ES2215162T3 - Uso de inhibidores de canp en preparaciones farmaceuticas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL USO DE INHIBIDORES DE PROTEINASAS DEPENDIENTES DE CA2+ NEUTRAS (CANPS) Y A SUS SALES DE ADICION FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES O A SUS SUBUNIDADES ACTIVAS EN EL CAMPO DE LA TERAPIA DE TUMORES, ESPECIALMENTE DE LA TERAPIA DEL CANCER, LA TERAPIA DE ENFERMEDADES VIRALES, LA TERAPIA CONTRA EL SIDA Y LA ANTICONCEPCION. LOS INHIBIDORES SE PUEDEN UTILIZAR ESPECIALMENTE CONTRA LOS TUMORES DEPENDIENTES DE UN SUSTRATO DE GLICOSAMINOGLICANO ENLAZADO A LA PROTEASA, ENFERMEDADES VIRALES Y LA ANTICONCEPCION A BASE DE MATAR LA CELULAS MALIGNAS, DE MATAR LOS VIRUS Y ESPERMATOZOIDES E INHIBIR LA VLIMMATA NUCLEAR EN UN SISTEMA DE CELULAS DE PARASITOS HUESPEDES QUE COMPRENDE UN SUSTRATO ENLAZADO A UNA PROTEASA COMUN. LOS INHIBIDORES SON PROTEINAS TETRAMERICAS, ESTABLES AL CALOR A UN PH NEUTRO, APROXIMADAMENTE 240 KDA, QUE SE DESTRUYEN CON TRIPSINA. LAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS SE PUEDEN PREPARAR DE LA MANERA CONOCIDA PER SE, CON LOS PORTADORES O ADITIVOS NORMALMENTE UTILIZADOS EN LA INDUSTRIA FARMACEUTICA.

Description

Uso de inhibidores de CANP en preparaciones farmacéuticas.

Campo de la invención

La presente invención trata del uso de inhibidores específicos de las proteasas neutras activadas por calcio (CANP) para la elaboración de una preparación farmacéutica para el tratamiento de tumores, especialmente cáncer, enfermedades víricas, SIDA y como anticonceptivo.

Antecedentes de la invención

Una de las propiedades más letales de las células malignas es su capacidad para infiltrarse en tejidos normales y para metastatizar en zonas distantes. Los tejidos conectivos normales consisten en células inclusas en una matriz extracelular que contiene glucoproteínas, colágeno, elastina y proteoglucanos. Se ha sugerido que las enzimas histolíticas asociadas a los tumores pueden ayudar en el procedimiento invasivo mediante la eliminación de la proteína de la matriz (Hart, I. y col., 1980, JNCI 64:891). Diversos estudios se han concentrado en este aspecto de la biología de las células tumorales, y se ha observado una producción de proteasa aumentada en muchas células transformadas (Jones, P. A. Y Declerk, Y. A., 1980, Cancer Res. 40:3222).

Las proteasas neutras m- y \mu- activadas por calcio (CANP), también conocidas como calpaína I y II son proteasas de cisteína intracelulares típicas de los animales superiores. Se cree que participan en diversas funciones celulares mediadas por Ca^{+2}, pero su función concreta todavía no está clara. Las CANP hidrolizan proteínas de clases limitadas in vitro, incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico, el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas y la proteín-cinasa C. Parecen estar implicadas en la regulación del metabolismo y la degradación de las proteínas miofibrilares musculares y de los elementos citoesqueléticos neuronales, sugiriendo que las CANP están implicadas en funciones celulares esenciales (Murachi, T., 1983, Trends. Biochem. Sci. 8, 167-169).

Para estudiar el papel de las CANP en los anteriores procedimientos se han utilizado varios inhibidores exógenos de esta enzima, por ejemplo, la leupeptina, un péptido con una estructura N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-arginal, y E64, un compuesto epoxi de la estructura peptídica L-trans-3-carboxi-oxiran-2-carbonil-L-leucilagmatina, ambos inhibidores específicos de las proteasas de tioles.

La leupeptina y el E64 se han propuesto para su uso en el tratamiento de la Distrofia Muscular de Duchenne (Höllenberg Sher, J. y col., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci, EE.UU. 78 (12), 7742-7744, y Kumatsu, K. y col., 1986, Exper. Neurol. 91, 23-29). Además, la leupeptina y el E64 se han usado como preparaciones farmacéuticas para estimular la formación de sinapsis y la inervación de las fibras musculares (solicitud PCT WO-A-9000 401, 1990, University College, Londres).

El E64 detiene las células A431 del carcinoma epidermoide humano en la metafase de la mitosis (Shoji-Kasai, Y. Y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 85, 146-150).

En el campo del cáncer, sólo se ha usado la leupeptina y se ha encontrado que inhibe el crecimiento celular in vitro únicamente de células de cerebro de rata: (Nishiura, I. y col., 1979, Neurol. Med. Chir. (Tokio) 19(1), 1-8).

Se cree que las pequeñas moléculas de leupeptina y de E64 pueden penetrar las membranas celulares y entrar en las terminaciones nerviosas y en las células, inhibiendo así la proteasa activada por calcio (Nishiura, I. y col., 1979, Neurol. Med.-Chir. 19(1), 1-8, y solicitud PCT WO-A-9 000 401, 1990, University College, Londres).

