KR20220063156A - 암세포 요법을 위한 p21 발현 단핵구 - Google Patents

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아와테프 알루치
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Abstract

대식세포에 의한 종양 세포의 프로그램화된 세포 제거 (PrCR)를 완화하는 효과적인 표적의 확인은 관심이 매우 높다. 본 발명자들은 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21 단백질이 대식세포-매개 PrCR의 강한 조절제라는 것을 확인하였다. 또한, 그들은 p21 과발현 단핵구의 입양 전달이 생체내에서 항염증성으로부터 염증촉진성 표현형으로의 전이 및 대식세포 PrCR을 유도하고, 암 진행을 지연시키고, 암세포가 생착된 마우스의 전체 생존을 상당히 증가시킨다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21 단백질을 과발현하는 단핵구를 포함하는 치료 조성물, 및 암, 특히 백혈병을 앓고 있는 포유동물을 치료하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

암세포 요법을 위한 P21 발현 단핵구
개요
대식세포에 의한 종양 세포의 프로그램화된 세포 제거(programmed cell removal) (PrCR)를 완화하는 효과적인 표적의 확인은 관심이 매우 높다. 본 발명자들은 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21 단백질이 대식세포-매개 PrCR의 강한 조절제라는 것을 확인하였다. 또한, 그들은 p21 과발현 단핵구의 입양 전달이 생체내에서 항염증성으로부터 염증촉진성(pro-inflammatory) 표현형으로의 전이 및 대식세포 PrCR을 유도하고, 암 진행을 지연시키고, 암세포가 생착된(engrafted) 마우스의 전체 생존을 상당히 증가시킨다는 것을 나타냈다. 따라서, 본 발명은 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21 단백질을 과발현하는 단핵구를 포함하는 치료 조성물, 및 암, 특히 백혈병을 앓고 있는 포유동물을 치료하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.
기술적 배경
적절하게 활성화되는 경우, 선천 및 적응 면역 체계 둘 다의 이펙터 세포는 암세포를 성공적으로 공격하는 능력을 보유한다. 과거에는, 조작된(engineered) 환자 자신의 면역 세포 (예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포)의 입양 전달을 사용하여 환자의 면역 반응의 정상 능력을 증진시키거나 음성 적응 면역 조절제 (예컨대 세포독성 T-림프구-연관 항원 4 (CTLA-4) 및 프로그램화된(programmed) 세포 사멸 단백질 1 (PD-1))를 억제하는 것이 제안되었다. 이러한 치료는 고형 암(solid cancer) 및 혈액학적 장애(hematological disorder)의 치료에서 상당한 진전을 야기하였다 (Pardoll DM., Nat Rev Cancer (2012) and Sharma SH et al, Cell (2015)).
그러나, 신규 치료학적 암 전략을 개발하기 위해 면역조절에 대한 보다 완전한 이해의 필요성이 있다.
프로그램화된 세포 제거 (PrCR)는 표적 세포가 인식되고 식균되는(phagocytosed) 대식세포-매개 면역 감시의 과정이다 (Jaiswal et al., Trends Immunol (2010)). 프로그램화된 세포 사멸을 죽어가는 세포의 제거와 연결시키는 핵심 메커니즘으로서 처음으로 기재되어 (Arandjelovic and Ravichandran, Nat Immunol (2015)), PrCR은 살아있는 종양 세포의 청소(clearance)에 또한 관여하였다 (Majeti et al., Cell (2009)).
PrCR의 효능은 대식세포에 의한 포식작용 촉진(pro-phagocytic) ("포식 허용(eat me)") 신호의 인식과 표적 암 세포에 의한 항포식작용(anti-phagocytic) ("포식 금지(don't eat me)") 경로의 활성화를 통한 대식세포의 억제 사이의 균형에 의해 결정된다 (Chao et al., Nat Rev Cancer (2011)). 대식세포로부터 "포식 허용" 신호 칼레티쿨린 (CRT)의 분비는 표적 암세포에 대한 아시알로글리칸의 결합을 통해 PrCR에 조력하는 첫 번째 신호로서 최근 확인되었다 (Feng et al., Nat Comm (2018)). 반대로, 막관통 단백질 CD47은 대식세포 막 상에서 발현되는 포식작용(phagocytosis)의 억제 수용체인 신호 조절 단백질 알파 (SIRPα)에 결합하고 이를 활성화함으로써 PrCR을 억제하는 "포식 금지" 신호로서 확인되었다 (Jaiswal et al., Cell (2009)). 한 연구는 CD47-차단 모노클로날 항체로 CD47-SIRPα 축을 차단하는 것이 종양 세포의 탐식(engulfment)을 선택적으로 유도함을 입증하였고 림프종, 방광암, 결장암(colon cancer), 교모세포종(glioblastoma), 유방암, 급성 림프구 백혈병(acute lymphocyte leukemia) 및 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)의 다양한 전임상 모델에서의 효능을 입증하였다 (Weiskopf K. Eur J Cancer (2017)). 보다 최근에, CD47 차단과 리툭시맙의 조합은 재발성(relapsed) 또는 불응성(refractory) 비호지킨 림프종(non Hodgkin's lymphoma)을 가진 환자에서 유망한 활성을 나타냈으며 (Advani R. et al., N Engl J Med (2018)), 이는 PrCR을 촉발시키기 위한 대식세포 면역 체크포인트(macrophage immune checkpoint) (MIC)의 표적화(targeting)가 상당한 치료 기회를 나타낸다는 사실을 강조한다.
따라서 대식세포에 의한 종양 세포의 프로그램화된 세포 제거 (PrCR)를 완화하는 효과적인 표적의 확인은 관심이 매우 높다. 본 발명은 이러한 필요성을 해결한다.
발명의 상세한 설명
하기 실시예에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 1차 인간 대식세포에서 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21을 고갈시키는 것이 그의 포식 능력(phagocytic capacity)을 차단하고, 따라서 그의 면역 감시를 감소시킨다는 것을 발견하였다 (도 1j 및 1k). 그들은 p21 단백질이 대식세포-매개 PrCR의 강한 조절제임을 처음으로 확인하였다. 그들은 p21의 과발현이 대식세포 면역 체크포인트 (MIC) 억제제로서 작용할 수 있으며, 그 덕분에 종양 세포가 결국 인식되고, 포식되며, 파괴된다는 것을 나타냈다. 따라서, 그들은 p21 과발현 단핵구의 입양 전달이 생체내에서 항염증성으로부터 염증촉진성 표현형으로의 전이 및 대식세포 PrCR을 유도하고, 암 진행을 지연시키고, 암세포가 생착된 마우스의 전체 생존을 상당히 증가시킨다는 것을 나타냈다 (도 1r).
본 발명은 세포 조성물 및 암 요법, 보다 구체적으로, 암 면역요법에서 사용될 수 있는 제약 조성물로의 그의 혼입에 관한 것이다. 구체적으로, 이는 단핵 포식세포계(mononuclear phagocytic system)의 세포의 단리, 배양, 활성화 및 유전자 변형(genetic modification), 및 세포 요법, 예를 들어 입양 면역요법에서의 그의 용도에 관한 것이다.
단핵 포식세포계의 세포는 말초 혈액 단핵구, 그의 골수 또는 혈액 전구체 및 조직 대식세포를 포함한다. 단핵구는 골수에서 형성되어, 이들은 성숙 후 떠나, 말초 혈액으로부터 조직으로 통과한다. 혈액에서 순환하는 인간 단핵구는 대략 3일의 반감기를 갖는다. 단핵구가 조직에 도달한 경우, 이는 대식세포라고 칭해진다. 조직 대식세포의 총 수는 순환하는 단핵구의 수를 대략 400배 크게 초과한다. 대식세포는 신체의 모든 곳에서 발견되나, 특히 간 (쿠퍼(Kupffer) 세포), 림프절, 폐, 복막 및 피부 (랑게르한스 세포(Langerhans' cell))에 많다. 전신 순환으로부터 조직으로의 단핵구의 통과는 되돌릴 수 없다.
단핵구 및 대식세포는 급성기의 면역 반응 유도, 조혈 조절, 면역 체계 활성화, 응고, 유기체 및 종양 세포의 파괴, 및 조직 복구 및 반흔형성(cicatrisation)을 포함한, 수많은 중요한 기능을 갖는 것으로 공지되어 있다.
단핵구-대식세포는 또한 인간에서 일부 유형의 암 치료를 위한 입양 면역요법에서 사용될 수 있다. 전형적으로, 이들 세포는 환자의 순환 혈액으로부터 정제하고, 생체외에서 배양하고 인터페론 γ로 활성화하여 그의 분화를 유도하고 그의 종양파괴력(tumoricidal power)을 증가시킨 다음에, 환자에게 재주사할 수 있다. 또한, 적합한 벡터(vector)를 사용하여, 유전자를 생체외에서 단핵구-유래 대식세포 세포로 전달할 수 있어, 이들에게 세포독성 및 면역 체계 자극의 면에서 우수한 특성이 부여되게 할 수 있게 한다.
