzellen) und GM5387 (Fibroblasten) zeigten
keine signifikante Zunahme der Trypanblau-Anfärbung von Zellen während einer
viertägigen
Kultivierung nach Taurolidin-Behandlung (10A und 11A). Die Proliferation von diesen Zellen war
jedoch nach einer Behandlung mit 50 und 100 μg/ml Taurolidin gehemmt (10B und 11B).
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Nachweis der Apoptose
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Es
wurde die Wirkung von Taurolidin auf Zelllinien von verschiedenen
Linien in Hinblick auf eine Apoptose ausgewertet. Eine Behandlung
mit wirksamen Mengen von Taurolidin führte zu einer Apoptose bei
verschiedenen Monozyten-, Granulozyten- und zahlreichen Leukämie-Zelllinien,
aber nicht bei Lymphozyten.
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Nach
einer Behandlung mit entweder Taurolidin oder der Vehikel-Lösung wurde
der Zelltod auf eine von zwei Weisen bestimmt. Bei der ersten Methode
wurde das für
eine Apoptose charakteristische DNA-Fragmentierungsmuster nachgewiesen
durch Extraktion der DNA mit niedrigem Molekulargewicht aus Zellen
unter Verwendung eines Phosphat-Citrat-Puffers (Darzynkiewicz et
al., "Assays of
cell viability: discrimination of cells dying by apoptosis", Methods Cell Biol.
41:15 (1994)) und Unterwerfen der extrahierten DNA einer Agarose-Gelelektrophorese.
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Bei
der zweiten Methode wurde die DNA-Fragmentierung über einen
TUNEL-Assay gemäß den Anweisungen
des Herstellers nachgewiesen. Bei dieser Methodik wurden 2 × 106 Zellen mit 2% Paraformaldehyd fixiert,
mit 0,1% Triton X-100/0,1% Citrat permeabilisiert, bei 37°C mit terminaler
Desoxynukleotidyltransferase und FITC-dUTP inkubiert, gespült und durch
Durchflusszytometrie analysiert. Ein verstärktes FITC-Signal zeigt eine
Apoptose-spezifische DNA-Fragmentierung an. Gavriali et al., "Identification of
programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA
fragmentation",
J. Cell Biol. 119:493 (1992). Parallele Aliquots von nicht-fixierten
Zellen wurden mit PI und FITC-konjugiertem anti-CD14 behandelt und
durch Durchflusszytometrie analysiert, um Zellen mit permeablen
Zellmembranen zu identifizieren (da PI an DNA bindet, aber aus Zellen
mit intakten Plasmamembranen ausgeschlossen ist) und auch um die
Zellspezifität
des apoptotischen Signals zu bestimmen.
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Für die durchflusszytometrische
Analyse von Zellen wurde ein Becton-Dickinson FACSCalibur-Instrument
verwendet. Die Bestimmung des Zelldurchmessers (Vorwärts-Streulicht; FCS)
und der Granularität
(Seitwärts-Streulicht;
SSC) wurden an nicht-fixierten
Zellen ausgeführt.
Die Unterscheidung zwischen Lymphozyten und Monozyten wurde durch
deren charakteristische Unterschiede in FSC und SSC ermöglicht und
durch die Anfärbung
von Monozyten mit FITC-markierten anti-CD14-Antikörpern und
von Lymphozyten mit einer Kombination von FICT-konjugiertem anti-CD3
und PE-konjugiertem
anti-CD19 bestätigt.
Nach einer Inkubation mit Taurolidin (mit oder ohne gleichzeitige
LPS-Behandlung) wurden die Zellen zweimal mittels Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung,
welche 0,1% Rinderserumalbumin (PBSA) enthielt, gespült und 1 × 106 Zellen wurden in 0,1 ml PBSA resuspendiert.