Esto sugirió que la leupeptina podría usarse con propósitos terapéuticos. Sin embargo, dicho tratamiento no se ha encontrado especialmente satisfactorio. Esto es porque las CANP no son inhibidas (Medí, S. y col., 1988, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 157(3), 1117-1123) o sólo lo son parcialmente por la leupeptina (Tsuji, S. e Imahori, K., 1981, J. Biochem. 1990, 233-240). Además, el sustrato de los tumores malignos sobre los que actúan los inhibidores de las CANP era desconocido hasta ahora. Además, como se describirá a continuación, la leupeptina y el E64 usados en los ensayos según la presente invención no inhibieron el crecimiento de células malignas.

Se ha publicado que las células malignas cultivadas de carcinoma urotelial invasivo humano forman nódulos tumorales y sacos membranosos de glucosaminoglucanos (GSG) con extensiones intracelulares y extracelulares de la membrana (Logothetou-Rella, H. y col., 1988a, Europ. Urol. 14(i), 61-64 y 65-71). Las mismas observaciones se realizaron en cultivos celulares de trofoblastos humanos (Logothetou-Rella, H. Y col., 1989, Europ. Urol. 15, 259-263. La participación de los GSG también se ha descrito en la formación de capilares, que está incrementada en tumores in vivo (Logothetou-Rella, H. Y col., 1990, Histol. Histopath. 5:55-64).

La matriz extracelular característica (GSG) de células malignas y embrionarias es PAS y PAS-diastasa positiva, identificada mediante tinción de Papanicolau por su color verde claro (color EA) y su textura translúcida fibrilar suave. Los GSG en las células malignas se distribuyen y acumulan en sacos membranosos intracelulares y extracelulares. Los sacos membranosos GSG aumentan las extensiones de la membrana, que forma canales a través de los cuales los GSG verde pasan desde dentro hacia fuera de la célula, incrementando la formación de nódulos tumorales e invadiendo otras células in vitro.

Objeto de la invención

Sorprendentemente, se descubrió un nuevo mecanismo de invasión célula a célula y formación de sustrato (CANP unidas a GSG) comunes, por ejemplo, en la formación de tumores, en enfermedades víricas, SIDA y en la fertilización.

Además, se encontró que administrando inhibidores específicos de las CANP para proporcionar una concentración efectiva de dichos inhibidores en el hombre o el animal se inhibirían los procedimientos anteriormente mencionados.

Descripción detallada de la invención

Se encontró que la matriz intracelular y extracelular (CANP unidas a sacos de GSG) producida por la interacción de células malignas con células normales in vitro e in vivo puede usarse como sustrato de los inhibidores específicos de las CANP.

Los sacos de CANP unidos a GSG intracelulares comunican con el entorno extracelular con extensiones de la membrana y forman grandes canales extracelulares (llenos de sustrato) o matriz propagada que permite a las grandes moléculas (aproximadamente, PM de 240.000) de los inhibidores de las CANP entrar también en las células e inactivar las CANP unidas a GSG. Las CANP unidas a sacos de GSG y la matriz extracelular de, por ejemplo, tumores, se producen mediante un nuevo mecanismo de invasión de célula a célula relacionado con el de las infecciones celulares víricas y la fertilización. Los inhibidores de las CANP eliminan selectivamente células malignas únicamente mediante inactivación de las CANP unidas a GSG intracelulares y extracelulares, una matriz especial de la que depende la viabilidad y la propagación únicamente de las células malignas.

La infección vírica de las células y la penetración del espermatozoide en el ovocito son fenómenos biológicos que también implican una invasión de célula a célula, es decir, la invasión de la célula por el virus y la invasión del ovocito por el espermatozoide, produce la misma matriz extracelular (sustrato) que las células malignas, y requiere la presencia de CANP. Según este nuevo mecanismo de invasión de célula a célula, los inhibidores de las CANP o sus subunidades activas también muestran una acción antivírica y anticonceptiva.

Un posible mecanismo de acción de un inhibidor inventivo sobre las células malignas podría ser, por ejemplo, la disociación del tetrámero del inhibidor tras el contacto con las CANP extracelulares unidas a los GSG (sustrato), en subunidades (por ejemplo, monómeros, cuyo PM varía considerablemente y depende del sustrato usado) y la formación de un complejo inactivo inhibidor-proteasa (gránulos hematoxilinóficos azules).

Entonces pueden estar teniendo lugar los siguientes acontecimientos. La subunidad del inhibidor producida extracelularmente puede difundir a través de la membrana de la célula maligna e inactivar las CANP endógenas, o las CANP activadas intracelulares difundir extracelularmente hacia un gradiente de concentración menor (tras la inactivación de las CANP activadas extracelulares) y ser inactivadas por el monómero inhibidor extracelular. También pueden estar teniendo lugar ambos acontecimientos. Las vacuolas citoplasmáticas vacías observadas en células malignas tratadas con inhibidor apoyan la difusión de las CANP activadas y su inactivación extracelular.

Además, los canales extracelulares de GSG-CANP son los suficientemente grandes como para permitir el paso del inhibidor hasta los sacos de GSG-CANP.

El efecto de los inhibidores de las CANP sobre los espermatozoides sugiere que los espermatozoides están asociados con la enzima de las CANP, de lo que depende su motilidad, viabilidad y capacidad de penetración. El aumento en la motilidad del esperma observado con altas concertaciones de Ca^{+2} (Fakih y col., 1986, Fertil. Steril. 46(s), 938-944) podría conseguirse mediante la activación de las CANP endógenas del esperma. La elevada liberación de Ca^{+2} por la corteza del óvulo en la prevención de la poliespermia (Steinhardt y col., 1977, Develop. Biol. 58, 185-196) podría implicar la participación de los posibles inhibidores de las CANP del ovocito.

