KR101986175B1 - 케라틴을 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것으로, 상기 조성물은 세포 사멸과 연관된 다양한 유전자의 발현을 증가시키고, 세포 증식과 연관된 유전자들의 발현을 억제하며, 암 세포의 증식을 억제하므로, 암의 예방 또는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

케라틴을 포함하는 항암용 조성물 {Anti-cancer composition comprising keratin}

본 발명은 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

세포는 수명이 다하거나 손상되면 스스로 사멸하여 전반적인 수의 균형을 유지한다. 그러나 여러 가지 원인에 의해 세포의 조절 기능에 문제가 생기면, 정상적으로는 사멸해야 할 비정상 세포들이 과다 증식하게 되며, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는데, 이러한 상태를 암이라 한다.

암의 치료방법으로는 외과적 수술, 방사선 요법, 생물요법 및 화학요법 등이 있다. 이 중에서 항암제를 이용한 화학요법은 현재 암 치료를 위해 많이 사용되고 있으며, 잘 확립된 치료방법 중 하나이다. 많은 항암제들은 탁월한 암세포 사멸 효과 및 증식 억제 효과를 가지고 있으나, 통상적인 항암제는 암세포에만 특이적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포에도 동시에 작용하며, 그로 인하여 혈구 감소증, 모낭세포 파괴로 인한 탈모증상, 난소와 고환에 대한 부작용으로 인한 월경불순 및 불임, 소화기의 점막 세포 파괴로 인한 구내염, 오심구토 및 음식 연하장애와 소화 장애, 설사증상, 세뇨관 괴사에 의한 신장독성, 신경계 장애로 인해 발생하는 말초 신경염과 쇠약감, 혈관통증 및 발진 등의 혈관장애, 피부 및 손발톱 변색 등의 다양한 부작용이 나타난다. 따라서 항암제에 의한 부작용을 최소화하면서 치료 효과를 상승시키기 위한 연구가 절실하다.

한편, 케라틴은 모발, 손톱, 발톱, 깃털 등을 구성하는 구조 단백질이다. 일반적으로 케라틴은 히스티딘 : 리신 : 아르기닌이 약 1 : 4 : 12의 몰비로 이루어져 있으며, 시스틴의 함량이 많아 황의 함량이 3 내지 5 %를 차지한다. 케라틴은 생체에 포함되어 있는 물질이기 때문에, 생체적합성이 매우 높으나, 용해가 낮은 편이어서 활용이 제한적인 실정이다.

다른 한편, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, 이하 PEG)은 HO-(-CH₂CH₂O-)_n-H의 구조를 갖는 고분자 화합물로, 친수성이 강하기 때문에 다양한 단백질에 결합시켜 그 용해도를 증가시킬 수 있다. 단백질에 결합 가능한 PEG의 분자량 범위는 대략 1,000-100,000으로, PEG 분자량이 1,000 이상일 경우에는 독성이 상당히 낮은 편으로 알려져 있다.

Keratins in health and cancer: more than mere epithelial cell markers, V. Karantza et al., Oncogene, 2001 January 13, 30(2), 127-138

본 발명의 목적은 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 PEG화된 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 케라틴 단백질이 암세포의 증식억제에 효과가 있으면서도, 일반적인 정상세포들에 대해서는 증식억제 효과가 미약한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 일 양태로서, 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 케라틴은 상업적으로 이용가능한 임의의 케라틴일 수 있으나, 바람직하게는 사람 머리카락에서 추출한 케라틴일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 케라틴은 순수한 케라틴뿐만 아니라 다른 화합물과 결합되거나 또는 복합체를 형성한 케라틴을 모두 포함하며, 구체적으로 PEG화된 케라틴, 케라틴-히알루론산 복합체 등을 모두 포함하는 개념이다.

구체적으로, 본 발명의 케라틴은, 사람 머리카락을 클로로포름과 메탄올을 2:1의 비율로 섞은 혼합액에 넣어 지질을 제거하고, 2 % 과산화아세트산 용액에서 12시간 교반한 후, 5 % 2-머캅토에탄올, 5 M 우레아, 2.6 M 티오우레아 및 25 mM Tris-HCl(pH 8.5)에 넣고, 50 ℃에서 72시간동안 반응시켜 수득할 수 있다.