Nachdem 5 μl
FITC-konjugierter anti-CD14
zugesetzt worden war, wurden Zellen im Dunkeln auf Eis 15 min inkubiert
und dann bei 250 × g
zentrifugiert. Zellen wurden in 500 μl PBSA, enthaltend 5 μg/ml PI,
resuspendiert und einer Durchflusszytometrie unterworfen.
-
Taurolidin-behandelte
MM6-Zellen und Monozyten des peripheren Bluts zeigten eine verringerte
Zellgröße, wie
durch eine Abnahme bei FSC und SSC veranschaulicht wird, wenn die
Zellen durch Durchflusszytometrie analysiert wurden (12). Nach einer dreistündigen Behandlung mit Taurolidin
zeigten MM6-Zellen eine ungefähr
30%-ige Abnahme bei FSC, wie dies Monozyten des peripheren Bluts
nach einer sechsstündigen
Behandlung taten. Diese morphologischen Veränderungen (verringerte Zellgröße und Auftreten
von kugelförmigen
Körpern)
wurden von einer intakten Plasmamembran begleitet, was anzeigt,
dass Taurolidin bei Monozytenzellen eine Apoptose induziert.
-
Apoptose
ist mit einer Fragmentierung von genomischer DNA in den internukleosomalen
Verknüpfungsregionen
verbunden, was als eine charakteristische Leiter von DNA-Fragmenten nach einer
Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden kann. Arends, M.J., und
Wyllie, A.H., "Apoptosis:
mechanisms and roles in pathology", Int. Rev. Exp. Path. 32:223 (1991).
Dementsprechend wurde DNA mit niedrigem Molekulargewicht aus Taurolidin-behandelten
MM6-Zellen extrahiert und einer Elektrophorese in Agarosegelen unterworten.
Mit 50 μg/ml
Taurolidin vier Stunden behandelte Zellen zeigten ein hervorstechendes
Leitermuster von DNA-Fragmenten, während unbehandelte und mit
Vehikel behandelte Zellen dies nicht taten (13). Diese
Zellen waren nicht mit LPS behandelt worden; es wurden jedoch identische
Ergebnisse festgestellt, wenn LPS während der Taurolidin-Behandlung
anwesend war. Diese Ergebnisse unterstützen die Schlussfolgerung,
dass Taurolidin eine Apoptose in MM6-Zellen induziert.
-
Um
zu untersuchen, ob eine Taurolidin-Behandlung eine Apoptose in Monozyten
des peripheren Bluts induzierte, wurde eine Technik, um die DNA-Fragmentierung
auszuwerten, eingesetzt die auf gemischte Populationen von Monozyten
und Lymphozyten angewendet werden konnte. Dementsprechend wurde
eine TUNEL-Analyse an PBMC 3, 6 oder 24 h nach der Behandlung mit
25 oder 100 μg/ml
Taurolidin ausgeführt.
Aliquots von geernteten Zellen wurden auch mit FITC-konjugierten
anti-CD14-Antikörpern
und PI markiert, was eine Identifizierung von Monozyten (CD14-positive
Zellen) und von Zellen mit beschädigten
Zellmembranen (PI-positive Zellen) ermöglichte. Während relativ wenige der PBMC
nach einer dreistündigen
Inkubation TUNEL-positiv waren, war eine substantielle Population
von TUNEL-positiven Zellen nach sechs Stunden Inkubation mit 100 μg/ml Taurolidin
(Ereignisse rechts von der vertikalen Linie in 14)
gleichzeitig mit einem starken Verlust von TUNEL-negativen Monozyten
(Region R1 in 14; siehe auch Tabelle
IV) leicht erkennbar. Dementsprechend waren nahezu 75% der Monozyten
nach einer Behandlung mit 100 μg/ml
Taurolidin für sechs
Stunden TUNEL-positiv. Eine Bestätigung,
dass die TUNEL-positiven Zellen Monozyten waren, wurde durch Anfärbung mit
FITC-konjugiertem anti-CD14 erhalten. Niedrigere Dosen von Taurolidin
(25 und 50 μg/ml)
führten
zu geringeren Ausmaßen
von Apoptose-Induktion
(Tabelle IV). Taurolidin-behandelte und Kontrollzellen zeigten äquivalent
niedrige Konzentrationen von PI-positiven Zellen nach sechs Stunden,
was anzeigt, dass die Zellmembranen zu diesem Zeitpunkt intakt blieben
(Tabelle IV). Im Rahmen einer anderen Untersuchung, weiche in Tabelle
V zusammengefasst ist, zeigten Taurolidinbehandelte polymorphkernige
Zellen (Granulozyten) bei 100 μg/ml,
MM6-Zellen (Monozytenleukämie-Zelllinie)
bei 50 μg/ml
und eine Zelllinie einer akuten myeloischen Leukämie (HL-60) bei 50 μg/ml ein
hohes Ausmaß an
Apoptose, wie durch den geringen Prozentsatz von % TUNEL-negativen
Zellen angezeigt wird, und der geringe Prozentsatz von Propidiumiodid-positiven
Zellen bestätigte,
dass die behandelten Zellen intakt blieben.