El efecto citológico de los inhibidores de las CANP sobre la mucina del semen demuestra fuertemente que la enzima activa está unida a glucosaminoglucanos, un sustrato aparentemente común tanto para la acción de la proteasa como del inhibidor. De nuevo, el mecanismo de acción de los inhibidores sobre el espermatozoide podría ser la disociación de un cierto inhibidor tras el contacto con las CANP unidas a mucina (sustrato) y la formación de un complejo inactivo inhibidor-proteasa (gránulos hematoxilimórficos azules). La subunidad de inhibidor producida extracelularmente tras la disociación difunde probablemente a través de la membrana del espermatozoide e inactiva las CANP endógenas, o las CANP se mueven extracelularmente hacia un gradiente de concentración menor tras la inactivación de las CANP extracelulares. Los inhibidores de las CANP, al no ser tóxicos para las células normales y sí para los espermatozoides, parecen un prometedor agente anticonceptivo masculino.

En un primer aspecto de la presente invención se prevé el uso de un inhibidor específico de las proteasas neutras activadas por calcio (CANP) para la elaboración de una preparación farmacéutica para el tratamiento de un tumor, especialmente cáncer.

En un segundo aspecto de la presente invención se prevé el uso de un inhibidor específico de las proteasas neutras activadas por calcio (CANP) para la elaboración de una preparación farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad vírica.

En un tercer aspecto de la presente invención se prevé el uso de un inhibidor específico de las proteasas neutras activadas por calcio (CANP) para la elaboración de una preparación farmacéutica para el tratamiento del SIDA.

En un cuarto aspecto de la presente invención se prevé el uso de un inhibidor específico de las proteasas neutras activadas por calcio (CANP) para la elaboración de un anticonceptivo.

El inhibidor específico de las CANP usado en la invención son preferiblemente inhibidores naturales endógenos aislados desde una fuente biológica tal como eritrocitos, cerebro, músculo cardiaco, pulmón, bazo, hígado, músculo esquelético, riñón, testículo y similares, y opcionalmente purificados, pero especialmente de esqueleto o hígado de conejo, comprendiendo una proteína tetramérica de un PM de aproximadamente 240.000 basado en su elución a partir de Sephadex G-200, termoestable a pH neutro, destruida mediante digestión con tripsina, y disociada en sus subunidades de un PM de aproximadamente 60.000 mediante Ca^{+2} 0,1-1 mM basado en electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (según describe Melloni y col. en Arch. of Biochem. and Biophys., vol. 232, nº 2, 513-19, 1984). También se describen en la presente memoria descriptiva todas las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Se cree que los PM de las subunidades activas del inhibidor específico dependen de los sustratos (por ejemplo, caseína, globina desnaturalizada, etc.) usados. Por lo tanto, el PM de la parte activa del inhibidor puede ser mayor, por ejemplo, aproximadamente 150.000, o menor, por ejemplo, aproximadamente 15.000, según se indicó anteriormente.

Un inhibidor preferible aislado de esqueleto de conejo lo elabora y vende Sigma Chemical Company, St. Louis, EE.UU., bajo el número de producto P-0787.

Los inhibidores también pueden producirse sintéticamente, especialmente mediante procedimientos biotecnológicos o de tecnología genética, por ejemplo, mediante su expresión en Escherichia coli.

En la presente invención, la preparación farmacéutica puede estar en forma de disolución, polvos, inyección, comprimido, cápsula, pastilla, en una forma de liberación rápida o prolongada, conteniendo cada una, una cantidad adecuada de un inhibidor específico natural o sintético, y eventualmente purificado, o sus sales de adición farmacéuticamente aceptables, junto con los excipientes adecuados bien conocidos.

Los inhibidores deben administrarse preferiblemente al hombre y a animales de sangre caliente, por vía intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa, en una cantidad que depende del tipo y gravedad de la enfermedad, del efecto inhibitorio del inhibidor, de la vía de administración, de la especie que se ha de tratar, del peso y el estado general del paciente, y finalmente, tiene que ser decidido, en la mayoría de los casos, por el médico responsable. En general, la dosis está entre aproximadamente 1 mg/kg al día y 25 mg/kg al día. Sin embargo, si también se necesitaran dosis mayores, por ejemplo, de hasta 100 mg/kg al día, podrían ser administradas.

El sorprendente efecto de los inhibidores de las CANP se ha confirmado y verificado por los siguientes ensayos, mediante los cuales se han completado todos los ensayos también con Aprotinina (Sigma A-4 529), inhibidor de Tripsina-Quimotripsina (Sigma T-9777), Leupeptina (Sigma L-2884) y E64 (Sigma E-3132) disueltos en RPMI-1 640 con HEPES 25 mM como control de los inhibidores de las proteasas. Todas las disoluciones de inhibidores se filtraron a través de filtros Sartorius de 0,22 \mu, se distribuyeron en alícuotas y se congelaron a -20ºC. Se usaron disoluciones de inhibidor frescas o descongeladas.

