DE69233337T2

DE69233337T2 - Verwendung von CANP-Inhibitoren in pharmazeutischen Zubereitungen

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Publication number: DE69233337T2
Application number: DE69233337T
Authority: DE
Inventors: Helen Logothetou-Rella
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-06-03
Filing date: 1992-06-02
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2012-06-03
Also published as: EP0549742A1; NO930305L; ATE263574T1; CA2088671C; IL102079A; PT100560A; DE69233337D1; AU1907392A; JPH06502188A; GR1001044B; NO930305D0; JP3703828B2; NZ243003A; CA2088671A1; ES2215162T3; EP0549742B1; DK0549742T3; WO1992021373A1; AU646961B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von spezifischen Inhibitoren von calciumaktivierten neutralen Proteasen (CANPs) zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von Tumoren, besonders Krebs, Viruskrankheiten, AIDS, und als Verhütungsmittel.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine der letalsten Eigenschaften von malignen Zellen ist ihre Fähigkeit, normale Gewebe zu infiltrieren und in entfernte Bereiche zu metastasieren. Die normalen Bindegewebe bestehen aus Zellen, die in einer extrazellulären Matrix eingebettet sind, die Glykoproteine, Kollagen, Elastin und Proteoglykane enthält. Es sind Vorschläge gemacht worden, dass Tumorassozierte histolytische Enzyme bei dem invasiven Prozess durch Abbau des Matrixproteins helfen können (Hart, I. et al., 1980, JNCI 64: 891). Mehrere Studien haben sich auf diesen Gesichtspunkt der Tumorzellbiologie konzentriert, und erhöhte Proteaseproduktion ist bei vielen transformierten Zellen beobachtet worden (Jones P. A. und Declerk Y. A., 1980, Cancer Res. 40: 3222).
m- und μ-calciumaktivierte neutrale Proteasen (CANPs), auch bekannt als Calpain I und II, sind typische intrazelluläre Cysteinproteinasen der höheren Tiere. Es ist vermutet worden, dass sie an verschiedenen zellulären Funktionen beteiligt sind, die durch Ca²⁺ vermittelt werden, aber ihre exakte Funktion ist noch nicht klar. CANPs hydrolysieren Proteine beschränkter Klassen i vitro, die den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (Epidermal growth factor-Rezeptor (EGF-Rezeptor)), den aus Blutplättchen stammenden Wachstumfaktor-Rezeptor (platelet derived growth factor-Rezeptor (PDGF-Rezeptor)) und die Proteinkinase C einschließen. Es scheint, dass sie bei der Regulierung der Umsatzrate und des Abbaus von myofibrillären Proteinen des Muskels und von neuronalen Zytoskelettelementen beteiligt sind, was nahelegt, dass CANPs bei wesentlichen zellulären Funktionen beteiligt sind (Murachi T., 1983, Trends. Biochem. Sci. 8, 167–169).
Beim Untersuchen der Rolle von CANPs in den vorstehenden Prozessen sind mehrere exogene Inhibitoren dieses Enzyms verwendet worden, zum Beispiel Leupeptin, ein Peptid der Struktur N-Acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-arginal und E64, eine Epoxyverbindung der Peptidstruktur L-trans-3-carboxy-oxiran-2-carbonyl-L-leucylagmatin, die beide spezifische Inhibitoren der Thiolproteasen sind.
Leupeptin und E64 sind zur Verwendung bei der Behandlung der Duchenne-Muskeldystrophie vorgeschlagen worden (Hollenberg Sher J. et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(12), 7742–7744 und Komatsu K. et al., 1986, Exper. Neurol. 91, 23–29). Außerdem sind Leupeptin und E64 beim Fördern der Synapsenbildung und Innervation von Muskelfasern als pharmazeutische Präparate verwendet worden (PCT-Anmeldung WO-A-9000 401, 1990, University College, London).
E64 hemmt humane Plattenepithelkarzinom A431-Zellen in der mitotischen Metaphase (Shoji-Kasai, Y. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 146–150).
Auf dem Gebiet von Krebs ist nur Leupeptin verwendet worden, und es ist festgestellt worden, dass es nur das in-vitro-Zellwachstum von Rattenhirnzellen hemmt: (Nishiura I. et al., 1979, Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 19(1), 1–8).
Es wird angenommen, dass die kleinen Moleküle Leupeptin und E64 Zellmembranen durchdringen und in Nervenenden und -Zellen hineinkommen können und folglich die calciumaktivierte Proteinase inhibieren (Nishiura I. et al., 1979, Neurol. Med. Chir. 19(1), 1–8 und PCT-Anmeldung WO-A-9 000 401, 1990, University College, London).
Dieses legte nahe, dass Leupeptin für therapeutische Zwecke verwendet werden könnte. Jedoch ist festgestellt worden, dass eine derartige Behandlung nicht besonders erfolgreich ist. Dieses ist so, weit CANPs durch Leupeptin nicht gehemmt werden (Mehdi S. et al. 1988, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 157(3) 1117–1123) oder nur teilweise gehemmt werden (Tsuji S. und Imahori K., 1981, J. Biochem. 1990, 233–240). Außerdem war das Substrat bei Malignitäten, bei welchem die Inhibitoren von CANPs wirken, bis jetzt unbekannt. Außerdem hemmten, wie später berichtet wird, Leupeptin und E64, die in den Tests gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, malignes Zellwachstum nicht.
Es ist veröffentlicht worden, dass maligne Zellen in Kultur aus humanem invasivem Urothelkarzinom Tumornoduli und Glykosaminoglykan-Membransäckchen (GSG) mit intrazellulärer sowie extrazellulärer Membranausdehnung bilden (Logothetou-Rella, H. et al., 1988a, Europ. Urol. 14(i), 61–64 und 65–71). Dieselben Beobachtungen wurden in humanen Trophoblastzellkulturen gemacht (Logothetou-Rella, H. et al., 1989, Histol. Histopath. 4: 367–374), während sie in humanen normalen Urothelzellen in Kultur nicht gefunden wurden (Logothetou-Rella, H. et al., 1988, Europ. Urol. 15, 259–263). Von der Beteiligung von GSG ist auch bei der Kapillarbildung berichtet worden, welche in Tumoren in vivo erhöht ist (Logothetou-Rella, H. et al., 1990, Histol. Histopath. 5: 55–64).