따라서, 첫 번째 측면에서, 본 발명은 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21 단백질을 과발현하는 단핵구를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 이들 단핵구는 일단 조직에 생착되면 대식세포로 분화될 것이다.
이 제약 조성물은 이하 "본 발명의 조성물", "본 발명의 제약 조성물", 또는 "본 발명의 세포 조성물"로 지칭된다.
특히, 본 발명은 암, 구체적으로 백혈병을 치료하기 위해 환자의 면역 및 조혈 체계를 강화하려고 의도된 의약을 제조하기 위한, 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21 단백질을 과발현하는 단핵구의 용도에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "p21 단백질"은 "p21Cip1", "p21Waf1", "Waf1", "CDKN1A", "CAP20", "CIP1", "MDA-6", "SDI1" 및 “CDK-상호작용 단백질 1"로도 공지된 사이클린-의존성 키나제 억제제 1을 상호교환가능하게 의미한다. 이 단백질은 사이클린-CDK1, CDK2 및 CDK4/6 복합체에 결합하여 상기 복합체의 활성을 억제하므로 G1 및 S 기에서 세포 주기 진행의 조절제로서의 기능을 한다. CDK 복합체에 대한 p21의 결합은 다른 CIP/CDK 억제제 p27 및 p57과 상동인, p21의 N-말단 도메인을 통해 발생한다. p53 활성의 주요 표적으로서, 이는 대개 DNA 손상을 세포 주기 정지에 연결하는 것과 연관이 있다. 이 단백질은 인간에서 염색체 6 (6p21.2)에 위치한 서열번호: 1 (NM_078467)의 CDKN1A 유전자에 의해 코딩(coding)된다. 마우스에서, 단백질은 서열번호: 3 (NM_007669)의 CDKN1A 유전자에 의해 코딩된다. 인간 p21 단백질은 서열번호: 2 (NP_000380)의 아미노산 서열을 가지며, 한편 마우스 p21 단백질은 서열번호: 4 (NP_031695)의 아미노산 서열을 갖는다.
본원에서 용어 "p21 단백질"은 또한 상기-언급된 p21 단백질의 기능적 변이체(functional variant) 및/또는 단편을 포함한다.
"기능적 변이체"는 예를 들어 인간 또는 마우스 이외의 동물 종 (예를 들어, 말, 개, 고양이, 또는 소 동물로부터)의 야생형 p21 단백질이다. 이들 단백질은 이제 널리 특성화되었으며 그의 서열은 통상적인 데이터 베이스로부터 쉽게 검색할 수 있다. "기능적 변이체"는 또한 천연 p21 단백질의 돌연변이된 버전이며, 그의 아미노산 서열은 상응하는 종의 야생형 단백질과 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%의 동일성 백분율을 공유한다 (인간 요법의 경우, 서열번호: 2와, 마우스 요법의 경우, 서열번호: 4와, 등).
본 발명의 맥락에서, 상기 2개의 상동 서열 사이의 동일성 백분율은 그의 서열 전체의 전체적인 정렬에 의해 확인되며, 이러한 정렬은 문헌 [Needleman and Wunsch (1970)]에 개시된 것과 같이, 통상의 기술자에 의해 널리 공지된 알고리즘에 의해 수행된다. 따라서, 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 비교는 예를 들어 "갭 개방(Gap open)" 파라미터 10, "갭 확장(Gap extend)" 파라미터 0.5 및 "블로섬(Blosum) 62" 행렬을 사용하는, "니들(needle)" 소프트웨어와 같은, 통상의 기술자에 의해 공지된 임의의 소프트웨어를 사용함으로써 수행될 수 있다.
p21 단백질의 "기능적 단편"은 대식세포에 의한 종양 세포의 프로그램화된 세포 제거 (PrCR)를 증진시키는 p21 단백질의 기능을 유지하는, 야생형 p21 단백질 또는 그의 기능적 변이체의 임의의 단편이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 포함된 단핵구는 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21을 코딩하는 복제 결함(defective) 재조합 바이러스를 함유하거나 그의 발현을 허용하는 조절 요소(regulatory element)의 제어 하에 배치된 p21을 코딩하는 유전자를 함유하는 비바이러스성 재조합 핵산을 함유한다. 이 재조합 바이러스 또는 핵산은 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21 단백질을 과발현하는 것을 가능하게 한다. 상기 재조합 핵산은 바람직하게는 DNA 플라스미드이다. 우리는 또한 미니서클(minicircle)이라고 칭해지는 초나선(supercoiled) 최소 DNA 벡터로부터 p21 유전자의 비바이러스성 슬리핑 뷰티 안정 전위(Sleeping Beauty stable transposition)를 사용할 수 있다. 단핵구의 유전 공학은 또한 단핵구에서 시험관내에서 번역된 p21 mRNA의 비바이러스성 전달의 사용에 의해 수행될 수 있다.
"사이클린-의존성 키나제 억제제 p21 단백질을 과발현시키는"이란, 본원에서 p21 단백질의 전체 발현 수준이 통상적인 비처리 대식세포에서보다 본 발명의 조성물에 함유된 대식세포에서 더 높다는 것을 의미한다. 이 과발현은 웨스턴 블롯(western blot)과 같은 단백질 수준의 측정을 가능하게 하는 임의의 통상적인 수단에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 조성물에서 사용하기 위해, 대식세포는 p21의 최종 발현이 비처리 대조군 대식세포에서보다 적어도 2배 또는 3배 더 높도록 유전자 변형된다. 단핵구 게놈에서 p21 유전자의 안정적인 통합은 조직에서 생착된 분화된 대식세포에서 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21 단백질 발현의 내구성을 보장한다. 조직에서 대식세포의 긴 수명을 고려하는 것 외에도, p21 단백질 발현의 내구성이 추가로 보장된다.
벡터 (플라스미드 또는 바이러스 또는 시험관내에서 번역된 mRNA)의 사용은 표적 세포에서 p21을 코딩하는 핵산의 투여를 개선할 수 있게 하고, 또한 상기 세포 내로의 상기 핵산의 안정성을 증가시켜, 오래 지속되는 효과를 수득할 수 있게 한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 벡터는, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 헤르페스바이러스, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이들은 대식세포를 효과적으로 형질감염시키는 것으로 나타났다 (Singh G. et al, F1000 research 2015).
유리하게는, 상기 바이러스는 결함 바이러스이다. 용어 "결함 바이러스"는 표적 세포에서 복제할 수 없는 바이러스를 의미한다. 일반적으로, 본 발명의 맥락에서 사용되는 결함 바이러스의 게놈은 따라서 적어도 감염된 세포에서 상기 바이러스의 복제에 필요한 서열이 결여되어 있다. 이들 영역은 (전체적으로 또는 부분적으로) 제거되거나, 기능하지 않게 되거나, 다른 서열에 의해, 특히 재조합 핵산에 의해 대체될 수 있다. 바람직하게는, 결함 바이러스는 그럼에도 불구하고 바이러스 입자의 캡슐화에 필요한 그의 게놈의 서열을 유지한다.
특히, AAV 벡터는 i) 합성된 유전자의 오래 지속되는 발현, ii) 병원성 반응에 대한 낮은 위험 (이들은 인공적으로 제조되고 독성이 없기 때문에), iii) 이들은 낮은 면역원성 반응을 촉발한다는 점 및 iv) 이들은 인간 게놈을 통합하지 않는다는 점과 같은 몇몇 이점을 나타낸다. 유전자 발현의 효능을 증가시키고, 바이러스의 의도하지 않은 확산을 예방하기 위해, AAV의 유전자 변형을 수행할 수 있다. 이들 유전자 변형은 E1 영역의 결실, E2 또는 E4 영역의 결실과 함께 E1 영역의 결실, 또는 시스-작용 역위 말단 반복부 및 패키징 신호를 제외한 전체 아데노바이러스 게놈의 결실을 포함한다. 이러한 벡터는 유리하게는 본 발명에 포함된다. 우리는 또한 미니서클이라고 칭해지는 초나선 최소 DNA 벡터로부터 p21 유전자의 비바이러스성 슬리핑 뷰티 안정 전위를 사용할 수 있다. 단핵구의 유전 공학은 또한 단핵구에서 시험관내에서 번역된 p21 mRNA의 비바이러스성 전달의 사용에 의해 수행될 수 있다. 이들 두 가지 방법에서의 플라스미드는 전기천공법을 통한 단핵구의 형질감염에 의해 전달된다.