Sin embargo, el sorprendente efecto sólo se desarrolló en los inhibidores de las CANP según la invención. En los siguientes ensayos se disolvieron el polvo marrón bronce del inhibidor de las CANP (Sigma Chemical Company, St. Louis, EE.UU., producto número P-0787) y 50 U/645 mg de músculo esquelético de conejo sólido en 5 ml de RPMI-1640 simple con HEPES 25 mM (Seromed), dando como resultado una disolución marrón bronce claro (10 U/ml), en la que una unidad (U) es aquella cantidad de inhibidor que reducirá la actividad de 1 unidad de CANP (Sigma Chemical Company, producto número P 4533) en un 50% a pH 7,5 y a 30ºC (volumen de reacción = 1,8 ml, 1 cm de trayectoria clara). Por supuesto, el ámbito de la invención no debe reducirse al uso del inhibidor en concreto usado en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Uso del inhibidor natural de las CANP para inhibir el crecimiento y la viabilidad de células malignas in vitro Establecimiento del cultivo celular

Se establecieron cultivos de células estacionarias a partir de muestras de tejido tumoral sólido humano mediante digestión enzimática. El solicitante ha caracterizado recientemente líneas celulares malignas de pulmón a partir de carcinoma metastático de pulmón, células M, células P y células B. Los cultivos de células uroteliales malignas se establecieron a partir de muestras de tejido de pacientes con carcinoma de células de transición invasivas. Las cinco líneas celulares establecidas de células uroteliales malignas se denominaron células Pa, células R, células S, células Br y células IG. Únicamente el paciente del que procedían las células Pa había recibido infusiones intravesicales de medicamentos anticancerosos. El cultivo de células de melanoma (células Ha) procedía de un paciente varón que padecía un melanoma rectal primario, metastatizado en los nódulos linfáticos del brazo derecho, de donde se obtuvo la muestra de tejido.

Las células malignas de médula ósea procedían de aspirados medulares de cinco (5) pacientes con leucemia mieloide crónica. Las células de tumor Walker de rata se aislaron a partir de tejido tumoral transplantado en ratas Wistar. Las células hepáticas humanas normales (células L) se aislaron a partir de muestras de tejido hepático de un paciente varón que sufrió una operación para la extracción de su vesícula biliar.

Las células normales de trompas de Falopio (células F) se aislaron a partir de muestras de tejido de una paciente que sufrió una histerectomía total. Las células normales de vejiga (Células N) se han caracterizado anteriormente (Logothetou-Rella, H. y col., 1988, Europ. Urol. 15, 259-263). También se usaron los leucocitos de cinco personas sanas como células de control.

Se cultivaron embriones de ratón recogidos en la etapa de 2 células en disolución salina equilibrada de Earle completa (EBSS complementada con suero bovino fetal al 10% y antibióticos) hasta la etapa de blastocitos incubados. Cuando todas las células embrionarias estaban fuera, el cultivo se usó para una citología. También se usaron en este estudio células embrionarias amnióticas de cinco (5) mujeres embarazadas cultivadas para un diagnóstico prenatal. Todos los cultivos celulares se hicieron crecer en medio completo, RPMI-1640 (Seromed) complementado con suero bovino fetal al 10% (Seromed), glutamina y antibióticos (Seromed) y se incubaron a 37ºC en un incubador humidificado con CO_{2}. Las existencias celulares se almacenan congeladas en nitrógeno líquido.

Análisis citogenéticos

Recientemente se ha informado de los análisis cromosómicos de las células M, las células P y las células B (Logothetou-Rella, H. y col., 1991, J. Exper. Clin. Cancer Res., remitido para su publicación). Las células uroteliales malignas, células Pa, consistían únicamente en clones de células malignas, con poliploidías de hasta 147 cromosoma y complejas anormalidades estructurales. Las células S consistían en clones de células malignas con tetraploidías regulares de hasta el 20% de población celular, y hasta el 80% de clones de células normales. Las células Br consistían en clones de células normales y malignas, pero el análisis cromosómico detallado no tuvo éxito. Las células Ha de melanoma sólo revelaron dobles diminutos. Las células L hepáticas, las células F de trompas de Falopio y las células embrionarias amnióticas eran citogenéticamente normales.

Se usaron dos técnicas para determinar la citotoxicidad del inhibidor sobre células normales y tumorales.

a) Cambios citológicos de los cultivos celulares en presencia continuada de los inhibidores

Se prepararon siete tipos de medio completo RPMI-1640. Uno se complementó con 1 U/ml del inhibidor de las CANP; el segundo, con 2 mg/ml de inhibidor de tripsina-quimotripsina; el tercero con 1 mg/ml de aprotinina; el cuarto con 1 mg/ml de leupeptina; el quinto con 1 mg/ml de E64; el sexto con los cinco inhibidores a la misma concentración, y el séptimo era RPMI-1640 completo como medio de control.

Se sembraron diez placas de Petri de vidrio (de 5 cm de diámetro), cada una con 1 x 10^{6} células M, y otras diez placas, cada una con 1 x 10^{6} células P. Los cultivos celulares duplicados recibieron cada uno un tipo de medio completo que contenía los inhibidores, y los cultivos de control sólo contenían el medio completo. Los cultivos celulares se incubaron a 37ºC en un inhibidor humidificado con CO_{2} durante 120 horas. El medio de cultivo se cambió por medio fresco del mismo tipo en cada caso, 24 y 72 horas después del inicio del cultivo. La mitad de los cultivos celulares se fijó en etanol al 50% 72 horas después del inicio del cultivo, y la otra mitad, 120 horas después del inicio del cultivo. Todos los cultivos celulares se tiñeron por el método de Papanicolau.

Los cultivos celulares estacionarios postconfluyentes de células M y células P malignas, y de células L normales (20 días de cultivo continuado) que habían producido abundante matriz extracelular, recibieron medio de cultivo RPMI-1640 completo fresco complementado con 1 U/ml del inhibidor de las CANP, y se incubaron a 37ºC durante 3 días, después se fijaron en etanol al 50% y se tiñeron con el método de Papanicolau.

El inhibidor de tripsina-quimotripsina, la aprotinina, la leupeptina y el E64 no afectaron al crecimiento y la citología de las células M y P, comparado con los cultivos de las células de control.