Die charakteristische extrazelluläre Matrix (GSG) von malignen und embryonalen Zellen ist PAS- und PAS-Krankheit-positiv, identifiziert durch Papanicolaou-Färbung durch ihre hellgrüne Farbe (EA-Farbe) und glatte bis fibrilläre transluzente Textur. GSG ist in malignen Zellen in intrazellulären und extrazellulären Membransäckchen verteilt und angesammelt. Die GSG-Membransäckchen lassen Membranausdehnungen entstehen, welche Kanäle bilden, durch welche das grüne GSG vom Inneren zur Außenseite der Zelle durchgeleitet wird, die Bildung von Tumornoduli erhöhen und in vitro in andere Zellen eindringen.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Überraschenderweise sind ein neuer Mechanismus von Zelle-zu-Zelle-Invasion und Substratbildung (GSG gebundene CANP), verbreitet z. B. bei der Bildung von Tumoren, Viruskrankheiten, AIDS und Befruchtung, festgestellt worden.
Außerdem ist festgestellt worden, dass das Verabreichen spezifischer Inhibitoren von CANPs zum Bereitstellen einer wirksamen Konzentration der Inhibitoren im menschlichen oder Tierkörper die vorher genannten Prozesse inhibieren würden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wurde festgestellt, dass die intrazelluläre und extrazelluläre Matrix (Säckchen-GSG gebundene CANPs), die in vitro und in vivo durch die Wechselwirkung von malignen mit normalen Zellen erzeugt werden, als Substrat für die spezifischen Inhibitoren von CANPs verwendet werden können.
Die intrazellulären GSG gebundenen CANPs-Säckchen stehen mit der extrazellulären Umgebung mit Membranausdehnungen in Verbindung und bilden große extrazelluläre Kanäle (voller Substrat) oder Diffusionsmatrix, die ermöglicht, dass das große Molekül (ungefähr MW 240,000) der Inhibitoren von CANPs auch in die Zellen hineinkommt und GSG gebundene CANPs inaktiviert. Die Säckchen-GSG gebundenen CANPs und die extrazelluläre Matrix z. B. in Tumoren werden durch einen neuen Mechanismus von Zelle-zu- Zelle-Invasion produziert, die mit dem von Viruszellinfektionen und der Befruchtung verwandt sind. Die Inhibitoren von CANPs töten selektiv maligne Zellen nur durch Inaktivierung der intrazellulären und extrazellulären GSG gebundenen CANPs, einer speziellen Matrix, von welcher die Lebensfähigkeit und Ausbreitung nur von malignen Zellen abhängt.
Die Virusinfektion von Zellen und das Oozyt-Eindringen durch Spermatozoen sind biologische Phänomene, welche auch Zelle-zu-Zelle-Invasion einschließen, d. h. Zelleninvasion durch Virus und Oozyt-Invasion durch Spermatozoen erzeugen dieselbe extrazelluläre Matrix (Substrat) wie maligne Zellen und erfordern die Gegenwart von CANPs. Beruhend auf diesem neuen Mechanismus der Zelle-zu-Zelle-Invasion, zeigen die Inhibitoren von CANPs oder ihren aktiven Untereinheiten auch antivirale und empfängnisverhütende Wirkung.
Ein möglicher Mechanismus der Wirkung eines erfinderischen Inhibitors auf maligne Zellen könnte z. B. die Dissoziation des Inhibitortetramers bei Kontakt mit extrazellulärem GSG (Substrat) gebundenen CANPs zu Untereinheiten (z. B. Monomere, deren MW beträchtlich variiert und vom verwendeten Substrat hängt) und die Bildung eines inaktiven Inhibitor-Proteinasekomplexes (blaue hämatoxylinophe Granula) sein.
Dann können die folgenden Ereignisse stattfinden. Die Inhibitoruntereinheit, die extrazellulär produziert wird, kann durch die maligne Zellenmembran diffundieren und die endogenen CANPs inaktivieren, oder die intrazellulären aktivierten CANPs diffundieren extrazellulär in Richtung eines niedrigeren Konzentrationsgradienten (nach der Inaktivierung der extrazellulären aktivierten CANPs) und werden durch das extrazelluläre Inhibitormonomer inaktiviert. Auch beide Fälle könnten stattfinden. Die leeren zytoplasmatischen Vakuolen, die in Inhibitor-behandelten malignen Zellen beobachtet wurden, unterstützen die Diffusion von aktivierten CANPs und ihre Inaktivierung extrazellulär.
Außerdem sind die extrazellulären GSG-CANPs-Kanäle groß genug für den Durchgang des Inhibitors vollständig in die GSG-CANPs-Säckchen.
Die Wirkung der Inhibitoren von CANPs auf Spermatozoen legt nahe, dass Spermatozoen mit dem CANPs-Enzym verbunden sind, von welchem ihre Motilität, Lebensfähigkeit und Eindringfähigkeit abhängt. Die erhöhte Spermienmotilität, die bei hoher Ca²⁺-Konzentration beobachtet wird (Fakih et al., 1986, Fertil. Steril. 46(s), 938–944) konnte über die Aktivierung von Sperma endogenen CANPs erreicht werden. Die hohe Ca²⁺-Freisetzung durch die Eirinde bei Verhinderung der Spermatorrhoe (Steinhardt et al., 1977, Develop. Biol. 58, 185–196) könnten die Beteiligung der möglichen Inhibitoren von CANPs der Oozyten einschließen.
Die zytologische Wirkung der Inhibitoren von CANPs auf Samenmuzin belegt stark, dass das aktive Enzym an Glykosaminoglykane, einem offensichtlich verbreiteten Substrat sowohl für die Protease als auch die Inhibitorwirkung, gebunden ist. Erneut, der Mechanismus der Wirkung der Inhibitoren auf Spermatozoen könnte die Dissoziation eines bestimmten Inhibitors bei Kontakt mit Muzin (Substrat) gebundenen CANPs und die Bildung eines inaktiven Inhibitor-Proteinasekomplexes (blaue hämatoxylinophe Granula) sein. Die Inhibitoruntereinheit, die nach Dissoziation extrazellulär produziert wird, diffundiert vermutlich durch die Spermatozoenmembran und inaktiviert die endogenen CANPs, oder CANPs bewegen sich extrazellulär in Richtung eines niedrigeren Konzentrationsgradienten nach Inaktivierung von extrazellulären CANPs. Die Inhibitoren von CANPs, die für normale Zellen nicht toxisch sind und für Spermatozoen toxisch sind, scheinen ein vielversprechendes männliches Verhütungsmittel zu sein.
