ES2965059T3 - Monocitos que expresan p21 para la terapia celular del cáncer - Google Patents

Abstract

La identificación de objetivos eficaces que alivien la eliminación celular programada (PrCR) de las células tumorales por parte de los macrófagos es de gran interés. Los presentes inventores han identificado que la proteína p21 inhibidora de la quinasa dependiente de ciclina es un potente regulador de la PrCR mediada por macrófagos. Además, demostraron que la transferencia adoptiva de monocitos que sobreexpresan p21 induce la PrCR de los macrófagos y la transición de un fenotipo antiinflamatorio a uno proinflamatorio in vivo, retrasa la progresión del cáncer y aumenta significativamente la supervivencia general de los ratones a los que se les han injertado células cancerosas. Por lo tanto, la presente invención se refiere a composiciones terapéuticas que comprenden monocitos que sobreexpresan la proteína p21 inhibidora de la quinasa dependiente de ciclina, y su uso para el tratamiento de mamíferos que padecen cáncer, especialmente leucemia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Monocitos que expresan p21 para la terapia celular del cáncer

Sumario

La identificación de dianas eficaces que alivien la eliminación celular programada (RCP) de las células tumorales por los macrófagos es de gran interés. Los presentes inventores han identificado que la proteína inhibidora de la cinasa dependiente de ciclina p21 es un fuerte regulador de la PrCR mediada por macrófagos. Asimismo, demostraron que la transferencia adoptiva de monocitos que sobreexpresan p21 induce la PrCR de los macrófagos y la transición de un fenotipo antiinflamatorio a uno proinflamatorioin vivo,retrasa la progresión del cáncer y aumenta significativamente la supervivencia global de los ratones injertados con células cancerosas. La presente invención se refiere, por lo tanto, a composiciones terapéuticas que comprenden monocitos que sobreexpresan la proteína inhibidora de la quinasa dependiente de ciclina p21, y a su uso para tratar mamíferos que padecen cáncer, especialmente leucemia.

Antecedentes técnicos

Cuando se activan adecuadamente, las células efectoras de los sistemas inmunitarios innato y adaptativo poseen la capacidad de atacar con éxito a las células cancerosas. En el pasado, se ha propuesto inhibir los reguladores inmunitarios adaptativos negativos (tales como el antígeno 4 asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1)) o potenciar la capacidad normal de la respuesta inmunitaria del paciente por medio de la transferencia adoptiva de células inmunitarias del propio paciente manipuladas (tales como las células T receptoras de antígenos quiméricos (CAR)). En el Documento WO2017019848se usan monocitos modificados para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) para tratar un modelo de ratón de cáncer de ovario.

Dicho tratamiento ha dado lugar a avances significativos en el tratamiento de cánceres sólidos y trastornos hematológicos (Pardoll DM.,Nat Rev Cáncer(2012) y Sharma SHet al., Cell(2015)).

Sin embargo, se necesita una comprensión más completa de la inmunorregulación a fin de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra el cáncer.

La eliminación programada de células (PrCR) es un proceso de vigilancia inmunitaria mediado por macrófagos por medio del cual se reconocen y fagocitan células diana (Jaiswalet al., Trends Immunol(2010)). Descrito inicialmente como un mecanismo clave que vincula la muerte celular programada con la eliminación de células moribundas (Arandjelovic y Ravichandran,Nat Immunol(2015)), la PrCR también se ha implicado en la eliminación de células tumorales vivas (Majetiet al., Cell(2009)).

La eficacia de la PrCR viene determinada por el equilibrio entre el reconocimiento de señales profagocíticas (“cómeme”) por los macrófagos y la inhibición de los macrófagos por medio de la activación de vías antifagocíticas (“no me comas”) por las células cancerosas diana (Chaoet al., Nat Rev Cancer(2011)). La secreción de la señal “cómeme” calreticulina (CRT) de los macrófagos se identificó recientemente como una primera señal que favorece la PrCR a través de la unión de asialoglicanos en las células cancerosas diana (Fenget al., Nat Comm(2018)). Inversamente, la proteína transmembrana CD47 se ha identificado como una señal de “no me comas” que inhibe la PrCR por medio de la unión y activación de la proteína reguladora de señales alfa (SIRPa), un receptor inhibidor de la fagocitosis expresado en las membranas de los macrófagos (Jaiswalet al., Cell(2009)). Un estudio ha demostrado que el bloqueo del eje CD47-SIRPa con anticuerpos monoclonales bloqueantes de CD47 induce selectivamente el engullimiento de células tumorales y ha demostrado eficacia en diversos modelos preclínicos de linfoma, cáncer de vejiga, cáncer de colon, glioblastoma, cáncer de mama, leucemia linfocitaria aguda y leucemia mieloide aguda (Weiskopf K.Eur J Cancer(2017)). Más recientemente, la combinación del bloqueo de CD47 con rituximab mostró una actividad prometedora en pacientes con linfoma no Hodgkin recidivante o refractario (Advani R.et al., N Engl J Med(2018)), lo que destaca el hecho de que dirigirse al punto de control inmunitario (MIC) de los macrófagos para desencadenar el PrCR representa una oportunidad terapéutica sustancial.

La identificación de dianas eficaces que alivien la eliminación celular programada (RCP) de las células tumorales por los macrófagos es, por lo tanto, de gran interés. La presente invención responde a esta necesidad.

Descripción detallada de la invención

Como se describe en los ejemplos siguientes, los presentes inventores han descubierto que el agotamiento del inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina p21 en macrófagos humanos primarios bloquea su capacidad fagocítica y, por lo tanto, disminuye su vigilancia inmunitaria (figuras 1j y 1k). Identificaron por primera vez que la proteína p21 es un fuerte regulador de la PrCR mediada por macrófagos. Demostraron que la sobreexpresión de p21 puede actuar como inhibidor del punto de control inmunitario (MIC) de los macrófagos, gracias al cual las células tumorales acaban siendo reconocidas, fagocitadas y destruidas.

En consecuencia, demostraron que la transferencia adoptiva de monocitos que sobreexpresan p21 induce la PrCR de macrófagos y la transición de un fenotipo antiinflamatorio a uno proinflamatorioin vivo,retrasa la progresión del cáncer y aumenta significativamente la supervivencia global de ratones injertados con células cancerosas (figura 1r). La presente invención se refiere a composiciones celulares y su incorporación en composiciones farmacéuticas que se pueden usar en la terapia del cáncer, más particularmente, en la inmunoterapia del cáncer. Específicamente, se relaciona con el aislamiento, cultivo, activación y modificación genética de células del sistema fagocítico mononuclear, y su uso en terapia celular, por ejemplo en inmunoterapia adoptiva.

Las células del sistema fagocítico mononuclear comprenden los monocitos de sangre periférica, sus precursores de médula ósea o sangre y los macrófagos tisulares. Los monocitos se forman en la médula ósea, que abandonan tras su maduración, pasando de la sangre periférica a los tejidos. Los monocitos humanos que circulan en la sangre tienen una vida media de aproximadamente 3 días. Cuando llega a los tejidos, el monocito se denomina macrófago. El número total de macrófagos tisulares supera con creces el número de monocitos circulantes, en un factor de 400 aproximadamente. Los macrófagos se encuentran en todo el organismo, pero son especialmente numerosos en el hígado (células de Kupffer), en los ganglios linfáticos, en los pulmones, en el peritoneo y en la piel (células de Langerhans). El paso de los monocitos de la circulación general a los tejidos es irreversible.