El inhibidor de las CANP provocó una gran exfoliación de las células y la matriz extracelular (ECM) en el medio de cultivo después de 72 horas de presencia continuada en los cultivos. Todas las células exfoliadas murieron (según la tinción azul tripano), y consistían en núcleos picnóticos hipercromáticos, poco citoplasma y núcleos con colas. En la superficie de la placa de cultivo permanecían vivas unas pocas células unidas, similares a fibroblastos, contables por campo y citológicamente normales. Todas las demás placas de cultivos celulares (excepto los casos nº 1 y nº 6, que contenían el inhibidor) junto con las de control, estaban llenas de células y de vlimma nuclear (="NV", "vlimma" = proyectil; estado de una célula parásita tras numerosas operaciones divisorias usando una célula hospedadora, en el que alcanza el tamaño de un nucleolo con una cabeza nuclear y una cola unida, que se asemeja a un pequeño espermatozoide inmóvil. La producción de cabezas nucleares, el lanzamiento y la implantación en otras células se produce principalmente en zonas de cultivo, donde los glucosaminoglucanos extracelulares se unen a las CANP y se localizan las membranas celulares. En cultivos celulares normales no se encuentran NV, mientras que se observó, por ejemplo, en cultivos sólidos humanos y libres de tumores hematológicos, o durante la producción, todavía unidos a la célula madre. Los NV son productos finales celulares de divisiones incompletas, desiguales y asimétricas de células malignas. Tras su producción pueden eventualmente separarse de su célula madre y buscar aleatoriamente una célula hospedadora. Cuando los NV se implantan y se incorporan al núcleo de una célula hospedadora normal puede considerarse un procedimiento similar a la fertilización o a una infección vírica. Como resultado, el genotipo y el fenotipo de la célula hospedadora se altera, y esta se comporta como una célula transformada. Después de muchas divisiones, la célula hospedadora pierde su citoplasma y ya no puede dividirse más; necesita ayuda de otra célula hospedadora o matriz extracelular, y se ve así forzada a volverse parásita y producir NV.) incontables por campo, sin exfoliación celular, con sacos de ECM y GSG macroscrópicamente aparentes, verdes, fibrilares y translúcidos. Las observaciones fueron persistentes después de 120 horas de presencia continuada del inhibidor de las CANP en los cultivos celulares, excepto porque las células supervivientes similares a fibroblastos habían crecido en presencia del inhibidor de las CANP.

Los cultivos postconfluyentes de células M y P mostraron células con un citoplasma vacuolado como una tinción, y núcleos degenerados de diferentes tamaños, con y sin colas. Las células muertas redondeadas, no unidas, se unían unas a otras en la superficie de cultivo de la placa mediante una red de membranas hematoxilinofílicas (azules) visible microscópicamente. La ECM y los sacos de GSG habían desaparecido. En su lugar había grandes masas de gránulos hematoxilinofílicos, visibles microscópicamente.

b) Procedimiento de cultivo en medio líquido a corto plazo (Chang, S. Y. y col., 1989, Eur. Urol. 16, 51-56)

Las células se separaron con EDTA-tripsina (Seromed), se resuspendieron en RPMI-1640 completo y los recuentos celulares se realizaron usando un hemocitómetro. Los recuentos viables se evaluaron usando el método de exclusión azul tripano al 0,4%. Entonces las células se lavaron una vez con RPMI-1640 completo, se centrifugaron a 200 g durante 8 min, se resuspendieron en RPMI-1640 completo a 30.000-200.000 céls. por 0,5 ml de medio y se inocularon en tubos de polipropileno según se muestra a continuación:

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Se ensayaron muestras celulares duplicadas para cada concentración de inhibidor. Todas las muestras se incubaron y se agitaron en un baño de agua a 37ºC durante una hora. Entonces, las células se lavaron dos veces con RPMI-1640 completo mediante centrifugación a 200 g durante 8 min. Cada sedimento de células enjuagado se resuspendió en 1 ml de RPMI-1640 completo, y entonces las células se separaron mediante un suave pipeteado, y después se sembraron en microplacas de 24 pocillos (Costar Cambridge Mass.) durante un periodo de 4 días de cultivo a corto plazo a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%. La evaluación de la citotoxicidad se realizó usando el método de exclusión de pigmentos de azul tripano al 0,4%. El grado de citotoxicidad se midió según la siguiente fórmula:

Citotoxicidad (%) = 1- \frac{\text{Número de células viables en el grupo experimental}}{\text{Número de células viables en el grupo de control}} X 100

Los inhibidores de las CANP eliminaron selectivamente todos los tipos de células malignas ensayadas (Tabla 1), permitiendo que las células normales dentro del mismo cultivo, o en cultivos separados, crecieran y se propagaran (Tabla 2). La concentración óptima de 4-5 U/ml de inhibidor eliminó todos los clones de células malignas, mientras que concentraciones menores eliminaron un menor porcentaje de células malignas. Una concentración mayor no alteró los resultados. El inhibidor no fue citotóxico para las células normales, incluyendo células hepáticas, células de las trompas de Falopio y leucocitos. El análisis citogenético de las células supervivientes (en líneas celulares mezcladas) tras el tratamiento con el inhibidor de las CANP mostró un cariotipo normal. El inhibidor de las CANP también fue citotóxico para las células embrionarias.

TABLA 1 Categorías de casos con diversas células ensayadas

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TABLA 2 Sensibilidad de las células ante diferentes concentraciones del inhibidor de las CANP

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La citotoxicidad del inhibidor para cada muestra se obtuvo a partir de la media de las muestras duplicadas.