In einem ersten Gesichtpunkt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines spezifischen Inhibitors von calciumaktivierten neutralen Proteinasen (CANPs) zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung eines Tumors, besonders Krebs bereitgestellt.
In einem zweiten Gesichtpunkt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines spezifischen Inhibitors von calciumaktivierten neutralen Proteinasen (CANPs) zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung einer Viruserkrankung bereitgestellt.
In einem dritten Gesichtpunkt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines spezifischen Inhibtors von calciumaktivierten neutralen Proteinasen (CANPs) zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von AIDS bereitgestellt.
In einem vierten Gesichtpunkt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines spezifischen Inhibitors von calciumaktivierten neutralen Proteinasen (CANPs) zur Herstellung eines Verhütungsmittels bereitgestellt.
Der spezifische Inhibitor von CANPs, der in der Erfindung verwendet wird, sind vorzugsweise endogene native Inhibitoren, die aus einer biologischen Quelle, wie Erythrozyten, Hirn, Herzmuskel, Lunge, Milz, Leber, Skelettmuskel, Niere, Hoden oder dergleichen, aber besonders aus Kaninchenskelett oder -leber, isoliert und gegebenenfalls gereinigt wurden, umfasst ein tetrameres Protein mit einem MW von ungefähr 240.000 auf der Basis seiner Elution von Sephadex G-200, das bei einem neutralen pH-Wert hitzestabil ist, wird bei Verdauung mit Trypsin zerstört und dissoziiert in seine Untereinheiten mit einem MW von ungefähr 60.000 durch 0,1–1 mM Ca²⁺ auf der Basis von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (wie durch Melloni et al. in Arch. of Biochem. and Biophys. Vol. 232, Nr. 2, 513–19, 1984 beschrieben). Hier offenbart sind auch alle pharmazeutischen verträglichen Salze.
Es wird angenommen, dass die MWs der aktiven Untereinheiten des spezifischen Inhibitors von den verwendeten Substraten (z. B. Casein, denaturiertem Globin usw.) abhängen. Deshalb kann das MW des aktiven Teils des Inhibitors höher sein, z. B. ungefähr 150.000 oder weniger, z. B. ungefähr 15.000, wie vorstehend angezeigt.
Ein bevorzugter Inhibitor, der aus Kaninchenskelett isoliert wurde, wird hergestellt und von Sigma Chemical Company, St. Louis, USA, unter der Produktnummer P-0787 verkauft.
Die Inhibitoren können auch synthetisch, besonders durch bio- und gentechnische Verfahren z. B. durch Expression in Escherichia Coli hergestellt werden.
In der vorliegenden Erfindung kann das pharmazeutische Präparat in Form einer Lösung, eines Pulvers, einer Injektion, Tablette, Kapsel, von Pillen, in einer schnellen oder verlängerten Freisetzungsform vorliegen, wobei jede eine geeignete Menge eines spezifischen nativen oder synthetischen und eventuell gereinigten Inhibitors oder seiner pharmazeutisch verträglichen Additionssalze zusammen mit bekannten geeigneten Excipienten enthält.
Die Inhibitoren können Menschen und Warmblütern vorzugsweise intramuskulär, subkutan, intraperitoneal, oder intravenös in einer Menge verabreicht werden, welche von der Art und der Schwere der Krankheit, der inhbitorischen Wirkung des Inhibitors, dem Weg der Verabreichung, der zu behandelnden Spezies, dem Gewicht und dem allgemeinen Zustand des Patienten abhängt und muss in den meisten Fällen schließlich vom verantwortlichen Arzt bestimmt werden. Allgemein liegt die Dosis zwischen etwa 1 mg/kg pro Tag und 25 mg/kg pro Tag. Jedoch können, wenn erforderlich, auch höhere Dosen, z. B. bis zu 100 mg/kg pro Tag, verabreicht werden.
Die überraschende Wirkung der Inhibitoren von CANPs sind durch die folgenden Tests bestätigt und überprüft worden, wobei alle Tests auch mit Aprotinin (Sigma A-4 529), Trypsin-Chymotrypsin Inhibitor (Sigma T-9777), Leupeptin (Sigma L-2884) und E64 (Sigma E-3132), gelöst in RPMI-1 640 mit 25 mM Hepes als Kontrollprotease-Inhibitoren durchgeführt worden sind. Alle Inhibitorlösungen wurden durch 0,22 μ Sartoriusfilter filtriert, in Aliquots aufgeteilt und bei –20°C eingefroren. Frische oder aufgetaute Inhibitorlösungen wurden verwendet.
Jedoch wurde die überraschende Wirkung nur durch die Inhibitoren von CANPs gemäß der Erfindung durchgeführt. In den folgenden Tests wurde das bräunlich-gelbbraune Pulver des Inhibitors von CANPs (Sigma Chemical Company, St. Louis, USA, Produktnummer P-0787), 50 U/645 mg Feststoff aus Kaninchenskelettmuskel, in 5 ml normalem RPMI-1640 mit 25 mM Hepes (Seromed) gelöst, was zu einer klaren gelbbraunen Lösung (10 U/ml) führte, wobei eine Unit (U) die Menge des Inhibitors ist, welche die Aktivität von 1 Unit von CANPs (Sigma Chemical Company, Produktnummer P 4533) bei pH 7,5 bei 30°C um 50% verringert (Reaktionsvolumen = 1,8 ml, 1 cm Lichtweg). Selbstverständlich sollte der Schutzbereich der Erfindung in den folgenden Beispielen nicht auf die Verwendung des konkreten Inhibitors reduziert werden.