Se sabe que los monocitos y los macrófagos tienen numerosas e importantes funciones, que incluye la inducción de respuestas inmunitarias en fases agudas, la regulación de la hematopoyesis, la activación del sistema inmunitario, la coagulación, la destrucción de organismos y de células tumorales y la reparación y cicatrización de tejidos.

Los monocitos-macrófagos también se pueden usar en inmunoterapia adoptiva para el tratamiento de algunos tipos de cáncer en el hombre. Normalmente, estas células se pueden purificar a partir de la sangre circulante de los pacientes, cultivarseex vivoy activarse con interferón<y>para inducir su diferenciación y aumentar su poder tumoricida, y posteriormente reinyectarse en los pacientes. También es posible, mediante el uso de vectores adecuados, transferir genesex vivoa células macrófagas derivadas de monocitos, lo que permite dotarlas de propiedades superiores en términos de citotoxicidad y de estimulación del sistema inmunitario.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere por lo tanto a una composición farmacéutica que comprende monocitos que sobreexpresan la proteína inhibidora de la quinasa dependiente de ciclina p21. Estos monocitos, una vez injertados en los tejidos, se diferenciarán en macrófagos.

Esta composición farmacéutica se denomina en lo sucesivo “composición de la invención”, “composición farmacéutica de la invención” o “composición celular de la invención”.

En particular, la presente invención se refiere al uso de monocitos que sobreexpresan la proteína inhibidora de la quinasa dependiente de ciclina p21, para preparar un medicamento destinado a reforzar el sistema inmunitario y hematopoyético de un paciente a fin de tratar el cáncer, específicamente la leucemia.

Como se usa en la presente memoria, el término “proteína p21” designa indistintamente al inhibidor 1 de la cinasa dependiente de ciclina, que también se conoce como “p21Cip1 ”, “p21Waf1 ”, “W afl”, “CDKN1A”, “CAP20”, “CIP1”, “MDA-6”, “SDI1” y “proteína 1 que interactúa con CDK”. Esta proteína se une a los complejos ciclina-CDK1, CDK2 y CDK4/6 e inhibe su actividad, por lo que actúa como regulador de la progresión del ciclo celular en las fases G1 y S. La unión de p21 a los complejos CDK se produce a través del dominio N-terminal de p21, que es homólogo a los otros inhibidores CIP/CDK p27 y p57. Como diana principal de la actividad de p53, se suele asociar a la vinculación del daño en el ADN con la detención del ciclo celular. Esta proteína está codificada por el genCDKN1Ade la SEC. ID Núm.: 1 (NM_078467) localizado en el cromosoma 6 (6p21.2) en humanos. En ratones, la proteína está codificada por el genCDKN1Ade la SEC. ID Núm.: 3 (NM_o07669). La proteína p21 humana tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 2 (NP_000380), mientras que la proteína p21 de ratón tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID Núm.: 4 (Np_031695).

El término “proteína p21” en la presente memoria también abarca variantes funcionales y/o fragmentos de las proteínas p21 antes mencionadas.

Las “variantes funcionales” son, por ejemplo, las proteínas p21 de tipo salvaje de especies animales diferentes del ser humano o el ratón (por ejemplo, de animales de la especie equina, canina, felina o bovina). En la actualidad, estas proteínas están bien caracterizadas y su secuencia se puede recuperar fácilmente de las bases de datos convencionales. Las “variantes funcionales” son también versiones mutadas de las proteínas p21 naturales, cuya secuencia de aminoácidos comparte un porcentaje de identidad de al menos el 75%, preferentemente de al menos el 80%, más preferentemente de al menos el 90% con la proteína de tipo salvaje de la especie correspondiente (para una terapia humana, con la SEC. ID Núm.: 2, para una terapia de ratón, con la SEC. ID Núm.: 4, etc.).

En el contexto de la invención, el porcentaje de identidad entre dichas dos secuencias homólogas se identifica por medio de un alineamiento global de las secuencias en su totalidad, este alineamiento se lleva a cabo por medio de un algoritmo muy conocido por los expertos, tales como el desvelado en Needleman y Wunsch (1970). En consecuencia, las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante el uso de cualquier software conocido por los expertos, tales como el software“needle"mediante el uso del parámetro“Gap open"de 10, el parámetro“Gap extendde 0,5 y la matriz“Blosum62”.

Los “fragmentos funcionales” de la proteína p21 son cualquier fragmento de la proteína p21 de tipo salvaje o de variantes funcionales de la misma, que retenga la función de la proteína p21 para potenciar la eliminación celular programada (PrCR) de células tumorales por macrófagos.

En una realización preferente, los monocitos comprendidos en la composición farmacéutica de la invención contienen un virus recombinante de replicación defectuosa que codifica el inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina p21 o un ácido nucleico recombinante no viral que contiene el gen que codifica p21 colocado bajo el control de elementos reguladores que permiten su expresión. Este virus o ácido nucleico recombinante permite sobreexpresar la proteína p21, inhibidora de la cinasa dependiente de ciclina. Dicho ácido nucleico recombinante es preferentemente un plásmido de ADN. También se puede usar la transposición estable no viral de la Bella Durmiente del gen p21 a partir de vectores de ADN mínimos superenrollados denominados como minicírculos. La ingeniería genética de los monocitos también se podría llevar a cabo mediante el uso de la transferencia no viral de ARNm de p21 traducidoin vitroen los monocitos.

Por “sobreexpresión de la proteína p21 inhibidora de la cinasa dependiente de ciclina” se entiende que el nivel de expresión global de la proteína p21 es mayor en los macrófagos contenidos en la composición de la invención que en los macrófagos convencionales no tratados. Esta sobreexpresión se puede detectar por cualquier medio convencional que permita medir los niveles de proteína, tales como el western blot. Para ser usados en la composición de la invención, los macrófagos se modifican genéticamente de forma que la expresión final de p21 sea al menos dos o tres veces superior a la de los macrófagos de control no tratados. La integración estable del gen p21 en el genoma de los monocitos garantiza la durabilidad de la expresión de la proteína inhibidora de la cinasa dependiente de ciclinas p21 en los macrófagos diferenciados injertados en los tejidos. Además de considerar la larga longevidad de los macrófagos en los tejidos, la durabilidad de la expresión de la proteína p21 está aún más garantizada.

El uso de un vector (plásmido o virus o ARNm traducidoin vitro)permite mejorar la administración del ácido nucleico que codifica la p21 en las células diana, así como aumentar la estabilidad de dicho ácido nucleico en dichas células, lo que permite obtener un efecto duradero.

En una realización preferente, dicho vector se elige en el grupo que consiste en: adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), herpesvirus, lentivirus, virus vaccinia, citomegalovirus (CMV) y similares, que han demostrado transfectar macrófagos eficazmente (Singh G.et al.,F1000 research 2015).

Ventajosamente, dicho virus es un virus defectuoso. El término “virus defectuoso” denota un virus incapaz de replicarse en la célula diana. Por lo general, el genoma de los virus defectuosos usados en el contexto de la presente invención carece de al menos las secuencias necesarias para la replicación de dicho virus en la célula infectada. Estas regiones se pueden eliminar (total o parcialmente), dejar de ser funcionales o sustituirse por otras secuencias, en particular por el ácido nucleico recombinante. Preferentemente, el virus defectuoso conserva no obstante las secuencias de su genoma necesarias para la encapsulación de la partícula viral.

