BR112018001858B1 - Composições compreendendo células modificadas que compreendem um receptor de antígeno quimérico (car), seus usos terapêuticos e método para modificar uma célula - Google Patents

Abstract

a presente invenção inclui métodos e composições para tratar câncer, seja um tumor sólido ou uma malignância hematológica. expressando-se um receptor de antígeno quimérico em um monócito, macrófago ou célula dendrítica, a célula modificada é recrutada ao microambiente tumoral onde atua como um efetor imune poderoso infiltrando-se o tumor e exterminando as células alvo. um aspecto inclui uma célula modificada e composições farmacêuticas que compreendem a célula modificada para terapia celular adotiva e tratamento de uma doença ou afecção associada à imunossupresão.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS

[001]O presente pedido tem prioridade concedida disposta no Título 35 do Código dos Estados Unidos § 119(e) ao Pedido de Patente Provisório no U.S. 62/197.675, depositado em 28 de julho de 2015, estando incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002]A imunoterapia contra câncer demonstrou resultados clínicos animadores no estabelecimento de diversos tumores sólidos e malignâncias hematológicas. O sistema imune endógeno é tipicamente não reativo a células malignas, ou pode ser ativamente imunossupressor em relação à reação do corpo à presença de células malignas. Uma forma de aprimorar o tratamento de tumores consiste em forçar o reconhecimento tumoral pelo sistema imune através de engenharia genética de leucócitos. As células T podem ser modificadas por engenharia genética para expressar um imunorreceptor sintético que compreende um anticorpo direcionado extracelular e um domínio de sinalização intracelular, conhecido como receptor de antígeno quimérico (CAR). As células T que expressam um CAR voltado contra CD19 foram mostradas tendo uma eficácia autileucêmica significativa, onde a remissão completa foi alcançada em 90% de pacientes com leucemia linfoblástica aguda tratados (Maude, et al., NEJM, vol. 371:1507-17, 2014). Esses resultados são acompanhados por proliferação de células T robustas e infiltração de células T claramente documentada em sítios tumorais em pacientes com leucemia tratados dessa forma. Apesar das altas taxas de resposta demonstradas em malignâncias hematopoiéticas, a eficácia de células T CAR em tumores sólidos (bem como em determinados tumores linfoides) pode ser limitada. Possíveis explicações para isso incluem a capacidade potencialmente prejudicada de células T infiltrarem em tumores sólidos, tráfego fraco, microambiente e tumor imunossupressor, e expressão de alguns antígenos específicos tumorais em células tumorais sólidas.

[003]Há uma necessidade na técnica por composições e métodos mais eficazes que tratam cânceres aperfeiçoando-se a especificidade por células tumorais e aperfeiçoando-se a infiltração em sítios tumorais tanto em tumores sólidos como em malignâncias hematológicas por essas composições. A presente invenção satisfaz essa necessidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004]Conforme revelado no persente documento, a presente invenção inclui composições e métodos de utilização de uma célula fagocítica com atividade efetora direcionada.

[005]Em um aspecto, a invenção inclui uma célula modificada que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar e um domínio intracelular de uma molécula estimulatória e/ou co-estimulatória, e em que a célula é um monócito, macrófago ou célula dendrítica que possui atividade efetora direcionada.

[006]Em outro aspecto, a invenção inclui uma célula modificada que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio de ligação ao antígeno, uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio transmembranar e uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio intracelular de uma molécula estimulatória e/ou co-estimulatória, e em que a célula é um monócito, macrófago ou célula dendrítica que expressa o CAR e possui atividade efetora direcionada.

[007]Em ainda outro aspecto, a invenção inclui um método para modificar uma célula que compreende introduzir um receptor de antígeno quimérico (CAR) no monócito, macrófago ou célula dendrítica, em que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar e um domínio intracelular de uma molécula estimulatória e/ou coestimulatória, e em que a célula é um monócito, macrófago ou célula dendrítica que expressa o CAR e possui atividade efetora direcionada.

[008]Em ainda outro aspecto, a invenção inclui uma composição que compreende a célula modificada de acordo com o método descrito no presente documento.

[009]Em várias modalidades dos aspectos anteriores ou qualquer outro aspecto da invenção delineada no presente documento, o domínio de ligação ao antígeno do CAR compreende um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo sintético, anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo de domínio simples, fragmento variável de cadeia simples e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Em outra modalidade, o domínio de ligação ao antígeno do CAR é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD19, um anticorpo anti-HER2 e um fragmento dos mesmos. Em ainda outra modalidade, o domínio intracelular do CAR compreende domínios de sinalização duplos.

[010]Em outra modalidade, a atividade efetora direcionada é voltada contra um antígeno em uma célula alvo que se liga especificamente ao domínio de ligação ao antígeno do CAR. Em ainda outra modalidade, a atividade efetora direcionada é selecionada a partir do grupo que consiste em fagocitose, citotoxicidade celular direcionada, apresentação de antígeno e secreção de citocina.

[011]Em outra modalidade, a composição compreende, ainda, um agente selecionado a partir do grupo que consiste em um ácido nucleico, um antibiótico, um agente anti-inflamatório, um anticorpo ou fragmentos de anticorpo do mesmo, um fator de crescimento, uma citocina, uma enzima, uma proteína, um peptídeo, uma proteína de fusão, uma molécula sintética, uma molécula orgânica, um carboidrato, ou similares, um lipídeo, um hormônio, um microssomo, um derivado ou variação dos mesmos, e qualquer combinação dos mesmos.

[012]Em outra modalidade, a célula modificada tem pelo menos um marcador M1 suprarregulado (upregulated) e pelo menos um marcador M2 infrarregulado (downregulated). Em ainda outra modalidade, a célula modificada é geneticamente modificada para expressar o CAR. Em ainda outra modalidade, a atividade efetora direcionada é aprimorada pela inibição da atividade de CD47 ou SIRPa.

[013]Em outra modalidade, introduzir o CAR na célula compreende introduzir uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR, tal como eletroporar um mRNA que codifica o CAR ou transduzir a célula com um vetor viral que compreende a sequência de ácido nucleico que codifica o CAR.

[014]Em outra modalidade, a atividade efetora direcionada é voltada contra um antígeno em uma célula alvo que se liga especificamente ao domínio de ligação ao antígeno do CAR. Em outra modalidade, a atividade efetora direcionada é selecionada a partir do grupo que consiste em fagocitose, citotoxicidade celular direcionada, apresentação de antígeno e secreção de citocina.

[015]Em outra modalidade, o método descrito no presente documento compreende, ainda, inibir a atividade de CD47 ou SIRPα para aprimorar a atividade efetora direcionada, tal como colocando-se a célula em contato com um anticorpo anti-CD47 bloqueador ou um anticorpo anti-SIRPα bloqueador. Em ainda outra modalidade, o método compreende, ainda, modificar a célula para entregar um agente a um alvo, em que o agente é selecionado a partir do grupo que consiste em um ácido nucleico, um antibiótico, um agente anti-inflamatório, um anticorpo ou fragmentos de anticorpo do mesmo, um fator de crescimento, uma citocina, uma enzima, uma proteína, um peptídeo, uma proteína de fusão, uma molécula sintética, uma molécula orgânica, um carboidrato ou similares, um lipídeo, um hormônio, um microssomo, um derivado ou uma variação dos mesmos, e qualquer combinação dos mesmos.

[016]Em um aspecto, a invenção inclui uma composição farmacêutica que compreende a célula descrita no presente documento.

[017]Em outro aspecto, a invenção inclui um uso da célula modificada descrita no presente documento na fabricação de um medicamento destinado ao tratamento de uma resposta imune em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em ainda outro aspecto, a invenção inclui um uso da célula modificada descrita no presente documento na fabricação de um medicamento destinado ao tratamento de um tumor ou câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[018]Em ainda outro aspecto, a invenção inclui um método para tratar uma doença ou afecção associadas a um tumor ou câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende a célula modificada descrita no presente documento.

[019]Em ainda outro aspecto, a invenção inclui um método para tratar um tumor em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende a célula modificada descrita no presente documento.

[020]Em outro aspecto, a invenção inclui um método para estimular uma resposta imune a uma célula tumoral alvo ou tecido tumoral em um indivíduo que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende a célula modificada descrita no presente documento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[021]A descrição detalhada a seguir das modalidades preferenciais da invenção será mais bem entendida quando lida em conjunto com os desenhos anexos. Para o propósito de ilustrar a invenção, mostram-se nos desenhos modalidades que sejam presentemente preferenciais. No entanto, deve-se compreender que a invenção não se limita às disposições e instrumentalidades precisas das modalidades mostradas nos desenhos.

[022]A Figura 1A é uma série de imagens que mostra o diagrama conceitual de um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendido de um gene/produto de gene que compreende um domínio extracelular com função de direcionamento, um domínio de dobradiça, um domínio transmembranar, um domínio(s) de sinalização intracelular, e/ou um 2A (P2A, T2A) para coexpressão estequiométrica de um produto de gene adicional que pode não ser secretado, incluindo qualquer gene/transcrição/proteína, incluindo, porém sem limitação, uma citocina, anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, fragmento variável de cadeia simples, enzima, receptor adicional, receptor negativo dominante, antígeno(s) associado(s) a tumor, e qualquer combinação dos mesmos. Além disso, o construto de CAR pode incluir a coentrega de material de edição de gene CRISPR/Cas9, ou pode ser introduzido no contexto de uma célula pré-editada de CRISPR/Cas9.

[023]A Figura 1B é uma série de imagens que mostra exemplos específicos de construtos de CAR, incluindo CARMA-Z, CARMA-y, e CARMA-Dectina, que contêm um scFv específico de antígeno, dobradiça CD8, transmembrana CD8, e um CD3 Z, subunidade FcεRI c y, ou o domínio intracelular de Dectina-1, respectivamente.

[024]A Figura 2A é um gráfico que mostra CAR19z expresso sobre a superfície de células mieloides após a transdução lentiviral. O lentivírus CAR19z foi titulado em três diluidores e usado para transduzir 1e5/0,1ml de células mRFP + THP1. mRFP é um gene repórter (proteína vermelha fluorescente) que foi expresso por transdução lentiviral da linhagem celular mieloide THP1. Essas células podem ser induzidas para diferenciação de macrófagos mediante exposição a PMA químico. As células THP1 foram coletadas 24 horas após a transdução e coradas para expressão de superfície de CAR com proteína L biotinilada seguido de estreptavidina-APC.

[025]A Figura 2B é um gráfico que mostra células THP1 transduzidas expandids e classificadas por FACS para gerar uma sub-linha 100% CAR19z positiva mRFP + THP1.

[026]A Figura 2C demonstra a expressão de construtos CAR lentivirais anti- CD19, anti-HER2 e anti-mesotelina em macrófagos THP1, com eventos de CAR(+) no quadrante superior direito.

[027]A Figura 3A é um fluxograma que mostra a visão geral de geração de sub-linha CARMA usando um modelo de macrófago THP1, diferenciação com 1ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), e ensaio de fagocitose in vitro.

[028]A Figura 3B é um gráfico que mostra macrófagos CAR anti-CD19, porém não macrófagos tipo selvagem (Wt), células tumorais K562 submetidas à fagocitose que expressaram CD19, conforme demonstrado por ensaios de fagocitose baseados em microscópio fluorescente.