본 발명에 따른 세포 조성물의 제조를 위한 또 다른 유리한 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 실제로, 문헌 [Haddada H. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun (1993)]은 아데노바이러스가 단핵구-대식세포 계통의 세포를 매우 효과적으로 감염시킬 수 있고, 그 안에서 안정적으로 유지될 수 있고, 치료 유전자를 발현할 수 있음을 나타냈다. 아데노바이러스의 상이한 혈청형이 존재하며, 그 구조 및 특성은 다소 다르나 사람에 대해, 특히 면역억제되지 않은 대상체에 대해 병원성이 아니다. 게다가, 이들 바이러스는 그들이 감염시키는 세포의 게놈에서 통합되지 않으며, 외인성 DNA의 큰 단편을 포함할 수 있다. 상이한 혈청형 중에서, 본 발명의 맥락에서 아데노바이러스 유형 2 또는 5 (Ad 2 또는 Ad 5)를 사용하는 것이 바람직하다. Ad 5 아데노바이러스의 경우에, 복제에 필요한 서열은 E1A 및 E1B 영역이다. 이들 서열은 바람직하게는 본 발명에서 사용되는 재조합 핵산으로부터 결실된다.
본 발명에 따른 세포 조성물의 제조를 위한 또 다른 유리한 벡터는 렌티바이러스이다. HIV와 같은 렌티바이러스는 비분열 및 분열 세포를 감염시키고 숙주 세포 게놈에 통합하는 능력을 갖는다. 이들 특성으로 인해, HIV-기반 렌티바이러스 벡터가 유전자 요법의 양호한 전달 시스템 후보로서 제안되었으나, 임상 시험에서 이들을 사용하려는 시도는 인간에서 복제-가능(replication-competent) 레트로바이러스의 생성을 야기하는 유전자 재조합의 위험을 포함하여 그의 안전성에 대한 우려를 제기하였다. 보다 안전한 HIV-기반 렌티바이러스 벡터 시스템을 개발하기 위해 바이러스 유전자의 포장 및 유전적 성분에서의 추가 변형이 수행되었다. 오늘날, 표적 유전자를 분화된 단핵구-유래 대식세포로 효율적으로 형질도입하기 위해 다수의 안전한 HIV-기반 렌티바이러스 벡터가 설계되었다 (Leyva F. et al, BMC biotechnology (2011). 이들 벡터 중 임의의 것은 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
바람직한 렌티바이러스 벡터는 포유동물에게 안전하게 투여되도록 변형된 벡터이다. 이들 벡터는 예를 들어 문헌 [Neschadim A. et al. Biol Blood Marrow Transplant.　2007 Dec;13(12):1407-16]에 개시된 바와 같이 인간 또는 포유동물 유전자 요법에서 유용한 것으로 공지된 HIV / SIV 벡터이다. 사용하기에 가장 흥미로운 벡터는 HIV 및 SIV 기반 렌티바이러스 자기 불활성화 벡터(Self Inactivating vector) (Neschadim A. et al. Biol Blood Marrow Transplant.　2007 Dec;13(12):1407-16.), 아데노바이러스 벡터 (Haddada H. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun (1993)) 및 슬리핑 뷰티 트랜스포존 비바이러스성 벡터 (Aronovich et al. Human. Molecular. Genetics (2011))이다.
예에서 사용된 벡터, 즉, p21 단백질을 코딩하는 HIV-1 기반 자기 불활성화된 (SIN) 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 이 벡터는 p21 단백질을 단독으로 코딩하거나 AIP와 같은 또 다른 단백질 (아릴 탄화수소 수용체 상호작용 단백질)과 융합하거나 플래그 태그(Flag tag) 또는 헤마글루티닌 (HA) 태그와 같은 작은 단백질 태그에 융합될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 또한 렌티바이러스 감염을 손상시키는 인자의 분해를 유도하기 위해 SIVmac-VPX를 함유하는 바이러스 유사 입자 (VLP)를 함유한다 (Berger G., Gene Therapy (2009)). SIVmac-VPX는 레트로바이러스 복제에 필요한 dNTP를 가수분해하는 HIV-1 제한 인자로 확인된 SAMHD1을 분해한다 (Lahouassa et al., Nat Immunol (2012)).
훨씬 보다 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물에 함유된 단핵구는 p21 단백질을 코딩하는 하기 핵산 서열 서열번호: 5를 함유하는 SIN 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입되었다:
ATG TCA GAA CCG GCT GGG GAT GTC CGT CAG AAC CCA TGCGGCAGCAAGGCCTGCCGCCGCCTCTTCGGCCCAGTGGACAGCGAGCAGCTGAGCCGCGACTGTGATGCGCTAATGGCGGGCTGCATCCAGGAGGCCCGTGAGCGATGGAACTTCGACTTTGTCACCGAGACACCACTGGAGGGTGACTTCGCCTGGGAGCGTGTGCGGGGCCTTGGCCTGCCCAAGCTCTACCTTCCCACGGGGCCCCGGCGAGGCCGGGATGAGTTGGGAGGAGGCAGGCGGCCTGGCACCTCACCTGCTCTGCTGCAGGGGACAGCAGAGGAAGACCATGTGGACCTGTCACTGTCTTGTACCCTTGTGCCTCGCTCAGGGGAGCAGGCTGAAGGGTCCCCAGGTGGACCTGGAGACTCTCAGGGTCGAAAACGGCGGCAGACCAGCATGACAGATTTCTACCACTCCAAACGCCGGCTGATCTTCTCCAAGAGGAAGCCCTAA
상기에 언급한 바와 같이, p21 코딩 유전자는 그의 발현을 허용하는 조절 요소의 제어 하에 배치된다. 이들 조절 요소는 일반적으로 전사 프로모터 서열로 이루어진다. 이들은 이들 서열이 단핵구-대식세포에서 기능할 수 있는 경우, p21의 발현을 자연적으로 담당하는 서열일 수 있다. 그들은 또한 상이한 기원의 서열일 수 있다 (다른 단백질, 또는 심지어 합성 유전자의 발현을 담당함). 특히, 이들은 진핵생물 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들어, 이들은 감염시키고자 하는 단핵구의 게놈으로부터 유래하는 프로모터 서열일 수 있다. 유사하게, 그들은 바이러스의 게놈으로부터 유래하는 프로모터 서열일 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, 프로모터 E2F1 (E2 프로모터 결합 인자 1) 또는 EFS (신장 인자(elongation factor) 1α 쇼트(short)), SFFV (침묵-경향 비장 병소 형성 바이러스(silencing-prone spleen focus forming virus), CMV (거대세포바이러스), RSV (라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)) 등, 유전자가 예를 들어 언급될 수 있다. 게다가, 이들 발현 서열은 활성제 서열, 조절 서열 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
벡터 및 조절 서열의 선택은 본 발명의 대식세포에 의한 p21의 최종 발현이 모의-형질감염된 대조군 대식세포와 비교된 바와 같이 적어도 2배 또는 3배 증진되어야 함을 염두에 두고 통상의 기술자에 의해 행해져야 한다.
코딩 서열 및 적절한 전사/번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 핵산은 상당한 순도로 단리되고 수득된 다음에, 관련 기술분야에서 이용가능한 여러 가지의 기술을 사용하여 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
아데노바이러스, 렌티바이러스, 또는 AAV로부터 유래된 벡터의 구축, 및 상기 벡터에 이종 핵산 서열의 혼입의 모든 기술은 문헌에 기재되어 있고 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 분자생물학에서 전통적으로 사용되는 방법, 예컨대 플라스미드 DNA의 예비 추출(preparative extraction), 염화세슘 구배에서 플라스미드 DNA의 원심분리, 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 전기용리에 의한 DNA 단편 정제, 단백질의 페놀 또는 페놀-클로로포름 추출, 식염수 배지에서의 DNA의 에탄올 또는 이소프로판올 침전, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)에서의 형질전환 등은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 문헌에 충분히 기재되어 있다 [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
일단 바이러스의 게놈이 유전자 변형되면, 분자 생물학의 표준 기술에 따라 바이러스가 증식되고 회수되고 정제된다.
본 발명의 제약 조성물은 p21 단백질을 과발현하는 단핵구를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단핵구-유래 대식세포"는 실시예에 상세히 설명된 조건 하에, 말초 혈액 단핵구(peripheral blood monocyte) (PBMC), 또는 그의 골수 또는 혈액 전구체로부터 대식세포로 배양 및 분화된 단핵 세포를 의미한다 (또한, 문헌 [Andressen R. et al., Cancer Res. 1990; Bartholeyns J et al., Anticancer Res. (1991)] 참조). 전구체로서, 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell), 골수성 줄기 세포(myeloid stem cell) (CFU-GEMM), 골수단핵구성 줄기 세포(myelomonocytic stem cell) (CFU-GM), CFU-M, 단핵모세포(monoblast) 또는 전단핵구(promonocyte)를 사용하는 것이 또한 가능하다. 단핵구의 정맥내 주사는 골수, 비장 및 간에서 그의 생착(engraftment) 및 대식세포로의 그의 분화를 유도하였다.
PBMC는 혈액 중에서 발견되기 때문에, 대상체로부터 완전히 무해하고 비침습적인 혈액 수집에 의해 PBMC 샘플을 수득할 수 있다.