En particular, el vector AAV presenta diversas ventajas tales como i) una expresión duradera de los genes sintetizados, ii) un bajo riesgo de reacciones patógenas (porque se fabrican artificialmente y no son tóxicos), iii) desencadenan una baja respuesta inmunogénica y iv) no integran el genoma humano. A fin de aumentar la eficacia de la expresión génica y evitar la propagación involuntaria del virus, se pueden llevar a cabo modificaciones genéticas del AAV. Estas modificaciones genéticas incluyen la supresión de la región E1, la supresión de la región E1 junto con la supresión de la región E2 o E4, o la supresión de todo el genoma del adenovirus excepto las repeticiones terminales invertidas cis-actores y una señal de empaquetamiento. La presente invención abarca ventajosamente dichos vectores. También se puede usar la transposición estable no viral de la Bella Durmiente del gen p21 a partir de vectores de ADN mínimos superenrollados denominados como minicírculos. La ingeniería genética de los monocitos también se podría llevar a cabo mediante el uso de la transferencia no viral de ARNm de p21 traducidoin vitroen los monocitos. Los plásmidos de estos dos procedimientos se administran por transfección de monocitos por medio de electroporación.

Otro vector ventajoso para la preparación de las composiciones celulares de acuerdo con la invención es un vector adenoviral. En efecto, Haddada H.et al. Biochem. Biophys. Res. Commun.(1993) demostró que los adenovirus son capaces de infectar con gran eficacia células de la línea monocito-macrófago, de mantenerse de forma estable en ellas y de expresar un gen terapéutico. Existen diferentes serotipos de adenovirus, cuya estructura y propiedades varían ligeramente, pero que no son patógenos para el hombre y, en particular, para los sujetos no inmunodeprimidos. Además, estos virus no se integran en el genoma de las células que infectan y pueden incorporar grandes fragmentos de ADN exógeno. Entre los diferentes serotipos, es preferente en el contexto de la presente invención usar adenovirus de tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad 5). En el caso de los adenovirus Ad 5, las secuencias necesarias para la replicación son las regiones E1A y E1B. Estas secuencias se eliminan preferentemente del ácido nucleico recombinante usado en la presente invención.

Otro vector ventajoso para la preparación de las composiciones celulares de acuerdo con la invención es un lentivirus. Los lentivirus, como el VIH, tienen la capacidad de infectar células que se dividen o no y de integrarse en el genoma de la célula huésped. Debido a estas características, los vectores lentivirales basados en el VIH se han propuesto como buenos candidatos a sistemas de administración para la terapia génica, pero el intento de usarlos en ensayos clínicos ha suscitado preocupaciones sobre su seguridad, incluido el riesgo de recombinación genética que lleve a la generación de retrovirus competentes para la replicación en humanos. Se han llevado a cabo otras modificaciones en el empaquetado y los componentes genéticos de los genes virales para desarrollar sistemas de vectores lentivirales basados en el VIH más seguros. En la actualidad, se ha diseñado un número de vectores lentivirales seguros basados en el VIH para transducir eficientemente genes diana en macrófagos diferenciados derivados de monocitos (Leyva F.et al., BMC biotechnology(2011). Cualquiera de estos vectores se puede usar en el contexto de la presente invención.

Los vectores lentivirales preferentes son aquellos que se han modificado para poder ser administrados con seguridad en mamíferos. Estos vectores son, por ejemplo, los vectores VIH/VIS que se sabe que son útiles en la terapia génica humana o de mamíferos, como se expone en Neschadim A.et al. Biol Blood Marrow Transplant.2007 dic;13(12):1407 a 1416. Los vectores más interesantes son los lentivirales autoinactivadores basados en el VIH y el VIS (Neschadim A.et al. Biol Blood Marrow Transplant.2007 dic;13(12):1407 a 1416.), los vectores adenovirales (Haddada H.et al. Biochem. Biophys. Res. Commun.(1993)) y los vectores no virales del transposón de la Bella Durmiente (Aronovichet al. Human Molecular Genetics(2011)).

Se puede usar el vector usado en el ejemplo, es decir, el vector lentiviral autoinactivado (SIN) en base al VIH-1 que codifica la proteína p21. Este vector puede codificar la proteína p21 sola o fusionada con otra proteína tal como la AIP (proteína que interactúa con el receptor de aril hidrocarburos) o fusionada con pequeñas etiquetas proteicas tales como la etiqueta Flag o la etiqueta hemaglutinina (HA).

En una realización particularmente preferente, la composición de la invención también contiene Partículas Similares Virales (VLPs) que contienen SlVmac-VPX para inducir la degradación de factores que perjudican la infección lentiviral (Berger G.,Gene Therapy(2009)). El SlVmac-VPX degrada SAMHD1, que fue identificado como un factor de restricción del VIH-1 que hidroliza dNTPs necesarios para la replicación retroviral (Lahouassaet al., Nat. Immunol.(2012)).

En una realización aún más particularmente preferente, los monocitos contenidos en la composición celular de la invención han sido transducidos por un vector lentiviral SIN que contiene la siguiente secuencia de ácido nucleico de la SEC. ID Núm.: 5 que codifica para la proteína p21:

ATG TCA GAA CCG GCT GGG GAT GTC CGT CAG AAC CCA

TGCGGCAGCAAGGCCTGCCGCCGCCTCTTCGGCCCAGTGGACAGCGAGCAGCTGAGCCG

CGACTGTGATGCGCTAATGGCGGGCTGCATCCAGGAGGCCCGTGAGCGATGGAACTTCG

ACTTTGTCACCGAGACACCACTGGAGGGTGACTTCGCCTGGGAGCGTGTGCGGGGCCTT

GGCCTGCCCAAGCTCTACCTTCCCACGGGGCCCCGGCGAGGCCGGGATGAGTTGGGAG

GAGGCAGGCGGCCTGGCACCTCACCTGCTCTGCTGCAGGGGACAGCAGAGGAAGACCAT

GTGGACCTGTCACTGTCTTGTACCCTTGTGCCTCGCTCAGGGGAGCAGGCTGAAGGGTCC

CCAGGTGGACCTGGAGACTCTCAGGGTCGAAAACGGCGGCAGACCAGCATGACAGATTTC

TACCACTCCAAACGCCGGCTGATCTTCTCCAAGAGGAAGCCCTAA

Como se ha indicado anteriormente, el gen codificante de p21 se encuentra bajo el control de elementos reguladores que permiten su expresión. Estos elementos reguladores suelen consistir en secuencias promotoras de la transcripción. Se puede tratar de secuencias naturalmente responsables de la expresión de p21, cuando estas secuencias son capaces de funcionar en los monocitos-macrófagos. También pueden ser secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o incluso genes sintéticos). En particular, pueden ser secuencias promotoras de genes eucariotas o virales. Por ejemplo, pueden ser secuencias promotoras procedentes del genoma del monocito que se desea infectar. Del mismo modo, pueden ser secuencias promotoras procedentes del genoma de un virus. A este respecto, se pueden mencionar, por ejemplo, los promotores E2F1 (factor 1 de unión al promotor E2) o los promotores de los genes EFS (factor de elongación 1a corto), SFFV (virus formador de focos del bazo propenso al silenciamiento), CMV (citomegalovirus), RSV (virus del sarcoma de Rous) y similares. Además, estas secuencias de expresión se pueden modificar por medio de la adición de secuencias activadoras, secuencias reguladoras y similares.

Los expertos deben seleccionar el vector y las secuencias reguladoras teniendo en cuenta que la expresión final de p21 por los macrófagos de la invención debe aumentar al menos dos o tres veces en comparación con los macrófagos de control transfectados de prueba.

Los procedimientos para construir vectores de expresión que contengan secuencias codificantes y señales de control transcripcional/traduccional apropiadas son muy conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantein vitro,técnicas sintéticas y recombinación/recombinación genéticain vivo.