[029]A Figura 3C é um gráfico que mostra macrófagos CAR anti-HER2, porém não macrófagos tipo selvagem (Wt), células tumorais K562 submetidas à fagocitose que expressaram HER2, conforme demonstrado por ensaios de fagocitose baseados em microscópio fluorescente.

[030]A Figura 3D é um gráfico que mostra macrófagos CAR anti-mesotelina, porém não macrófagos tipo selvagem (Wt), células tumorais K562 submetidas à fagocitose que expressaram mesotelina, conforme demonstrado por ensaios de fagocitose baseados em microscópio fluorescente.

[031]A Figura 3E é um gráfico de FACS representativa que mostra que a fagocitose tumoral de CARMA foi validada por um ensaio baseado em citometria de fluxo, em que mRFP+ CARMA contra CD19 foram co-culturados com células CD19+ GFP+ K562 e eventos positivos duplos foram quantificados.

[032]A Figura 3F é uma imagem que mostra mRFP em um campo de visão padrão 10x usado na tabulação de função de fagocitose de CARMA.

[033]A Figura 3G é uma imagem que mostra uma sobreposição em um campo de visão padrão 10x usado na tabulação de função de fagocitose de CARMA.

[034]A Figura 3H é uma série de imagens que mostra que eventos positivos duplos de mRFP/GFP baseados em FACS foram definidos como eventos fagocíticos, e foram validados como por análise FACS Amnis Imagestream. Os eventos mostrados são selecionados em eventos positivos duplos e ordenados a partir de alto a baixo pelo algoritmo de fagocitose-erode Amnis Imagestream.

[035]A Figura 3I é uma série de imagens que mostra que a fagocitose de células tumorais por mRFP+ CARMA no modelo de linhagem celular THP-1 foi adicionalmente demonstrada por microscopia confocal, verificando que as células tumorais GFP+ foram completamente encerradas no interior de fagossomas através de reconstruções de pilhas z confocais tridimensionais.

[036]A Figura 3J é uma série de imagens que mostra que a fagocitose de células tumorais por mRFP+ CARMA no modelo de linhagem celular THP-1 foi adicionalmente demonstrada por microscopia confocal, verificando que as células tumorais GFP+ foram completamente encerradas no interior de fagossomas através de reconstruções de pilhas z confocais tridimensionais.

[037]A Figura 3K é uma série de imagens que demonstra o destino de uma única célula CARMA ao longo do tempo- com contato e a formação de sinapse imunológica sendo a primeira etapa, levando ao engolfamento fagocítico, degradação do tumor usando a perda de GFP como um marcador de morte celular, divisão de fagossoma e reparo de fagossoma - demonstrando que CARMA sobrevive após a fagocitose de células tumorais.

[038]A Figura 4A é um gráfico que mostra macrófagos CAR anti-CD19 testados usando um ensaio de fagocitose in vitro contra células tumorais CD19+ (alvo) ou CD19- (controle) GFP+ K562. Demonstrando a especificidade do antígeno de CARMA, apenas as células tumorais portadoras de antígenos foram fagocitadas. Para demonstrar o requisito do domínio da sinalização intracelular na função CARMA, construtos CAR19-ΔZ (que são desprovidos de um domínio de sinalização intracelular) foram usados.

[039]A Figura 4B é um gráfico que mostra que os macrófagos CAR19-ΔZ não conseguiram realizar a fagocitose de células tumorais.

[040]A Figura 4C é um gráfico que mostra que os macrófagos CAR19-ΔZ reduziram significativamente a função antitumoral através de um ensaio de lise específico baseado em luciferase in vitro.

[041]A Figura 4D é um gráfico que mostra o ensaio de fagocitose de CARMA in vitro realizado na presença de R406 (inibidor Syk). R406 revogou independentemente a função fagocítica de CARMA, indicando que a sinalização de CAR em macrófagos é dependente de Syk e resulta em polimerização de actina e na função fagocítica mediada por NMIIA.

[042]A Figura 4E é um gráfico que mostra o ensaio de fagocitose de CARMA in vitro realizado na presença de citocasalina D (inibidor de polimerização de actina). A citocasalina D revogou independentemente a função fagocítica de CARMA, indicando que a sinalização de CAR em macrófagos é dependente de Syk e resulta em polimerização de actina e na função fagocítica mediada por NMIIA.

[043]A Figura 4F é um gráfico que mostra o ensaio de fagocitose de CARMA in vitro realizado na presença de blebistatina (inibidor de miosina IIA não muscular). A blebistatina revogou independentemente a função fagocítica de CARMA, indicando que a sinalização de CAR em macrófagos é dependente de Syk e resulta em polimerização de actina e na função fagocítica mediada por NMIIA.

[044]A Figura 5A é um gráfico de citometria de fluxo que mostra a expressão de CD47 em linhagens de células alvo tumorais em relação ao controle de isótipo. K562 e K562-CD19+ (K19) foram usadas nesses experimentos, ambas as quais são linhagens celulares que expressam altamente CD47.

[045]A Figura 5B é um gráfico que mostra que a adição de anticorpo monoclonal anti-CD47 aumentou seletivamente a fagocitose mediada por macrófagos CAR, porém não por Wt de células tumorais portadoras de antígeno. Os macrófagos Wt ou CAR19Z foram incubados com células tumorais CD19+ K562 com 0, 0,01, 0,10, 1,00, ou 10,0 mcg/ml de anticorpo monoclonal anti-CD47.

[046]A Figura 5C é um gráfico que mostra que a adição de anticorpo monoclonal anti-SIRPα aumentou seletivamente a fagocitose mediada por macrófagos CAR, porém não por Wt de células tumorais portadoras de antígeno. Os macrófagos Wt ou CAR19Z foram incubados com células tumorais CD19+ K562 com 0, 0,01, 0,10, 1,00, ou 10,0 mcg/ml de anticorpo monoclonal anti-SIRPα.

[047]A Figura 5D é um gráfico que demonstra que o bloqueio do eixo geométrico de CD47/SIRPα com anticorpos monoclonais anti-SIRPα aumentou a polifagocitose (definida como um macrófago que engolfou 2 ou mais células tumorais de uma vez) por macrófagos CAR.

[048]A Figura 5E é um gráfico que mostra um ensaio de fagocitose in vitro. Para controlar a opsonização adicionada pelos anticorpos monoclonais de bloqueio de CD47/SIRPα, um anticorpo monoclonal anti-CD47 de controle (clone 2D3), que se liga a CD47, porém não bloqueia o CD47 para o sítio de ligação SIRPα, foi usado em um ensaio de fagocitose in vitro . Apenas o clone que bloqueou o sítio de ligação (anti-CD47, clone B6H12) ou o bloqueio do receptor SIRPα resultou diretamente no aumento de fagocitose de tumor CARMA.

[049]A Figura 5F é um gráfico que mostra uma fagocitose in vitro contra células tumorais negativas para antígeno (CD19 negativo). Para testar se o bloqueio do eixo geométrico de CD47/SIRPα em macrófagos CAR resulta na perda da especificidade de antígeno, uma fagocitose in vitro contra células tumorais negativas para o antígeno (CD19 negativo) foi conduzida na presença de anticorpo monoclonal anti-CD47 ou anti-SIRPα, e não houve fagocitose observável.

[050]A Figura 5G é um gráfico que mostra a especificidade de aumento fagocítico de CARMA na presença de anticorpo monoclonal de bloqueio de SIRPα testada por knockout do receptor SIRPα em macrófagos THP1, e comparação de fagocitose tumoral por CARMA ou CARMA SIRPα-KO na ausência ou presença de anticorpo anti-SIRPα. CRISPR/Cas9 foi usado para a deleção de SIRPα, e as células foram classificadas quanto à negatividade de SIRPα antes de ensaios funcionais. A eliminação da função CARMA aprimorada de SIRPα e a adição de anti- SIRPα de volta às células knockout não conseguiram aumentar ainda mais a fagocitose.

[051]A Figura 6A é um gráfico que mostra a lise específica de células CD19+ GFP+ Luciferase+ K562 por CARMA CAR19Z, porém não macrófagos Wt (usando o modelo de macrófago THP-1) em um ensaio de ensaio baseado em luciferase in vitro em 48 horas de maneira dose-dependente.

[052]A Figura 6B é um gráfico que demonstra a lise específica de células tumorais por monócitos THP-1 de CAR19Z ou Wt (indiferenciado, dessa forma, um modelo de monócitos em vez de macrófagos) em um ensaio de extermínio baseado em luciferase in vitro em 48 horas de maneira dose-dependente.

[053]A Figura 6C é um painel de imagens que mostra a bioluminescência conduzida por luciferase, derivada de células tumorais CD19 + K562 positivas para luciferase, após co-cultura de 48 horas com macrófagos Wt ou CAR19Z in vitro, na ausência ou presença de 10 ug/ml de anticorpo monoclonal anti-SIRPα.

[054]A Figura 6D é um gráfico que demonstra a lise específica de macrófagos Wt ou CAR19Z +/- anticorpo monoclonal anti-SIRPα.

[055]A Figura 7A é uma série de gráficos que mostra que os construtos de CAR com um domínio intracelular de subunidade comum de FcεRI y (CAR19y, CARMA19y) foram gerados, embalados em lentivírus, e usados para transduzir células mieloides THP-1 em uma diluição viral serial tripla. CAR19y foi expresso em macrófagos THP-1.

[056]A Figura 7B é um gráfico que mostra macrófagos CAR19y ou CAR19Z classificados para 100% de positividade de CAR e usados para caracterização funcional in vitro. Os macrófagos CAR19Z e CAR19y realizaram a fagocitose de células tumorais CD19+, e ambos exibiram sinergia com bloqueio do eixo geométrico de CD47/SIRPα pela adição de anticorpo monoclonal anti-SIRPα

[057]A Figura 7C é um gráfico que mostra uma inibição de R406 Syk ensaio de fagocitose in vitro que demonstra que os macrófagos CAR19Z e CAR19y realizam a sinalização através de Syk para conduzir a fagocitose tumoral.

[058]A Figura 7D é um gráfico que mostra que tanto os macrófagos CAR19Z como CAR19y THP1, porém não macrófagos THP1 Wt, exterminaram eficientemente as células tumorais CD19+ em um ensaio de lise específica baseado em luciferase in vitro após 24 horas de co-cultura em várias razões E:T.

[059]A Figura 8A é um gráfico que mostra que os macrófagos responderam a sinais moleculares conservados de infecção, como padrões moleculares associados a patógenos, através de receptores de reconhecimento de patógenos constitutivamente expressos.

[060]A Figura 8B é um gráfico que mostra um ensaio de fagocitose in vitro conduzido usando macrófagos CAR que foram iniciados com os ligantes de TLR1-9, independentemente, ou controle de meio para melhorar a função fagocítica de tumor de CARMA. Os ligantes de TLR1, 2, 4, 5 e 6 melhoraram a função fagocítica de CARMA.

[061]A Figura 8C é um gráfico que mostra a diferença entre ligantes TLR que aumentou ou não aumentou a fagocitose de CARMA de células tumorais em uma faixa de concentrações de ligante TLR3 ou TLR6.