PBMC / 단핵구-대식세포 세포 또는 그의 전구체의 채취(withdrawal) 및 단리는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술에 의해 수행될 수 있다. 이들 상이한 기술은 물리적 분리 단계 (원심분리, 세포 분류 (FACS) 등), 및 면역학적 화합물 (세포 마커 등에 대한 특이적 항체 등) 또는 생화학적 화합물 (막 수용체 리간드) 등을 사용한 선택을 포함할 수 있다. 단리된 세포를 배양하는 것은, 특히, 혈청 및 아미노산이 보충된 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 상이한 배지 (예를 들어 RPMI, IMDM)에서 수행될 수 있다. 세포의 배양은 실시예에 예시된 바와 같이, 멸균 조건, 바람직하게는 37℃에서 수행된다. 이는 배양 플레이트, 또는 바람직하게는 테프론 백에서 수행될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물에 함유된 세포는 PBMC를 그의 분화를 허용하는 적합한 조건 하에 배양함으로써 수득되었다. 대식세포로의 인간 혈액 단핵구 분화는 예를 들어, 세 가지 상이한 방법을 사용하여, 즉, PBMC를 1) 인간 혈청 (HS), 2) 과립구-대식세포 집락-자극 인자 (GM-CSF)를 가진 소 태아 혈청 (FBS) 또는 3) 대식세포 집락-자극 인자 (M-CSF)를 가진 FBS에서 배양함으로써, 시험관내에서 유도될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 재조합 핵산을 사용한 PBMC 세포로부터 정제된 단핵구의 형질도입은 생체외에서 수행되고, 이어서 형질도입된 세포는 생체외에서 대식세포로 분화 / 배양된다. 이 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 p21 단백질을 과발현하는 분화된 대식세포를 함유한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산은 일단 그들이 생체외에서 대식세포로 분화 / 배양되면 세포에서 형질도입되었다. 이 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 또한 p21 단백질을 과발현하는 분화된 대식세포를 함유하나, 세포의 대식세포로의 분화는 본 발명의 재조합 핵산으로 형질도입되기 전에 수행되었다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산은 생체외에서 그의 단핵구 단계에서 세포에서 형질도입되었다. 이어서 세포는 대식세포로의 그의 분화가 일어나는 대상체에게 투여된다. 이 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 p21 단백질을 과발현하는 미분화 단핵구를 함유한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 순환 대식세포가 계내에서 형질감염되도록 하기 위해 재조합 핵산을 생체내 투여하는 것이 가능하다.
본원에 개시된 바와 같이, 용어 "시험관내" 및 "생체외"는 동등하며, 그의 통상적인 숙주 유기체 (예를 들어 동물 또는 인간)로부터 단리된 생물학적 구성요소 (예를 들어 세포 또는 세포 집단)를 사용하여 수행되는 연구 또는 실험을 지칭한다. 대조적으로, 용어 "생체내" 또는 "계내"는 살아있는 대상체에서 본 발명의 조성물을 투여한 후, 전체 살아있는 유기체 (예를 들어, 인간)에 대해 수행되는 연구를 지칭한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 생체외에서 형질전환되었으나 생체외에서 대식세포로 분화되지 않은 PBMC로부터의 정제된 단핵구를 함유한다. 그의 분화는 숙주에서 생체내에서 일어날 것이다. 이 경우에, 본 발명의 조성물은 80% 초과의 단핵구 또는, 보다 바람직하게는 90% 초과의 단핵구, 훨씬 보다 바람직하게는 99% 초과의 단핵구를 보유한다. 이는 본 발명의 세포 조성물이, 만약에 있다손치더라도, 매우 적은 다른 세포를 함유함을 의미한다.
본 발명의 세포 조성물 내에 함유된 PBMC로부터 정제된 단핵구는 통상적인 수단에 의해 개인의 말초 혈액으로부터 회수된 단핵구 세포이다. PBMC로부터 정제된 이들 단핵구는 마커: CD14, CD11b 및 CD16에 대해 양성이나, 마커 CD56 (이는 NK 세포의 마커임), CD3 (T 세포의 마커) 및 CD20 (B 세포의 마커)에 대해서는 음성이다. 바람직하게는, 본 발명의 세포 조성물은 이러한 세포를 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과 그리고 이상적으로는 99% 초과 함유한다. 이들 마커의 존재는 임의의 통상적인 수단, 예를 들어, 세포측정법 (FACS)에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 세포 조성물의 정맥내 주사 후 조직에서 분화된 대식세포는 마커: CD14, CD11b, CD71, CD163 및 CD206에 대해 양성이나, 마커 CD56 (이는 NK 세포의 마커임), CD3 (T 세포의 마커) 및 CD20 (B 세포의 마커)에 대해서는 음성이다. 바람직하게는, 본 발명의 세포 조성물은 이러한 세포를 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과 그리고 이상적으로는 99% 초과 함유한다. 이들 마커의 존재는 임의의 통상적인 수단, 예를 들어, 세포측정법 (FACS)에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산으로 본 발명의 조성물에 포함되는 세포의 형질전환은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 조정된 조건 하에, 멸균 배지에서 수행되어야 한다. 특히, 감염 다중도는 사용된 벡터에 따라 조정되어야 한다. SIV 바이러스를 사용한 한 가지 예가 하기 실시예에 제공되어 있다.
렌티바이러스 벡터가 사용되는 경우, 본 발명의 조성물에 포함되는 세포는 예를 들어 정제된 바이러스의 세포당 50 내지 250 pfu, 보다 바람직하게는 50 내지 100 pfu/세포와 접촉된다. 형질전환 조건에 따라, 재조합 핵산의 삽입에 의해 변형된 세포의 백분율은 30% 내지 95%로 다양할 수 있다.
이어서 이에 의해 수득된 변형된 세포는 즉각적인 사용을 위해 포장될 수 있고/있거나, 후속 사용을 위해 보관될 수 있다. 즉각적인 재투여를 위해, 세포는 일반적으로 용량당 30x106개 내지 109개 세포로 다양한 농도에서 인산염 완충제 또는 생리 식염수에 현탁시킨다. 그의 보관을 위해, 세포는, 바람직하게는 글리세롤, DMSO 등과 같은 보존제의 존재 하에 동결시킬 수 있다.
특히 상기에 개시된 재조합 바이러스 벡터를 사용함으로써, 본 발명에 따라 생체외에서 형질전환된 세포는 제약 조성물, 특히 환자의 면역 및 조혈 체계를 강화하려고 의도된 조성물의 제조를 위한 선택 도구이다.
본 발명의 조성물의 세포는 환자 자신으로부터 (따라서 조성물은 자가 세포를 함유함) 또는 공여자 (따라서 조성물은 동종이계 세포를 함유함)로부터 유래할 수 있다. 동종이계 세포의 경우, 공여자와 세포를 받는 환자 사이의 HLA 적합성 및 매칭이 필요하다.
제약 조성물은, 활성 성분으로서, 상기에 기재된 형질전환된 세포를 함유한다. 이는 게다가 제약상 허용되는 부형제를 함유한다.
용어 "제약상 허용되는 부형제"는 일반적으로 안전하고, 비독성이며, 바람직한 제약 조성물을 제조하는 데 유용한 부형제를 의미하며, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간 제약 용도에 허용되는 부형제를 포함한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는, 에어로졸 조성물의 경우에 기체일 수 있다. 암 치료용 조성물은 대개 비경구, 국소, 정맥내, 종양내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 복강내, 비강내 또는 근육내 수단에 의해 투여될 수 있다. 전형적인 투여 경로는 정맥내 또는 종양내이긴 하지만, 다른 경로가 동등하게 효과적일 수 있다.
정맥내 투여의 경우, 본 발명의 조성물은 액체 형태 하에 있을 것이다. 따라서 이는, 세포와는 별도로, 본 발명의 세포의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 제약상 허용되는 희석제를 함유할 것이다. 이러한 희석제의 예는 생리학적 인산염-완충 식염수, 링거액(Ringer's solution), 덱스트로스 용액 및 행크 용액(Hank's solution)이다. 게다가, 제약 조성물 또는 제제(agent)는 또한 다른 담체, 아주반트, 또는 비독성, 비치료적, 비면역원성 안정화제 등을 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 액체 형태 하에 있다.
본 발명의 제약 조성물은 단독으로 또는 또 다른 제약 조성물 또는 또 다른 활성 성분과 조합하여 투여될 수 있다. 특히, 본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 세포 조성물뿐만 아니라 동일한 용기에서 조합된, 또 다른 활성 성분을 함유할 수 있다.