-
Im
Gegensatz zu deren Wirkung auf Monozyten induzierte eine Behandlung
mit bis zu 100 μg/ml
Taurolidin für
sechs Stunden keine nachweisbare Apoptose bei der Lymphozyten-Population
von PBMC, wobei im wesentlichen 100% der Zellen TUNEL-negativ blieben
(14 und Tabelle IV).
-
Tabelle
IV. Dosis-Wirkung von PBMC auf Taurolidin: 6-stündige Behandlung
a
-
Taurolidin
induzierte in einer Konzentration von 100 μg/ml eine Apoptose von ungefähr 75% der
gereinigten Monozyten des peripheren Bluts, wenn diese Zellen in
Kulturmedium inkubiert wurden. Um jedoch das Milieu von Leukozyten
in vivo besser nachzuahmen, wurde die Induktion der Apoptose in
PBMC durch Taurolidin in Vollblut (mit Heparin-Antikoagulans versetzt)
untersucht. Wie zuvor, wurde die Apoptose durch Messen des Verlusts
von Monozyten aus einer TUNEL-negativen (keine DNA-Fragmentierung),
CD14-positiven Population von Zellen, welcher gleichzeitig mit dem
Auftreten einer TUNEL-positiven Population von Zellen auftrat, quantifiziert.
Die Behandlung von PBMC in Vollblut führte zu einer Verschiebung
der Taurolidin-Dosis-Wirkungs-Kurve. Konzentrationen von Taurolidin
bis zu 200 μg/ml
induzierten keine signifikante
-
Tabelle
V. Induktion von Apoptose durch Taurolidin
-
Apoptose,
wenn Zellen in Vollblut behandelt wurden (Tabelle VI und 15A). Jedoch führte
Taurolidin in einer Konzentration von 500 μg/ml zum Auftreten einer Population
von TUNEL-positiven Zellen (15B,
Region 3) und zum Verlust von 70% der TUNEL-negativen Monozyten (Tabelle VI). Als
Positivkontrolle für
die Induktion von Apoptose wurden einige Zellen mit Anisomycin,
einem Proteinsynthese-Inhibitor, von welchem bekannt ist, dass er
Apoptose bei Monozyten induziert, behandelt. Die Anisomycin-Behandlung von PBMC
in Vollblut führte
auch zu einem Verlust von TUNEL-negativen Monozyten; jedoch wurden
nach einer 6-stündigen
Inkubation weniger TUNEL-positive Zellen nachgewiesen (15C, Region 3). Es gab keinen Hinweis auf eine
signifikante Wirkung von entweder Taurolidin oder Anisomycin auf
die Induktion von Apoptose bei Lymphozyten.