[062]A Figura 9A é um gráfico que mostra β-glucano, um produto de levedura, ligado à Dectina-1 sobre a superfície de macrófagos e resultou na ativação e função efetora. Para testar a capacidade de β-glucano para aumentar a função de CARMA, ensaios de fagocitose tumoral in vitro foram conduzidos na ausência ou presença de 5mcg/ml de β-glucano. O β-glucano aumentou a capacidade fagocítica de macrófagos CAR, porém não de Wt.

[063]A Figura 9B é uma série de gráficos que mostra ensaios de lise específicos baseados em luciferase in vitro conduzidos em várias razões de efetor (E): alvo (T) na presença de 0, 0,5, 5 de 50 μg/ml de β-glucano para testar a capacidade de β-glucano para aumentar o extermínio de tumores de CARMA. O β- glucano aumentou a lise específica de células tumorais portadoras de antígeno por macrófagos CAR, porém não THP-1 Wt.

[064]A Figura 10A é uma série de imagens que mostra que construtos de CAR compreendidos de um domínio de sinalização intracelular de Dectina-1 foram gerados. Esses construtos foram embalados em lentivírus e usados para transduzir células mieloides THP-1 em uma diluição em série tripla de títulos lentivirais.

[065]A Figura 10B é um gráfico que mostra que CAR foi detectado sobre a superfície de macrófago que expressa construtos de CAR de CD8TM-Dectina1.

[066]A Figura 10C é um gráfico que mostra que CAR foi detectado sobre a superfície de macrófago que expressa construtos de CAR de DectinaTM-Dectina1.

[067]A Figura 10D é um gráfico que mostra macrófagos CAR de CD8TM- Dectina1 e CAR de DectinaTM-Dectina1 testados em um ensaio de extermínio baseado em luciferase in vitro. Ambos os construtos demonstraram lise específica de células tumorais.

[068]A Figura 10E é um gráfico que mostra macrófagos de Dectina1-CAR testados em um ensaio de fagocitose tumoral in vitro contra células tumorais K562 (controle) ou K19 (alvo). Os macrófagos de Dectina1-CAR realizaram seletivamente a fagocitose de células tumorais portadoras de antígenos cognatos.

[069]A Figura 10F é uma série de imagens que mostra que os macrófagos CAR de Dectina-1 demonstraram a capacidade de fagocitose de múltiplas células tumorais.

[070]A Figura 10G é um gráfico que mostra um ensaio de fagocitose tumoral in vitro. Os macrófagos Dectina1-CAR demonstraram sinergia com o bloqueio de SIRPα, ou com a iniciação com um ligante TLR.

[071]A Figura 11A é uma série de gráficos que mostra os níveis de calreticulina em três linhagens de célula alvo CD19+ diferentes em relação ao controle de isótipo.

[072]A Figura 11B é um gráfico que mostra a intensidade fluorescente média normalizada de expressão de calreticulina em três linhagens de células alvo CD19+ diferentes.

[073]A Figura 11C é um gráfico que mostra que baixos níveis de calreticulina protegeram moderadamente as células alvo, especificamente as linhagens celulares Nalm6 e JEKO, contra a fagocitose de macrófago CAR19z. Esses dados sugerem que a exploração de deposição/indução de calreticulina pode ser usada como uma tática adicional para aumentar a função efetora de CARMA.

[074]A Figura 12A é uma série de gráficos que mostra construtos de CAR anti-HER2 clonados em plasmídeos de expressão de mRNA, transcritos in vitro, e o mRNA diretamente eletroporado em monócitos humanos primários.

[075]A Figura 12B é uma série de gráficos que mostra a eficiência de eletroporação de mRNA de CAR anti-HER2 em macrófagos derivados de monócitos humanos primários (completamente dferenciados) em 79,7%.

[076]A Figura 12C é um gráfico que mostra que, embora a eletroporação de mRNA resulte em uma alta eficiência de transfecção de CAR tanto de monócitos como macrófagos, a expressão de CAR era temporária devido à degradação de mRNA, atingindo o pico no dia 2 e desaparecendo no dia 7 após a eletroporação in vitro.

[077]A Figura 13A é um gráfico que mostra camundongos NSGS injetados com células de câncer de ovário humanas 1E6 SKOV3 CBG/GFP + através de injeção de IP, um modelo de carcinomatose intraperitoneal metastática de câncer de ovário HER2 +. Os camundongos foram coinjetados com macrófagos humanos primários eletroporados simulados ou eletroporados por mRNA de CAR anti-HER2 (razão E:T 1:1) e a carga tumoral foi representada em imagens. Os macrófagos CAR demonstraram redução marginal em crescimento tumoral ao longo de aproximadamente duas semanas. O primeiro ponto de tempo em que a carga tumoral foi quantificada de forma bioluminescente foi 24 horas após o tratamento, demonstrando que monócitos e macrófagos CAR tiveram atividade nas primeiras 24 horas.

[078]A Figura 13B é um gráfico que mostra camundongos NSGS injetados com células de câncer de ovário humanas 1E6 SKOV3 CBG/GFP + através de injeção de IP, um modelo de carcinomatose intraperitoneal metastática de câncer de ovário HER2 +. Os camundongos foram coinjetados com monócitos humanos primários eletroporados simulados ou eletroporados por mRNA de CAR anti-HER2 (razão E:T 1:1) e a carga tumoral foi representada em imagens. Os monócitos CAR demonstraram redução marginal em crescimento tumoral ao longo de aproximadamente duas semanas. O primeiro ponto de tempo em que a carga tumoral foi quantificada de forma bioluminescente foi 24 horas após o tratamento, demonstrando que monócitos e macrófagos CAR tiveram atividade nas primeiras 24 horas.

[079]A Figura 14A é uma série de gráficos que mostra que a entrega lentiviral de transgenes CAR a macrófagos derivados de monócito humanos primários foi testada usando múltiplos construtos CAR. O CAR19 foi distribuído a macrófagos humanos através de transdução lentiviral, demonstrando uma eficiência de transdução de 4,27% e 38,9% no grupo controle vs. Grupos lentivirais CAR19 (MOI 10), respectivamente.

[080]A Figura 14B é uma série de gráficos FACS representativos que mostram a expressão de CAR anti-HER2 em macrófagos humanos primários, com uma eficiência de transdução de 1,47 e 18,1% entre o controle e condições de MOI 10 CAR LV, respectivamente.

[081]A Figura 15A é uma série de gráficos que mostra que a eficiência de transdução atingir seu pico no ponto médio de transdução (dia 4), para anti-CD19. Os macrófagos derivados de monócitos foram gerados por diferenciação de células CD14+ selecionadas (a partir de produtos de aférese de doadores normais em meios condicionados GM-CSF durante 7 dias. Para otimizar a entrega de CAR através de transdução lentiviral, o lentivírus anti-CD19 foi usado para transduzir macrófagos em diferentes pontos do processo de diferenciação de monócito para macrófago.

[082]A Figura 15B é uma série de gráficos que mostra que a eficiência de transdução atingir seu pico no ponto médio de transdução (dia 4), para anti-HER2. Os macrófagos derivados de monócitos foram gerados por diferenciação de células CD14+ selecionadas (a partir de produtos de aférese de doadores normais em meios condicionados GM-CSF durante 7 dias. Para otimizar a entrega de CAR através de transdução lentiviral, o lentivírus anti-HER2 foi usado para transduzir macrófagos em diferentes pontos do processo de diferenciação de monócito para macrófago.

[083]A Figura 15C é uma série de gráficos que mostra que a eficácia da fagocitose evoluiu com a eficiência de transdução de CAR, atingindo seu pico com macrófagos transduzidos no dia 4 durante o processo de diferenciação.

[084]A Figura 16A é uma série de gráficos que mostra que abordagens de transdução alternativas para a entrega de transgenes para macrófagos humanos primários foram testadas, uma vez que a eletroporação de mRNA era transitória e o lentivírus era apenas moderadamente eficiente e exigia alto título. O adenovírus (recombinante, deficiente em replicação) foi identificado como uma abordagem eficiente para a transdução de macrófago humano primário. A expressão de Receptor de Adenovírus Coxackie (a proteína de ancoragem para Ad5) e CD46 (a proteína de ancoragem para Ad35) foi testada em relação ao controle do isótipo em macrófagos humanos primários, e CD46, porém não o receptor de Adenovirus Coxackie, foi altamente expresso. Dessa forma, o adenovírus quimérico Ad5f35 foi utilizado para a transdução de macrófagos humanos primários e foi elaborado através de técnicas padrão de biologia molecular para expressar um receptor de antígeno quimérico (GFP e vírus vazios Ad5f35 foram usados como controles) contra HER2.

[085]A Figura 16B é um gráfico que mostra que, em um MOI de 1000, Ad5f35 distribuiu efetivamente um transgene (GFP foi usado como um modelo de transgene) em macrófagos humanos, e a expressão aumentou ao longo do tempo, conforme monitorado pela quantificação de sinal GFP em um Espectro IVIS.

[086]A Figura 16C é um gráfico que mostra a comparação entre a cinética de transdução de macrófagos humanos primários em pontos de tempo diferentes em uma ampla gama de MOIs - até 10.000.

[087]A Figura 16D é uma série de gráficos representativos de FACS de expressão de CAR anti-HER2 em macrófagos humanos transduzidos Ad5f35 48 horas após a transdução, em uma ampla gama de MOIs virais.

[088]A Figura 16E é uma série de imagens de microscópio fluorescente de macrófagos humanos primários transduzidos Ad5f35-GFP, com a eficiência de transdução mais alta demonstrada em um MOI de 1000.

[089]A Figura 17A é uma série de gráficos que mostra CARMA humano primário testado em um ensaio de fagocitose in vitro através de análise de FACS. Os macrófagos (CAR não transduzido ou anti-HER2) foram corados com DiI antes da co-cultura com células de câncer de ovário GFP+ SKOV3. Fagocitose, definida por eventos positivos duplos DiI/GFP, foi medida em um nível de 26,6% no grupo CAR e 4,55% no grupo de controle.

[090]A Figura 17B é uma série de imagens que demonstra visualmente que esses eventos positivos duplos representam fagocitose. Para validar que os dois eventos positivos duplos de DiI/GFP eram eventos fagocíticos e não dupletos, a citocalasina D (um inibidor de fagocitose) foi adicionada a um ramo do experimento e anulou completamente a fagocitose mediada por CAR até 1,74%. Para validar adicionalmente que os macrófagos CAR humanos primários poderiam fagocitar as células tumorais, eventos positivos duplos foram fechados por FACS Amnis Imagestream e ordenados de alto a baixo pelo algoritmo de fagocitose-erode Amnis.

[091]A Figura 17C é uma série de imagens que mostra imagens de microscópio confocal de macrófagos CAR-HER2 corados com DiI co-culturados com SKOV3-GFP.

[092]A Figura 18 é um gráfico que mostra células de câncer de mama fagocitadas por macrófagos humanos CAR, porém não UTD. Macrófagos humanos primários CAR Anti-HER2 gerados usando transdução de Ad5f35-CAR de macrófagos derivados de monócitos. Essas células (ou células não transduzidas de controle) foram usadas como efetores em um ensaio de fagocitose baseado em FACS in vitro de células de câncer de mama humanas SKBR3. Além disso, a adição de anticorpo monoclonal anti-SIRPα aumentou a fagocitose de macrófago CARMA, porém não UTD de células de câncer de mama. Esses resultados demonstram que a sinergia entre o bloqueio do eixo geométrico de CD47/SIRPα observado com CARMA no modelo THP-1 é traduzida para estudos de macrófagos humanos primários.