이러한 활성 성분은 예를 들어 화학요법제일 수 있다. 예시적인 화학요법제는 알데스류킨, 알트레타민, 아미포스틴, 아스파라기나제, 블레오마이신, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클라드리빈, 시사프리드, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진 (DTIC), 닥티노마이신, 도세탁셀, 독소루비신, 드로나비놀, 듀오카르마이신, 에토포시드, 필그라스팀, 플루다라빈, 플루오로우라실, 젬시타빈, 그라니세트론, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 인터페론 알파, 이리노테칸, 란소프라졸, 레바미솔, 류코보린, 메게스트롤, 메스나, 메토트렉세이트, 메토클로프라미드, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 오메프라졸, 온단세트론, 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)™), 필로카르핀, 프로클로로페라진, 리툭시맙, 사프로인, 타목시펜, 탁솔, 토포테칸 히드로클로라이드, 트라스투주맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈 타르트레이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조합된"은 본 발명의 세포 및 다른 활성 성분이 반드시 동시에 투여된다는 것을 의미하지는 않는다. 이는 또한 상이한 시간 간격으로, 또는 별도의 용기에서 그의 투여를 수반하는 임의의 사용 또는 제공(presentation)으로 확장된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 예를 들어 상기에 정의된 바와 같은 화학요법제와 조합된다. 　
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 유효 용량의, 환자의 헤마토크릿(haematocrit)을 증가시키는 제제, 예를 들어 에리트로포이에틴 자극제 (ESA)와 조합된다 (또는 이를 함유한다). 이러한 제제는, 예를 들어, 아라네스프(Aranesp)® (다르베포에틴 알파(darbepoetin alfa)), 에포겐(Epogen)®NF/프로크릿(Procrit)®NF (에포에틴 알파(epoetin alfa)), 오몬티스(Omontys)® (페기네사티드(peginesatide)), 프로크릿® 등을 포함하여, 관련 기술분야에 공지되어 있고 사용된다.
다른 조합 요법은 세포-특이적 항체, 예를 들어 종양 세포 마커, 방사선, 수술, 및/또는 호르몬 결핍에 대해 선택적인 항체를 사용한 투여를 포함한다.
따라서, 본 발명의 세포 조성물은 유효 용량의 상기 세포-특이적 항체와 조합된다 (또는 이를 함유한다).
다수의 항체가 현재 암 치료를 위해 임상적으로 사용 중이며, 다른 항체들은 다양한 임상 개발 단계에 있다. 예를 들어, B 세포 악성종양의 치료를 위한 다수의 항원 및 상응하는 모노클로날 항체가 있다. 하나의 표적 항원은 CD20이다. 리툭시맙은 CD20 항원을 겨냥하는 키메라 비접합 모노클로날 항체이다. CD20은 B 세포 활성화, 증식, 및 분화에서 중요한 기능적 역할을 한다. CD52 항원은 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)의 치료에 지시되는 모노클로날 항체 알렘투주맙의 표적이 된다. CD22는 다수의 항체의 표적이 되며 최근에 화학요법-내성 모발 세포 백혈병(hairy cell leukemia)에서 독소와 조합된 효능을 입증하였다. CD20을 표적으로 하는 2개의 신규 모노클로날 항체, 토시투모맙 및 이브리투모맙이 미국 식품의약국(Food and Drug Administration) (FDA)에 제출되었다. 이들 항체는 방사성동위원소와 접합된다. 알렘투주맙(Alemtuzumab) (캄파쓰(Campath))은 만성 림프구성 백혈병의 치료에서 사용되며; 겜투주맙(Gemtuzumab) (마일로타그(Mylotarg))은 급성 골수원성 백혈병(acute myelogenous leukemia)의 치료에서 사용되며; 이브리투모맙 (제발린(Zevalin))은 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)의 치료에서 사용되며; 파니투무맙(Panitumumab) (벡티빅스(Vectibix))은 결장암의 치료에서 사용된다.
혈관신생 억제제가 또한 본 발명의 조성물과 조합될 수 있다 (또는 이에 함유될 수 있다).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 조성물은 유효 용량의 면역 체크포인트 조정제, 특히 면역 체크포인트 억제제 (immune checkpoint inhibitor; ICI)와 조합된다 (또는 이를 함유한다).
"면역 체크포인트 억제제" (ICI)는 항-PD1 항체 (예컨대 니볼루맙(Nivolumab) 또는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab) 또는 피딜리주맙(Pidilizumab)), 항-PD-L1 항체 (예컨대 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 더발루맙(Durvalumab)), 항-CTLA-4 항체 (예컨대 이필리무맙(Ipilimumab) 또는 트레멜리무맙(Tremelimumab)) 및 항-PD-L2 항체를 포함한다.
상기 활성 성분과 본 발명의 제약 조성물의 "병용(Concomitant) 투여"는 활성 성분 및 본 발명의 조성물 둘 다가 치료 효과를 가질 때 재조합 세포와의 투여를 의미한다. 이러한 병용 투여는 본 발명의 화합물의 투여와 관련하여 활성 성분의 공동(concurrent) (즉, 동시에), 이전, 또는 후속 투여를 포함할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 특정한 약물 및 조성물에 대한 투여의 적절한 시기선택, 순서 및 투여량을 결정하는 데 어려움이 전혀 없을 것이다.
수득된 p21-발현 단핵구를 함유하는 본 발명의 세포 조성물의, 이를 필요로 하는 대상체에서의, 생체내 전달은 암, 구체적으로 백혈병을 치료하는 간단하고 효과적인 방법으로서 본원에서 제안된다.
대개, 상기 대상체는 인간이나, 인간이 아닌 포유동물, 예를 들어 개, 고양이, 말 등의 반려동물, 토끼, 마우스, 래트 등의 실험용 포유동물 등이 또한 치료될 수 있다.
따라서, 본원에서 의미하는 바와 같이 "이를 필요로 하는 대상체"는 암을 앓고 있는 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 상기 암은 원발성 또는 전이성 암으로서 액체 또는 고형 암 예컨대, 그러나 제한 없이, 림프종, 백혈병, 암종, 흑색종, 교모세포종, 육종, 골수종, 결장 직장 종양 등일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 "이를 필요로 하는 대상체"는 백혈병을 앓고 있는 인간 또는 또 다른 포유동물이다.
본 발명은 본 발명의 세포 조성물이 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 주사, 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여되는 치료 방법을 포함한다. 전신 주사는 또한 관류에 의해 수행될 수 있다. 이들 주사는 치료된 대상체에게 무해하다. 본 발명의 세포 조성물의 정맥내 투여는 대상체의 혈액에 존재하는 종양 세포의 생체내 포식작용을 증가시킬 수 있고, 이에 의해 상기 대상체에서 종양 세포의 양을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 특정한 치료 방법은 다음을 포함한다:
1. 혈액 또는 골수 또는 탯줄, 이를 필요로 하는 대상체 또는 건강한 공여자로부터 단핵구 또는 그의 전구체 또는 다능성 줄기 세포의 채취 및 단리,
2. 단핵구 집단을 수득 / 단리하기 위해, 상기에 개시된 바와 같은 이들 세포의 배양,
3. 상기에 정의된 바와 같은 재조합 핵산으로 이들 세포의 형질전환,
4. 임의로, 이에 의해 수득된 세포의 포장 및/또는 보관, 및 이어서
5. 환자에 대한 그의 투여.
본 발명의 치료는 LAK, TIL 또는 NK (자연 살해자)를 사용한 입양 면역요법에서 다른 치료에 비해 많은 이점, 예컨대, 예를 들어, 세포에 의해 방출되는 독성 매개체의 부재, 세포독성의 경우 표적 세포에 대한 이펙터의 비가 다른 치료에서 보다 낮다는 사실, 및 그의 부작용이 해로운, IL-2와 같은 시토카인의 동시 주사가 필요하지 않다는 사실을 제공한다. 더욱이, 본 발명의 치료는 정의되고 제어된 세포 집단만을 감염시키는 것을 가능하게 하고, 감염 다중도 (세포당 바이러스 입자의 수)를 선택할 수 있게 하고, 조직이 혈액 순환으로부터 비가역적으로 도달할 수 있게 하고, 상기에 설명한 바와 같이, 대식세포의 항종양 또는 항감염 활성 둘 다에 의해 및 면역 체계의 자극 또는 조절의 그의 활성에서 둘 다, 신체에서 대식세포의 중심 역할을 좋게 활용하는 것을 가능하게 한다. PrCR+의 염증촉진성 재프로그래밍 외에도 대식세포는 선천성 및 적응 항암 면역 반응을 증진시키고, 이는 결국 내구성 항종양 성장 미세환경을 확립한다. 게다가, 그리고 대식세포의 상당한 수명을 고려하여, 환자에 대한 치료를 불리하게 만드는 반복을 피할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명은 환자에게 덜 요구되고, 덜 비싸고, 그리고 더 재현가능한 보다 효과적인 치료의 신규 가능성을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 장애 (예를 들어, 백혈병)의 증상, 및/또는 이와 연관된 증상을 감소시키거나 개선하는 것을 지칭한다. 배제되지는 않긴 하지만, 장애 또는 병태를 치료하는 것이 그와 연관된 장애, 병태 또는 증상이 완전히 제거되는 것을 필요로 하지 않는다는 것이 인식될 것이다.