-
Tabelle
VI. Dosis-Wirkung von PBMC (in Vollblut) auf Taurolidin
a
-
Die
Wirkung von Taurolidin auf Granulozyten wurde durch eine TUNEL-Analyse
an Taurolidin-behandelten gereinigten Granulozyten untersucht. Diese
Experimente wurden in Kulturmedium anstelle von Vollblut ausgeführt. Granulozyten
wurden mit 100 μg/ml
Taurolidin behandelt, da gezeigt worden war, dass diese Konzentration
von Taurolidin für
Monozyten des peripheren Bluts, welche in Kulturmedium behandelt
werden, zur Apoptose führte.
TUNEL-positive Granulozyten reichten in unbehandelten Proben von
2% bis 30% und variierten je nach Blutspender. Eine Taurolidin-Behandlung
führte
zur Apoptose bei 92% der Granulozyten innerhalb von 6 Stunden (Tabelle
VII). Dementsprechend ist die apoptogene Wirkung von Taurolidin
nicht spezifisch für
Monozytenzellen.
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Tabelle
VII. Reaktion von Granulozyten auf 100 μg/ml Taurolidin
a
-
Im
Rahmen einer anderen Untersuchung wurden TUNEL-Assays an allen Zelllinien
6 h, nachdem die Zellen anfänglich
Taurolidin ausgesetzt worden waren (Zellen wurden 4 h behandelt,
gespült
und dann 2 weitere Stunden inkubiert, bevor der TUNEL-Assay ausgeführt wurde),
ausgeführt.
Für diese
Experimente wurde die Wirkung von 100 μg/ml Taurolidin mit jener von
1 μg/ml
Anisomycin, einem Proteinsynthese-Inhibitor, von dem gezeigt worden
ist, dass er Apoptose bei Monozyten- (Kochi, S.K., und Collier,
R.J., "DNA fragmentation and
cytolysis in U937 cells treated with diphtheria toxin or other inhibitors
of protein synthesis",
Exp. Cell Res. 208:296-302 (1993)), Granulozyten- (Polverion, A.J.,
und Patterson, S.D., "Selective
activation of caspases during apoptotic induction in HL-60 cells", J. Biol. Chem.
272:7013-7021 (1997)) und Epithelzelllinien (Liao et al., "Stress, apoptosis,
and mitosis induce phosphorylation of human keratin 8 at Ser-73 in tissues and
cultured cells",
J. Biol. Chem. 272:17565-17573 (1997)) induziert, verglichen. Taurolidin
und Anisomycin induzierten eine Apoptose in MM6-, HL-60- und Jurkat-Zellen
(Tabelle VIII). MM6- und HL-60-Zellen wurden in ähnlicher Weise beeinflusst,
mit > 80% TUNEL-positiven
Zellen nach 6 h. Jurkat-Zellen waren weniger empfindlich mit ungefähr 50% Zellen,
die induziert worden waren, eine Apoptose nach einer Taurolidin-Behandlung
zu durchlaufen. Nach 6 h waren 73% der Anisomycin-behandelten REH-Zellen
apoptotisch, wobei weniger als 20% der Taurolidin-behandelten REH-Zellen TUNEL-positiv
waren. Jedoch zeigte ein Assay von Zellen 24 h nach der Behandlung
an, dass Taurolidin Apoptose in REH-Zellen induziert (Tabelle IX),
dass diese aber weniger schnell als bei einer Anisomycin-Behandlung
auftritt, was nahelegt, dass diese beiden Mittel möglicherweise
durch unterschiedliche Mechanismen wirken. K562- Zellen waren am widerstandsfähigsten
gegen eine Apoptose mit weniger als 10%
TUNEL-positiven Zellen 6 h nach der Behandlung mit entweder Anisomycin
oder Taurolidin. Nach 24 h wurde ein gewisses Ausmaß an Induktion
von Apoptose gezeigt, wobei ungefähr 20% der Taurolidin-hehandelten
K562 TUNEL-positiv wurden.