Los ácidos nucleicos se pueden aislar y obtener con una pureza sustancial, y posteriormente introducirse en células huésped adecuadas mediante el uso de una variedad de técnicas disponibles en la técnica.

Todas las técnicas de construcción de vectores derivados de adenovirus, lentivirus, o de AAV, y de incorporación de secuencias de ácido nucleico heterólogas en los mismos, se han descrito en la literatura y se pueden usar en el contexto de la presente invención. Los procedimientos usados tradicionalmente en biología molecular, tales como las extracciones preparatorias de ADN plasmídico, la centrifugación de ADN plasmídico en un gradiente de cloruro de cesio, la electroforesis en gel de agarosa o acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN por electroelución, la extracción de proteínas con fenol o fenol-cloroformo, la precipitación de ADN con etanol o isopropanol en un medio salino, la transformación enEscherichia coli,etc., son muy conocidos por los expertos en la técnica y están ampliamente descritos en la bibliografía [Maniatis Tet al., “Molecular Cloning, a Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y, 1982; Ausubel F. M.et al.(eds),“Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley & Sons, Nueva York, 1987].

Una vez modificado genéticamente el genoma de los virus, éstos se multiplican y se recuperan y purifican de acuerdo con las técnicas estándar de la biología molecular.

La composición farmacéutica de la invención contiene monocitos que sobreexpresan la proteína p21.

Como se usa en la presente memoria, el término “macrófagos derivados de monocitos” designa células mononucleares que han sido cultivadas y diferenciadas en macrófagos a partir de monocitos de sangre periférica (PBMC), o de sus precursores de médula ósea o sangre, en las condiciones detalladas en los ejemplos (véase también Andressen R.et al., Cancer Res.1990; Bartholeyns Jet al., Anticancer Res.(1991)). Como precursores, también es posible usar células madre pluripotentes, células madre mieloides (CFU-GEMM), células madre mielomonocíticas (CFU-GM), CFU-M, monoblastos o promonocitos. Las inyecciones intravenosas de monocitos indujeron su injerto y su diferenciación en macrófagos en la médula ósea, en el bazo y en el hígado.

Dado que las PBMCs se encuentran en la sangre, una muestra de PBMCs se puede obtener por medio de una extracción de sangre del sujeto completamente inocua y no invasiva.

La extracción y el aislamiento de PBMC / células monocito-macrófagas o sus precursores se pueden llevar a cabo por medio de cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Estas diferentes técnicas pueden implicar pasos físicos de separación (centrifugación, clasificación celular (FACS), y similares), y selección con compuestos inmunológicos (anticuerpos específicos para marcadores celulares y similares) o compuestos bioquímicos (ligandos de receptores de membrana), y similares. El cultivo de las células aisladas se puede llevar a cabo en diferentes medios conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo RPMI, IMDM), suplementados, entre otros, con suero y aminoácidos. El cultivo de las células se lleva a cabo en condiciones estériles, preferentemente a 37 °C, como se ilustra en los ejemplos. Se puede llevar a cabo en placas de cultivo o, preferentemente, en bolsas de teflón.

En una realización preferente, las células contenidas en la composición de la invención se han obtenido por medio del cultivo de PBMC en condiciones adecuadas que permiten su diferenciación. Por ejemplo, la diferenciación de monocitos de sangre humana en macrófagos se puede inducirin vitropor medio de tres procedimientos diferentes, a saber, por medio del cultivo de PBMC en 1) suero humano (HS), 2) suero bovino fetal (FBS) con factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) o 3) FBS con factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF).

En una realización particular, la transducción de los monocitos purificados a partir de células PBMC con los ácidos nucleicos recombinantes se lleva a caboex vivoy, a continuación, las células transducidas se diferencian/cultivan en macrófagosex vivo.En esta realización, la composición celular de la invención contiene macrófagos diferenciados que sobreexpresan la proteína p21.

En otra realización particular, los ácidos nucleicos recombinantes de la invención se han transducido en las células una vez que se han diferenciado/cultivado en macrófagosex vivo.En esta realización, la composición celular de la invención también contiene macrófagos diferenciados que sobreexpresan la proteína p21, pero la diferenciación de las células en macrófagos se ha llevado a cabo antes de la transducción con los ácidos nucleicos recombinantes de la invención.

En otra realización particular, los ácidos nucleicos recombinantes de la invención han sido transducidos en las células en su estadio monocítico,ex vivo.A continuación, las células se administran al sujeto, donde se produce su diferenciación en macrófagos. En esta realización, la composición celular de la invención contiene monocitos indiferenciados que sobreexpresan la proteína p21.

En otra realización particular, es posible administrar el ácido nucleico recombinantein vivoa fin de transfectarin situlos macrófagos circulantes.

Como se desvela en la presente memoria, los términos“in vitro"y “exvivo"son equivalentes y se refieren a estudios o experimentos que se llevan a cabo mediante el uso de componentes biológicos (por ejemplo, células o población de células) que se han aislado de sus organismos huéspedes habituales (por ejemplo, animales o humanos). Por el contrario, los términos“in vivo” o “in situ"se refieren a estudios que se llevan a cabo en organismos vivos completos (por ejemplo, seres humanos), tras la administración de la composición de la invención en un sujeto vivo.

En otra realización, la composición celular de la invención contiene monocitos purificados de PBMC que han sido transformadosex vivo,pero no han sido diferenciadosex vivoen macrófagos. Su diferenciación se produciráin vivo,en el huésped. En este caso, las composiciones de la invención poseen más del 80% de monocitos o, más preferentemente más del 90% de monocitos, aún más preferentemente más del 99% de monocitos. Esto significa que la composición celular de la invención contiene muy pocas otras células, si es que contiene alguna.

Los monocitos purificados de PBMC contenidos en la composición celular de la invención son células monocitarias que se han recuperado de la sangre periférica de un individuo por medios convencionales. Estos monocitos purificados a partir de PBMC son positivos para los marcadores: CD14, CD11b y CD16, pero negativos para los marcadores CD56 (que es un marcador de las células NK), CD3 (marcador de las células T) y CD20 (marcador de las células B). Preferentemente, la composición celular de la invención contiene más del 90%, preferentemente más del 95% e idealmente más del 99% de dichas células. La presencia de estos marcadores se puede evaluar por cualquier medio convencional, por ejemplo, por citometría (FACS).

Los macrófagos diferenciados en los tejidos tras las inyecciones intravenosas de la composición celular de la invención son células derivadas de monocitos que son positivas para los marcadores: CD14, CD11b, CD71, CD163 y CD206, pero negativos para los marcadores CD56 (que es un marcador de las células NK), CD3 (marcador de las células T) y CD20 (marcador de las células B). Preferentemente, la composición celular de la invención contiene más del 90%, preferentemente más del 95% e idealmente más del 99% de dichas células. La presencia de estos marcadores se puede evaluar por cualquier medio convencional, por ejemplo, por citometría (FACS).

La transformación de las células que se incluirán en la composición de la invención con el ácido nucleico recombinante de la invención se llevará a cabo en un medio estéril, en condiciones ajustadas por los expertos en la técnica. En particular, la multiplicidad de la infección se debe ajustar en función del vector usado. En los ejemplos siguientes se da un ejemplo con un virus SIV.

Cuando se usa un vector lentiviral, las células que se van a incluir en la composición de la invención se ponen en contacto, por ejemplo, con 50 a 250 ufp por célula de virus purificado, y más preferentemente 50 a 100 ufp/célula. Dependiendo de las condiciones de transformación, el porcentaje de células modificadas por la inserción del ácido nucleico recombinante puede variar del 30 al 95%.