[093]A Figura 19 é uma série de gráficos de FACS representativos que mostram que CARMA exibe fagocitose intacta de partículas de E.Coli pH-Rodo Green. Para demonstrar que macrófagos CAR ainda eram células imunes funcionais inatas no sentido antimicrobiano e não perderam a capacidade de responder a estímulos infecciosos, macrófagos controle não transduzidos ou CAR foram empregados em um ensaio de fagocitose de E.Coli baseado em FACS.

[094]A Figura 20A é um gráfico que mostra CARMA anti-HER2 humano primário testado como células efetoras em ensaios de extermínio baseados em luciferase in vitro. Os macrófagos CARMA Anti-HER2, porém não UTD de controle, resultaram na lise específica de células HER2+ K562, porém não de células de controle K562, desprovidas de expressão de HER2, após 48 horas de co-cultura.

[095]A Figura 20B é um gráfico que mostra um ensaio de extermínio baseado em luciferase in vitro usando células de câncer de mama SKBR3 como alvos. Macrófagos CARMA, porém não UTD de controle ou Ad5f35 Vazio de controle transduzidos, tinham atividade antitumoral significativa contra ambos os modelos após 48 horas de co-cultura.

[096]A Figura 20C é um gráfico que mostra um ensaio de extermínio baseado em luciferase in vitro usando células de câncer de ovário SKOV3 como alvos. Macrófagos CARMA, porém não UTD de controle ou Ad5f35 Vazio de controle transduzidos, tinham atividade antitumoral significativa contra ambos os modelos após 48 horas de co-cultura.

[097]A Figura 20D é um gráfico que mostra a sinergia entre o bloqueio do eixo CD47/SIRPα em um ensaio de extermínio. As células de câncer de ovário SKOV3 foram co-culturadas com meios, macrófagos não transduzidos de controle, CARMA anti-HER2, CARMA anti-HER2 + mAB antiCD47 (10mcg/ml) ou CARMA anti-HER2 + anti-SIRPα (10mcg/ml) e o sinal de luciferase foi medido em série. CARMA resultou na erradicação de tumor total no dia 13, enquanto a cinética da erradicação do tumor foi ainda mais rápida na presença de bloqueio do eixo CD47/SIRPα.

[098]A Figura 20E é um gráfico que mostra a sinergia com o β-glucano, que foi demonstrada em um modelo de CARMA de macrófago THP-1, e a iniciação de β- glucano do CARMA resultou em cinética de extermínio de tumores melhorada.

[099]A Figura 20F é um gráfico que mostra que a exposição de CARMA a LPS (um ligante de TLR-4) ou Poli-IC (um ligante de TLR-3) resultou em modulação do efeito antitumoral.

[0100]A Figura 21 é uma série de imagens que mostra a capacidade de CARMA humano primário eliminar tumores em um ensaio de luciferase in vitro. As células de câncer de ovário GFP + SKOV3 foram co-culturadas com macrófagos UTD de controle, macrófagos UTD de controle mais 10 μc/ml de trastuzumabe, macrófagos transduzidos por vírus Ad5f35 vazio de controle, ou CARMA anti-HER2 humano primário. As condições de CARMA, porém não de controle, foram capazes de eliminar as células tumorais.

[0101]A Figura 22A é um painel de gráficos que mostra que uma supraregulação dose-dependente de marcadores M1 CD80/CD86 e uma infraregulação dose-dependente de marcador CD23 M2, foram medidas por FACS. Macrófagos são células fenotipicamente plásticas capazes de adotar diversas características funcionais, comumente separadas nas classificações de macrófago M1 e M2 - sendo M1 inflamatório/ativado e M2 sendo imunossupressor/promotor de tumor. Os marcadores M1 e M2 foram medidos 48 horas após a transdução de macrófagos humanos primários com vírus CAR Ad5f35.

[0102]A Figura 22B é uma série de gráficos que mostra se o efeito sobre os marcadores M1 e M2 era um resultado de expressão de CAR ou transdução de Ad5f35. Os macrófagos foram transduzidos com nada, Ad5f35 vazio ou Ad5f35 anti- HER2, e Ad5f35 Vazio/CAR mostrou o mesmo padrão de mudança de fenótipo.

[0103]A Figura 22C e um gráfico que mostra que o CARMA exposto a citocinas supressoras manteve sua atividade de extermínio em um ensaio de lise específica in vitro baseado em luciferase em 48 horas. Os macrófagos UTD de controle foram condicionados com citocinas supressoras demonstrando crescimento de tumor aumentado.

[0104]A Figura 22D é um painel de gráficos que mostra a resistência à imunossupressão de macrófagos CAR humanos, UTD de controle, Ad5f35 Vazio ou macrófagos transduzidos por CAR Ad5f35 anti-HER2 expostos a 10 ng/ml de IL-4, uma citocina de indução M2 canônica ou células cancerígenas que anteriormente foram mostradas para subverter macrófagos para M2 durante a co-cultura (SKOV3, linhagem de células de câncer de ovário, HDLM2, linhagem de células de linfoma de Hodgkin). Os macrófagos UTD de controle suprarregulam (upregulation) CD206, um marcador M2 que responde especificamente ao estímulo de IL-4 através da fosforilação de STAT6. Ad5f35 vazio, e mais macrófagos transduzidos por CAR- Ad5f35, exibiram resistência à IL-4 e subversão induzida por tumor ao fenótipo M2.

[0105]A Figura 22E é um gráfico que mostra o fenótipo metabólico de macrófagos UTD de controle ou CAR anti-HER2 expostos à IL-4 durante 24 horas para polarizar para M2 (ou não) e a taxa de consumo de oxigênio.

[0106]A Figura 22F é um gráfico que mostra que os ensaios fenotípicos, metabólicos e funcionais indicam que o CARMA é resistente à subversão de M2.

[0107]A Figura 23A é um painel de gráficos que mostra monócitos doadores normais humanos primários (purificados através de seleção positiva de CD14) transduzidos com Ad5f35-CAR-HER2 em MOI’s variando de 0 (UTD) a 1000. A expressão de CAR foi medida através de FACS 48 horas após a transdução. Os monócitos CAR foram eficientemente gerados com Ad5f35, com a expressão atingindo seu pico em um MOI de 1000.

[0108]A Figura 23B é um gráfico que mostra a eficiência de transdução de monócitos primários.

[0109]A Figura 23C é um gráfico que mostra que os monócitos mantiveram alta viabilidade (medida pela análise FACS Live/Dead Aqua) em MOIs de até 1000.

[0110]A Figura 23D é uma série de gráficos que mostra marcadores de ativação de M1 suprarregulados (upregulated) por monócitos humanos CAR, porém não-transduzidos (UTD).

[0111]A Figura 23E é uma série de gráficos que mostra marcadores de monócitos humanos CAR, porém não-transduzidos (UTD) infrarregulados (downregulated).

[0112]A Figura 24A é um gráfico que mostra o extermínio de células HER2 + SKBR3 (câncer de mama humano) por monócito CAR anti-HER2 avaliado através de um ensaio de extermínio in vitro baseado em luciferase.

[0113]A Figura 24B é um gráfico que mostra o extermínio de células HER2 + SKOV3 (câncer de ovário humano) por monócito CAR anti-HER2 avaliado através de um ensaio de extermínio in vitro baseado em luciferase.

[0114]A Figura 25A é um diagrama esquemático dos camundongos NOD- scid IL2Rg-null-IL3/GM/SF, NSG-SGM3 (NSGS) usados para modelar xenoenxertos de câncer de ovário humano HER2 (+) in vivo. No dia 0, os camundongos foram injetados intraperitonealmente (IP) com células de câncer de ovário SKOV3 positivas para luciferase de cleópteros 7.5E5 (CBG luc)/ positivas para proteína verde fluorescente (GFP) como um modelo de carcinomatose intraperitoneal, um modelo metastático inerentemente agressivo de malignidade sólida. Os camundongos não foram tratados (tumor individualmente), ou injetados com uma dose única de macrófagos humanos 4-E6 não transduzidos (UTD) ou CAR-HER2 (CARMA) no dia 0 através de injeção IP.

[0115]A Figura 25B é um gráfico que mostra os camundongos representados em imagens em série usando bioluminescência (fluxo total, fótons/segundo) como um substituto de carga tumoral.

[0116]A Figura 25C é um gráfico que mostra a porcentagem de sobrevivência de camundongos que receberam o tratamento com CARMA. Os camundongos tratados com CARMA tiveram uma redução da carga tumoral de aproximadamente duas ordens de grandeza.

[0117]A Figura 25D é um painel de imagens que mostra que os camundongos tratados com CARMA tiveram um benefício de sobrevivência de 30 dias (p = 0,018) em relação aos camundongos não tratados ou tratados com macrófago UTD.

[0118]A Figura 25E é um painel de gráficos que mostra tumores coletados de camundongos que morreram no dia 36 e avaliados quanto à presença de macrófagos humanos transferidos de forma adotiva através da expressão de CD45 humano na análise FACS.

[0119]A Figura 26A é um gráfico que mostra a expressão de CAR de superfície verificada por análise FACS 48 horas após a transdução de macrófagos humanos não transduzidos (UTD) ou transduzidos com vírions V5f35 vazios desprovidos de um transgene (Vazio) ou Ad5f35-CAR-HER2-Z (CARMA) em multiplicidades de infecção de 1000.

[0120]A Figura 26B é um painel de gráficos que mostra marcadores de superfície avaliados para demonstrar a polarização do macrófago M1 em células transduzidas por V5f35 vazio ou CAR-HER2-Z Ad5f35. Os marcadores M1 (HLA DR, CD86, CD80, PDL1) foram suprarregulados (upregulated) enquanto os marcadores M2 (CD206, CD163) foram infrarregulados (downregulated).

[0121]A Figura 26C é um diagrama esquemático dos camundongos NSGS usados em um modelo IP de câncer de ovário metastático HER2 + e estratificado em quatro grupos de tratamento (n = 5 por grupo). Os camundongos não foram tratados ou receberam injeções IP de macrófagos não transduzidos por 1-E7, transduzidos por Ad5f35 vazio ou macrófagos transduzidos por CAR-HER2-Z no dia 0.

[0122]A Figura 26D é um painel de imagens que mostra a carga tumoral monitorada através de imageamento bioluminescente serial, com dados representativos mostrados no dia 27 após o engolfamento tumoral.

[0123]A Figura 26E é um gráfico que mostra a carga tumoral monitorada através de imageamento bioluminescente serial, com dados representativos mostrados no dia 27 após o engolfamento tumoral.

[0124]A Figura 27A é um diagrama esquemático dos camundongos NSGS usados em um modelo IP de câncer de ovário metastático HER2 + e estratificado em quatro grupos de tratamento (n = 5 por grupo), incluindo sem tratamento, e macrófagos humanos 3E6, 1E7, ou 2E7 CAR-HER2—Z, administrados IP no dia 0.

[0125]A Figura 27B é um gráfico que mostra a carga tumoral monitorada através de imageamento bioluminescente serial. Uma resposta dose-dependente ao número de macrófagos foi observada nesse modelo.