예를 들어 암의 치료를 위한, 본 발명의 치료제의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 사람인지 동물인지, 투여되는 기타 의약, 및 치료가 예방적 또는 치료적인지를 포함하여, 많은 상이한 요인에 따라 다양하다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 수 있다.
예방적 적용을 위해, 제약 조성물 또는 의약은 질환의 생화학적, 조직학적 및 거동학적 증상, 질환의 발달 동안 나타나는 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함한, 질환의 위험을 제거하거나 감소시키거나, 중증도를 감소시키거나, 질환의 발병을 지연시키기에 충분한 양으로 질환에 걸리기 쉽거나, 또는 그렇지 않으면 질환의 위험이 있는 환자에게 투여된다. 이들 예방적 적용에서, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여될 수 있다. 일부 환자는 그의 여생 동안 계속 치료를 받는다.
반대로, 치료적 적용에서, 비교적 짧은 간격 (전형적으로 매주)으로 비교적 높은 투여량 (환자당 주사 용량당 50x106개 단핵구)이 때때로 질환의 진행이 감소되거나 종료될 때까지, 그리고 바람직하게는 환자가 질환의 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 필요하다.
도면 범례
도 1은 p21-의존적 PrCR이 대식세포의 염증촉진성 재프로그래밍을 촉발하고 (도 1a 내지 k) 백혈병 퇴행(regression)에 조력한다는 것을 나타낸다 (도 1l 내지 r).
도 2는 p21이 SIRPa의 조정을 통한 대식세포의 프로그램화된 세포 제거 및 백혈병 퇴행을 지시한다는 것을 나타내고 (도 2a 및 2b), p21이 백혈병 퇴행에 조력한다는 것을 확인한다 (도 2c 및 2d).
실시예
하기에 제공된 실시예는 제한하는 것이 아니라 대식세포로의 p21 단백질 발현의 실현가능성, 및 생체내에서의 그의 치료적 가치의 실례이다.
1. 재료 및 방법
백혈병 세포주를 사용한 1차 대식세포의 배양
단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 버피 코트(buffy coat)로부터의 단핵구의 대식세포로의 분화를 통해 수득하였다. 건강한 공여자로부터의 버피 코트(buffy coat)는 프랑스 법에 따라 EFS-INSERM 협약의 일부로서 프랑스 혈액 은행 (Etablissement Fran
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ais du sang (EFS))을 통해 수득하였다. 단핵구를 먼저 플라스틱에 부착하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 분리한 다음에 15%의 열 불활성화 인간 혈청 AB를 함유하는 대식세포 배지 (200 mM L-글루타민, 100 U의 페니실린, 100 μg 스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 10 mM 피루브산나트륨, 50 μM β-메르캅토에탄올, 1% 최소 필수 배지 비타민, 1% 비필수 아미노산이 보충된 RPMI 1640)에서 소수성 테플론(Teflon) 접시 (루목스(Lumox); 더쓰셔(Duthsher))에서 6 내지 7일 동안 배양하였다. 이어서 MDM을 수확하고 10%의 열 불활성화 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 대식세포 배지에 현탁시켰다. 이 방법으로 수득한 MDM은 유세포 분석기에 의해 점검할 경우 분화 마커 (C11b 및 CD71)와 M2 대식세포 분극 마커 (CD163 및 CD206)를 발현하는 91 내지 96% CD14 양성이다. MDM의 순도는 또한 CD56 (NK 세포), CD3 (T 세포) 및 CD20 (B 세포)에 대한 음성 염색에 의해 제어되었다. T 세포 음성 선택 키트 (STEM CELL)를 사용하여 비부착(non-adherent) PBMC 분획으로부터 1차 혈액 림프구(primary blood lymphocyte) (PBL)를 단리하였다. 이 방법에 의해 수득된 림프구는 90 내지 97% CD3 발현 T 세포였으며, 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지에서 배양되었다. 분화된 MDM (0.125x106개) 및 생존가능한 백혈병 세포 (0.125x106개) (주르카트(Jurkat), MT4, CEM, THP1, HEL-5320, K562 또는 CD34+ 급성 골수성 백혈병 모세포 (CD34+AML))를 1시간 동안 세포 추적체(cell tracker) 그린 (CMFDA) 또는 레드 (CMTMR)로 각각 미리 표지하였다. 건강한 공여자로부터 수득한 PBL을 대조군으로서 사용하였다. 광범위한 세척 후, MDM 및 백혈병 세포를 8시간 동안 250 μl 총 부피의 ZVAD-fmk 판-카스파제(pan-caspase) 억제제 (100 μM)의 존재 또는 부재 하에 10% FBS가 보충된 대식세포 배지에서 8x 웰 챔버 슬라이드에서 공동-배양하였다. 광범위한 세척 후, 대식세포에 의해 탐식되지 않은(non-engulfed) 백혈병 세포를 제거하고 대식세포를 공초점 현미경 분석 전에 고정하였다 (2% PFA 사용). PrCR+ 대식세포의 백분율은 대식세포의 총 수에 대해 백혈병 세포 (CMTMR+)를 내재화한 대식세포 (CMFDA+) 수에 의해 결정되었다. 백혈병 세포와 1차 대식세포의 공동-배양 직후 시간 경과 비디오 현미경(Time lapse video microscopy)을 수행하였다. MDM의 p21 침묵 후 24시간에 백혈병 세포와 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21에 대해 침묵된 1차 대식세포의 공동-배양을 수행하였다. 분화된 MDM은 다마콘(Dharmacon)으로부터 수득된 온-타겟 플러스 siRNA p21 n.12 (서열번호: 6 : 5' AGA CCA GCA UGA CAG AUU U 3')인 p21 유전자에 대한 siRNA (siRNA p21) 50 nM의 형질감염을 통해 p21 유전자에 대해 침묵되었다. siRNAs 형질감염은 INTERFERin 키트 (폴리플러스 트랜스펙션(Polyplus Transfection))를 사용하여 수행하였다. 동일한 양의 온-타겟 플러스 비-표적화 siRNA (siCo.) (다마콘)를 첨가하여 MDM을 제어하였다. MDM에서 p21 유전자 녹다운의 효율성은 백혈병 세포와의 공동-배양 시간에 상응한 침묵 후 24시간에 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 유세포 분석기에 의한 PrCR+ 대식세포의 분류는 대식세포와 백혈병 세포의 공동-배양의 2시간 후에 수행하였다. 이어서, 분류된 PrCR+ 대식세포 (CMFDA+CMTMR+) 및 PrCR- 대식세포 (CMFDA+)를 추가 96시간 동안 배양한 다음에 스캐빈저 수용체 CD163 막 발현 (유세포 분석기에 의해), IRF5 발현 (웨스턴 블롯에 의해)을 분석하고 (시토카인 마이크로어레이 프로파일링에 의한) 세포 상청액에서의 시토카인 분비를 분석하였다.
p21-과발현 조작된 인간 1차 단핵구
정제된 1차 단핵구 (15x106개)를, SIVmac-VPX를 함유하는 바이러스 유사 입자(Viral Like Particle) 및 SFFVp 프로모터 하에 p21 유전자 (AIP-p21)에 대해 코딩하는 HIV-1-기반 자기 불활성화 (SIN) 렌티바이러스 벡터의 150 μg CAp24로 형질도입하여 렌티바이러스 감염 SAMHD1 단백질의 골수성 제한 인자(myeloid restriction factor)의 분해를 유도하였다. 대조군 단핵구는 동일한 양의 AIP 벡터 및 VLPs-SIV-mac-VPX로 형질도입되었다. 형질도입은 1시간 스핀접종(spinoculation) (1200 g, 22C에서) 및 37C에서 1시간으로 수행하였다. 이어서, 형질도입된 단핵구 (15x106개)를 1시간 동안 셀 트레이스(Cell Trace) CFSE 염료로 표지하고 광범위하게 세척한 후에 X선 조사 후 24시간에 1 그레이 (1 Gy) 방사선조사된 수컷 또는 암컷 NSG 마우스 (6 내지 8주령)에 이를 정맥내 주사하였다. MT4 엠체리+ T 세포 (1x106개)를 p21-단핵구 전달 후 7일차에 정맥내 주사하였다. 일부 마우스가 공초점 현미경에 의해 골수에서 PrCR+ 대식세포 (CFSE+엠체리+)의 존재를 모니터링하기 위해 희생되었을 때 백혈병 생착 후 15일까지, 마우스의 전체 생존을 모니터링하였다. PrCR+ 대식세포의 염증촉진성 활성화는 희생된 마우스의 비장 및 골수로부터 분류된 PrCR+ 대식세포 (CFSE+엠체리+) 및 PrCR-대식세포 (CFSE)에 대한 CD163 막 발현의 유세포 분석기 분석에 의해 결정하였다.