BEISPIEL 1
Die Verwendung des nativen Inhibitors von CANP zur Inhibierung des Wachstums und der Lebensfähigkeit von malignen Zellen in vitro
Zellkultur-Etablierung
Stationäre Zellkulturen wurden aus humanen soliden Tumorgewebeproben durch enzymatische Verdauung etabliert. Maligne Lungenzellinien aus Lungenkarzinommetastasen, M-Zellen, P-Zellen und B-Zellen sind vor kurzem durch den Anmelder charakterisiert worden. Maligne Urothelzellkulturen wurden aus einer Gewebeprobe von Patienten mit invasivem Übergangszellkarzinom etabliert. Die fünf etablierten malignen Urothelzelllinien wurden als Pa-Zellen, R-Zellen, S-Zellen, Br-Zellen und IG-Zellen bezeichnet. Nur der Patient, aus dem die Pa-Zellen stammen, hatte intravesikale Blaseninfusionen von krebsbekämpfenden Arzneimitteln erhalten. Eine Melanom-Zellkultur (Ha-Zellen) stammte von einem männlichen Patienten, der an rektalem Primärmelanom litt, das an den Lymphknoten des rechten Arms metastasierte, aus denen Gewebeproben erhalten wurden.
Maligne Knochenmarkzellen stammten aus Knochenmarkabsaugungen von fünf (5) Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie. Walker-Tumor-Rattenzellen wurden aus transplantiertem Tumorgewebe in Wistar-Ratten isoliert. Normale humane Leberzellen (L-Zellen) wurden aus einer Lebergewebeprobe von einem männlichen Patienten isoliert, der sich der Chirurgie zum Entfernen seiner Gallenblase unterzog.
Normale Eileiterzellen (F-Zellen) wurden aus einer Gewebeprobe von einem weiblichen Patienten isoliert, die sich einer Totalhysterektomie unterzog. Normale Blasenzellen (N-Zellen) sind vorher charakterisiert worden (Logothetou-Rella, H. et al., 1988, Europ. Urol. 15, 259–263). Weiße Blutzellen aus fünf gesunden Personen wurden auch als Kontrollzellen verwendet.
Mäuseembryonen, die im 2-Zell-Stadium geerntet wurden, wurden in kompletter Earle's Salzlösung (complete Earle's balanced salt solution (EBSS, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika)) zum Stadium von entwickelten Blastozysten kultiviert. Als als Embryonalzellen heraus waren, wurde die Kultur für die Zytologie verwendet. Amniotische Embryonalzellen von fünf (5) schwangeren Frauen, die für die Pränataldiagnose kultiviert wurden, wurden in dieser Studie auch verwendet. Alle Zellkulturen wurden in komplettem Medium, RPMI-1640 (Seromed), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (Seromed), Glutamin und Antibiotika (Seromed), wachsen gelassen und bei 37°C in einem CO₂-Inkubator mit wassergesättigter Atmosphäre inkubiert. Stammzellen werden, in flüssigem Stickstoff gefroren, gelagert.
Zytogenetische Analyse
Von der Chromosomenanalyse von M-Zellen, P-Zellen und B-Zellen ist vor kurzem berichtet worden (Logothetou-Rella, H. et al., 1991, J. Exper. Clin. Cancer Res, zur Veröffentlichung eingereicht). Maligne Urothel-Pa-Zellen bestanden nur aus malignen Zellklonen, mit Polyploidien bis zu 147 Chromosomen und komplexen strukturellen Anomalien. S-Zellen bestanden aus einem malignen Zellklon mit regulären Tetraploidien, bis zu 20% der Zellpopulation und 80% normale Zellklone. Die Br-Zellen bestanden aus normalen und malignen Zellklonen, aber die ausführliche Chromosomenanalyse war erfolglos. Melanom-Ha-Zellen zeigten nur double minutes. Leber-L-Zellen, Eileiter-F-Zellen und amniotische Embryonalzellen waren zytogenetisch normal.
Zwei Verfahren wurden verwendet, um die Zytotoxizität der Inhibitoren auf Tumor- und normale Zellen zu bestimmen.
a) Zytologische Änderungen von Zellkulturen in ununterbrochener Gegenwart der Inhibitoren
Sieben Arten von komplettem RPMI-1640-Medium wurden hergestellt. Eines wurde mit 1 U/ml des Inhibitors von CANPs ergänzt; das Zweite mit 2 mg/ml Trypsin-Chymotrypsin-Inhibitor; das Dritte mit 1 mg/ml Aprotinin; das Vierte mit 1 mg/ml Leupeptin; das Fünfte mit 1 mg/ml E64; das Sechste mit allen fünf Inhibitoren mit derselben Konzentration und das Siebente komplettes RPMI-1640 als Kontrollmedium.
10 Glaspetrischalen (Durchmesser von 5 cm) wurden jeweils mit 1 × 10⁶ M-Zellen und andere 10 Schalen jeweils mit 1 × 10⁶ P-Zellen angeimpft. Doppelte Zellkulturen erhielten jede Art von komplettem Medium, das die Inhibitoren und Kontrollkulturen enthielt, die nur komplettes Medium enthalten. Die Zellkulturen wurden 120 Stunden lang bei 37°C in einem CO₂-Inhibitor mit wassergesättigter Atmosphäre inkubiert. Das Kulturmedium wurde in jedem Fall 24 und 72 Stunden nach Kulturbeginn gegen ein frisches derselben Art ausgetauscht. Eine Hälfte der Zellkulturen wurde 72 Stunden und die andere Hälfte 120 Stunde nach Kulturinitiator in 50% Ethanol fixiert. Alle Zellkulturen wurden mit dem Papanicolaou-Verfahren gefärbt.
Postkonfluente stationäre Zellkulturen von malignen M-Zellen, P-Zellen und normalen L-Zellen (20 Tage ununterbrochener Züchtung), die reichliche extrazelluläre Matrix produziert hatten, erhielten frisches komplettes RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 1 U/ml des Inhibitors von CANPs und wurden 3 Tage lang bei 37°C inkubiert, dann in 50% Ethanol fixiert und mit dem Papanicolaou-Verfahren gefärbt.
Trypsin-Chymotrypsin-Inhibitor, Aprotinin, Leupeptin und E64 beeinflussten das Wachstum und die Zytologie von M- und R-Zellen, verglichen mit Kontrollzellkulturen, nicht.