Ejemplo 2 Uso del inhibidor de las CANP sobre la viabilidad de tejidos uroteliales normales y malignos

Se enjuagaron unos fragmentos de tejido tumoral (de 5 pacientes) y normal (de 5 personas) de urotelio humano de 2 mm x 2 mm x 2 mm de tamaño en RPMI-1640 completo, se manipularon con suavidad con unas pinzas finas, se sumergieron un fragmento (de cada tipo de tejido) en RPMI-1640 completo (control) y un fragmento en la disolución de inhibidor (10 U/ml) en tubos de polipropileno, y se incubaron a 37ºC durante una hora en el incubador humidificado con CO_{2} al 5%. Todos los fragmentos de tejido se enjuagaron entonces cuidadosamente con medio completo y se sumergieron en tubos de polipropileno (1 fragmento/tubo) que contenían 2 ml de RPMI-1640 completo, y después se incubaron durante 4 días a 37ºC. Los fragmentos de tejido se fijaron en formaldehído, se incluyeron en parafina y las secciones de tejido se tiñeron con eosina-hematoxilina. Las células exfoliadas en los tubos con los fragmentos de tejido maligno se dejaron sedimentar en un tubo cónico de polipropileno durante 10 min, y después se extendieron sobre portaobjetos de vidrio fijados con citospray y se tiñeron con Papanicolau. El inhibidor de las CANP provocó una exfoliación celular masiva de los tejidos malignos. El examen histológico de los tejidos malignos tratados con inhibidor mostró zonas de bionecróticas a necróticas, y amplias zonas tisulares consistentes en matriz extracelular eosinófila desnuda de células. Las células exfoliadas estaban muertas, con núcleos degenerados y morfología espermatozoidal, separadas entre sí y sin las ECM verdes. Las pocas células exfoliadas de tejido maligno, en ausencia del inhibidor de las CANP, mostraron masas celulares compactas en una ECM verde con los límites celulares continuos.

Los tejidos uroteliales normales se mantuvieron intactos tras el tratamiento con el inhibidor.

Ejemplo 3 Uso del inhibidor de las CANP contra nódulos tumorales humanos in vivo

Una paciente con carcinoma de mama metastásico, con metástasis extendidas en hueso, hígado y tejido subcutáneo, después de tratamiento con quimioterapia y radiación repetidas sin éxito, y también con un mal estado de salud general, consintió el ensayo del medicamento en sus nódulos subcutáneos. Los nódulos se localizaban por todo el tórax, y algunos en el abdomen. En el centro de un nódulo duro del tamaño de un guisante se inyectaron 0,1 ml (1 U/0,1 ml) del inhibidor de las CANP disuelto en RPMI-1640 con HEPES 25 mM. Veinticuatro horas después se extrajeron el nódulo tratado y un nódulo cercano no tratado de control, se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina para su examen microscópico.

La paciente no mostró ninguna reacción alérgica 1, 4 y 24 horas después de la inyección. El tacto del nódulo era más suave y ligeramente menor 4 horas después de la inyección. Veinticuatro horas después, el nódulo era suave y se había reducido a la mitad de su tamaño original. El neoplasma tratado se caracterizaba histológicamente por una agregación celular pequeña degenerada y muchas células individuales degeneradas. La mayoría de las células tenía núcleos vacuolados picnóticos, cariolíticos o degenerados. Algunas células mostraron un citoplasma vacuolado. En la zona periférica externa del tumor permanecían unas pocas células neoplásicas con núcleos regulares, una cromatina fina y delgados nucleolos individuales. La zona principal de la degeneración celular del tumor, provocada por el inhibidor de las CANP, midió aproximadamente un total de 3,4 mm x 2,5 mm de los 5,2 mm x 2,5 mm de la zona principal de la sección tumoral. Las glándulas sudoríparas vecinas y la epidermis superyacente se mantuvieron intactas. No hubo reacción inflamatoria ni siquiera alrededor de la zona hemorrágica fisurada provocada por la inyección. El examen histológico del nódulo tumoral sin tratamiento mostró que el neoplasma se caracterizaba por grandes columnas o hebras simples de células neoplásicas viables, con núcleos relativamente ovoides o redondeados, uniformes, con un fino punteado de cromatina y nucleolos delgados. El histograma era compatible con carcinoma de mama metastásico.

Ejemplo 4 Uso del inhibidor de las CANP contra tumores de rata in vivo

Se extrajeron dos tumores Walker 2 semanas después de la implantación subcutánea de tejido tumoral en ratas Wistar macho. La suspensión de células tumorales para inyección se preparó según se describió previamente (Fisher, E. R. Y Fischer, B., 1959, 12, 926-928). A un grupo de ratas Wistar macho, de 100 g de peso cada una, se les inyectaron 10 x 10^{6} células de tumor Walker por vía subcutánea en la almohadilla de la pata izquierda. Entonces las ratas se dividieron en cuatro grupos, dos de control y dos tratados. El tratamiento se inició cuando los tumores habían alcanzado un tamaño mensurable de 50-100 mm^{3}. En el primer grupo de ratas se inyectaron a cada una, por vía intraperitoneal, 50 U/2,5 ml (645 mg/2,5 ml) de inhibidor de las CANP, una vez al día, durante un periodo de 2 días (0,5 U/kg o 6,45 mg/kg por peso corporal de la rata).