본 발명에서, 암은 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물 또는 악성 종양을 지칭하며, 백혈병, 암종 및 육종을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 암은 예를 들어, 간암, 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 유방암, 선암종, 위암, 췌장암, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 대장암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 식도암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 뇌종양, 척수종양 또는 혈액암 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 간암, 폐암, 골암 또는 유방암일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서, 케라틴은 총 조성물의 중량에 대하여 0.001 %(w/v) 내지 10 %(w/v), 바람직하게는 0.01 %(w/v) 내지 5 %(w/v), 더욱 바람직하게는 0.05 %(w/v) 내지 2 %(w/v)의 함량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 폐암 세포, 골육종 세포 및 선암종 세포에 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물을 투여한 후 Live&Dead assay를 수행하였다. 또한, 본 발명의 구체적인 다른 실시예에서, 상기 암 세포의 세포 증식 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물이 상기 암 세포의 증식을 현저히 억제함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 간암 세포에 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물을 투여한 후 세포 증식 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물이 상기 암 세포의 증식을 억제함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 간암 세포에 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물을 투여한 후 ID1(Inhibitor of DNA binding 1) 및 HipK2(Homeodomain-interacting protein kinase 2)의 발현을 RT-PCR로 측정하였다. 상기 ID1은 암 증식과 혈관생성에 관여하는 단백질이며, 상기 HipK2는 세포사멸에 관여하는 단백질인 p53의 음성 조절자이다. 그 결과, 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물이 ID1과 HipK2의 발현을 현저히 저하시킴을 확인하였다.

또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 간암 세포에 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물을 투여한 후 RNA 염기서열 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물이 세포 사멸과 연관된 유전자들의 발현을 증가시키고, 세포 증식과 연관된 유전자들의 발현을 억제시킴을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 케라틴을 포함하는 약학적 조성물은 다양한 세포 사멸과 연관된 유전자의 발현을 증가시키고, 세포 증식과 연관된 유전자들의 발현을 억제하며, 암 세포의 증식을 억제여, 암의 예방 또는 치료에 매우 효과적일 수 있다.

또한, 케라틴은 생체적합성이 높은 물질이므로 정상세포에 대해서는 증식억제 효과가 미약하다. 즉, 본 발명의 케라틴을 포함하는 약학적 조성물은 암세포의 증식억제에 효과가 있으면서도, 정상세포에 대해서는 증식억제 효과가 미약하여, 기존 항암제에 의한 부작용을 경감시키면서도 암의 치료 효과를 상승시킬 수 있다.

본 발명자들은 케라틴을 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG)화하여 용해성을 증가시켰으며, 상기 PEG화된 케라틴이 암세포 증식 억제에 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 일 양태로서, PEG화된 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 케라틴 및 암은 앞서 기술한 바와 같다.

본 발명에서, PEG화된 케라틴이란 케라틴의 아미노산 잔기에 PEG가 결합되어 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 PEG화된 케라틴에 있어서, PEG는 케라틴의 임의의 아미노산 잔기에 제한 없이 결합될 수 있으나, 바람직하게는 아민기에 결합한다.

본 발명에서, PEG는 예를 들어, O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜, 2염기산 폴리에틸렌글리콜, α,ω-비스(2-카르복시에틸-폴리에틸렌글리콜, O,O`-비스(2-브로모에틸)폴리에틸렌글리콜, O,O`-비스(2-클로로에틸)폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 디메실산, 메톡시폴리에틸렌글리콜 아세트산, O-[2-(3-숙시닐아미노)에틸]-O`-메틸-폴리에틸렌글리콜, O-(2-브로모에틸)-O`-메틸폴리에틸렌글리콜, O-(2-클로로에틸)-O`-메틸폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 모노메틸 에테르 메실산(mesylate), 알데히드 기능화 폴리에틸렌글리콜, 글리시딜이써 기능화 폴리에틸렌글리콜, 나이트로페틸 카보네이트 기능화 폴리에틸렌글리콜, 메실(Mesyl) 기능화 폴리에틸렌글리콜 또는 토실(Tosyl) 기능화 폴리에틸렌글리콜일 수 있으며, 바람직하게는 O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜일 수 있다. 상기 PEG의 분자량은 1000 내지 20000일 수 있으며, 바람직하게는 2000 내지 10000 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 양태에서, PEG화된 케라틴은

ⅰ) O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜을 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일) 4-메톡시몰폴리늄 클로라이드(DMTMM)와 반응시키는 단계; 및

ⅱ) 단계ⅰ)에서 생성된 물질을 케라틴과 반응시켜 PEG화된 케라틴을 생성하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된다.

상기 제ⅰ) 단계는 O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜의 숙신산 작용기를 활성화시키는 단계이며, 상기 제ⅱ) 단계는 케라틴의 아미노산의 아민 잔기가 숙시닐기와 반응하여 PEG화된 케라틴을 생성하는 단계이다.