Der Inhibitor von CANPs verursachte nach 72 Stunden ununterbrochener Gegenwart in Kulturen große Abblätterung von Zellen und extrazellulärer Matrix (ECM) in das Kulturmedium. Alle abgeblätterten Zellen waren tot (gemäß Trypanblau-Färbung), bestehend aus hyperchromatischen, pyknotischen Kernen, wenig Zytoplasma und Kernen mit Schwanzstücken. Auf der Kulturschalenoberfläche blieben einige, pro Feld zählbare, adhärierte Fibroblasten-ähnliche Zellen, cytologisch normal am Leben. Alle anderen Zellkulturschalen (ausgenommen Fallnr. 1 und Fallnr. 6, welche den Inhibitor enthielten) und die Kontrollschalen waren voll mit Zellen und Kernvlimma (= „NV", „Vlimma" = Kugel; Zustand einer Parasitenzelle nach zahlreichen Teilungsvorgängen unter Verwendung einer Wirtszelle, wo sie die Größe eines Nucleolus mit einem Kernkopf und einem gefestigten Schwanzstück erreicht, das einem kleinen immotilen Spermatozoon ähnlich ist. Die Produktion von Kernköpfen, das Einschießen und Implantieren in andere Zellen findet hauptsächlich in Kulturbereichen statt, wo sich extrazelluläre Glykosaminoglykane gebundenes CANP und Zellmembranen befinden. In Normalzellkulturen werden NV nicht festgestellt, während es z. B. in humanen soliden und hämatologischen Tumoren beobachtet wurde, die frei von oder während der Produktion noch an der Mutterzelle befestigt sind. NVs sind Zellendprodukte von unvollständiger, ungleicher, asymmetrischer Teilung von malignen Zellen. Bei ihrer Produktion trennen sie sich schließlich von ihrer Mutterzelle ab und suchen zufällig eine Wirtszelle. Wenn NVs in den Kern einer normalen Wirtszelle implantiert und eingebracht werden, kann es als Verfahren betrachtet werden, das einer Befruchtung oder Virusinfektion ähnlich ist. Infolgedessen wird der Genotypus und Phänotypus der Wirtszelle geändert und verhält sich wie eine transformierte Zelle. Nach vielen Teilungen verliert die Wirtszelle ihr Zytoplasma und kann sich nicht mehr selbst teilen; sie benötigt die Hilfe durch eine andere Wirtszelle oder extrazelluläre Matrix, ist folglich gezwungen, ein Parasit zu werden und NVs zu produzieren.), die unzählbar weren pro Feld, ohne Zellenabblätterung, mit makroskopisch sichtbaren grünen, fibrillären, transluzenten ECM- und GSG-Säckchen. Die Beobachtungen waren nach 120 Stunden ununterbrochener Gegenwart des Inhibitors von CANPs in Zellkulturen persistent, außer dass die überlebenden Fibroblasten-ähnlichen Zellen in Gegenwart des Inhibitors von CANPs aufgewachsen waren.
Postkonfluente M- und P-Zellkulturen zeigten Zellen mit vakuolisiertem Zytoplasma als Stamm und degenerierten Kernen verschiedener Größen mit und ohne Schwanzstücken. Die abgerundeten, abgelösten, toten Zellen hielten auf der Kulturschalenoberfläche durch ein Netzwerk von mikroskopisch sichtbaren hämatoxylinophilen (blauen) Membranen aneinander. Die ECM- und GSG-Säckchen waren verschwunden. Stattdessen lagen mikroskopisch sichtbare große Massen von hämatoxylinophilen Granula vor.
b) Kurzzeitkulturverfahren mit flüssigem Medium (Chang S. Y. et al. 1989, Eur. Urol. 16, 51–56)
Die Zellen wurden mit Trypsin-EDTA (Seromed) abgelöst und in komplettem RPMI-1640 resuspendiert, und Zellzählungen wurden unter Verwendung eines Hämozytometers durchgeführt. Die Zählungen lebensfähiger Zellen wurden unter Verwendung des 0,4% Trypanblau-Ausschlussverfahrens beurteilt. Die Zellen wurden dann einmal mit komplettem RPMI-1640 gewaschen, 8 min lang bei 200 g zentrifugiert, mit 30.000–200.000 Zellen pro 0,5-ml Medium in komplettem RPMI-1640 resuspendiert und in Polypropylenröhrchen geimpft, wie wie folgt gezeigt:
Doppelte Proben von Zellen wurden für jede Konzentration des Inhibitors getestet. Alle Proben wurden eine Stunde lang bei 37°C in einem Wasserbad inkubiert und geschüttelt. Dann wurden die Zellen 8 min lang durch Zentrifugierung bei 200 g zweimal mit komplettem RPMI-1640 gewaschen. Jedes gewaschene Zellpellet wurde in 1 ml komplettem RPMI-1640 resuspendiert, die Zellen wurden dann durch vorsichtiges Pipettieren vereinzelt und wurden dann über einen Zeitraum von 4 Tagen kurzzeitiger Kultur bei 37°C unter einer wassergesättigten Atmosphäre von 5% CO₂ in Mikrotiterplatten mit 24 Vertiefungen (Costar Cambridge Mass.) ausgesät. Die Zytotoxizitätseinschätzung wurde unter Verwendung des Farbstoffausschlussverfahrens von 0,4% Trypanblau durchgeführt. Der Grad der Zytotoxizität wurde gemäß der folgenden Formel gemessen:
Der Inhibitor von CANPs tötete selektiv alle Arten von malignen getesteten Zellen (Tabelle 1), während ermöglicht wurde, dass normale Zellen innerhalb derselben oder verschiedenen Kultur wachsen und sich ausbreiten (Tabelle 2). Die optimale Konzentration von 4–5 U/ml Inhibitor tötete alle malignen Klone, während niedrigere Konzentration einen niedrigeren Prozentsatz von malignen Zellen tötete. Eine höhere Konzentration änderte die Ergebnisse nicht. Der Inhibitor war für normale Zellen, einschließlich Leberzellen, Eileiterzellen und WBCs, nicht zytotoxisch. Zytogenetische Analyse der überlebenden Zellen (in gemischten Zelllinien) nach der Inhibitor-CANPs-Behandlung zeigte einen normalen Karyotyp. Der Inhibitor von CANPs war auch für embryonale Zellen zytotoxisch. Tabelle 1. Kategorien von Fällen mit verschiedenen getesteten Zellen

+: zeigt den zytogenetischen Zustand jedes Zelltyps an

Tabelle 2. Sensitivität der Zellen gegenüber verschiedenen Konzentrationen des Inhibitors von CANPs
Die Zytotoxizität des Inhibitors in jeder Probe wurde aus dem Mittel von doppelten Proben erhalten.