[0126]A Figura 27C é um gráfico que mostra que as doses únicas de macrófagos CAR-HER2 em macrófagos 3E6, 1E7, ou 2E7 por camundongo resultaram na erradicação de tumor dose-dependente (em relação aos camundongos não tratados) no dia 36 após o engolfamento.

[0127]A Figura 28 é uma ilustração da abordagem terapêutica proposta para CARMA. Em suma, os monócitos de pacientes poderiam ser selecionados a partir do sangue periférico, diferenciados ex vivo e transduzidos para expressar um CAR, coestimulado (ou não) com compostos sinérgicos e injetados novamente no paciente por via intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, através de procedimento radiológico intervencionista, ou por outra via. Salienta-se que o processo diferenciado poderia ser ignorado e os monócitos podem ser transduzidos e infundidos novamente no paciente. A fonte de monócitos também pode ser um doador compatível com HLA.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0128]Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um indivíduo com conhecimento comum na técnica à qual a invenção pertence. Muito embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática para testar a presente invenção, os materiais e métodos preferenciais são descritos no presente documento. Ao descrever e reivindicar a presente invenção, a terminologia a seguir será usada.

[0129]Deve-se compreender, também, que a terminologia usada no presente documento serve para o propósito de descrever modalidades particulares somente, e não é destinada a ser limitante.

[0130]Os artigos “um” e “uma” são usados no presente documentos para se referir a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramático do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.

[0131]“Cerca de” conforme o uso em questão quando refere-se a um valor mensurável como uma quantidade, uma duração temporal, e similares, destina-se a abranger variações de ±20% ou ±10%, com mais preferência, ±5%, com mais preferência ainda, ±1%, e com mais preferência ainda, ±0,1% a partir do valor especificado, visto que tais variações são adequadas para realizar os métodos revelados.

[0132]“Ativação,” conforme o uso em questão, refere-se ao estado de um monócito/macrófago que foi suficientemente estimulado para induzir a proliferação celular detectável ou foi estimulado para exercer sua função efetora. A ativação também pode estar associada à produção de citocina induzida, fagocitose, sinalização celular, extermínio de célula alvo, ou processamento e apresentação de antígenos. O termo “monócitos/macrófagos ativados” refere-se a, entre outros, monócitos/macrófagos que estão sendo submetidos à divisão celular ou exercendo a função efetora.

[0133]O termo “agente” ou “agente biológico” ou “agente terapêutico” conforme o uso em questão, refere-se a uma molécula que pode ser expressa, liberada, secretada ou entregue a um alvo pela célula modificada descrita no presente documento. O agente inclui, porém sem limitação, um ácido nucleico, um antibiótico, um agente anti-inflamatório, um anticorpo ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, um fator de crescimento, uma citocina, uma enzima, uma proteína, um peptídeo, uma proteína de fusão, uma molécula sintética, uma molécula orgânica (por exemplo, uma molécula pequena), um carboidrato ou similares, um lipídeo, um hormônio, um microssomo, um derivado ou uma variação dos mesmos, e qualquer combinação dos mesmos. O agente pode se ligar a qualquer porção celular, como um receptor, um determinante antigênico, ou outro sítio de ligação presente em um alvo ou célula alvo. O agente pode se difundir ou ser transportado para dentro da célula, onde o mesmo pode atuar de maneira intracelular.

[0134]O termo “anticorpo,” conforme o uso em questão, refere-se a uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas intactas distribuídas a partir de fontes naturais ou de fontes recombinantes e podem ser porções imunorreativas de imunoglobulinas intactas. Os anticorpos são tipicamente tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina. Os anticorpos na presente invenção podem se apresentar em uma variedade de formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, Fv, Fab e F(ab)2, bem como anticorpos de cadeia única (scFv) e anticorpos humanizados (Harlow et al., 1999, Em: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Em: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 a 5883; Bird et al., 1988, Science 242:423 a 426).

[0135]O termo “fragmento de anticorpo” refere-se a uma porção de um anticorpo intacto e refere-se às regiões variáveis determinantes antigênicas de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, porém sem limitação, fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv, anticorpos lineares, anticorpos scFv, e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[0136]Uma “cadeia pesada de anticorpo”, conforme o uso em questão, refere-se ao maior dos dois tipos de cadeias de polipeptídeos presentes em todas as moléculas de anticorpo em suas conformações de ocorrência natural.

[0137]Uma “cadeia leve de anticorpo”, conforme o uso em questão, refere-se ao menor dos dois tipos de cadeias de polipeptídeos presentes em todas as moléculas de anticorpo em suas conformações de ocorrência natural. As cadeias leves α e β referem-se aos dois principais isótipos de cadeia leve de anticorpo.

[0138]Pelo termo “anticorpo sintético” conforme o uso em questão, entende- se um anticorpo que é gerado usando tecnologia de DNA recombinante, como, por exemplo, um anticorpo expresso por um bacteriófago conforme descrito no presente documento. O termo também deveria ser entendido como significando um anticorpo que foi gerado pela síntese de uma molécula de DNA que codifica o anticorpo e tal molécula de DNA expressa uma proteína de anticorpo ou uma sequência de aminoácidos que especifica o anticorpo, em que o DNA ou sequência de aminoácidos foi obtido utilizando tecnologia de DNA ou sequência de aminoácidos que está disponível e é bem conhecida na técnica.

[0139]O termo “antígeno” ou “Ag” conforme o uso em questão é definido como uma molécula que provoca uma resposta imune. Essa resposta imune pode envolver tanto a produção de anticorpos, como a ativação de células competentes imunologicamente específicas, ou ambas. O versado na técnica entenderá que qualquer macromolécula, incluindo praticamente todas as proteínas ou peptídeos, pode servir como um antígeno. Além disso, os antígenos podem ser derivados de DNA recombinante ou genômico. O versado na técnica entenderá que qualquer DNA, que compreende uma sequência de nucleotídeos ou uma sequência de nucleotídeos parcial que codifica uma proteína que provoca uma resposta imune, portanto, codifica um “antígeno” como esse termo é usado no presente documento. Além disso, o versado na técnica entenderá que um antígeno não precisa ser codificado exclusivamente por uma sequência de nucleotídeos de comprimento total de um gene. É prontamente evidente que a presente invenção inclui, porém sem limitação, o uso de sequências de nucleotídeos parciais de mais de um gene e que essas sequências de nucleotídeos são dispostas em várias combinações para provocar a resposta imune desejada. Além disso, um versado na técnica entenderá que um antígeno não precisa de modo algum ser codificado por um “gene”. É prontamente evidente que um antígeno pode ser gerado sintetizado ou pode ser derivado de uma amostra biológica. Tal amostra biológica pode incluir, porém sem limitação, uma amostra de tecido, uma amostra de tumor, uma célula ou um fluido biológico.

[0140]O termo “efeito antitumoral” conforme o uso em questão, refere-se a um efeito biológico que pode ser manifestado por uma redução no volume de tumor, uma redução no número de células tumorais, uma redução no número de metástases, um aumento da expectativa de vida, ou melhora de vários sintomas fisiológicos associados à condição cancerígena. Um “efeito antitumoral” também pode ser manifestado pela capacidade dos peptídeos, polinucleotídeos, células e anticorpos da invenção na prevenção da ocorrência de tumor em primeiro lugar.

[0141]O termo “autoantígeno” significa, de acordo com a presente invenção, qualquer autoantígeno que é reconhecido pelo sistema imune como sedo estranho. Os autoantígenos compreendem, porém sem limitação, proteínas celulares, fosfoproteínas, proteínas de superfície celular, lipídeos celulares, ácidos nucleicos, glicoproteínas, incluindo receptores de superfície celular.

[0142]O termo “doença autoimune” conforme o uso em questão é definido como um distúrbio que resulta de uma resposta autoimune. Uma doença autoimune é o resultado de uma resposta inadequada e excessiva a um autoantígeno. Exemplos de doenças autoimunes incluem, porém sem limitação, doença de Addision, alopecia areata, espondilite anquilosante, hepatite autoimune, parotidite autoimune, doença de Crohn, diabetes (Tipo I), epidermólise bolhosa distrófica, epididimite, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barr, doença de Hashimoto, anemia hemolítica, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, miastenia grave, pênfigo vulgar, psoríase, febre reumática, artrite reumatoide, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatias, tiroidite, vasculite, vitiligo, mixedema, anemia perniciosa, colite ulcerativa, entre outros.

[0143]Conforme o uso em questão, o termo “autólogo” se destina a se referir a qualquer material derivado do mesmo indivíduo ao qual o mesmo será posteriormente reintroduzido no indivíduo.

[0144]“Alogênico” refere-se a um enxerto derivado de um animal diferente da mesma espécie.

[0145]“Xenogênico” refere-se a um enxerto derivado de um animal de uma espécie diferente.

[0146]O termo “câncer” conforme o uso em questão é definido como doença caracterizada pelo crescimento rápido e descontrolado de células anormais. As células cancerígenas podem se espalhar localmente ou através da corrente sanguínea e sistema linfático para outras partes do corpo. Exemplos de vários cânceres incluem, porém sem limitação, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer cervical, câncer de pele, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer renal, câncer de fígado, câncer de cérebro, linfoma, leucemia, câncer de pulmão e similares. Em determinadas modalidades, o câncer é carcinoma medular da tireoide.

[0147]O termo “receptor de antígeno quimérico” ou “CAR”, conforme o uso em questão, refere-se a um receptor de superfície de células T artificiais que é elaborado para ser expresso em uma célula efetora imune e se liga especificamente a um antígeno. Os CARs podem ser usados como uma terapia com transferência de células adotivas. Os monócitos são removidos de um paciente (sangue, tumor ou fluido ascítico) e modificados de modo que os mesmos expressem os receptores específicos para uma forma específica de um antígeno. Em algumas modalidades, os CARs foram expressos com especificidade a um antígeno associado a tumor, por exemplo. Os CARs também podem compreender um domínio de ativação intracelular, um domínio transmembranar e um domínio extracelular que compreende uma região de ligação a antígeno associada a tumor. Em alguns aspectos, os CARs compreendem fusões de anticorpos monoclonais derivados de fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), fundidos com a transmembrana CD3-zeta e domínio intracelular. A especificidade de desenhos de CAR pode ser derivada de ligantes de receptores (por exemplo, peptídeos). Em algumas modalidades, um CAR pode alvejar cânceres redirecionando um monócito/macrófago que expressa o CAR específico para antígenos associados a tumor.

[0148]O termo “molécula de sinalização intracelular quimérica” refere-se a um receptor recombinante que compreende um ou mais domínios intracelulares de uma ou mais moléculas estimulatórias e/ou co-estimulatórias. A molécula de sinalização intracelular quimérica é substancialmente desprovida de um domínio extracelular. Em algumas modalidades, a molécula de sinalização intracelular quimérica compreende domínios adicionais, como um domínio transmembranar, uma etiqueta detectável, e um domínio espaçador.

[0149]Conforme o uso em questão, o termo “modificações de sequência conservadora” se destina a se referir a modificações de aminoácido que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. Tais modificações conservadoras incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo da invenção por técnicas padrão na técnica, como mutagênese sítio- dirigida e mutagênese mediada por PCR. As substituições de aminoácidos conservadoras são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos que têm cadeias laterais foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina , metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Portanto, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das regiões CDR de um anticorpo podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeias laterais e o anticorpo alterado pode ser testado quanto à capacidade de ligação a antígenos usando os ensaios funcionais descritos no presente documento.