생체내 설정 모델 동안, NSG 마우스 모델에서 단핵구의 대식세포로의 분화는, 단핵구 전달 후 7일차에, 골수, 비장, 및 혈액으로부터의 CFSE+ 세포를 정제하고 자가 시험관내 분화된 대식세포에 대한 분화 마커 (CD71, CD163 및 CD14)의 발현을 평가함으로써 확인하였다. AIP-p21 형질도입된 단핵구 중 일부는 분화 후 7일차에 웨스턴 블롯에 의한 p21 발현의 상향조절을 평가하기 위해 시험관내에서 병렬적으로 배양하였다.
마우스 치료 연구
NSG 마우스를 귀스타브 루시 연구소(Gustave Roussy Institute)의 동물 시설에서 병원균이 없는 조건 하에 사육하고 유지관리하였다. 동물 실험을 프랑스 동물 기관 위원회(French Institutional Animal Committee)에 의해 확립된 지침에 따라 수행하였다. 렌티바이러스 벡터 형질도입 및 엠체리 발현을 위한 유세포 분석기 분류를 통해, 안정적으로 엠체리 형광 유전자를 발현하는 MT4 백혈병 T 세포 (1x106개)를 암컷 또는 수컷 마우스 (6-8주령)에 정맥내 주사하였다. 백혈병 생착은 골수, 비장, 간 및 혈액에서 엠체리+MT4 T 세포의 존재를 통해 그리고 체중 감소, 골수 침범 및 현저한 비장비대를 특징으로 하는 질환 진행 및 전체 생존을 통해 주사 후 4주까지 평가하였다.
SIRPa cDNA 클로닝
호모 사피엔스(homo sapiens) SIRPa 포식작용 억제제를 발현하는 cDNA를 제한 부위 MluI 및 NheI 사이의 HIV-1-기반 자기 불활성화 (SIN) 렌티바이러스 벡터 (pRRLEF1-PGK-GFP)에서 클로닝하였다.
hsSIRPa cDNA의 서열은 서열번호: 7에 표시되어 있다.
p21 및 SIRPa를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 사용한 단핵구의 형질도입
정제된 1차 단핵구 (107개)를, SFFVp 프로모터 하에 p21 유전자 (AIP-p21)에 대해 코딩하는 HIV-1-기반 자기 불활성화 (SIN) 렌티바이러스 벡터의 100 μg CAp24 및/또는 SIVmac-VPX를 함유하는 바이러스 유사 입자 (VLP)의 존재 하에 EF1 프로모터 하에 SIRPa 유전자 (PRRL-SIRPa)에 대해 코딩하는 HIV-1-기반 자기 불활성화 (SIN) 렌티바이러스 벡터의 100 μg CAp24로 형질도입하여 렌티바이러스 감염 SAMHD1 단백질의 골수성 제한 인자의 분해를 유도하였다. 대조군 단핵구는 동일한 양의 AIP 및/또는 PRRL 벡터 및 VLPs-SIV-mac-VPX로 형질도입하였다. 형질도입은 폴리브렌 (10 μg/ml)의 존재 하에 37℃에서 3시간 동안 수행하였다. 이어서, 형질도입된 단핵구 (107)를 1시간 동안 셀 트레이스 CFSE 염료로 표지하고 광범위하게 세척한 후에 X선 조사 후 24시간에 1 그레이 (1Gy) 방사선조사된 수컷 또는 암컷 NSG 마우스 (6 내지 8주령)에 이를 정맥내 주사하거나 또는 주요 특허 자료 및 방법에서 이전에 기재된 바와 같이 시험관내에서 대식세포로 분화시켰다.
2. 결과
본 발명자들은 대식세포가 PrCR을 조절할 수 있는 분자 메커니즘을 조사하였다. 이들은 다양한 살아있는 백혈병 세포 (적색 형광 세포 추적체 CMTMR로 표지됨) 패널의 1차 항염증성 종양형성촉진성(pro-tumorigenic) 인간 단핵구-유래 대식세포 (MDM) (녹색 형광 세포 추적체 CMFDA로 표지됨)에 의한 포식작용을 평가하였다 (도 1a).
공초점 현미경을 사용하여, 이들은 MIC 억제제의 부재 하에, 인간 1차 대식세포와 급성 T 림프모세포(lymphoblast) (주르카트, CEM 또는 MT4 세포, 도 1b 및 1c), 급성 골수성 세포 (THP1 세포, 도 1c), 급성 거핵모구성 세포(acute megakaryoblastic cell) (UT-7 세포, 나타내지 않음), 적혈모구(erythroblast) (HEL-5320, 도 1c), 만성 골수성 림프모세포 (K562 세포, 도 1c) 및 급성 골수성 백혈병을 가진 환자의 혈액으로부터 정제된 1차 형질전환된 CD34+ 모세포 (도 1d)의 공동-배양 동안에 살아있는 종양 세포의 포식작용이 이미 상당히 증가되었으며, 한편, 살아있는 자가 또는 이종 형질전환되지 않은 말초 혈액 림프모세포 (PBL)는 영향을 받지 않는다는 것을 (도 1c)을 관찰하였다. 판-카스파제 억제제 (ZVAD)는 표적 세포의 탐식을 감소시키지 않았다 (도 1c). 이들 결과는 대식세포가 MIC 차단의 부재 하에 또한 자발적으로 PrCR을 발생시킬 수 있음을 나타낸다.
이어서, 본 발명자들은, 일단 내재화되면, MT4 세포가 리소좀에 의해 빠르게 분해된다는 것을 관찰하였다 (도 1e 및 1f). 이들은 또한 PrCR이 항염증성으로부터 염증촉진성 표현형으로 탐식 대식세포의 기능적 재프로그래밍을 유도할 수 있음을 밝혔냈다 (IRF5 전사 인자의 증가된 발현 (도 1g), CD163 스캐빈저 수용체의 감소된 막 발현 (도 1h) 및 세포-분류 탐식 "PrCR+" 대식세포로부터의 염증촉진성 시토카인 (예를 들어 MCP-1, 세르핀(Serpin) 및 IL-8)의 방출 (도 1i)에 의해 밝혀진 바와 같이.
게다가, 본 발명자들은 1차 인간 대식세포에서 과발현되는 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21이 PrCR의 마스터(master) 조절제라는 것을 나타냈다. 이것은 p21-고갈된 인간 1차 대식세포에 의한 살아있는 MT4 세포의 탐식의 억제에 의해 밝혀졌다 (도 1j 및 1k). 종합하면, 이들 결과는 p21 발현이 PrCR의 유도를 통한 대식세포의 염증촉진성 재프로그래밍을 지시한다는 것을 입증하였다.
이어서, p21-과발현 조작된 인간 1차 단핵구 (p21EHM)의 입양 전달을 통해 PrCR을 조작하는 치유적 치료 가능성이 인식되었다. HTLV-1 형질전환된 MT4 세포의 이식 전에 NOD/SCID 마우스로의 p21EHM의 입양 전달의 생물학적 효과를 결정하였다. 대조군 마우스는 백혈병이 발생하였다 (생착된 마우스의 체중 감소 (도 1l), 골수 침범 (도 1m) 및 현저한 비장 비대 (도 1n)에 의해 밝혀진 바와 같이). CFSE-표지된 p21EHM을 생착된 마우스로 옮긴 후, 생체내에서 대식세포로의 그의 분화가 관찰되었으며 (도 1o 및 나타내지 않음), 생착된 마우스에서: 골수 (도 1p), 간 및 비장 (나타내지 않음)에서 MT4-탐식 대식세포의 존재가 검출되었다.
또한, MT4-탐식 대식세포가 항염증성으로부터 염증촉진성 표현형으로 전이되는 것으로 관찰되었다 (CD163의 감소된 막 발현 및 IFNγ 및 IL-1β의 증가된 분비에 의해 밝혀진 바와 같이; 도 1q 및 나타내지 않음). 흥미롭게도, p21EHM-기반 세포 요법은 처리된 마우스에서 질환 진행의 지연을 야기하고 전체 생존을 상당히 증가시켰다 (도 1r).