BEISPIEL 2
Verwendung des Inhibitors von CANPs auf die Lebensfähigkeit von normalen und malignen Urothelgeweben
Tumor- (von 5 Patienten) und normale (von 5 Personen) Gewebestücke von humanem Urothelium mit einer Größe von 2 mm × 2 mm × 2 mm wurden in komplettem RPMI-1640 gewaschen, mit feiner Pinzette vorsichtig angefasst, ein Teil (von jeder Art von Gewebe) in komplettem RPMI-1640 (Kontrolle) und ein Teil in der Inhibitorlösung (10 U/ml) in Polypropylenröhrchen eingetaucht und eine Stunde lang bei 37°C in einem Inkubator mit wassergesättigter Atmosphäre und 5% CO₂ inkubiert. Alle Gewebestücke wurden dann sorgfältig in komplettem Medium gewaschen und wurden in Polypropylenröhrchen (1 Stück/Röhrchen), das 2 ml komplettes RPMI-1640 enthielt, eingetaucht und dann 4 Tage lang bei 37°C inkubiert. Die Gewebestücke wurden in Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet, und Gewebeschnitte wurden mit Eosin-Hämatoxylin gefärbt. Die abgeblätterten Zellen in den Röhrchen mit den malignen Gewebestücken wurden 10 min lang in einem konischen Polypropylenröhrchen absitzen gelassen, dann auf Objektträger gestrichen, mit Zytospray fixiert und mit Papanicolaou gefärbt. Der Inhibitor von CANPs verursachte massive Zellenabblätterung der malignen Gewebe. Histologische Untersuchung der mit Inhibitor behandelten malignen Gewebe zeigte nekrobiotische bis nekrotische Bereiche und große Gewebebereiche, die aus eosinophiler extrazellulärer Matrix bestehen, die von Zellen denudiert ist. Die abgeblätterten Zellen waren tot, mit degenerierten Kernen und Spermatozoen-ähnlicher Morphologie, getrennt voneinander und mangelnd an grünem ECM. Die sehr wenigen abgeblätterten Zellen des malignen Gewebes bei Fehlen des Inhibitors von CANPs zeigten kompakte Zellenmassen in grünem ECM mit zusammenhängenden Zellrändern.
Normale Urothelgewebe blieben nach Behandlung mit dem Inhibitor intakt.
BEISPIEL 3
Die Verwendung des Inhibitors von CANPs gegen humane Tumor-Knötchen in vivo
Ein weiblicher Patient mit Brustkrebsmetastasen, mit umfangreichen Leber-, Knochen- und subkutanen Metastasen, nach wiederholter Chemotherapie und Strahlenbehandlung ohne Erfolg und auch in allgemeinem schlechtem Gesundheitszustand, genehmigte den Versuch des Arzneimittels in ihren subkutanen Knötchen. Die Knötchen wurden über die ganze Brust und einige im Abdomen ausfindig gemacht. Ein hartes Knötchen in der Größe einer Erbse wurde in seiner Mitte mit 0,1 ml (1 U/0,1 ml) Inhibitor von CANPs, der in RPMI-1640 mit 25 mM Hepes gelöst war, injiziert. Vierundzwanzig Stunden später wurde das behandelte Knötchen und ein nahe gelegenes unbehandeltes Kontrollknötchen entfernt, in Formalin fixiert und zur mikroskopischen Untersuchung in Paraffin eingebettet.
Der Patient zeigte 1, 4 und 24 Stunden nach der Injektion keine allergische Reaktion. Das Knötchengefühl war 4 Stunden nach der Injektion weicher und etwas kleiner. Vierundzwanzig Stunden später war das Knötchen weich und auf die Hälfte seiner ursprünglichen Größe reduziert. Das behandelte Neoplasma wurde durch degenerierte kleine Zellaggregation und viele degenerierte Einzelzellen histologisch charakterisiert. Die meisten Zellen hatten unregelmäßige pyknotische, karyolytische oder degenerierte vakuolisierte Kerne. Einige Zellen zeigten vakuolisiertes Zytoplasma. Im äußeren Randbereich des Tumors blieben einige neoplastische Zellen mit regelmäßigen Kernen, feinem Chromatin und schlanken Einzelnukleolen. Der Hauptbereich der Tumorzelldegeneration, die durch den Inhibitor von CANPs verursacht wurde, wurde ungefähr zu einer Gesamtgröße von 3,4 mm × 2,5 mm aus dem Haupttumorsegmentbereich von 5,2 mm × 2,5 mm gemessen. Benachbarte Schweißdrüsen und die darüberliegende Epidermis blieben intakt. Es gab keine Entzündungsreaktion, nicht einmal um den hämorrhagischen Fissurbereich herum, der durch die Injektion verursacht wurde. Die histologische Untersuchung des Tumorknötchens ohne Behandlung zeigte, dass das Neoplasma durch lebensfähige große Säulen oder einzelne Fasern von neoplastischen Zellen mit verhältnismäßig einheitlichen eiförmigen oder runden Kernen mit fein punktiertem Chromatin und schlanken Nukleolen charakterisiert war. Das histologische Bild stimmte mit Brustkrebsmetastasen überein.
BEISPIEL 4
Die Verwendung der Inhibitoren von CANPs gegen Rattentumoren in vivo
Zwei Walker-Tumore wurden 2 Wochen nach der subkutanen Implantation von Tumorgewebe in männliche Wistar-Ratten herausgeschnitten. Die Tumorzellsuspension für die Injektion wurde hergestellt, wie vorher beschrieben (Fischer E. R. und Fischer B., 1959, 12, 926–928). Einer Gruppe von männlichen Wistar-Ratten, die jeweils 100 g wogen, wurde subkutan 10 × 10⁶ Walker-Tumorzellen in den linken Fußballen injiziert. Die Ratten wurden dann in vier Gruppen aufgeteilt, zwei Kontroll- und zwei behandelte Gruppen. Die Behandlung wurde eingeleitet, als Tumoren eine messbare Große von 50–100 mm³ erreicht hatten. In der ersten Gruppe von Ratten wurde jeder Ratte intraperitoneal 50 U/2,5 ml (645 mg/2,5 ml) Inhibitor von CANPs einmal täglich über einen Zeitraum von 2 Tagen (0,5 U/kg oder 6,45 mg/kg Körpergewicht der Ratte) injiziert.