본 발명의 구체적일 일 실시예에서, 폐암 세포, 골육종 세포 및 간암 세포에 본 발명의 PEG화된 케라틴을 포함하는 조성물을 투여한 후 Live&Dead assay를 수행하였다. 또한, 본 발명의 구체적인 다른 실시예에서, 상기 암 세포의 세포 증식 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 PEG화된 케라틴을 포함하는 조성물이 상기 암 세포의 증식을 현저히 억제함을 확인하였다.

따라서 본 발명의 PEG화된 케라틴을 포함하는 약학적 조성물은 암 세포의 증식을 억제하여 암의 예방 또는 치료에 매우 효과적일 수 있다.

본 발명자들은 케라틴을 히알루론산(Hyalonunic acid)와 결합시켜 복합체를 형성하여 용해성을 증가시켰으며, 이러한 케라틴-히알루론산 복합체가 암세포 증식 억제에 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 일 양태로서, 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 케라틴 및 암은 앞서 기술한 바와 같다.

본 발명에서, 케라틴-히알루론산 복합체란 케라틴의 아미노산 잔기에 히알루론산이 결합되어 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 케라틴-히알루론산 복합체에 있어서, 히알루론산은 케라틴의 임의의 아미노산 잔기에 제한 없이 결합될 수 있으나, 바람직하게는 아민기에 결합한다.

본 발명의 바람직한 일 양태에서, 케라틴-히알루론산 복합체는 히알루론산의 카르복실기(Carboxyl group)와 케라틴의 아민기(amine group)를 아미드화 반응으로 결합시켜 제조된다.

본 발명의 구체적일 일 실시예에서, 선암종 세포에 본 발명의 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 조성물을 투여한 후 세포 증식 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 조성물이 선암종 세포의 증식을 현저히 억제함을 확인하였다.

따라서 본 발명의 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 약학적 조성물은 암 세포의 증식을 억제하여 암의 예방 또는 치료에 매우 효과적일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 케라틴, PEG화된 케라틴 또는 케라틴-히알루론산 복합체 외에 추가적인 유효성분을 1 종 이상 더 포함할 수 있다. 상기 추가적인 유효성분으로는 대부분의 항암제가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 이리노테칸 및 트로포테칸 등이 포함될 수 있다. 상기 추가적인 유효성분은 케라틴과 함께 시너지 효과 또는 상가적 효과를 나타낼 수 있으며, 케라틴에 의해 부작용이 억제될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 사용될 수 있으며, 호르몬 치료, 약물 치료 등의 다양한 방법들과 병용하여 사용될 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 케라틴, PEG화된 케라틴 또는 케라틴-히알루론산 복합체 외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 패치제, 액제, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 좌제 등이 될 수 있다. 이들 제제는 각 질환에 따라 및/또는 성분에 따라 이 분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science (최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법으로 제제화될 수 있다.

본 발명에서 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적조직에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구투여, 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 케라틴을 포함하는 약학적 조성물은, 암세포의 증식을 억제하고, 세포 증식과 연관된 유전자들의 발현을 억제하며, 암세포의 증식을 억제하면서도, 정상세포에는 영향을 미치지 않는다.

또한, 본 발명의 PEG화된 케라틴 또는 히알루론산-케라틴 복합체를 포함하는 약학적 조성물은, 케라틴의 용해도를 증가시켜, 암세포의 증식을 보다 효과적으로 억제할 수 있다.

따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 작용할 수 있다.

도 1은 PEG화된 케라틴을 제조하는 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 PEG화된 케라틴을 NMR 분석한 데이터이다.
도 3은 폐암 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 억제능을 Live&Dead assay와 세포 증식 분석으로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 골육종 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 샘/유방 선암종 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 인간 유방 선암종 세포 및 쥐 선암종 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 간암 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 정도를 도립 현미경으로 관찰한 것이다.
도 8은 간암 세포에 케라틴을 처리한 경우의 ID1 및 HipK2 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 간암 세포에 케라틴을 처리한 경우의 RNA 서열정보 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 간암 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 억제능을 Live&Dead assay로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 11은 간암 세포, 폐암 세포 및 샘/유방 선암종 세포에 PEG화된 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 억제능을 Live&Dead assay로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 12는 간암 세포, 폐암 세포 및 샘/유방 선암종 세포에 PEG화된 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 케라틴이 나타내는 항암 활성의 작용 메카니즘을 도식화한 것이다.
도 14는 인간 유방 선암종 세포 및 쥐 선암종 세포에 케라틴-히알루론산 복합체(Keratin-HA)를 처리한 경우의 세포 증식 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