-
Tabelle
VIII. Reaktion von Zelllinien auf Taurolidin und Anisomycin
-
-
Weniger
als 0,1% der ECV304- oder GM5387-Zellen waren 6 h nach der Behandlung
mit Taurolidin oder Anisomycin TUNEL-positiv (Tabelle VIII). Dementsprechend
induziert keines dieser Agentien eine schnelle DNA-Fragmentierung
in diesen Zelltypen. Es gab jedoch eine ungefähr 70%-ige Zunahme der Anzahl
von Ereignissen von subzellularer Größe, aufgezeichnet durch Durchflusszytometrie
nach Taurolidin-Behandlung dieser Zellen, was eine gewisse Wirkung
von Taurolidin auf die Zellintegrität anzeigt. Diese Zellfragmente
wurden durch Propidiumiodid nicht angefärbt, was damit übereinstimmt,
dass sie apoptotische Körper
sind.
-
Zusammengefasst,
waren Konzentrationen von Taurolidin, die wirksam waren, die Induktion
der TF- und TNFα-Expression
in LPS-stimulierten Monozytenzellen zu hemmen, auch wirksam, Apoptose
in diesen Zellen zu induzieren. Dies wurde durch Analyse der DNA-Fragmentierung
von MM6-Zellen durch Agarose-Gelelektrophorese und durch TUNEL-Analyse
von Monozyten des peripheren Bluts ermittelt. Die Induktion von
Apoptose erfolgte relativ schnell, da sie innerhalb Tabelle
IX. Reaktion von Zelllinien auf Taurolidin und Anisomycin. Apoptose
24 h nach der Behandlung
a ![Figure 00320001](https://patentimages.storage.googleapis.com/cf/1e/1f/60486e79a0e894/00320001.png)
von vier bis sechs Stunden nach der Behandlung
bei MM6-Zellen und Monozyten nachweisbar war. In diesem Zeitraster
war eine DNA-Fragmentierung leicht nachweisbar bei Zellen, deren
Plasmamembranen nach wie vor intakt waren. Gegen Ende nahm jedoch
die Zellpermeabilität
zu (d.h. 24 h nach der Behandlung mit Taurolidin). Dies ist wahrscheinlich
auf eine "sekundäre Nekrose", ein unvermeidbares
Ergebnis einer fortgeschrittenen in vitro-Apoptose, wo es kein System
für Phagozytose
und intrazellulären
Abbau von apoptotischen Zellen gibt, zurückzuführen. Es ist jetzt herausgefunden
worden, dass Taurolidin auch die Apoptose von Monozytenzellen, welche
in Vollblut behandelt werden, induziert. Die wirksame Konzentration
(500 μg/ml)
ist das fünffache
von jener, die benötigt
wird, wenn gereinigte PBMC in Kulturmedium behandelt werden. Es
ist vorgeschlagen worden, dass Metabolite von Taurolidin LPS inaktivieren
und Bakterien abtöten
durch Bildung von Vernetzungen zwischen primären Amin- und Hydroxylgruppen
an LPS und bakteriellen Zellwänden.
(Browne et al., "Taurolin,
a new chemotherapeutic agent",
J. Appl. Bacteriol. 41:363-368 (1976); Pfirrmann, R.W., "Tau rolin: ein neues
Konzept zur antimikrobiellen Chemotherapie chirurgischer Infektionen
Einführung
und Übersicht". In Taurolin, ein
neues Konzept zur antimikrobiellen Chemotherapie chirurgischer Infektionen,
herausgegeben von Brückner,
W.L., und Pfirrmann, R.W., München-Wien-Baltimore:
Urban und Schwarzenburg; S. 3-23 (1985)). Wenn Taurolidin Apoptose
durch ähnliche
Mechanismen induziert, könnte
eine Inkubation in Vollblut dessen Wirksamkeit verringern, indem
eine hohe Konzentration von nicht-zellulären Substraten bereitgestellt
wird. Tatsächlich
ist darüber
berichtet worden, dass Taurolidin mit Proteinen in Plasma und Serum
reagiert (Jones et al., "A
study of the stability of taurolidine in plasma and protein-free
serum", Int. J.