Las células modificadas obtenidas de este modo se pueden entonces envasar para su uso inmediato y/o almacenarse para su uso posterior. Para una readministración inmediata, las células se suspenden generalmente en un tampón fosfato o en solución salina fisiológica a una concentración que varía de 30*10® a 109 células por dosis. Para su almacenamiento, las células se pueden congelar, preferentemente en presencia de conservantes tales como glicerol, DMSO y similares.

Las células transformadas exvivode acuerdo con la invención, especialmente mediante el uso de el vector viral recombinante desvelado anteriormente, son una herramienta de elección para la preparación de una composición farmacéutica, en particular de una composición destinada a reforzar el sistema inmunitario y hematopoyético de un paciente.

Las células de la composición de la invención pueden proceder del propio paciente (la composición contiene por lo tanto células autólogas) o de un donante (la composición contiene por lo tanto células alogénicas). En el caso de las células alogénicas, se requiere compatibilidad y compatibilidad<h>L<a>entre el donante y el paciente que recibe las células.

La composición farmacéutica contiene, como principio activo, las células transformadas descritas anteriormente. Además, contiene un excipiente aceptable para uso farmacéutico.

El término “excipiente aceptable para uso farmacéutico” significa un excipiente que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica y deseable, e incluye excipientes que son aceptables para uso veterinario así como para uso farmacéutico humano. Dichos excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o, en el caso de una composición en aerosol, gaseosos. Las composiciones para el tratamiento del cáncer se pueden administrar normalmente por vía parenteral, tópica, intravenosa, intratumoral, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intraperitoneal, intranasal o intramuscular. Una vía de administración típica es la intravenosa o intratumoral, aunque otras vías pueden ser igualmente eficaces.

Para la administración intravenosa, la composición de la invención estará bajo forma líquida. Así, contendrá, aparte de las células, un diluyente aceptable para uso farmacéutico que no afecte a la actividad biológica de las células de la invención. Los ejemplos de tales diluyentes son la solución salina fisiológica tamponada con fosfato, las soluciones de Ringer, la solución de dextrosa y la solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.

En una realización preferente, la composición de la invención se presenta en forma líquida.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar solas o combinadas con otra composición farmacéutica u otro principio activo. En particular, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener las composiciones celulares de la invención así como otro principio activo, combinados en el mismo envase.

Este principio activo puede ser, por ejemplo, un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aldesleukina, altretamina, amifostina, asparaginasa, bleomicina, capecitabina, carboplatino, carmustina, cladribina, cisaprida, cisplatino, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, docetaxel, doxorrubicina, dronabinol, duocarmicina, etopósido, filgrastim, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, granisetrón, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, interferón alfa, irinotecán, lansoprazol, levamisol, leucovorina, megestrol, mesna, metotrexato, metoclopramida, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, omeprazol, ondansetrón, paclitaxel (Taxol™), pilocarpina, procloroperazina, rituximab, saproína, tamoxifeno, taxol, clorhidrato de topotecán, trastuzumab, vinblastina, vincristina y tartrato de vinorelbina.

Como se usa en la presente memoria, el término “combinado” no implica que las células de la invención y el otro principio activo se administren necesariamente de forma simultánea. También se extiende a cualquier uso o presentación que implique su administración a intervalos de tiempo diferentes, o en envases separados.

En otra realización, la composición celular de la invención se combina con un agente quimioterapéutico, por ejemplo como se ha definido anteriormente.

En otra realización, la composición celular de la invención se combina con (o contiene) una dosis eficaz de un agente que aumenta el hematocrito del paciente, por ejemplo agentes estimulantes de la eritropoyetina (ESA). Tales agentes son conocidos y usados en la técnica, que incluyen, por ejemplo, Aranesp® (darbepoetina alfa), Epogen®NF/Procrit®NF (epoetina alfa), Omontys® (peginesatida), Procrit®, etc.

Otras terapias combinadas incluyen la administración con anticuerpos específicos para células, por ejemplo anticuerpos selectivos para marcadores de células tumorales, radiación, cirugía y/o privación hormonal.

Por lo tanto, la composición celular de la invención se combina con (o contiene) una dosis eficaz de dichos anticuerpos específicos de células.

Un número de anticuerpos está actualmente en uso clínico para el tratamiento del cáncer, y otros están en diversas etapas de desarrollo clínico. Por ejemplo, existe un número de antígenos y sus correspondientes anticuerpos monoclonales para el tratamiento de las neoplasias de células B. Un antígeno diana es el CD20. El rituximab es un anticuerpo monoclonal quimérico no conjugado dirigido contra el antígeno CD20. CD20 desempeña un importante papel funcional en la activación, proliferación y diferenciación de las células B. El antígeno<c>D52 es la diana del anticuerpo monoclonal alemtuzumab, indicado para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica. CD22 es el objetivo de un número de anticuerpos, y recientemente ha demostrado su eficacia combinada con toxina en la leucemia de células pilosas resistente a la quimioterapia.

Dos nuevos anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD20, tositumomab e ibritumomab, han sido presentados a la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). Estos anticuerpos se conjugan con radioisótopos. Alemtuzumab (Campath) se usa en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica; Gemtuzumab (Mylotarg) se usa en el tratamiento de la leucemia mielógena aguda; Ibritumomab (Zevalin) se usa en el tratamiento del linfoma no Hodgkin; Panitumumab (Vectibix) se usa en el tratamiento del cáncer de colon.

Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con (o estar contenidos en) las composiciones de la invención.

En otra realización, la composición celular de la invención se combina con (o contiene) una dosis eficaz de un modulador del punto de control inmunitario, en particular de un inhibidor del punto de control inmunitario (ICI).

Los “inhibidores del punto de control inmunitario” (ICI) incluyen anticuerpos anti-PD1 (tales como Nivolumab o Pembrolizumab o Pidilizumab), anticuerpos anti-PD-L1 (tales como Atezolizumab o Durvalumab), anticuerpos anti-CTLA-4 (tales como Ipilimumab o Tremelimumab) y anticuerpos anti-PD-L2.

El término “administración concomitante” de dicho principio activo con la composición farmacéutica de la presente invención significa administración con las células recombinantes en un momento tal que tanto el principio activo como la composición de la presente invención tendrán un efecto terapéutico. Dicha administración concomitante puede implicar la administración concurrente (es decir, al mismo tiempo), previa o posterior del principio activo con respecto a la administración de un compuesto de la invención. Una persona con conocimientos ordinarios en la técnica no tendría dificultad para determinar el momento, la secuencia y las dosis de administración adecuados para determinados fármacos y composiciones de la presente invención.

La administraciónin vivode la composición celular de la invención, que contiene los monocitos que expresan p21 obtenidos, en un sujeto que la necesita, se propone en la presente memoria como una forma sencilla y eficaz de tratar el cáncer, específicamente la leucemia.

Normalmente, dicho sujeto es un humano, pero también se pueden tratar mamíferos no humanos, por ejemplo, animales de compañía tales como perros, gatos, caballos, etc., mamíferos de laboratorio tales como conejos, ratones, ratas, etc., y similares.

Un “sujeto que lo necesita”, como se entiende en la presente memoria, es un mamífero, preferentemente un ser humano, que padece cáncer. Dicho cáncer puede ser un cáncer líquido o sólido tal como, sin limitación, un linfoma, una leucemia, un carcinoma, un melanoma, un glioblastoma, un sarcoma, un mieloma, tumores de colon rectal, etc. como cánceres primarios o metastásicos. En una realización particular, dicho “sujeto que lo necesita” es un ser humano u otro mamífero que padece leucemia.