제조예

<제조예 1> 케라틴의 수득

사람 머리카락을 약한 세제를 이용해서 깨끗하게 세척한 후 증류수로 여러 번 씻어주었다. 지질제거를 위해 머리카락을 비이커에 담고, 클로로포름과 메탄올을 2:1의 비율로 섞은 혼합액에 머리카락이 잠길 때까지 넣어주었다. 24시간 후 지질 제거에 사용한 용액이 머리카락에 남아있지 않을 때까지 증류수로 여러 번 세척한 후 머리카락을 기건(air-dry)시켰다. 2 % 과산화아세트산(Sigma aldrich) 800 mL에 기건시킨 머리카락 20 g을 넣고 37 ℃에서 12시간동안 300 rpm의 속도로 교반하였다. 12시간 후, 머리카락을 체에 거르고 증류수로 세척하여 남아있는 산화물을 제거하였다. 머리카락을 400 mL 신다이(Shindai) 용액(5 % 2-머캅토에탄올, 5 M 우레아, 2.6 M 티오우레아(이상 Sigma aldrich) 및 25mM Tris-HCl(pH 8.5))에 넣고, 50 ℃, 400 rpm의 조건에서 72시간동안 반응시켰다. 그 후, 머리카락 용액을 50 mL 튜브에 넣고 3500 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 모아 12-14 kDa 컷오프 Spectra/Por^®4 투석막(Spectrum)을 이용해서 투석하였다. 투석이 끝난 케라틴 액체샘플을 동결 건조하여 케라틴 파우더를 제조하였다.

<제조예 2> PEG화된 케라틴의 제조

제조예 2-1: PEG화된 케라틴의 합성

도 1에 제시된 반응과정으로 PEG화된 케라틴을 합성하였다.

먼저, 케라틴 파우더 0.5 g을 미세부품 단위계수 측정 전자저울(0.001 g ~ 620 g, AJ-620E)로 달아 500 mL 파이렉스 비이커(ISOLAB, YLS, 독일)에 넣었다. 비이커에 삼차수 100 mL를 넣고, 40×8 mm 마그네틱 교반봉([B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 300 rpm의 속도로 24시간 동안 교반하였다.

메톡시폴리에틸렌글리콜을 변형시킨 O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜 5000(mPEG, 17929-5G-F, Lot#R063737/2V Sigma aldrich) 300 mg을 삼차수 20 mL에 1시간 동안 녹였다. mPEG 용액에 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일) 4-메톡시몰폴리늄 클로라이드(DMTMM) n-수화물(327-53752, wako chemical) 16 mg을 넣고 1시간동안 교반하였다. 케라틴 용액과 mPEG 및 DMTMM의 결합 용액을 500 mL 비커에 넣어, 40×8mm 마그네틱 교반봉(1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 500 rpm의 속도로 실온에서 3일 동안 교반하여 PEG와 케라틴을 반응시켰다.

제조예 2-2: PEG화된 케라틴의 정제

제조예 2-1의 반응이 끝난 후, Spectra/Por 투과막 튜브(직경 16 mm, 평폭 25 mm, MW10000, Spectrum)에 PEG화된 케라틴 용액을 한 튜브당 100 mL씩 넣고, Spectra/Por RC 투석 튜빙 클로져(최대 폭 55 mm, Orange, Spectrum)를 양쪽 튜브에 패킹하였다. 5 L 플라스틱 비이커(지름 197 mm, 높이 265 mm)에 삼차수 4 L를 채워 PEG화된 케라틴 용액이 담긴 튜브를 넣고 마그네틱 바를 넣고 교반하면서 투석하였다. 이때, 12시간마다 새로운 삼차수로 갈아주었으며, 실온에서 3일동안 삼차수로 총 6번을 갈아주면서 투석하였다. 최종 PEG화된 케라틴 용액을 50 mL 원심관(17×120 mm, BD Falcon)에 40 mL 씩 나눠 담은 후, 초저온냉장고(Nihon freezer, Upright type, Single cooling type, 542ℓ)에서 -70 ℃로 24시간 동안 완전히 동결시켰다. 원심관 뚜껑을 열고, 동결건조기(ALPHA 2-4 LSC PLUS, Laboratory freeze dryers, Christ)에 넣고 -85 ℃의 진공상태에서 완전히 파우더 형태가 되도록 3일동안 건조시켰다.

제조예 2-3: PEG화된 케라틴의 확인

제조예 2-2에서 얻은 PEG화된 케라틴을 NMR을 통해 분석하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 PEG화된 케라틴에서 각기 케라틴 및 PEG에서 특이적으로 나타나는 피크가 동시에 존재하고 있음을 확인하였다.