Pharm. 64:R1-R4 (1990)). Taurolidin verringert auch die TF-Aktivität von LPS-induzierten
Monozyten, welche in Vollblut behandelt werden, wobei eine signifikante
Verringerung bei Taurolidin-Konzentrationen, die so gering wie 200 μg/ml sind,
festgestellt wird.
-
Taurolidin
induziert sogar bei Konzentrationen (in Vollblut) bis zu 500 μg/ml kein
signifikantes Ausmaß von
Apoptose in Lymphozyten. Jedoch ist Taurolidin wenigstens so wirksam
bei der Induktion von Apoptose bei Granulozyten, wie es bei Monozyten
ist, wie durch TUNEL-Assays, welche an gereinigten Zellen, die in Kulturmedium
behandelt wurden, ausgeführt
wurden, gemessen wurde. Es ist darüber berichtet worden, dass sowohl
Granulozyten als auch Monozyten, aber nur ein Bruchteil der Lymphozyten
konstitutiv das Fas-Antigen exprimieren (Iwai et al., "Differential expression
of bcl-2 and susceptibility to anti-Fas-mediated cell death in peripheral
blood lymphocytes, monocytes, and neutrophils", Blood 84:1201-1208 (1994)) und dass
eine Vernetzung des Fas an der Zelloberfläche die Weiterleitung von apoptotischen
Signalen in Zellen hinein vermittelt (Itoh et al., "The polypeptide encoded
by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis", Cell 66:233-243
(1991)). Obwohl der Mechanismus, durch den Taurolidin Apoptose induziert,
unbekannt ist, beeinflusst Taurolidin Monozyten und Granulozyten,
aber nicht Lymphozyten.
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Die
Spezifität
der Fähigkeit
von Taurolidin, Apoptose zu induzieren, wurde weiter untersucht,
indem dessen Wirkungen auf verschiedene Leukämiezelllinien bestimmt wurden.
Taurolidin war bei der Induktion von Apoptose am wirkungsvollsten
bei Monozyten-(MM6)
und Granulozyten- (HL-60) -leukämie-Zelllinien
analog zu dessen starker Wirkung auf Monozyten des peripheren Bluts
und Granulozyten. Taurolidin war jedoch auch in der Lage, Apoptose
in einem signifikanten Anteil von Jurkat-Zellen, einer Lym phozytenleukämie-Zelllinie,
zu induzieren. Ungefähr
50% von diesen Zellen wurden innerhalb von 6 Stunden Behandlung
apoptotisch. Taurolidin induzierte unter ähnlichen Versuchsbedingungen
keine Apoptose bei Lymphozyten des peripheren Bluts, was anzeigt,
dass von Leukämien
abgeleitete Zellen möglicherweise
empfindlicher gegenüber
Taurolidin sind als normale Zellen. Taurolidin war auch in der Lage,
Apoptose in der Lymphoblastenzelllinie REH zu induzieren, obwohl
der Prozess in diesen Zellen verglichen mit MM6 und HL-60 verzögert war.
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Wie
im Rahmen von früheren
Untersuchungen festgehalten worden war (Evans et al., "Activation of the
Abelson tyrosine kinase activity is associated with suppression
of apoptosis in hemopoietic cells", Cancer Res. 53:1735-1738 (1993)) war
die multipotente Zelllinie K562 relativ resistent gegen Apoptose.
Anisomycin induzierte weniger als 10% von diesen Zellen, TUNEL-positiv
zu werden. Taurolidin war etwas wirkungsvoller, da ungefähr 20% von
diesen Zellen 24 h, nachdem die Behandlung begonnen worden war,
TUNEL-positiv wurden.