[0150]“Ligante co-estimulatório”, conforme o uso no presente documento, inclui uma molécula em uma célula apresentadora de antígeno (por exemplo, um aAPC, célula dendrítica, célula B, e similares) que se liga especificamente a uma molécula co-estimulatória cognata em um monócito/macrófago, fornecendo assim um sinal que media uma resposta a monócito/macrófago, incluindo, porém sem limitação, proliferação, ativação, diferenciação, e similares. Um ligante co- estimulatório pode incluir, mas não se limita a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD- L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligante co-estimulatório induzível (ICOS-L), molécula de adesão intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, HEVEM, um agonista ou anticorpo que se liga ao receptor de ligante Toll e um ligante que se liga especificamente a B7-H3. Um ligante co-estimulatório também abrange, inter alia, um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula co-eestimulatória presente em uma célula T, como mas não se limitando a, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 associado à função de linfócito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, e um ligante que se liga especificamente a CD83.

[0151]Uma “molécula co-estimulatória” refere-se a uma molécula em uma célula imune inata que é usada para aumentar ou reduzir o estímulo inicial. Por exemplo, os receptores de reconhecimento de padrão associado a patógeno, como TLR (aumentar) ou o eixo CD47/SIRPα (reduzir), são moléculas em células imunes inatas. As moléculas co-estimulatórias incluem, porém sem limitação, TCR, CD3 zeta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD86, FcR gama comum, FcR beta (Fc Épsilon R1b), CD79a, CD79b, Fcgama RIIa, DAP10, DAP12, receptor de células T (TCR), CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 associado à função de linfócito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligante que se liga especificamente a CD83, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA- 1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, outras moléculas co-estimulatórias descritas no presente documento, qualquer derivado, variante, ou fragmento do mesmo, qualquer sequência sintética qualquer sequência sintética de uma molécula co-estimulatória que tem a mesma capacidade funcional, e qualquer combinação dos mesmos.

[0152]Um “sinal co-estimulatório”, conforme o uso em questão, refere-se a um sinal, que em combinação com um sinal primário, como ativação do CAR em um macrófago, resulta na ativação do macrófago.

[0153]O termo “citotóxico” ou “citotoxicidade” refere-se ao extermínio ou dano a células. Em uma modalidade, a citotoxicidade das células metabolicamente melhoradas é aprimorada, por exemplo, atividade citolítica aumentada de macrófagos.

[0154]Uma “doença” é um estado de saúde de um animal em que o animal não pode manter a homeostase, e em que se a doença não for melhorada, então, a saúde do animal continua a se deteriorar. Em contrapartida, um “distúrbio” em um animal é um estado de saúde em que o animal é capaz de manter a homeostase, porém em que o estado de saúde do animal é menos favorável do que poderia ser na ausência do distúrbio. Sem tratamento, um distúrbio não causa necessariamente uma redução adicional no estado de saúde do animal.

[0155]“Quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” são usados de forma intercambiável no presente documento, e se referem a uma quantidade de um composto, formulação, material, ou composição, como descrito no presente documento eficaz para obter um resultado biológico específico ou fornecer um benefício terapêutico ou profilático. Tais resultados incluem, porém sem limitação, atividade antitumoral como determinado por quaisquer meios adequados na técnica.

[0156]“Codificação” refere-se à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, como um gene, um cDNA, ou um mRNA, para servir como modelos para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos que têm uma sequência definida de nucleotídeos (isto é, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas resultantes dos mesmos. Dessa forma, um gene codifica uma proteína se a transcrição e tradução de mRNA correspondente àquele gene produz a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a cadeia de codificação, cuja sequência de nucleotídeos é idêntica à sequência de mRNA e é geralmente é fornecida em listagens de sequências, e a cadeia de não codificação, usada como o modelo para a transcrição de um gene ou cDNA, pode ser chamada de codificação da proteína ou outro produto daquele gene ou cDNA.

[0157]Conforme o uso em questão “endógeno” refere-se a qualquer material derivado ou produzido dentro de um organismo, célula, tecido ou sistema.

[0158]Conforme o uso em questão, o termo “exógeno” refere-se a qualquer material introduzido ou produzido fora de um organismo, célula, tecido ou sistema.

[0159]O termo “expandir” conforme o uso em questão refere-se ao aumento no número, como em um aumento no número de monócitos/macrófagos. Em uma modalidade, os monócitos/macrófagos que são expandidos ex vivo aumentam em número em relação ao número originalmente presente na cultura. Em outra modalidade, os monócitos/macrófagos que são expandidos ex vivo aumentam em número em relação a outros tipos de célula na cultura. O termo “ex vivo”, conforme o uso em questão, refere-se a células que foram removidas de um organismo vivo, (por exemplo, um ser humano) e propagadas fora do organismo (por exemplo, em uma placa de cultura, tubo de ensaio ou biorreator).

[0160]O termo “expressão” conforme o uso em questão é definido como a transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleotídeos específica conduzida por seu promotor.

[0161]“Vetor de expressão” refere-se a um vetor que compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende sequências de controle de expressão ligadas de maneira funcional a uma sequência de nucleotídeos que será expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de atuação cis suficientes para a expressão; outros elementos para a expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem aqueles conhecidos na técnica, como cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus, e vírus adeno-associados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

[0162]“Homólogo” conforme o uso em questão, refere-se à identidade de sequência de subunidade entre duas moléculas poliméricas, por exemplo, entre duas moléculas de ácido nucleico, como, duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas de polipeptídeo. Quando uma posição de subunidade em ambas as duas moléculas for ocupada pela mesma subunidade monomérica; por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA for ocupada por adenina, então a mesmas são homólogas naquela posição. A homologia entre duas sequências é uma função direta do número de posições correlacionadas ou homólogas; por exemplo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero com dezenas de subunidades de comprimento) das posições em duas sequências for homóloga, as duas sequências são 50% homólogas; se 90% das posições (por exemplo, 9 de 10), forem correlacionadas ou homólogas, as duas sequências são 90% homólogas. Conforme aplicado ao ácido nucleico ou proteína, “homólogo” conforme o uso em questão refere-se a uma sequência que tem cerca de 50% de identidade de sequência. Com mais preferência, a sequência homóloga tem cerca de 75% de identidade de sequência, com mais preferência ainda, tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência.

[0163] Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subsequências de ligação ao antígeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região determinante complementar (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) como camundongo, rato ou coelho que tem especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região de estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídas por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem na CDR importada ou sequências de estrutura. Essas modificações são feitas para aprimorar e otimizar ainda mais o desempenho de anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também irá compreender idealmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, consulte Jones et al., Nature, 321: 522 a 525 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323 a 329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593 a 596, 1992.

[0164]“Completamente humana” refere-se a uma imunoglobulina, como um anticorpo, em que a molécula inteira é de origem humana ou consiste em uma sequência de aminoácidos idêntica a uma forma humana do anticorpo.

[0165]“Identidade” conforme o uso em questão refere-se à identidade de sequência de subunidade entre duas moléculas poliméricas particularmente entre duas moléculas de aminoácido, como, entre duas moléculas de polipeptídeo. Quando duas sequências de aminoácidos têm os mesmos resíduos nas mesmas posições; por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de polipeptídeo for ocupada por uma Arginina, então, a mesmas são idênticas naquela posição. A identidade ou extensão na qual duas sequências de aminoácidos têm os mesmos resíduos nas mesmas posições em um alinhamento é geralmente expressa como uma porcentagem. A identidade entre duas sequências de aminoácidos é uma função direta do número de posições correlacionadas ou idênticas; por exemplo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero com dezenas de aminoácidos de comprimento) das posições em duas sequências for idêntica, as duas sequências são 50% idênticas; se 90% das posições (por exemplo, 9 de 10), forem correlacionadas ou homólogas, as duas sequências são 90% idênticas.

[0166]Por “substancialmente idêntico” entende-se um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico que exibe pelo menos 50% de identidade com uma sequência de aminoácidos de referência (por exemplo, qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas no presente documento) ou sequência de ácido nucleico (por exemplo, qualquer uma das sequências de ácido nucleicos descritas no presente documento). De preferência, tal sequência é pelo menos 60%, com mais preferência, 80% ou 85%, e com mais preferência, 90%, 95% ou ainda 99% idêntica no nível de aminoácido ou ácido nucleico à sequência usada para comparação.

[0167]A sequência guia de ácido nucleico pode ser complementar a uma fita (sequência de nucleotídeos) de um sítio alvo de DNA dupla fita. A porcentagem de complementação entre a sequência guia de ácido nucleico e a sequência alvo pode ser pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. A sequência-guia de ácido nucleico pode ter pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência-guia de ácido nucleico compreende uma extensão contígua de 10 a 40 nucleotídeos. O domínio de alvejamento variável pode ser composto de uma sequência de DNA, uma sequência de RNA, uma sequência de DNA modificada, uma sequência de RNA modificada (consulte, por exemplo, as modificações descritas no presente documento), ou qualquer combinação dos mesmos.

[0168]A identidade de sequência é tipicamente medida usando o software para análise de sequências (por exemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, ou programas PILEUP/PRETTYBOX). Tal software correlaciona sequências idênticas ou similares atribuindo graus de homologia a várias substituições, deleções e/ou outras modificações. As substituições conservadoras tipicamente incluem substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. Em uma abordagem exemplificativa para determinar o grau de identidade, um programa BLAST pode ser usado, com uma pontuação de probabilidade entre e-3 e e-100 indicando uma sequência estritamente relacionada.

[0169]O termo “imunoglobulina” ou “Ig,” conforme o uso em questão é definido como uma classe de proteínas, que funcionam como anticorpos. Os anticorpos expressos por células B, às vezes, são chamados do BCR (receptor de células B) ou receptor de antígeno. Os cinco membros incluídos nessa classe de proteínas são IgA, IgG, IgM, IgD e IgE. IgA é o anticorpo primário que está presente em secreções corporais, como saliva, lágrimas, leite materno, secreções gastrointestinais e secreções mucosas dos tratos respiratório e genitourinário. IgG é o anticorpo de circulação mais comum. IgM é a imunoglobulina principal produzida na resposta imune principal na maioria dos indivíduos. Essa é a imunoglobulina mais eficiente em aglutinação, fixação ao complemento, e outras respostas de anticorpos, e é importante na defesa contra bactérias e vírus. IgD é a imunoglobulina que não tem função de anticorpo conhecido, porém pode servir como um receptor de antígeno. IgE é a imunoglobulina que media a hipersensibilidade imediata causando a liberação de mediadores a partir de células de mastócitos e basófilos mediante a exposição ao alérgeno.

[0170]O termo “resposta imune” conforme o uso em questão é definido como uma resposta celular a um antígeno que ocorre quando os linfócitos identificam moléculas antigênicas como estranhas e induzem a formação de anticorpos e/o ativam linfócitos para remover o antígeno.