<제조예 3> 케라틴-히알루론산 복합체 (keratin-Hyaluronic acid Conjugate) 하이드로젤의 제조

제조예 3-1: 케라틴-히알루론산 복합체의 합성

500 mL 증류수에 히알루론산나트륨염(Hyaluronic acid sodium salt, HA)(분자량: 50000 Da 또는 2500000 Da (LifeCore biomedical, chaska, MN, 미국)) 800 mg을 녹였다. 40×8 mm 마그네틱 교반봉([B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 300 rpm의 속도로 완전히 녹게 24시간 동안 교반하였다.

10 mL 증류수에 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메톡시몰폴리늄 클로라이드(DMTMM) n-수화물(327-53752, wako chemical) 16 mg을 넣고 실온에서 2시간 교반하여 녹인 후 상기 히알루론산나트륨염 용액에 넣고 히알루론산나트륨염의 카르복실기(Carboxyl group)와 케라틴의 아민기(amine group)가 아미드화 반응을 할 수 있게 반응시켰다. 히알루론산나트륨염과 DMTMM이 반응된 용액을 Spectra/Por 투과막 튜브(직경 16 mm, 평폭 25 mm, MW10000, Spectrum)에 넣고 반응 후 DMTMM을 석출하기 위해 4 L 증류수에 담궜다. 40×8 mm 마그네틱 교반봉([B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 500rpm의 속도로 실온에서 24시간 동안 교반기를 이용해서 제거하였다. 케라틴 파우더 (분자량:4~60000 Da) 1200 mg 무게를 측정하여 300 mL 증류수에 녹인 후 히알루론산나트륨염과 DMTMM이 반응된 용액의 카르복실기와 케라틴의 아민기가 아미드화 반응을 하여 최종 몰농도가 1:1 또는 3:1가 되도록 합성시켰다. 40×8 mm 마그네틱 교반봉([B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 500 rpm의 속도로 실온에서 3일 동안 교반기를 이용해서 합성하였다.

제조예 3-2: 케라틴-히알루론산 복합체의 정제

제조예 3-1의 반응이 끝난 후, Spectra/Por 투과막 튜브(직경 16 mm, 평폭 25 mm, MW10000, Spectrum)에 합성된 히알루론산-케라틴 용액을 한 튜브 당 100 mL씩 넣고, Spectra/Por RC 투석 튜빙 클로져(최대 폭 55 mm, Orange, Spectrum)를 양쪽 튜브에 패킹하였다. 5 L의 플라스틱 비이커 (5000cc, 지름 197 mm, 높이 265mm)에 4 L 증류수를 채워 합성된 히알루론산-케라틴 용액이 담긴 튜브를 넣고 마그네틱바를 교반하면서 투석하였다. 히알루론산-케라틴 용액 중 반응이 된 케라틴과 DMTMM을 완전히 제거하였다. 이때, 3시간마다 새로운 4 L의 증류수로 갈아주었으며, 실온에서 5일간 증류수를 갈아주면서 투석하였다. 최종적으로 완성된 히알루론산-케라틴 용액을 50 mL 원심관(17×120 mm, BD Falcon)에 35mL씩 나눠 담은 후, -70 ℃의 초저온냉장고 (Nihon freezer, Upright type, Single cooling type, 542ℓ)에 넣어 24시간 동안 완전히 동결시켰다. 원심관 뚜껑을 열고, 동결건조기(ALPHA 2-4 LSC PLUS, Laboratory freeze dryers, Christ)에 넣고 진공상태에서 완전히 파우더 형태가 되도록 3일 이상 동안 건조시켜, 최종 히알루론산-케라틴 젤 파우더를 얻었다.

실시예

<실시예 1> 폐암, 골육종 및 선암종 세포에서의 케라틴의 암세포 증식 억제능 확인

인간 폐암 세포(A549 ATCC^® CCL-185™), 골육종 세포(U205), 인간 포유류 샘/유방 선암종 세포(MDA-MB-231 ATCC^® HTB-26™), 인간 유방 선암종 세포(MCF-7 ATCC^®) 및 쥐 선암종 세포 (4T1) 각각을, 24 웰 플레이트에 5x10³ 또는 1x10⁴개씩 접종하고, 24시간 후에 high glucose DMEM 일반배지 또는 1%(w/v)의 케라틴이 포함된 high glucose DMEM 일반 배지로 바꾸어 주었다. 배양배지는 이틀에 한번씩 새로운 배지로 교환해 주었으며, 일정시간 배양한 후 인간 폐암 세포(A549 ATCC^® CCL-185™), 골육종 세포(U205), 인간 포유류 샘/유방 선암종 세포(MDA-MB-231 ATCC^® HTB-26™)에 대해서 Live&Dead assay를 수행하였으며, 인간 폐암 세포(A549 ATCC^® CCL-185™), 골육종 세포(U205), 인간 포유류 샘/유방 선암종 세포(MDA-MB-231 ATCC^® HTB-26™), 인간 유방 선암종 세포(MCF-7 ATCC^®) 및 쥐 선암종 세포 (4T1)에 대해서 세포 증식 분석을 수행하였다.