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Obwohl
Taurolidin die Proliferation der Endothel- und Fibroblasten-Zelllinien
hemmte, wurde ein tragfähiger
Beweis für
eine Induktion von Apoptose in diesen Zellen nicht erhalten. Die
Taurolidin-Behandlung verursachte keinen messbaren Zelltod, wie
durch die Tatsache gezeigt wurde, dass Zellen während der gesamten 4 Tage Kultivierung
nach der Behandlung Trypanblau-negativ blieben. Zusätzlich zeigten
diese Zellen keinen Hinweis auf eine Fragmentierung von DNA (TUNEL-Positivität), wenn
sie 6 h nach der Behandlung dem Assay unterzogen wurden. Die DNA-Fragmentierung
ist verwendet worden, um in Fibroblasten-Zelllinien auf Apoptose
zu testen (Kim et al., "Plateledderived
growth factor induces apoptosis in growth-arrested murine fibroblasts", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92:9500-9504 (1995)), einschließlich insbesondere des TUNEL-Assays (Gansauge
et al., "The induction
of apoptosis in proliferating human fibroblasts by oxygen radicals
is associated with a p53- and p21WAF1CIP1 induction", FEBS Letters 404:6-10
(1997)). Einige Fibroblasten-Zelllinien zeigten jedoch keinen DNA-Abbau
und die Apoptose wurde durch Veränderungen
in der Zellmorphologie und die Ablösung von Zellen von dem Kulturgefäß identifiziert
(Boyle et al., "Apoptosis
in C3H-10T1/2 cells: roles of intracellular pH, protein kinase C,
and the Na+IH+ antiporter",
J. Cell Biochem. 67:231-240 (1997)). Diese Untersuchungen untersuchten
zusätzlich
Zellen auf Hinweise auf Apoptose 24-48 h nach der Behandlung mit dem
Apoptose bewirkenden Mittel.
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Obwohl
Beweise für
eine DNA-Fragmentierung von Fibroblasten- oder Endothelzellen nicht
gefunden wurden, enthüllte
eine Analyse durch Durchflusszytometrie eine Zunahme der Zellfragmentierung.
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Taurolidin
induziert Apoptose bei Monozyten, Granulozyten und zahlreichen Leukämiezelllinien.
Bei allen getesteten Zellen war es ein so effizientes Apoptose bewirkendes
Mittel wie der Proteinsynthese-Inhibitor Anisomycin. Eine intravenöse Verabreichung
von Taurolidin verursacht keine nachweisbaren Veränderungen bei
den hämatologischen
Variablen, einschließlich
der Leukozytenzahl (Browne, M.K., "Pharmacological and clinical studies
with taurolin".
In Taurolin, Ein Neues Konzept zur Antimikrobiellen Chemotherapie
Chirurgischer Infektionen, Brückner,
W.L., und Pfirrmann, R.W. (Hrsg.), München-Wien-Baltimore, Urban & Schwarzenberg, S.
51-60 (1985); Browne et al., "A
controlled trial of taurolin in established bacterial peritonitis", Surg. Gynecol Obstet.
146:721-724 (1978); und Williats et al., "Effect of the antiendotoxic agent, taurolidine,
in the treatment of sepsis syndrome", Crit. Care Med. 23:1033-1039 (1995)).
Taurolidin ermöglicht
eine Behandlung für
verschiedene Leukämieerkrankungen
aufgrund seiner Fähigkeit,
Apoptose in Leukämiezellen
und Zellen in Vollblut zu induzieren, in Verbindung mit dem Fehlen
einer generalisierten Toxizität
in menschlichen Individuen.
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Die
Induktion von Apoptose in Monozytenzellen durch Taurolidin schien
unabhängig
von jeglichen Wirkungen, die das Arzneimittel auf LPS haben könnte, zu
sein. Tatsächlich
induzierte Taurolidin eine Apoptose in Monozytenzellen in Abwesenheit
einer LPS-Behandlung.
Dementsprechend haben wir zusätzlich
zu dessen potentieller Nützlichkeit
als Behandlung für
Sepsis, über
die zuvor von anderen berichtet worden ist, herausgefunden, dass
Taurolidin ein sehr effektives, selektives Induktionsmittel von
Apoptose in Monozyten- und myeloischen Zellen ist und bei der Behandlung
von bestimmten Leukämien,
einschließlich
Monozyten- und myeloischen Leukämien,
nützlich
ist.