La presente invención abarca procedimientos de tratamiento en los que la composición celular de la invención se administra a dicho sujeto que la necesita por inyección, preferentemente por inyección intravenosa. También se puede llevar a cabo una inyección sistémica por perfusión. Estas inyecciones son inocuas para el sujeto tratado. La administración intravenosa de la composición celular de la invención es capaz de aumentar la fagocitosisin vivode las células tumorales presentes en la sangre del sujeto, para de ese modo reducir la cantidad de células tumorales en dicho sujeto.

Un procedimiento de tratamiento particular de acuerdo con la invención comprende:

1. Extracción y aislamiento de monocitos o sus precursores o células madre pluripotentes de sangre o médula ósea o cordón umbilical, del sujeto que lo necesite o de un donante sano,

2. Cultivo de estas células como se ha descrito anteriormente, para obtener/aislar una población de monocitos, 3. Transformación de estas células con el ácido nucleico recombinante como se ha definido anteriormente, 4. Opcionalmente, envasado y/o almacenamiento de las células obtenidas de este modo, y a continuación 5. Su administración al paciente.

El tratamiento de la presente invención ofrece muchas ventajas en relación con otros tratamientos de inmunoterapia adoptiva con LAK, TIL o NK (asesinos naturales), tales como, por ejemplo, la ausencia de mediadores tóxicos liberados por las células, el hecho de que la proporción de células efectoras y diana para la citotoxicidad es menor que en otros tratamientos, y el hecho de que no necesita la inyección simultánea de citoquinas tales como la IL-2, cuyos efectos secundarios son deletéreos. Además, permite infectar únicamente a una población celular definida y controlada, permite seleccionar la multiplicidad de la infección (número de partículas virales por célula), permite llegar a los tejidos de forma irreversible desde la circulación sanguínea, y permite aprovechar el papel central de los macrófagos en el organismo, tanto por su actividad antitumoral o antiinfecciosa como en su actividad de estimulación o regulación del sistema inmunitario, como se ha explicado anteriormente. Además, la reprogramación proinflamatoria de los macrófagos PrCR+ mejora la respuesta inmunitaria innata y adaptativa contra el cáncer, lo que a su vez establece un microambiente de crecimiento antitumoral duradero. Además, y teniendo en cuenta la considerable longevidad de los macrófagos, se podría evitar una repetición de tratamientos perjudicial para el paciente.

Por lo tanto, la presente invención ofrece nuevas posibilidades de tratamiento más eficaz, menos exigente para el paciente, menos costoso y más reproducible.

Como se usan en la presente memoria, los términos “tratar”, “tratamiento” y similares se refieren a reducir o mejorar los síntomas de un trastorno (por ejemplo, leucemia) y/o los síntomas asociados al mismo. Se apreciará que, aunque no se excluye, el tratamiento de un trastorno o afección no requiere que el trastorno, la afección o los síntomas asociados al mismo se eliminen por completo.

Las dosis eficaces de la entidad terapéutica de la presente invención, por ejemplo para el tratamiento del cáncer, varían en función de muchos factores diferentes, incluidos los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosis de tratamiento se pueden ajustar para optimizar la seguridad y la eficacia.

En las aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o los medicamentos se administran a un paciente susceptible de padecer una enfermedad o en riesgo de padecerla en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar el inicio de la enfermedad, incluidos los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. En estas aplicaciones profilácticas, se puede administrar una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes siguen recibiendo tratamiento durante el resto de su vida.

Por el contrario, en aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta (50*10® monocitos por dosis de inyección por paciente) a intervalos relativamente cortos (típicamente cada semana) hasta que se reduzca o termine la progresión de la enfermedad, y preferentemente hasta que el paciente muestre una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad.

Leyendas de las figuras

La Figura 1 muestra que la PrCR dependiente de p21 desencadena la reprogramación proinflamatoria de los macrófagos (figuras 1a a k) y favorece la regresión de la leucemia (figuras 1I a r).

La Figura 2 muestra que p21 dicta la eliminación celular programada de los macrófagos y la regresión de la leucemia a través de la modulación de SIRPa (figuras 2a y 2b) y confirma que p21 favorece la regresión de la leucemia (figuras 2c y 2d).

Ejemplos

Los ejemplos que se dan a continuación no son limitativos, sino que ilustran la viabilidad de la expresión de la proteína p21 en los macrófagos y su valor terapéuticoin vivo.

1. Material y procedimientos

Cultivo de macrófagos primarios con líneas celulares leucémicas

Los macrófagos derivados de monocitos (MDM) se obtuvieron por medio de la diferenciación de monocitos de capas leucocitarias en macrófagos. Las capas leucocitarias procedentes de donantes sanos se obtuvieron a través del banco de sangre francés(Etablissement Frangais du sang(EFS)) en el marco del Convenio EFS-INSERM en conformidad con la legislación francesa. Los monocitos se separaron primero de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) por adherencia al plástico y posteriormente se cultivaron durante 6 a 7 días en placas de teflón hidrófobas (Lumox; Duthsher) en medio para macrófagos (RPMI 1640 suplementado con 200 mM de L-glutamina, 100 U de penicilina, 100 |jg de estreptomicina, 10 mM de HEPES, 10 mM de piruvato de sodio, 50 jM de p-mercaptoetanol, 1% de vitaminas mínimas esenciales del medio, 1% de aminoácidos no esenciales) que contenía un 15% de suero humano AB inactivado por calor. A continuación, se recolectaron las MDM y se suspendieron en medio de macrófagos que contenía un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS). Las<m>D<m>obtenidas con este procedimiento son entre un 91 y un 96% positivas para CD14 y expresan los marcadores de diferenciación (C11b y CD71) y los marcadores de polarización de macrófagos M2 (CD163 y CD206) cuando se comprueban por medio de citómetro de flujo. La pureza de las MDM también se controló por medio de la tinción negativa para CD56 (células NK), CD3 (células T) y CD20 (células B). Los linfocitos sanguíneos primarios (PBL) se aislaron de la fracción de PBMCs no adherentes mediante el uso del kit de selección negativa de células T (STEM CELL). Los linfocitos obtenidos por este procedimiento tenían entre un 90 y un 97% de células T que expresaban CD3 y se cultivaron en medio RPMl con un 10% de FBS. Las MDM diferenciadas (0,125*10®) y las células leucémicas viables (0,125*10®) (Jurkat, MT4, CEM, THP1, HEL-5320, K562 o blastos de leucemia mieloide aguda CD34+ (CD34+AML)) se marcaron previamente, respectivamente, con verde (CMFDA) o rojo (CMTMR) de rastreador celular durante una hora. Los PBL obtenidos de donantes sanos se usaron como controles. Tras lavados exhaustivos, las MDM y las células leucémicas se co-cultivaron en portaobjetos de cámara de 8* pocillos en medio de macrófagos suplementado con FBS al 10% en presencia o ausencia del inhibidor de la pan-caspasa ZVAD-fmk (100 jM ) en 250 j l de volumen total durante 8 horas. Tras extensos lavados, se eliminaron las células leucémicas no engullidas por los macrófagos y se fijaron éstos (con PFA al 2%) antes del análisis por microscopía confocal. El porcentaje de macrófagos PrCR+ se determinó por medio del número de macrófagos (CMFDA+) que internalizaron células leucémicas (CMTMR+) sobre el número total de macrófagos. Se llevaron a cabo microscopías de vídeo de lapso de tiempo directamente después del co-cultivo de macrófagos primarios con células leucémicas. El co-cultivo de macrófagos primarios que fueron silenciados para el inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina p21 con células leucémicas se llevó a cabo a las 24 horas después del silenciamiento p21 de MDMs. Las MDM diferenciadas fueron silenciadas para el gen p21 por medio de la transfección de 50 nM del ARNsi contra el gen p21 (ARNsi p21) que es el ARNsi on-target plus p21 Núm. 12 (SEC. ID Núm.:6 : 5' AGA CCA GCA UGA CAG AUU U 3') obtenido de Dharmacon. La transfección de ARNsi se llevó a cabo mediante el uso de kits INTERFERin (Polyplus Transfection). Cantidades iguales de ARNsi dirigidos y no dirigidos (siCo.) (Dharmacon) a las MDM de control. La eficacia de la eliminación del gen p21 en las MDM se evaluó por medio de western blot a las 24 horas del silenciamiento, lo que correspondía al momento del co cultivo con células leucémicas. La clasificación de macrófagos PrCR+ por medio de citómetro de flujo se llevó a cabo tras dos horas de co-cultivo de macrófagos con células leucémicas. Los macrófagos PrCR+ clasificados (CMFDA+CMTMR+) y los macrófagos PrCR (CMFDA+) se cultivaron durante 96 horas más antes de analizar la expresión del receptorscavengerde membrana CD163 (por medio de citómetro de flujo), la expresión de IRF5 (por medio de western blot) y el análisis de la secreción de citoquinas en el sobrenadante celular (por medio del perfil de microarreglos de citoquinas).