실시예 1-1: Live&Dead assay

폐암 세포에 대하여 Live/Dead viability/cytotoxicity 키트(invitrogen)를 사용하여, Live&Dead assay를 수행하였다. DPBS 1ml에 0.5μl의 칼세인(Calcein)과 2.0μl의 에티듐 호모다이머(Ethidium Homodimer)를 넣고 섞어주었다. 배지를 제거한 후 DPBS로 세척한 각각의 웰에 위 혼합액을 200μl씩 넣어주었다. 알루미늄 호일로 빛을 차단하고, 37 ℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, DPBS로 세척해주고, 형광현미경(Olympus BX51)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 접종한 세포 밀도에 크게 상관없이 암세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 1-2: 세포 증식 분석

DPBS로 웰을 세척한 후, 각각의 웰에 high glucose DMEM 일반배지로 10배 희석된 Cell Counting Kit-8 용액(Dojindo laboratory)을 넣고, 알루미늄 호일로 빛을 차단한 후, 37 ℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다(인큐베이션 시간은 4시간을 넘지 않는다). 인큐베이션 후, 각각의 웰에서 100μl씩을 96웰 플레이트에 옮기고, 96웰 포맷 플레이트 리더(format plate reader, ELX 800 universal microplate Reader, Bio Tek, Inc.) 기기를 이용하여 450nm 파장(O.D 450nm)에서 흡광도를 측정하였다.

케라틴 처리 1일, 4일 및 7일 후에 인간 폐암 세포(A549 ATCC^® CCL-185™), 골육종 세포(U205) 및 인간 포유류 샘/유방 선암종 세포(MDA-MB-231 ATCC^® HTB-26™)의 증식능을 평가한 결과, 도 3 내지 5에 나타난 바와 같이, 케라틴을 처리하지 않은 그룹에 비해 케라틴을 처리한 그룹에서 세포의 증식이 현저히 억제됨을 확인하였다. 또한 케라틴 처리 1일, 2일 및 3일 후에 인간 유방 선암종 세포(MCF-7 ATCC^®) 및 쥐 선암종 세포 (4T1)의 증식능을 평가한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 케라틴을 처리하지 않은 그룹에 비해 0.5% 이상의 농도인 케라틴을 처리한 그룹에서 세포의 증식이 현저히 억제됨을 확인하였다.

<실시예 2> 간암 세포에서 케라틴의 암세포 증식 억제능 확인

6웰 플레이트 또는 125㎠ 배양 플라스크에 간암 세포(HepG2 ATCC-HB-8065) 5x10⁴개를 접종하고, 24시간 후 high glucose DMEM 일반 배지 또는 1%(w/v)의 케라틴이 포함된 high glucose DMEM 일반배지로 바꾸어 주었다. 48시간 동안 배양한 후, 세포의 증식 정도를 도립 현미경(inverted microscope)으로 관찰하고, RT-PCR과 RNA 염기서열 분석을 수행하였다.

실시예 2-1: 도립 현미경 관찰

현미경 관찰 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 간암 세포(HepG2 ATCC-HB-8065)에 케라틴 처리시, 48시간 후에 세포의 증식이 억제됨을 확인하였다.

실시예 2-2: RT-PCR

RT-PCR분석을 위해 6웰 플레이트에서 배양한 세포들의 배양배지를 제거하고 DPBS로 세척해 주었다. RNA의 추출에 Hybrid-R 키트(Gene All)를 사용하였고, 나노드롭(MICROP UV-Vis Spectrophotometer M600)을 사용하여 정량 하였다. 1μg의 RNA를 AccuPower Cycle Script RT Premix (Bioneer, 대전, 한국)에 첨가하고, 열 순환기(T106, Bio-Rad)를 이용해 cDNA를 만들었다. 사용한 프라이머의 서열은 하기 [표 1]과 같다.

[표 1]

각각의 반응에 SYBR Green PCR Mix 10 μL, 0.5 pm의 프라이머(sense와 antisense)와 50 nm의 주형(template)을 넣어주었다. RT-PCR은 RG6000 5plex HRM (Corbett Research)기기를 사용하였으며, 95 ℃에서 15초, 어닐링(annealing) 온도 57 ℃에서 45초로, 40 사이클을 설정하였다. 역치주기(Threshold cycle, Ct) 값을 측정하기 위해, 상대정량(comparative Ct (2^-ΔΔCt))법을 사용하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 암증식과 혈관생성에 관여하는 ID1과, 세포사멸에 관여하는 p53의 음성 조절자인 HipK2의 유전자 발현이 현저히 저하됨을 확인하였다.