[0171]Conforme o uso em questão, um “material instrucional” inclui uma publicação, um registro, um diagrama, ou qualquer outro meio de expressão que pode ser usado para comunicar a utilidade das composições e métodos da invenção. O material instrucional do kit da invenção pode, por exemplo, ser fixado a um recipiente que contém o ácido nucleico, peptídeo e/ou composição da invenção ou ser enviado juntamente com um recipiente que contém o ácido nucleico, peptídeo e/ou composição. Alternativamente, o material instrucional pode ser enviado separadamente do recipiente com a intenção que o material instrucional e o composto sejam usados cooperativamente pelo receptor.

[0172]“Isolado” significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não é “isolado”, porém o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcial ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é “isolado”. Um ácido nucleico ou proteína isolada pode se apresentar sob a forma substancialmente purificada, ou pode se apresentar em um ambiente não nativo como, por exemplo, uma célula hospedeira.

[0173]Um “lentivírus” conforme o uso em questão refere-se a um gênero da família Retroviridae. Os lentivírus são exclusivos dentre os retrovírus pelo fato de serem capazes de infectar células não divisoras; os mesmos podem distribuir uma quantidade significativa de informações genéticas no DNA da célula hospedeira, então os mesmos são um dos métodos mais eficientes de um vetor de entrega de genes. HIV, SIV e FIV são exemplos de lentivírus. Os vetores derivados de lentivírus oferecem os meios para obter níveis significativos de transferência de gene in vivo.

[0174]Pelo termo “modificado” conforme o uso em questão, entende-se um estado ou estrutura alterada de uma molécula ou célula da invenção. As moléculas podem ser modificadas de muitas maneiras, incluindo de forma química, estrutural e funcional. As células podem ser modificadas através da introdução de ácidos nucleicos.

[0175]Pelo termo “modulação”, conforme o uso em questão, entende-se a mediação de um aumento ou redução detectável no nível de uma resposta em um indivíduo em comparação com o nível de uma resposta no indivíduo na ausência de um tratamento ou composto e/ou em comparação com o nível de uma resposta em um indivíduo, de outro modo, idêntico, porém não tratado. O termo abrange perturbar e/ou afetar um sinal nativo ou resposta mediando, assim, uma resposta terapêutica benéfica em um indivíduo, de preferência, um ser humano.

[0176]No contexto da presente invenção, as seguintes abreviações das bases de ácido nucleico comumente ocorrentes são usadas. “A” refere-se à adenosina, “C” refere-se à citosina, “G” refere-se à guanosina, “T” refere-se à timidina e “U” refere-se à uridina.

[0177]Exceto onde especificado em contrário, uma “sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos” inclui as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. A frase sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou um RNA também pode incluir íntrons na medida em que a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína pode conter em algumas versões um íntron(s).

[0178]O termo “ligado de maneira funcional” refere-se à ligação funcional entre uma sequência reguladora e uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga resultando na expressão da última. Por exemplo, uma primeira sequência de ácidos nucleicos está ligada de maneira funcional a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácidos nucleicos for colocada em uma relação funcional à segunda sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor está ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação se o promotor afetar a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Em geral, as sequências de DNA ligadas de maneira funcional são contíguas e, quando necessário une-se duas regiões de codificação de proteína, no mesmo quadro de leitura.

[0179]O termo antígeno tumoral “superexpresso” ou “superexpressão” de um antígeno tumoral destina-se a indicar um nível de expressão anormal de um antígeno tumoral em uma célula a partir de uma área doente como um tumor sólido dentro de um tecido ou órgão específico do paciente em relação ao nível de expressão em uma célula normal daquele tecido ou órgão. Os pacientes que têm tumores sólidos ou uma malignidade hematológica caracterizada pela superexpressão do antígeno tumoral podem ser determinados por ensaios padrão conhecidos na técnica.

[0180]A administração “parenteral” de uma composição imunogênica inclui, por exemplo, técnicas de injeção ou infusão subcutânea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.), intratumoral (i.t.) ou intraperitoneal (i.p.), ou intrasternal.

[0181]O termo “polinucleotídeo” conforme o uso em questão é definido como uma cadeia de nucleotídeos. Além disso, ácidos nucleicos são polímeros de nucleotídeos. Dessa forma, ácidos nucleicos e polinucleotídeos conforme o uso em questão são intercambiáveis. O versado na técnica tem o conhecimento geral que ácidos nucleicos são polinucleotídeos, que podem ser hidrolisados nos “nucleotídeos” monoméricos. Os nucleotídeos monoméricos podem ser hidrolisados em nucleosídeos. Conforme o uso em questão os polinucleotídeos incluem, porém sem limitação, todas as sequências de ácidos nucleicos que são obtidas por quaisquer meios disponíveis na técnica, incluindo, sem limitação, meios recombinantes, isto é, a clonagem de sequências de ácidos nucleicos de uma biblioteca recombinante ou um genoma celular, usando tecnologia de clonagem comum e PCR™, e similares, e por meios sintéticos.

[0182]Conforme o uso em questão, os termos “peptídeo”, “polipeptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável, e se referem a um composto compreendido de resíduos de aminoácidos covalentemente ligados por ligações peptídicas. Uma proteína ou peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos, e sem limitação, é colocado no número máximo de aminoácidos que podem compreender uma sequência de proteínas ou peptídeos. Os polipeptídeos incluem qualquer peptídeo ou proteína que compreende dois ou mais aminoácidos unidos uns aos outros por ligações peptídicas. Conforme o uso em questão, o termo refere- se tanto a cadeias curtas, que também são comumente chamadas na técnica de peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, e a cadeias mais longas, que em geral são chamadas na técnica de proteínas, das quais há muitos tipos. Os “polipeptídeos” incluem, por exemplo, fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos substancialmente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipeptídeos, polipeptídeos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusão, entre outros. Os polipeptídeos incluem peptídeos naturais, peptídeos recombinantes, peptídeos sintéticos, ou uma combinação dos mesmos.

[0183]O termo “promotor” conforme o uso em questão é definido como uma sequência de DNA reconhecida pela maquinaria sintética da célula, ou maquinaria sintética introduzida, necessária para iniciar a transcrição específica de uma sequência de polinucleotídeos.

[0184]Conforme o uso em questão, o termo “sequência promotora/reguladora” significa uma sequência de ácido nucleico que é necessária para a expressão de um produto de gene ligado de maneira funcional à sequência promotora/reguladora. Em alguns casos, essa sequência pode ser a sequência promotora de núcleo e em outros casos, essa sequência também pode incluir uma sequência potencializadora e outros elementos reguladores que são necessários para a expressão do produto de gene. A sequência promotora/reguladora pode ser, por exemplo, uma que expressa o produto de gene de maneira específico quanto a tecido.

[0185]Um promotor “constitutivo” é uma sequência de nucleotídeos que, quando ligada de maneira funcional a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto do gene, faz com que o produto do gene seja produzido em uma célula sob a maioria ou todas as condições fisiológicas da célula.

[0186]Um promotor “induzível“ é uma sequência de nucleotídeos que, quando ligada de maneira funcional a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto do gene, faz com que o produto do gene seja produzido em uma célula substancialmente apenas quando um indutor que corresponde ao promotor está presente na célula.

[0187]Um promotor “específico quanto a tecido” é uma sequência de nucleotídeos que, quando ligada de maneira funcional a um polinucleotídeo codificado ou especificado por um gene, faz com que o produto genético seja produzido em uma célula apenas se a célula for uma célula do tipo de tecido correspondente ao promotor.

[0188]O termo “resistência à imunosupressão” refere-se à falta de supressão ou supressão reduzida de uma atividade ou ativação de sistema imune.

[0189]Uma “via de transdução de sinal” refere-se à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que exercem uma função na transmissão de um sinal a partir de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. A frase “receptor de superfície celular” inclui moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e transmitir sinal através da membrana plasmática, de uma célula.

[0190]“Anticorpos de cadeia única” referem-se a anticorpos formados por técnicas de DNA recombinante em que fragmentos de imunoglobulina de cadeia pesada e leve são ligados à região Fv através de um span de aminoácidos modificado por engenharia genética. Vários métodos de geração de anticorpos de cadeia única são conhecidos, inclusive aqueles descritos na patente US n° 4.694.778; Bird (1988) Science 242:423 a 442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 a 5883; Ward et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038 a 1041.

[0191]Pelo termo “se liga especificamente”, conforme o uso em questão em relação a um anticorpo, entende-se um anticorpo que reconhece um antígeno específico, porém não reconhece ou se liga substancialmente a outras moléculas em uma amostra. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno a partir de uma espécie também pode se ligar àquele antígeno de uma ou mais espécies. Porém, tal reatividade cruzada de espécies não altera por si só a classificação de um anticorpo como específico. Em outro exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno também pode se ligar a formas alélicas diferentes do antígeno. Entretanto, tal reatividade cruzada não altera por si só a classificação de um anticorpo como específico. Em alguns casos, os termos “ligação específica” ou “se liga especificamente”, podem ser usados em referência à interação de um anticorpo, uma proteína, ou um peptídeo com uma segunda espécie química, para significar que a interação é dependente da presença de uma estrutura específica (por exemplo, um determinante ou epítopo antigênico) da espécie química; por exemplo, um anticorpo reconhece e se liga a uma estrutura de proteína específica em vez de proteínas em geral. Se um anticorpo for específico quanto a epítopo “A”, a presença de uma molécula contendo epítopo A (ou A livre, não marcado), em uma reação contendo “A” marcado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de A marcado ligada ao anticorpo.

[0192]Pelo termo “estimulação”, entende-se uma resposta primária induzida pela ligação de uma molécula estimulatória (por exemplo, um complexo TCR/CD3) com o seu ligante cognato, mediando assim um evento de transdução de sinal, como, porém sem limitação, transdução de sinal através da maquinaria do receptor Fc ou através do CAR sintético. A estimulação pode mediar a expressão alterada de determinadas moléculas, como infraregulação de TGF-beta, e/ou reorganização de estruturas citoesqueléticas e similares.

[0193]Uma “molécula estimulatória” conforme o uso no presente documento, significa uma molécula em um monócito/macrófago que se liga especificamente a um ligante estimulatório cognato presente em uma célula apresentadora de antígeno.

[0194]Um “ligante estimulatório” significa um ligante, conforme o uso em questão, significa um ligante que, quando presente em uma célula apresentadora de antígeno (por exemplo, uma aAPC, uma célula dendrítica, uma célula B e similares) ou célula tumoral pode se ligar especificamente a um parceiro de ligação cognato (chamado no presente documento de uma “molécula estimulatória”) em um monócito/macrófago, mediando assim uma resposta pela célula imune, incluindo, porém sem limitação, ativação, iniciação de uma resposta imune, proliferação e similares . Os ligantes estimuladores são bem conhecidos na técnica e abrangem, inter alia, um ligante do receptor do tipo Toll (TLR), um anticorpo receptor do tipo anti-toll, um agonista e um anticorpo para um receptor de monócito/macrófago. Além disso, citocinas, como interferon-gama, são potentes estimulantes de macrófagos.

[0195]O termo “indivíduo” destina-se a incluir organismos vivos em que uma resposta imune pode ser obtida (por exemplo, mamíferos). Um “indivíduo” ou “paciente,” como usado no presente documento, pode ser um ser humano ou mamífero não humano. Os mamíferos não humanos incluem, por exemplo, gado e animais de estimação, como mamíferos ovinos, bovinos, suínos, caninos, felinos e murinos. De preferência, o indivíduo é um ser humano.