El segundo grupo de ratas se trató por vía intraperitoneal dos veces al día durante 5 días con la dosis de 0,25 U/kg (3,23 mg/kg) por peso corporal de la rata. A cada una de las ratas de control se les inyectaron 2,5 ml de medio RPMI-1640 con HEPES 25 mM. Todas las ratas se sacrificaron 4 días después del último tratamiento, las patas inyectadas, de los grupos de control, estaban todas cubiertas de tumores, incluso hasta la escápula del hombro, y fue imposible realizar mediciones precisas de control de los tumores. Los patas con tumores, los nódulos linfáticos y el hígado de todas las ratas fueron extraídos, fijados en formalina e incluidos en parafina para estudios histológicos. Los volúmenes de los tumores se midieron diariamente después de la primera dosis con un calibrador. El inhibidor de las CANP provocó una regresión del 50% de los tumores en el primer grupo de ratas tratadas, y un 90% en el segundo grupo. Todos los grupos (tratados y de control) partieron en el tiempo 0 sin ninguna diferencia significativa en el volumen de los tumores.

Las ratas en tratamiento estaban sanas y no mostraron ninguna reacción alérgica o efectos secundarios a las altas dosis del inhibidor procedente de músculo esquelético de conejo. El examen histológico de los hígados de las ratas tratadas no mostró ningún efecto citotóxico causado por el inhibidor, dado que las vénulas centrales no mostraban necrosis ni daño celular.

Entre el primer grupo tratado, una rata desarrolló un foco metastásico abdominal y otra un foco metastásico hepático. El foco abdominal desapareció al tacto 24 horas después de la primera dosis. El examen histológico mostró necrosis de grandes nódulos carcinomatosos con formación de abscesos, necrosis de la epidermis superyacente y ulceración. El foco metastásico hepático estaba necrotizado, mostrando material necrótico con restos del núcleo en el centro y un residuo de tejido carcinomatoso con mitosis en su contorno. Los tumores de las almohadillas plantares de las ratas tratadas mostraron zonas necróticas de tamaño variable, con formación de microabscesos. Estos resultados se hacen más importantes si se tiene en cuenta la agresividad de las células de los tumores Walker (las ratas mueren normalmente 20 días después del transplante).

Conclusión deducida a partir de los ejemplos 1-4

La composición farmacéutica de la presente invención eliminó todas las células malignas de diferentes anormalidades cromosómicas, tejidos y especies de origen, sin afectar al genotipo de las células normales.

La mejor dosis in vitro es la que contiene 4-5 unidades del inhibidor de las CANP por mililitro de disolución.

Esta composición farmacéutica no fue citotóxica para las células normales, incluyendo hepatocitos y leucocitos. Mostró un amplio espectro de acción sobre diferentes tipos de tumores humanos. Fue citotóxica para células tumorales humanas hematológicas y sólidas, e incluso más para las células tumorales quimiorresistentes (células P del pulmón y células Pa de la vejiga) de diferentes tumores de origen (las células embrionarias fueron muy sensibles al inhibidor por su parecido con las células malignas).

La composición farmacéutica de la presente invención, ensayada sobre tumores de rata, provocó una regresión del 50-90% de los tumores principales, inhibió las metástasis y provocó necrosis de los focos metastásicos. Se usó adecuadamente de forma no inmunogénica y no tóxica en una dosis diaria de 0,5 U/kg (6,5 mg/kg) de peso corporal, en dosis únicas o divididas. La administración se continúa adecuadamente hasta la completa regresión del tumor.

Ejemplo 5 Acción anticonceptiva del inhibidor de las CANP

Se depositó esperma fértil (tras el ensayo swim up o de recuperación de espermatozoides móviles) de 10 donantes, cada uno en 4 tubos de ensayo de plástico (5 ml, Falcon). Dos tubos de ensayo recibieron 0,4 ml de suspensión de esperma (600.000 espermatozoides) y 0,6 ml de EBSS completo. Los otros dos tubos de ensayo recibieron cada uno 0,4 ml de suspensión de esperma, 0,4 ml (10 U/ml) de inhibidor de las CANP y 0,1 ml de suero bovino fetal. Todos los tubos se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Entonces los espermatozoides se lavaron dos veces con EBSS completo y se centrifugaron. Los sedimentos de esperma se resuspendieron, cada uno en 2 ml de EBSS completo y se incubaron a 37ºC durante 18 horas, momento en el que se contaron los espermatozoides mediante la tinción de exclusión de viabilidad Eosina Y, se extendieron sobre portaobjetos de vidrio, se fijaron con etanol al 50% y se tiñeron con Papanicolau.

El grado de citotoxicidad provocado por el inhibidor de las CANP se midió según la siguiente fórmula:

Citotoxicidad (%) = 1- \frac{\text{Número de espermatozoides viables tratados con inhibidor}}{\text{Número de espermatozoides viables de las muestras de control}} X 100

El esperma tratado y no tratado con inhibidor se inoculó en cultivos de células granulosas postconfluyentes, se incubó a 37ºC durante 18 horas, se fijó en etanol al 50% y se tiñó con Papanicolau. Los recuentos de motilidad del esperma fértil tratado con el inhibidor mostró únicamente un 3% de esperma móvil 2 horas después del tratamiento, y ningún esperma móvil 18 horas después del tratamiento. El ochenta por ciento del esperma inmóvil estaba muerto (teñido con eosina Y). El esperma tratado con inhibidor no pudo penetrar en las células granulosas durante el cultivo conjunto.

El examen citológico reveló que el 80% de los espermatozoides tratados con inhibidor, 18 horas después del tratamiento, tenía los extremos de las colas enrollados y unos claros acrosomas. Además, la mucina fibrilar verde presente en las muestras de control había cambiado a unas masas desprendidas dispersas de grandes gránulos azules en los espermatozoides tratados con el inhibidor.