종합하면, 이들 데이터는 p21EHM의 입양 전달이 대식세포 PrCR 유도를 통해 혈액 악성종양(hematological malignancies)을 치료하기 위한 신규 치료 전략을 나타낸다는 것을 입증하였다.
p21과 프로그램화된 세포 제거 사이의 분자적 연결을 추가로 특성화하기 위해, 포식작용 억제제 SIRPa의 발현에 대한 p21 발현의 영향을 결정하였다. 1차 인간 단핵구는 그의 각각의 대조군 빈(empty) 벡터 pCo. (pAIP 및/또는 pRRL)와 조합되거나/또는 조합되지 않은 p21 및/또는 SIRPa를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 동시에 형질도입되었다. 단핵구의 분획은 시험관내에서 7일 동안 대식세포로 분화되었고 p21 및 SIRPa 발현은 웨스턴 블롯에 의해 결정되었다 (도 2a). 각각의 조건에서 형질도입의 효율을 검증하였다. p21의 과발현이 SIRPa 발현을 억제한다는 것이 검출되어, p21 발현이 부정적으로 SIRPa 발현을 조절한다는 것이 밝혀졌다 (도 2a). 프로그램화된 세포 제거에 대한 이들 형질도입의 영향을 결정하기 위해, 이어서, 형질도입된 대식세포의 공동배양을 엠체리 형광 단백질을 발현한 백혈병 MT4 세포로 수행하고 엠체리+ MT4 세포를 탐식한 대식세포 (PrCR+ 대식세포)의 빈도를 형광 현미경을 사용하여 분석하였다 (도 2b). p21 및 SIRPa의 증가된 발현은 각각 엠체리+ MT4 세포의 포식작용을 증진 및 감소시키는 것으로 관찰되었다. 게다가, p21에 대해 형질도입된 대식세포에서 SIRPa의 증가된 발현은, 이 과정을 억제하였으며, 따라서 p21이 SIRPa 발현의 조정을 통해 대식세포의 프로그램화된 세포 제거를 지시한다는 것을 입증하였다. 이어서, 이들 조정이 백혈병 진행에 미치는 영향을 분석하였다. 형질도입된 단핵구 (도 2a에 나타냄)를 엠체리+ MT4 세포의 주사 1주일 전에 NOD/SCID 마우스에 입양 전달하고 (도 2c), 생착된 마우스의 전체 생존을 분석하였다 (각각의 군에서 n=5 마우스) (도 2d). P 값은 만텔-콕스 검정(Mantel-Cox test)을 사용하여 계산되었으며 분석된 군 간의 통계적 유의성을 나타냈다 (***p<0.001). 종합하면, 이들 결과는 p21 과발현 단핵구 (p21EHM)의 입양 전달이 대식세포의 SIRPa-의존적 프로그램화된 세포 제거의 조정을 통해 백혈병 진행을 지연시킬 수 있음을 확인시켜 주었다.
서지적 참고문헌
Advani R. et al., N Engl J Med (2018) Nov 1;379(18):1711-1721
Andressen R. et al., Cancer Res. (1990) 50:7450
Arandjelovic S and Ravichandran KS, Nat Immunol (2015) Sep;16(9):907-17
Aronovich EL et al., Human. Molecular. Genetics (2011) Vol. 20, Review Issue 1 R14-R20
Bartholeyns J et al., Anticancer Res. 11 (1991) 1201-1204
Berger G., Gene Therapy (2009) 16,　pages159-163
Chao MP et al., Nat Rev Cancer (2011) Dec 8　; 12(1)　:58-67
Feng et al., Nat Comm (2018) Aug 10;9(1):3194.
Haddada H. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun (1993) Sep 30;195(3):1174-83.
Jaiswal S., Trends Immunol. (2010) Jun; 31(6):212-9
Jaiswal et al., Cell (2009) Jul 23;138(2):271-85
Leyva F. et al, BMC biotechnology (2011) ; 11: 13
Majeti et al., Cell (2009) Jul 23;138(2):286-99
Neschadim A. et al. Biol Blood Marrow Transplant.　2007 Dec;13(12):1407-16.
Pardoll DM., Nat Rev Cancer (2012)　Mar 22;12(4):252-64.
Sharma SH et al, Cell (2015) Apr 9;161(2):205-14
Singh G. et al, F1000 research 2015, 4:495
Weiskopf K, Eur J Cancer (2017) May;76:100-109.
SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT GUSTAVE ROUSSY <120> P21 expressing monocytes for cancer cell therapy <130> B378361PCT D39471 <140> PCT/EP2020/070379 <141> 2020-07-17 <150> EP19305963.1 <151> 2019-07-19 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2122 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human p21 mRNA transcript variant 2 <400> 1 ggtggctatt ttgtccttgg gctgcctgtt ttcagctgct gcaaccacag ggatttcttc 60 tgttcaggcg ccatgtcaga accggctggg gatgtccgtc agaacccatg cggcagcaag 120 gcctgccgcc gcctcttcgg cccagtggac agcgagcagc tgagccgcga ctgtgatgcg 180 ctaatggcgg gctgcatcca ggaggcccgt gagcgatgga acttcgactt tgtcaccgag 240 acaccactgg agggtgactt cgcctgggag cgtgtgcggg gccttggcct gcccaagctc 300 taccttccca cggggccccg gcgaggccgg gatgagttgg gaggaggcag gcggcctggc 360 acctcacctg ctctgctgca ggggacagca gaggaagacc atgtggacct gtcactgtct 420 tgtacccttg tgcctcgctc aggggagcag gctgaagggt ccccaggtgg acctggagac 480 tctcagggtc gaaaacggcg gcagaccagc atgacagatt tctaccactc caaacgccgg 540 ctgatcttct 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cctggttcct tgccacttct tacctggggg tgatcctcag acctgaatag 1020 cactttggaa aaatgagtag gactttgggg tctccttgtc acctctaagg ccagctagga 1080 tgacagtgaa gcagtcacag cctagaacag ggatggcagt taggactcaa ccgtaatatc 1140 ccgactcttg acattgctca gacctgtgaa gacaggaatg gtccccactc tggatcccct 1200 ttgccactcc tggggagccc acctctcctg tgggtctctg ccagctgccc ctctattttg 1260 gagggttaat ctggtgatct gctgctcttt tcccccaccc catacttccc cttctgcagg 1320 tcggcaggag gcatatctag gcacttgccc cacagctcag tggactggaa gggaatgtat 1380 atgcagggta cactaagtgg gattccctgg tcttacctta ggcagctcca gtggcaaccc 1440 cctgcattgt gggtctaggg tgggtccttg gtggtgagac aggcctccca gagcattcta 1500 tggtgtgtgg tggtgggggt gggcttatct gggatgggga ccccagttgg ggttctcagt 1560 gacttctccc atttcttagt agcagttgta caaggagcca ggccaagatg gtgtcttggg 1620 ggctaaggga gctcacagga cactgagcaa tggctgatcc tttctcagtg ttgaataccg 1680 tgggtgtcaa agcacttagt gggtctgact ccagccccaa acatccctgt ttctgtaaca 1740 tcctggtctg gactgtctac ccttagcccg caccccaaga acatgtattg tggctccctc 1800 cctgtctcca 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Claims (15)

  1. 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21 단백질을 코딩(coding)하는 벡터(vector)를 함유하는 유전자 변형된 단핵구(genetically modified monocyte), 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단핵구가 이의 발현을 허용하는 조절 요소(regulatory element)의 제어 하에 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21을 코딩하는 복제 결함 재조합 바이러스(replication defective recombinant virus)를 함유하는 제약 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 바이러스가 복제 결함 렌티바이러스인 제약 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 복제 결함 렌티바이러스가 HIV-1 기반 자기 불활성화된 (SIN) 렌티바이러스 벡터인 제약 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 정맥내 주사가능한 형태 또는 관류 형태(perfusion form)로 제제화되는 제약 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, mL당 30x106개 내지 109개의 형질도입된 단핵구를 함유하는 제약 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단핵구가 이의 발현을 허용하는 조절 요소의 제어 하에 사이클린-의존성 키나제 억제제 p21을 코딩하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템(Sleeping Beauty transposon system)을 함유하는 제약 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p21 단백질이 서열번호: 2, 또는 이의 기능적 변이체(functional variant) 또는 단편인 제약 조성물.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 또는 상기 트랜스포존 시스템이, 바람직하게는 SFFV 프로모터의 제어 하에, 서열번호: 5의 핵산을 함유하는 제약 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 유효 용량의, 환자 헤마토크릿(patient haematocrit)을 증가시키는 제제(agent), 화학요법제, 세포-특이적 항체 또는 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor; ICI)를 추가로 함유하는 제약 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구성(lymphoid) 또는 골수성(myeloid) 암 또는 고형(solid) 암, 바람직하게는 백혈병을 앓고 있는 포유동물을 치료하기 위한 용도를 위한 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 주사 용량당 50x106개의 단핵구를 함유하고, 질환의 진행이 감소될 때까지 매주 투여되는 제약 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 제약 조성물.
  14. 림프구성 또는 골수성 암 또는 고형 암을 앓고 있는 포유동물을 치료하기 위한 동시 또는 순차적 사용을 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제약 조성물, 및 유효 용량의, 헤마토크릿을 증가시키는 제제, 화학요법제, 세포-특이적 항체 또는 면역 체크포인트 억제제 (ICI)를 포함하는 조합 생성물(combination product).
  15. 제14항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 조합 생성물.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2533803A1 (en) * 2003-07-29 2005-02-10 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers of cyclin-dependent kinase modulation
US20090227533A1 (en) * 2007-06-08 2009-09-10 Bader Andreas G miR-34 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention
CN102858985A (zh) * 2009-07-24 2013-01-02 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基因组编辑方法
BR112018001858B1 (pt) 2015-07-28 2022-02-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composições compreendendo células modificadas que compreendem um receptor de antígeno quimérico (car), seus usos terapêuticos e método para modificar uma célula

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