Monocitos primarios humanos de ingeniería con sobreexpresión de p21

Se transdujeron monocitos primarios purificados (15*106) con 150 jg CAp24 de un vector lentiviral autoinactivado (SIN) basado en el VIH-1 que codifica el gen p21 bajo el promotor SFFVp (AIP-p21) y las partículas virales similares (VLPs) que contienen SlVmac-VPX para inducir la degradación del factor de restricción mieloide de las infecciones lentivirales de la proteína SAMHD1. Los monocitos de control fueron transducidos con cantidades iguales de vectores AIP y VLPs-SIV-mac-VPX. Las transducciones se llevaron a cabo por medio de espinoculación de 1 hora (a 1200 g, 22 C) y una hora a 37 °C. A continuación, los monocitos transducidos (15*106) se marcaron con el colorante Cell Trace CFSE durante 1 hora y se lavaron abundantemente antes de su inyección intravenosa a ratones NSG macho o hembra irradiados con 1 Gray (1 Gy) (de 6 a 8 semanas de edad) a las 24 horas de la irradiación con rayos X. Se inyectaron por vía intravenosa células T MT4mCherry+ (1*106) a los 7 días de la transferencia de monocitos p21. Se monitorizó la supervivencia global de los ratones, hasta 15 días después del injerto leucémico, cuando se sacrificaron algunos ratones para monitorizar la presencia de macrófagos PrCR+ (CFSE+mCherry+) en la médula ósea por medio de microscopía confocal. La activación proinflamatoria de los macrófagos PrCR+ se determinó por medio del análisis con citómetro de flujo de la expresión de la membrana CD163 en los macrófagos PrCR+ (CFSE+mCherry+) y los macrófagos PrCR- (CFSE) clasificados a partir del bazo y la médula ósea de los ratones escarificados.

Durante el modelo establecidoin vivo,se verificó la diferenciación de los monocitos en macrófagos en el modelo de ratones NSG por medio de la purificación, 7 días después de la transferencia de monocitos, de las células CFSE+ de la médula ósea, el bazo y la sangre y por medio de la evaluación de las expresiones de los marcadores de diferenciación (CD71, CD163 y CD14) con respecto a los macrófagos autólogos diferenciadosin vitro.Algunos de los monocitos transducidos con AIP-p21 se cultivaron en paraleloin vitropara evaluar la regulación al alza de la expresión de p21 por medio de western blot 7 días después de la diferenciación.

Estudios de tratamiento en ratones

Los ratones NSG fueron criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos en el animalario del Instituto Gustave Roussy. Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por el Comité Institucional Francés de Animales. Las células T leucémicas MT4 (1*106) que expresan de forma estable el gen fluorescente mCherry, por medio de transducciones de vectores lentivirales y clasificación por citómetro de flujo para la expresión de mCherry, se inyectaron por vía intravenosa a ratones hembra o macho (de 6 a 8 semanas de edad). El injerto leucémico se evaluó hasta cuatro semanas después de las inyecciones por medio de la presencia de células T mCherry+MT4en la médula ósea, el bazo, el hígado y la sangre y por medio de la progresión de la enfermedad caracterizada por la pérdida de peso, la invasión de la médula ósea y la marcada esplenomegalia y la supervivencia global.

Clonación del ADNc de SIRPa

El ADNc que expresa el inhibidor de la fagocitosis SIRPa delhomo sapiensse clonó en un vector lentiviral autoinactivado (SIN) basado en el VIH-1 (pRRLEF1-PGK-GFP) entre los sitios de restricción Mlul y Nhel.

La secuencia del ADNc de hsSIRPa se indica en la SEC. ID Núm.: 7.

Transducción de monocitos con vectores lentivirales que expresan p21 y SIRPa

Se transdujeron monocitos primarios purificados (107) con 100 |jg de CAp24 de un vector lentiviral autoinactivado (SIN) basado en el VIH-1 que codifica el gen p21 bajo el promotor SFFVp (AIP-p21) y/o 100 jg de CAp24 de un vector lentiviral autoinactivado (SIN) basado en el VIH-1 que codifica el gen SIRPa bajo el promotor<e>F1 (PRRL-SIRPa) en presencia de partículas virales similares (VLP)(SIN) que codifica el gen SIRPa bajo el promotor EF1 (PRRL-SIRpa) en presencia de partículas virales (VLP) que contienen SlVmac-VPX para inducir la degradación del factor de restricción mieloide de las infecciones lentivirales, la proteína SAMHD1. Los monocitos de control fueron transducidos con cantidades iguales de vectores AIP y/o<p>R<r>L y VLPs-SIV-mac-VPX. Las transducciones se llevaron a cabo durante tres horas a 37 °C en presencia de polibreno (10 jg/ml). A continuación, los monocitos transducidos (107) se marcaron con el colorante Cell Trace CFSE durante 1 hora y se lavaron abundantemente antes de su inyección intravenosa a 1 ratón NSG macho o hembra irradiado con Gray (de 6 a 8 semanas de edad) a las 24 horas de la irradiación con rayos X o se diferenciaronin vitroen macrófagos como se ha descrito anteriormente en los materiales y procedimientos de la patente principal.

2. Resultados

Los presentes inventores investigaron los mecanismos moleculares por los que los macrófagos pueden regular la PrCR. Evaluaron la fagocitosis, por macrófagos primarios antiinflamatorios pro-tumorigénicos humanos derivados de monocitos (MDMs) (etiquetados con rastreador celular fluorescente verde CMFDA) de un panel de diversas células leucémicas vivas (etiquetadas con rastreador celular fluorescente rojo CMTMR) (Fig. 1a).

Mediante el uso de microscopía confocal, observaron que en ausencia de inhibidores MIC, la fagocitosis de células tumorales vivas ya se había incrementado significativamente durante los co-cultivos de macrófagos primarios humanos con linfoblastos T agudos (células Jurkat, CEM o MT4, Fig. 1b y 1c), células mieloides agudas (células THP1, Fig. 1c), células megacarioblásticas agudas (células UT-7, no mostradas), eritroblastos (HEL-5320, Fig. 1c), linfoblastos mieloides crónicos (células K562, Fig. 1c) y blastos CD34+transformados primarios purificados de sangre de pacientes con leucemia mieloide aguda (Fig. 1d), mientras que los linfoblastos de sangre periférica vivos autólogos o heterólogos no transformados (PBLs) no se vieron afectados (Fig. 1c). El inhibidor pan-caspasa (ZVAD) no redujo el engullimiento de las células diana (Fig. 1c). Estos resultados indican que los macrófagos también pueden desarrollar espontáneamente PrCR en ausencia de bloqueo MIC.