Die zweite Gruppe von Ratten wurde intraperitoneal zweimal täglich 5 Tage lang mit einer Dosis von 0,25 U/kg (3,23 mg/kg) Körpergewicht der Ratte behandelt. Den Kontrollratten wurde jeweils 2,5 ml RPMI-1640-Medium mit 25 mM Hepes injiziert. Alle Ratten wurden 4 Tage nach der letzten Behandlung der injizierten Beine getötet, die der Kontrollgruppe waren alle mit Tumoren bedeckt, einschließlich bis zum Schulterblatt, und genaue Kontrolltumormessungen waren unmöglich. Die Tumor-Beine, Lymphknoten und Leber von allen Ratten wurden herausgeschnitten, in Formalin fixiert und für histologische Studien in Paraffin eingebettet. Die Tumorvolumina wurden jeden Tag nach der ersten Dosis mit Schiebern gemessen. Der Inhibitor von CANPs verursachte 50% Tumorrückbildung in der ersten Gruppe der behandelten Ratten und 90% in der zweiten Gruppe. Alle Gruppen (behandelt und Kontrolle) begannen zur Zeit 0 ohne irgendeinen wesentlichen Unterschied bezüglich des Tumorvolumens.
Die Ratten unter Behandlung waren gesund und zeigten keine allergische Reaktion oder Nebenwirkungen wegen der hohen Dosis des Inhibitors, der vom Skelettmuskel des Kaninchens stammte. Die histologische Untersuchung der Lebern der behandelten Ratten zeigte keine zytotoxischen Wirkungen, die durch den Inhibitor verursacht wurden, weit zentrale Venolen ohne Nekrose oder Zellschädigung beobachtet wurden.
Unter der ersten behandelten Gruppe entwickelte eine Ratte einen Unterleibsmetastasenfokus und eine andere einen Lebermetastasenfokus. Das Gefühl des Unterleibsfokus verschwand 24 Stunden nach der ersten Dosis. Die histologische Untersuchung zeigte Nekrose eines großen karzinomatösen Knötchens mit Bildung eines Abszesses, Nekrose der darüberliegenden Epidermis und Ulzeration. Der Lebermtetastasenfokus war nekrotisiert und zeigte nekrotisches Material mit Kerntrümmern in der Mitte und Rückstände von karzinomatösem Gewebe mit Mitosen in seiner Peripherie. Die Fussballentumore der behandelten Ratten zeigten nekrotische Bereiche variabler Größe mit Bildung von Mikroabzessen. Diese Ergebnisse werden wichtiger, wenn die Aggressivität von Walker-Tumorzellen berücksichtigt wird (Ratten sterben normalerweise 20 Tage nach der Tranplantation).
AUS BEISPIEL 1–4 ABGELEITETE ZUSAMMENFASSUNG
Das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung tötete alle malignen Zellen verschiedener chromosomaler Anomalien, verschiedenen Gewebe- und Speziesursprungs, ohne den Genotypus normaler Zellen zu beeinflussen.
Die beste in-vitro-Dosierung war die, die 4–5 Units des Inhibitors von CANPs pro Milliliter Lösung enthielt.
Dieses Arzneimittel war für normale Zellen, einschließlich Leber und WBCs, nicht zytotoxisch. Es zeigte ein breites Wirkungsspektrum auf verschiedenen Arten von humanen Tumoren. Es war für humane solide und hämatologische Tumorzellen zytotoxisch und für chemoresistente Tumorzellen (Lungen-P-Zellen und Blasen-Pa-Zellen) verschiedenen Tumorursprungs (Embryonalzellen waren gegenüber dem Inhibitor wegen ihrer Ähnlichkeit mit malignen Zellen sehr sensitiv) noch zytotoxischer.
Das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung, das an Rattentumoren getestet wurde, bewirkte eine 50–90%-Rückbildung der Haupttumoren, inhibierte die Metastasierung und bewirkte Nekrose der Metastasenfoki. Es war nicht immunogen, nicht toxisch, wurde geeigneterweise in einer täglichen Dosis von 0,5 U/kg (6,5 mg/kg) Körpergewicht in Einzel- oder geteilten Dosen verwendet. Die Verabreichung wird geeigneterweise bis zur kompletten Tumorrückbildung fortgesetzt.
BEISPIEL 5
Verhütungsmittelwirkung des Inhibitors von CANPs
Fertile, motile Spermien (nach Heraufschwimmtest) von 10 Spendern wurden in jeweils 4 Kunststoffreagenzgläser (5 ml, Falcon) verteilt. Zwei Reagenzgläser nahmen 0,4 ml-Spermiensuspension (600.000 Spermatozoen) und 0,6 ml komplettes EBSS auf. Die anderen beiden Reagenzgläser nahmen jeweils 0,4 ml-Spermiensuspension, 0,4 ml (10 U/ml) Inhibitor von CANPs und 0,1 ml fötales Rinderserum auf. Alle Reagenzgläser wurden 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Spermatozoen wurden dann zweimal mit komplettem EBSS gewaschen und zentrifugiert. Die Spermienpellets wurden jeweils in 2 ml komplettem EBSS resuspendiert und 18 Stunden lang bei 37°C inkubiert, wobei zu diesem Zeitpunkt die Spermatozoen mit der Eosin-Y-Lebensfähigkeits-Ausschluss-Färbung gezählt, auf Objektträger gestrichen, in 50% Ethanol fixiert und mit Papanicolaou gefärbt wurden.
Der Grad der Zytotoxizität, die durch den Inhibitor von CANPs verursacht wurde, wurde entsprechend der folgenden Formel gemessen:
Inhibitor behandelte und nichtbehandelte Spermien wurden in postkonfluente Granulosazellkulturen geimpft, 18 Stunden lang bei 37°C inkubiert, in 50% Ethanol fixiert und mit Papanicolaou gefärbt. Motilitätszählungen der Inhibitor behandelten fertilen Spermien zeigten 2 Stunden nach der Behandlung nur 3% motile Spermien, und 18 Stunden nach der Behandlung keine motile Spermien. 80 Prozent der immotilen Spermien waren tot (gefärbt mit Eosin Y). Inhibitor behandelte Spermien konnten während der Cozüchtung nicht in Granulosazellen eindringen.
Die zytologische Untersuchung deckte auf, dass 80% der Inhibitor behandelten Spermatozoen 18 Stunden nach der Behandlung aufgerollte Schwanzenden und klare Akrosomkappen aufwiesen. Außerdem war das grüne fibrilläre Muzin, das in den Kontrollproben vorlag, zu dispergierten losen Massen von großen blauen Granula in den Inhibitor behandelten Spermatozoen verändert.