실시예 2-3: RNA 염기서열 분석

RNA 염기서열 분석을 위해 125 ㎠ 배양 플라스크의 배양배지를 제거하고 DPBS로 세척해 주었다. RNA의 추출에 Hybrid-R 키트(Gene All)를 사용하였고, 나노드롭(MICROP UV-Vis Spectrophotometer M600)을 사용하여 정량 하였다. 추출된 10 μg의 RNA를 무-RNase 마이크로원심분리기(RNase free microcentrifuge)에 옮기고, 얼음이 채워진 아이스박스에 넣어 마크로젠사에 보내 분석을 의뢰하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 RNA 염기서열 분석에서도 세포 사멸와 연관된 유전자인 GO:0043067, GO:0010941 및 GO:0042987 등의 발현이 증가되고, 세포 증식과 연관된 유전자인 GO:0022403, GO:0007049 및 GO:0000279 등의 발현이 억제됨을 확인하였다.

실시예 2-4: Live&Dead assay

삼차원적 in vitro 마이크로 간암세포유래 조직을 만들기 위해 직경 450 μm의 폴리에틸렌글리콜(PEG) 마이크로웰 어레이에 1 × 10⁶세포/mL 농도의 세포 현탁액을 200 μL씩 접종 하여 세포 스페로이드(spheroid)를 형성 시킨 후, 1일 동안 high glucose DMEM 일반배지에 배양하였다. 24시간 후에 배양배지를 제거하고, PBS를 넣고 피펫팅을 통해 형성된 세포 스페로이드를 회수하였다. 회수된 세포를 HARV bioreactor (Synthecon)의 10 ml 용기(vessel)에 옮기고, 각각의 용기에 high glucose DMEM 일반배지를 넣어 20 rpm의 속도로 회전시키면서 동적 배양(dynamic culture)을 수행하였다. 4일간 배양 후, Live/Dead viability/cytotoxicity 키트(invitrogen)를 사용하여 Live&Dead assay를 수행하였다. DPBS 1ml에 0.5 μl의 칼세인(Calcein)과 2.0 μl의 에티듐 호모다이머(Ethidium Homodimer)를 넣고 섞어주었다. 배지를 제거한 후 DPBS로 세척한 각각의 웰에 위 혼합액을 200 μl씩 넣어주었다. 알루미늄 호일로 빛을 차단하고, 37 ℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, DPBS로 세척해주고, 형광현미경(Olympus BX51)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 삼차원적 간암 세포 유래 마이크로조직에서도 케라틴 처리 시 세포가 사멸되는 것을 확인하였다.

<실시예 3> PEG화된 케라틴의 암세포 증식 억제능 확인

인간 폐암 세포(A549 ATCC^® CCL-185™), 인간 포유류 샘/유방 선암종 세포(MDA-MB-231 ATCC^® HTB-26™) 및 간암 세포(HepG2 ATCC-HB-8065) 각각을, 24 웰 플레이트에 5x10³ 또는 1x10⁴개씩 접종하고, high glucose DMEM 일반 배지, 1 %(w/v)의 케라틴이 포함된 high glucose DMEM 일반 배지, 또는 2 %(w/v)의 PEG화된 케라틴이 포함된 high glucose DMEM 일반 배지로 바꾸어 주었다. 배양배지는 이틀에 한번씩 새로운 배지로 교환해 주었다. 일정 시간 배양한 후에 Live&Dead assay 및 세포 증식 분석을 수행하였다.

실시예 3-1: Live&Dead assay

Live/Dead viability/cytotoxicity 키트(invitrogen)를 사용하여, Live&Dead assay를 수행하였다. DPBS 1ml에 0.5 μl의 칼세인(Calcein)과 2.0 μl의 에티듐 호모다이머(Ethidium Homodimer)를 넣고 섞어주었다. 배지를 제거한 후 DPBS로 세척한 각각의 웰에 위 혼합액을 200 μl씩 넣어주었다. 알루미늄 호일로 빛을 차단하고, 37 ℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, DPBS로 세척해주고, 형광 현미경(Olympus BX51)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 각 암세포들의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 3-2: 세포 증식 분석

DPBS로 웰을 세척한 후, 각각의 웰에 high glucose DMEM 일반 배지로 10배 희석된 Cell Counting Kit-8 용액(Dojindo laboratory)을 넣고, 알루미늄 호일로 빛을 차단한 후, 37 ℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다 (인큐베이션 시간은 4시간을 넘지 않는다). 인큐베이션 후, 각각의 웰에서 100μl씩을 96웰 플레이트에 옮기고, 96웰 포맷 플레이트 리더(ELX 800 universal micro plate Reader, Bio Tek, Inc.) 기기를 이용하여 450 nm 파장(O.D 450 nm)에서 흡광도를 측정하였다.