Los inventores observaron entonces que, una vez internalizadas, las células MT4 son rápidamente degradadas por los lisosomas (Fig. 1e y 1f). También revelaron que la PrCR puede inducir la reprogramación funcional de los macrófagos engullidores de un fenotipo antiinflamatorio a uno proinflamatorio (como revela el aumento de la expresión del factor de transcripción IRF5 (Fig. 1g), la disminución de la expresión de membrana del receptorscavengerCD163 (Fig. 1h) y la liberación de citoquinas proinflamatorias (tales como MCP-1, Serpin e IL-8) (Fig. 1i) de macrófagos engullidores “PrCR+” clasificados por células.

Los inventores demostraron además que el inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina p21, que está sobreexpresado en macrófagos humanos primarios, es un regulador maestro de la PrCR. Esto ha sido revelado por la inhibición del engullimiento de células MT4 vivas por macrófagos primarios humanos empobrecidos en p21 (Fig. 1j y 1k). En conjunto, estos resultados demostraron que la expresión de p21 dicta la reprogramación proinflamatoria de los macrófagos a través de la inducción de PrCR.

Se apreció entonces el potencial terapéutico curativo de manipular la PrCR por medio de la transferencia adoptiva de Monocitos Humanos primarios de ingeniería que sobreexpresan p21 (p21EHM). Se determinaron los efectos biológicos de la transferencia adoptiva de EHMs p21 a ratones NOD/SCID antes de la implantación de células MT4 transformadas con HTLV-1. Los ratones control desarrollaron leucemia (como revelan la pérdida de peso (Fig. 1I), la invasión de la médula ósea (Fig. 1m) y la marcada esplenomegalia (Fig. 1n) de los ratones injertados). Tras la transferencia de p21EHMs marcadas con CFSE a ratones injertados, se observóin vivosu diferenciación en macrófagos (Fig. 1o y no mostrada) y se detectó la presencia de macrófagos fagocitadores de MT4 en los ratones injertados: en la médula ósea (Fig. 1 p), en el hígado y en el bazo (no mostrada).

También se observó que los macrófagos fagocitadores de MT4 experimentaron una transición de un fenotipo antiinflamatorio a uno proinflamatorio (como reveló la disminución de la expresión de membrana de CD163 y el aumento de la secreción de IFNy e IL-1p; Fig. 1q y no mostrada). Curiosamente, la terapia celular basada en p21 EHM condujo al retraso de la progresión de la enfermedad en los ratones tratados y aumentó significativamente la supervivencia global (Fig. 1r).

En conjunto, estos datos demostraron que la transferencia adoptiva de p21EHM representa una estrategia terapéutica novedosa para tratar neoplasias hematológicas a través de la inducción de PrCR en macrófagos.

Para caracterizar aún más el vínculo molecular entre p21 y la eliminación celular programada, se determinó el impacto de la expresión de p21 sobre la expresión del inhibidor de la fagocitosis SIRPa. Se transdujeron simultáneamente monocitos humanos primarios con vectores lentivirales que expresaban p21 y/o SIRPa en combinación o/no con sus respectivos vectores vacíos de control pCo. (pAIP y/o pRRL). Una fracción de monocitos se diferencióin vitroen macrófagos durante siete días y se determinaron las expresiones de p21 y SIRPa por medio de western blot (Figura 2a). Se validó la eficacia de la transducción en cada condición. Se detectó que la sobreexpresión de p21 reprimía la expresión de SIRPa, para de ese modo revelar que la expresión de p21 regula negativamente la expresión de SIRPa (Figura 2a). Para determinar el impacto de esta transducción en la eliminación celular programada, se llevaron a cabo cocultivos de macrófagos transducidos con células leucémicas MT4 que expresaban la proteína fluorescente mCherry y se analizó la frecuencia de macrófagos que engullían células MT4 mCherry+ (macrófagos PrCR+) por medio de microscopía de fluorescencia (Figura 2b). Se observó que el aumento de la expresión de p21 y SIRPa potenciaba y reducía la fagocitosis de las células MT4 mCherry+, respectivamente. Además, el aumento de la expresión de SIRPa en macrófagos transducidos para p21 inhibió este proceso, para de ese modo demostrar que p21 dicta la eliminación celular programada de los macrófagos a través de la modulación de la expresión de SIRPa. A continuación se analizó el impacto de estas modulaciones en la progresión de la leucemia. Los monocitos transducidos (mostrados en la Figura 2a) se transfirieron adoptivamente a ratones NOD/SCID una semana antes de la inyección de células MT4 mCherry+ (Figura 2c) y se analizó la supervivencia global de los ratones injertados (n=5 ratones en cada grupo) (Figura 2d). Los valores p se calcularon por medio de la prueba de Mantel-Cox y revelaron significación estadística entre los grupos analizados (***p<0,001). En conjunto, estos resultados confirmaron que la transferencia adoptiva de monocitos que sobreexpresan p21 (p21EHM) puede retrasar la progresión de la leucemia a través de la modulación de la eliminación celular programada de macrófagos dependiente de SIRPa.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende monocitos modificados genéticamente que contienen un vector que codifica la proteína p21, inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, y un excipiente aceptable para uso farmacéutico.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dichos monocitos contienen un virus recombinante de replicación defectuosa que codifica el inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina p21 bajo el control de elementos reguladores que permiten su expresión.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en la que dicho virus es un lentivirus de replicación defectuosa.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, en la que dicho lentivirus de replicación defectuosa es el vector lentiviral autoinactivado (SIN) basado en el VIH-1.

5. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que está formulada en forma inyectable intravenosa o en forma de perfusión.

6. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que contiene de 30*10® a 109 de monocitos transducidos por ml.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que dichos monocitos contienen un sistema de transposón de la Bella Durmiente que codifica el inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina p21 bajo el control de elementos reguladores que permiten su expresión.

8. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha proteína p21 es la SEC.

ID Núm.:2, o una variante funcional o fragmento de la misma.

9. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en la que dicho virus o dicho sistema de transposón contiene el ácido nucleico de la SEC. ID Núm.:5, preferentemente bajo control del promotor SFFV.

10. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que además contiene una dosis eficaz de un agente que aumenta el hematocrito del paciente, de un agente quimioterapéutico, de un anticuerpo celular específico o de un inhibidor del punto de control inmunitario (ICI).

11. La composición farmacéutica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso en el tratamiento de un mamífero que padece un cáncer linfoide o mieloide o un cáncer sólido, preferentemente leucemia.

12. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que dicha composición contiene 50*10® monocitos por dosis inyectable y se administra cada semana hasta que se reduce la progresión de la enfermedad.

13. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en la que dicho mamífero es un ser humano.

14. Un producto combinado que comprende la composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones 1 a 9, y una dosis eficaz de un agente que aumenta el hematocrito, de un agente quimioterapéutico, de un anticuerpo celular específico o de un inhibidor del punto de control inmunitario (ICI), para uso simultáneo o secuencial para tratar a un mamífero que padece un cáncer linfoide o mieloide o un cáncer sólido.

15. El producto combinado de la reivindicación 14, en el que dicho mamífero es un ser humano.