BEISPIEL 6
Antiviruswirkung des Inhibitors von CANPs in vitro
1) auf das Epstein-Barr-Virus (EBV)
Virusinfektion von Zellen, welche die Wirt-Parasit-Wechselwirkung einschließt. Viren sind auch Vehikel von biologischer aktiver DNA oder RNA in Wirtszellen, die, um zu überleben und sich auszubreiten, bei Tieren und Menschen Viruskrankheiten verursachen.
In den folgenden Experimenten wurde der CANPs-Inhibitor in zwei Zellenlinien auf seine Antiviruswirkung getestet. Eine Zellenlinie waren gezüchtete Burkitt-Tumor-Lymphoblasten (Raji-Stamm), die mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) in vitro (Kottaridis et al., J. Natl. Cancer Inst. 1977, 59(1), 89–91) infiziert wurden, und die andere waren P3HR-1-Burkitt-Lymphom, EBV-produzierende Zellen (Hinuma Y. et al., 1967, J. Virol. 1, 1045–1051). IgG-Antikörper wurden durch Immunfluoreszenz (Gull-Laboratorien) an EBV-infizierten Raji-Zellabstrichen und an P3HR-1 nachgewiesen, wobei 10% bzw. 20–25% der Zellen Fluoreszenz zeigten. Für Negativkontrollen wurden IgG-EBV negative-Antikörper verwendet.
Zum Testen der Chemosensitivität wurden 200.000 Zellen/Röhrchen verwendet. Die Ergebnisse für EBV-infizierte Raji-Zellen zeigten 22% Zytotoxizität bei 2 U/ml CANPs-Inhibitor, 97% bei 4 U/ml und 100% bei 5 U/ml. Im Fall von P3HR-1, EBV produzierenden Zellen lag 95% Zytotoxizität bei 2 U/ml CANPs-Inhibitor, 100% bei 4 U/ml und 5 U/ml vor. Es wurde festgestellt, dass beide Zellenlinien nach Behandlung von Zellen mit mehr als 4 U/ml CANPs-Inhibitor frei von nachweisbarem Immunfluoreszenz-IgG waren.
Obwohl beide Zellenlinien gegenüber dem CANPs-Inhibitor sensitiv sind, weil sie maligne sind, belegt das Verschwinden von Immunfluoreszenz-IgG nach Behandlung die Antiviruswirkung des CANPs-Inhibitors.
2) auf das menschliche Immunschwäche Virus (Human Immunodeficiency Virus) Typ 1 (HIV-1-, AIDS-Virus)
Die Zellenlinie MOLT-4 (ATCC CRL 1582, von der akuten lymphatischen Leukämie), die mit HIV 1 infiziert wurde (Koyanagi Y. S. et al., 1987, Science 236, 819–822 und Cann A. J. et al., 1990, J. Virol. 64 (10) 4735–4742) wurde verwendet. Zum Testen der Chemosensitivität wurden 200.000 Zellen/Röhrchen mit dem Inhibitor von CANPs mit 4 U/ml und 10 U/ml behandelt. Die Ergebnisse zeigten 97% Zytotoxizität bei 4 U/ml und 100% bei 10 U/ml Inhibitor von CANPs.
Zellabstriche, die in kaltem Aceton fixiert wurden, wurden für Immunfluoreszenztests unter Verwendung von positivem humanem Serum, das Antikörper gegen HIV-1 (1 : 100) und anti-Human-IgG-Fluoreszenz-Konjugat (1 : 200 Dako Corp.) enthält, verwendet. Für Negativkontrollen wurde gegen HIV-1-Antikörper negatives humanes Serum verwendet. Das Immunfluoreszenz-HIV-1-Antigen wurde in 60% der unbehandelten HIV-1-infizierten MOLT-4-Zellkulturen detektiert. Die behandelten HIV-1-infizierten MOLT-4-Zellen waren bei Konzentrationen von 4 U und 10 U/ml Inhibitor von CANPs frei von nachweisbarem Immunfluoreszenz-HIV-1-Antigen.
Es wird gefolgert, dass HIV-1-infizierte MOLT-4-Zellen gegenüber dem Inhibitor von CANPs wegen ihrer malignen Zellen hoch sensitiv sind, aber das Verschwinden von Immunfluoreszenz-HIV-1-Antigen belegt die Anti-AIDS-Wirkung des Inhibitors von CANPs.

Claims

Verwendung eines spezifischen Inhibitors einer calciumaktivierten neutralen Proteinase (CANP) für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung eines Tumors, besonders Krebs.
Verwendung eines spezifischen Inhibitors einer calciumaktivierten neutralen Proteinase (CANP) für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung einer Viruserkrankung.
Verwendung eines spezifischen Inhibitors einer calciumaktivierten neutralen Proteinase (CANP) für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von AIDS.
Verwendung eines spezifischen Inhibitors einer calciumaktivierten neutralen Proteinase (CANP) für die Herstellung eines Verhütungsmittels.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Inhibitor ein endogener nativer Inhibitor von einer biologischen Quelle ist, der ausgewählt ist aus Erythrozyten, Hirn, Herzmuskel, Lunge, Milz, Leber, Skelettmuskel, Niere oder Hoden, gereinigt ist und tetramere Proteine mit einer relativen Molekülmasse von etwa 240.000 auf der Basis ihrer Elution von Sephadex G-200 hat, die bei einem neutralen pH-Wert temperaturstabil sind; zerstört bei Verdauung mit Trypsin und zerlegt in ihre Untereinheiten mit einer relativen Molekülmasse von etwa 60.000 oder weniger durch 0,1–1 mM Ca²⁺ auf der Basis von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, oder pharmazeutisch akzeptable Additionssalze davon.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die biologische Quelle des Inhibitors aus Skelettmuskel oder Leber von Kaninchen ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei der Inhibitor von Kaninchenskelettmuskel ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die Inhibitoren der Ansprüche 5–7 oder deren pharmazeutisch akzeptable Additionssalze synthetisch hergestellt werden.
Verwendung eines spezifischen Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Herstellung eines pharamzeutischen Präparats, das in Lösungs-, Pulver-, Injektions-, Tabletten-, Kapsel-, Pelletform oder in einer Form für eine schnelle oder verzögerte Freigabe vorliegt.