-
Beispiel 1: In vitro-Screeningtest
für eine
Taurolidin-Behandlung
-
Es
wird ein in vitro-Screeningtest am Blut eines Patienten ausgeführt, um
zu bestimmen, ob die Monozyten-, myeloischen und/oder Leukämiezellen
auf eine Taurolidin-Therapie
ansprechen würden,
indem sie eine Apoptose zeigen.
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Die
Leukozyten des peripheren Bluts eines Patienten werden aus heparinisiertem
Blut durch Zentrifugation unter Verwendung von Histopaque, Ficoll-Hypaque
oder eine jegliche andere geeignete Methodik isoliert. Nach der
Abtrennung werden die isolierten Leukozyten in RPMI + 10% BCS suspendiert.
Aliquots der suspendierten Zellen werden mit 10-100 μg/ml Taurolidin
4-6 h behandelt. Mit der Vehikel-Lösung allein behandelte Zellen
werden als Kontrollen verwendet. Das Vorliegen einer Apoptose wird
als das Ausmaß von
DNA-Fragmentierung unter Verwendung von entweder der Agarosegelelektrophorese
oder des TUNEL-Assays gemessen. Ein hohes Ausmaß von Apoptose, welches in
vitro bei den Leukämiezellen
des Patienten beobachtet wird, zeigt eine günstige Prognose bei einer in
vivo-Taurolidin-Behandlung an, während
ein minimales Ausmaß von Apoptose
nahelegt, dass eine alternative Therapie zu bevorzugen sein könnte.
-
Beispiel 2: In vivo-Taurolidin-Behandlung
-
Um
die Anzahl von Monozyten- und/oder myeloischen Leukämiezellen
zu verringern, wird ein Patient mit Monozyten- und/oder myeloischer
Leukämie
mit ungefähr
10 bis 500 mg/kg Körpergewicht
Taurolidin, welches entweder intravenös oder intraperitoneal verabreicht
wird, behandelt. Das Ansprechen des Patienten auf die Behandlung
wird durch eine Abnahme der WBC-Zahl (Leukozytenzahl) und Untersuchung
der Leukozyten des Patienten auf eine Abnahme der Leukämiezellen überwacht.
Die Behandlung kann fortgesetzt werden, wenn nötig.
-
Beispiel 3: In vivo-Taurolidin-Behandlung,
um Koagulopathien zu verringern
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Um
den Zustand erhöhter
Gerinnung, welcher mit einer TF-Expression auf zirkulierenden Leukämiezellen
verbunden ist, zu verringern, wird ein Patient mit Leukämie und
einer damit verbundenen Koagulopathie mit ungefähr 10 bis 500 mg/kg Körpergewicht
Taurolidin, welches entweder intravenös oder intraperitoneal verabreicht
wird, behandelt. Zusätzlich
kann die Behandlung vor oder gleichzeitig mit einer Standard-Krebs-Chemotherapie verabreicht
werden, um die Inzidenz oder Schwere von thrombotischen Komplikationen
zu verringern. Das Ansprechen des Patienten auf die Behandlung wird
durch eine jegliche von verschiedenen hämatologischen Standard-Messgrößen für Hyperkoagulabilität oder DIC überwacht.
Diese Messgrößen umfassen Verlängerung
der Prothrombinzeit, erhöhte
Konzentrationen von Fibrin-Abbauprodukten (FDP), erhöhte Konzentrationen
von Fibrin-D-Dimer und Hypofibrinogenämie. Ein positives Ansprechen auf
die Behandlung wird durch eine Rückkehr
dieser Messgrößen in Richtung
auf normale (Kontroll)-Niveaus angezeigt. Die Behandlung kann fortgesetzt
werden, wenn erforderlich.