PEG화된 케라틴 처리 1일, 4일 및 7일 후에 각 암세포들의 증식능을 평가한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, PEG화된 케라틴을 처리하지 않은 그룹에 비해 PEG화된 케라틴을 처리한 그룹에서 세포의 증식이 현저히 억제됨을 확인하였다.

<실시예 4> 케라틴-히알루론산 복합체의 암세포 증식 억제능 확인

사람 유방 선암종 세포(MCF-7 ATCC^®) 및 쥐 유방 선암종 세포 (4T1) 각각을, 24 웰 플레이트에 1x10⁴개씩 접종하고, 24시간 후에 high glucose DMEM 일반배지 또는 0.25-4% (w/v)의 케라틴 또는 2% 케라틴-히알루론산 복합체가 포함된 high glucose DMEM 일반 배지로 바꾸어 주었다. 배양배지는 매일 한번씩 새로운 배지로 교환해 주었으며, 일정시간 배양한 후 세포 증식 분석을 수행하였다.

DPBS로 웰을 세척한 후, 각각의 웰에 high glucose DMEM 일반 배지로 10배 희석된 Cell Counting Kit-8 용액(Dojindo laboratory)을 넣고, 알루미늄 호일로 빛을 차단한 후, 37 ℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다 (인큐베이션 시간은 4시간을 넘지 않는다). 인큐베이션 후, 각각의 웰에서 100μl씩을 96웰 플레이트에 옮기고, 96웰 포맷 플레이트 리더(ELX 800 universal micro plate Reader, Bio Tek, Inc.) 기기를 이용하여 450nm 파장(O.D 450nm)에서 흡광도를 측정하였다.

케라틴-히알루론산 복합체(50K 히알루론산:케라틴 3:1 ; 50K 히알루론산:케라틴 1:1 ; 2500K 히알루론산:케라틴 3:1 ; 또는 2500K 히알루론산:케라틴 1:1) 처리 1일, 2일 및 3일 후에 각 암세포들의 증식능을 평가한 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 케라틴-히알루론산 복합체의 처리시 세포의 증식이 현저히 억제됨을 확인하였다.

<110> UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION GROUP OF KYUNG HEE UNIVERSITY <120> Anti-cancer composition comprising keratin <130> P15-197-REA-KHU <150> KR 10-2016-0089385 <151> 2016-07-14 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of ID1 <400> 1 agcaggtaaa cgtgctgctc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of ID1 <400> 2 gaatctccac cttgctcacc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of HipK2 <400> 3 gctacctgct ggagaactgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of HipK2 <400> 4 acgtgcttgg tcttcgagat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of beta-Actin <400> 5 gtcaggcagc tcgtagctct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of beta-Actin <400> 6 tcgtgcgtga cattaaggag 20

Claims (15)

1. 케라틴을 포함하는 간암, 폐암, 골암 또는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 케라틴은 사람의 머리카락으로부터 수득된 것인 약학적 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 케라틴이 0.001 %(w/v) 내지 10 %(w/v)의 함량으로 포함되는 약학적 조성물.
6. PEG화된 케라틴을 포함하는 간암, 폐암, 골암 또는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 PEG화된 케라틴은 케라틴의 아민기에 PEG가 결합된 것인 약학적 조성물.
8. 제6항에 있어서, 상기 PEG화된 케라틴은
   ⅰ) O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜을 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일) 4-메톡시몰폴리늄 클로라이드(DMTMM)와 반응시키는 단계; 및
   ⅱ) 단계ⅰ)에서 생성된 물질을 케라틴과 반응시켜 PEG화된 케라틴을 생성하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것인 약학적 조성물.
9. 삭제
10. 삭제
11. 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 간암, 폐암, 골암 또는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 케라틴-히알루론산 복합체는 케라틴과 히알루론산이 아미드 결합한 것인 약학적 조성물.
13. 제 11항에 있어서, 케라틴-히알루론산 복합체는 히알루론산의 카르복실기(Carboxyl group)와 케라틴의 아민기(amine group)를 아미드화 반응으로 결합시켜 제조된 것인 약학적 조성물.
14. 삭제
15. 삭제

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