Ejemplo 6 Acción antivírica del inhibidor de las CANP in vitro 1) Sobre el virus de Epstein-Barr (EBV)

La infección vírica de las células implica una interacción hospedador-parásito. Los virus también son vehículos de ADN o ARN biológicamente activo dentro de las células hospedadoras, con objeto de sobrevivir y propagarse, provocando enfermedades víricas en animales y en el hombre.

En los siguientes experimentos se ensayó el inhibidor de las CANP para comprobar su acción antivírica en dos líneas celulares. Una línea celular eran linfoblastos de tumor de Burkitt cultivados (tinción Raji) infectados con el virus de Epstein-Barr (EBV) in vitro (Kottaridis y col., J. Natl. Cancer Inst. 1977, 59(1), 89-91), y la otra células de linfoma de Burkitt P3HR-1 productoras de EBV (Inhuma, Y. y col., 1967, J. Virol.1, 1045-1051). Los anticuerpos de IgG se pusieron en evidencia por inmunofluorescencia (Gull labs), en extensiones de células Raji infectadas por EBV con un 10%, y en P3HR-1 con un 20-25% de las células mostrando fluorescencia. Para los controles negativos se usaron anticuerpos negativos IgG-EBV.

Para los ensayos de quimiosensibilidad se usaron 200.000 céls./tubo. Los resultados de las células Raji infectadas por EBV mostraron un 22% de citotoxicidad a 2 U/ml de inhibidor de las CANP, un 97% a 4 U/ml y un 100% a 5 U/ml. En el caso de las P3HR-1, las células productoras de EBV, hubo un 95% de citotoxicidad a 2 U/ml de inhibidor de las CANP, y un 100% a 4 U/ml y 5 U/ml. Ninguna de las dos líneas celulares tenían IgG inmunofluorescente detectable después del tratamiento de las células con más de 4 U/ml de inhibidor de las CANP.

Aunque ambas líneas celulares son sensibles al inhibidor de las CANP, dado que son malignas, la desaparición de la IgG inmunofluorescentes tras el tratamiento demuestra la acción antivírica del inhibidor de las CANP.

2) Sobre el virus de la inmunodeficiencia humana de Tipo I (VIH-1, virus del SIDA)

Se usó la línea celular MOLT-4 (ATCC CRL 1582, de una leucemia linfoblástica aguda) infectada con VIH-1 (Koyanagi, Y. S., y col., 1987, Science 236, 819-822, y Cann, A. J., y col., 1990, J. Virol. 64 (10), 4735-4742). Para el ensayo de quimiosensibilidad, se trataron 200.000 céls./tubo con el inhibidor de las CANP a 4 U/ml y 10 U/ml. Los resultados mostraron un 97% de citotoxicidad a 4 U/ml y un 100% a 10 U/ml de inhibidor de las CANP.

Se usaron extensiones celulares fijadas en acetona fría para los ensayos de inmunofluorescencia, usando suero humano positivo que contenía anticuerpos contra VIH-1 (1:100) y conjugado fluorescente anti-IgG humana (1:200, Dako corp.). Para los controles negativos se usó suero humano negativo frente a anticuerpos de VIH-1. El VIH-1-antígeno inmunofluorescente se detectó en el 60% de los cultivos celulares de MOLT-4 infectados con VIH-1 no tratados. Las células MOLT-4 infectadas por VIH-1 tratadas no tenían VIH-1-antígeno inmunofluorescente detectables a concentraciones de 4 U y 10 U/ml de inhibidor de las CANP.

Se concluye que las células MOLT-4 infectadas por VIH-1 son altamente sensibles al inhibidor de las CANP porque son células malignas, pero la desaparición del VIH-1-antígeno inmunofluorescente demuestra la acción anti-SIDA del inhibidor de las CANP.

Claims (9)

1. El uso de un inhibidor específico de una proteasa neutra activada por calcio (CANP) para la elaboración de una preparación farmacéutica para el tratamiento de un tumor, especialmente cáncer.

2. El uso de un inhibidor específico de una proteasa neutra activada por calcio (CANP) para la elaboración de una preparación farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad vírica.

3. El uso de un inhibidor específico de una proteasa neutra activada por calcio (CANP) para la elaboración de una preparación farmacéutica para el tratamiento del SIDA.

4. El uso de un inhibidor específico de una proteasa neutra activada por calcio (CANP) para la elaboración de un anticonceptivo.

5. El uso reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el inhibidor es un inhibidor natural endógeno de una fuente biológica, seleccionado entre eritrocitos, cerebro, músculo cardiaco, pulmón, bazo, hígado, músculo esquelético, riñón o testículo, está purificado, y comprende proteínas tetraméricas de un PM de aproximadamente 240.000 basado en su elución a partir de Sephadex G-200, que son termoestables a pH neutro, destruidas mediante digestión con tripsina, y disociadas en sus subunidades de un PM de aproximadamente 60.000 o menos, mediante Ca^{+2} 0,1-1 mM, basado en electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, o sales de adición farmacéuticamente aceptables de los mismos.

6. El uso según se reivindica en la reivindicación 5, en el que la fuente biológica del inhibidor se selecciona entre músculo esquelético o hígado de conejo.

7. El uso según se reivindica en la reivindicación 6, en el que el inhibidor procede de músculo esquelético de conejo.

8. El uso según se reivindica en las reivindicaciones 1-4, en el que los inhibidores de las reivindicaciones 5-7, o sus sales de adición farmacéuticamente aceptables, se producen sintéticamente.

9. El uso de un inhibidor específico según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en la preparación de una preparación farmacéutica que está en forma de disolución, polvo, inyección, comprimido, cápsula, pastilla, o en una forma de liberación rápida o prolongada.