[0196]Conforme o uso em questão, uma célula “substancialmente purificada” é uma célula que é essencialmente isento de outros tipos de célula. Uma célula substancialmente purificada também refere-se a uma célula que foi separada de outros tipos de célula com a quais a mesma está normalmente associada e seu estado de ocorrência natural. Em alguns casos, uma população de células substancialmente purificadas refere-se a uma população homogênea de células. Em outros casos, esse termo refere-se simplesmente a uma célula que foi separada das células com as quais a mesma está naturalmente associada em seu estado natural. Em algumas modalidades, as células são cultivadas in vitro. Em outras modalidades, as células não são cultivadas in vitro.

[0197]Um “sítio alvo” ou “sequência alvo” refere-se a uma sequência genômica de ácidos nucleicos que define uma porção de um ácido nucleico ao qual uma molécula de ligação pode se ligar especificamente sob condições suficientes para a ligação ocorrer.

[0198]Por “alvo” entende-se uma célula, órgão, ou sítio dentro do corpo que está em necessidade de tratamento.

[0199]Conforme o uso em questão, o termo “receptor de células T” ou “TCR” refere-se a um complexo de proteínas membranares que participa da ativação de célula T em resposta à apresentação de antígeno. O TCR é responsável pelo reconhecimento de antígenos ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade. O TCR é composto de um heterodímero de uma cadeia alfa (a) e beta (β), embora em algumas células o TCR consista em cadeias gama e delta (y/δ). Os TCRs podem existir em formas alfa/beta e gama/delta, que são estruturalmente similares, porém têm localizações e funções anatômicas diferentes. Cada cadeia é composta de dois domínios extracelulares, um domínio variável e um domínio constante. Em algumas modalidades, o TCR pode ser modificado em qualquer célula que compreende um TCR, incluindo, por exemplo, uma célula T auxiliar, uma célula T citotóxica, uma célula T de memória, célula T reguladora, célula T assassina natural e célula T gama delta.

[0200]O termo “terapêutico” conforme o uso em questão significa um tratamento e/ou profilaxia. Um efeito terapêutico é obtido por supressão, remissão, ou erradicação de um estado de doença.

[0201]O termo “transfectado” ou “transformado” ou “transduzido” conforme o uso em questão refere-se a um processo por meio do qual o ácido nucleico exógeno é transferido ou introduzido na célula hospedeira. Uma célula “transfectada” ou “transformada” ou “transduzida” é uma que foi transfectada, transformada ou transduzida com ácido nucleico exógeno. A célula inclui a célula em questão primária e sua progênie.

[0202]“Tratar” uma doença como o termo usado no presente documento, significa reduzir a frequência ou gravidade de pelo menos um sinal ou sintoma de uma doença ou distúrbio experimentado por um indivíduo.

[0203]O termo “tumor” conforme o uso em questão, refere-se a um crescimento anormal de tecido que pode ser benigno, pré-cancerígeno, maligno ou metastático.

[0204]A frase “sob controle transcricional” ou “ligado de maneira funcional” conforme o uso em questão significa que o promotor está na localização e orientação corretas em relação a um polinucleotídeo para controlar a iniciação de transcrição por RNA polimerase e expressão do polinucleotídeo.

[0205]Um “vetor” é uma composição de substância que compreende um ácido nucleico isolado e que pode ser usada para distribuir o ácido nucleico isolado para o interior de uma célula. Vários vetores são conhecidos na técnica incluindo, porém sem limitação, polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos e vírus. Dessa forma, o termo “vetor” inclui um plasmídeo de replicação autônoma ou um vírus. O termo também deveria ser interpretado como incluindo compostos não plasmídicos e não virais que facilitam a transferência de ácido nucleico para dentro das células, como, por exemplo, compostos de polilisina, lipossomas, e similares. Exemplos de vetores virais incluem, porém sem limitação, vetores adenovirais, vetores virais adeno- associados, vetores retrovirais, vetores lentivirais, e similares.

[0206]Intervalos: ao longo desta revelação, vários aspectos da invenção podem ser apresentados em um formato de intervalo. Deve-se compreender que a descrição em formato de intervalo serve apenas para conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de um intervalo deve ser considerada como tendo revelado especificamente todos os possíveis subintervalos, bem como valores numéricos individuais dentro daquele intervalo. Por exemplo, a descrição de um intervalo como de 1 a 6 deve ser considerada como tendo revelado especificamente os subintervalos como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais daquele intervalo, por exemplo, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 e 6. Isto se aplica independentemente da amplitude do intervalo.

Descrição

[0207]O acúmulo de evidências sugere que os macrófagos são abundantes no microambiente tumoral de vários tipos de câncer, em que os mesmos podem adotar um fenótipo classicamente ativado (M1, antitumoral) ou um alternativamente ativado (M2, pró-tumor). Os macrófagos são potentes efetores do sistema imune inato e são capazes de pelo menos três funções antitumorais distintas: fagocitose, citotoxicidade celular e apresentação de antígeno para orquestrar uma resposta imune adaptável. Embora as células T necessitem de ativação dependente do antígeno através do receptor de células T ou do imunorreceptor quimérico, os macrófagos podem ser ativados de várias maneiras. A ativação direta de macrófago é independente de antígeno, dependendo de mecanismos como o reconhecimento de padrões moleculares associados a patógeno por receptores tipo Toll (TLRs). A ativação mediada por complexo imune é dependente de antígeno, porém exige a presença de anticorpos específicos de antígeno e a ausência da interação inibitória de CD47-SIRPα.

[0208]Os macrófagos associados a tumor revelaram ser reprogramáveis pelo microambiente tumoral para se tornarem os principais imunossupressores no microambiente. Portanto, a capacidade de elaborar geneticamente macrófagos para impedir o desenvolvimento de uma reprogramação genética imunossupressora poderia representar um avanço vertical no campo.

[0209]A presente invenção inclui composições e métodos para tratar uma malignidade em um indivíduo. A invenção inclui a expressão de um receptor de antígeno quimérico em um monócito, macrófago ou célula dendrítica. Tal célula modificada é recrutada para o microambiente tumoral em que a mesma atua como um efetor imune potente infiltrando o tumor e exterminando as células alvo.

Receptor de antígeno quimérico (CAR)

[0210]Em um aspecto da invenção, um monócito modificado, macrófago, ou célula dendrítica é gerado expressando-se um CAR. Logo, a presente invenção abrange um CAR e uma construção de ácido nucleico que codifica um CAR, em que o CAR inclui um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar e um domínio intracelular.

[0211] Em um aspecto, a invenção inclui uma célula modificada que compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar e um domínio intracelular de uma molécula co-estimulatória, e em que a célula é um monócito, macrófago, ou célula dendrítica que possui atividade efetora direcionada. Em outro aspecto, a invenção inclui uma célula modificada que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio de ligação ao antígeno, uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio transmembranar e uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio intracelular de uma molécula co-estimulatória, e em que a célula é um monócito, macrófago, ou célula dendrítica que expressa o CAR e possui atividade efetora direcionada. Em uma modalidade, a atividade efetora direcionada é voltada contra um antígeno em um a célula alvo que se liga especificamente ao domínio de ligação ao antígeno do CAR. Em outra modalidade, a atividade efetora direcionada é selecionado a partir do grupo que consiste em fagocitose, citotoxicidade celular direcionada, apresentação de antígeno e secreção de citocina.

Domínio de ligação ao antígeno

[0212]Em uma modalidade, o CAR da invenção compreende um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno em uma célula alvo. Exemplos de marcadores de superfície celular que podem atuar como um antígeno que se liga ao domínio de ligação ao antígeno do CAR incluem aqueles associados a infecções virais, bacterianas e parasíticas, doenças autoimunes e células cancerígenas.

[0213]A escolha do domínio de ligação ao antígeno depende do tipo e do número de antígenos que estão presentes na superfície de uma célula alvo. Por exemplo, o domínio de ligação ao antígeno pode ser escolhido para reconhecer um antígeno que atua como um marcador de superfície celular em uma célula alvo associada a um estado de doença particular.

[0214]Em uma modalidade, o domínio de ligação ao antígeno se liga a um antígeno tumoral, tal como um antígeno que seja específico para um tumor ou câncer de interesse. Em uma modalidade, o antígeno tumoral da presente invenção compreende um ou mais epítopos de câncer antigênicos. Exemplos não limitantes de antígenos associados a tumor incluem CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (também referidos como CD2 subconjunto 1, CRACC, SLAMF7, CD319 e 19A24); molécula-1 tipo lectina tipo C (CLL-1 ou CLECL1); CD33; variante de receptor de fator de crescimento epidérmico III (EGFRvIII); gangliosideo G2 (GD2); gangliosideo GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); maturação de célula B de membro da família do receptor TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) ou (GalNAcα-Ser/Thr)); antígeno membranar próstata-específico (PSMA); receptor 1 orfano tipo tirosina quinase receptor (ROR1); Tirosina Quinase tipo Fms 3 (FLT3); glicoproteína associada a tumor 72 (TAG72); CD38; CD44v6; antígeno carcinoembriônico (CEA); molécula de adesão celular epitelial (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); subunidade.e de receptor de interleucina-13 alfa-2 (IL-13Ra2 ou CD213A2); Mesotelina; receptor de interleucina 11 alfa (IL-11Ra); antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA); Protease Serina 21 (Testisina ou PRSS21); receptor de fator de ecrescimento endotelial vascular 2 (VEGFR2); antígeno de Lewis(Y); CD24; receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas beta (PDGFR-beta); antígeno-4 embriônico estágio-específico (SSEA-4); CD20; receptor de folato alfa; tirosina receptor-proteína quinase ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1, superfície celular associada (MUC1); receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR); molécula de adesão celular neural (NCAM); Prostase; fosfatase de ácido prostático (PAP); fator de alongamento 2 mutado (ELF2M); Efrina B2; proteína alfa de ativação de fibroblasto (FAP); receptor de fator de crescimento 1 tipo insulina (receptor IGF-I), anidrase carbônica IX (CAIX); Subunidade de Proteassoma (Prossoma, Macropaina), Beta Tipo, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusão de oncogene que consiste em uma região de grupamento de ponto de ruptura (BCR) e homólogo de oncogene viral de leucemina de murinho de Abelson 1 (Abl) (bcr-abl); tirosinase; receptor 2 de efrina tipo A (EphA2); Fucosil GM1; molécula de adesão de Lewis sialil (sLe); gangliosídeo GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1- 4)bDGlcp(1-1)Cer); transglutaminase 5 (TGS5); antígeno associado à metanoma de alto peso molecular (HMWMAA); o-acetyl-GD2 gangliosídeo (OAcGD2); receptor beta de folato; marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); marcador endotelial tumoral 7-relacionado (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormônio estimulante da tireoide (TSHR); receptor acoplado à proteína G classe C grupo 5, membro D (GPRC5D); fase de leitura abertura de cromossomo X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; linfoma quinase anaplásico (ALK); ácido polissiálico; placenta- específico 1 (PLAC1); porção de hexassacarídeo de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciação de glândula mamária (NY-BR-1); uroplacina 2 (UPK2); receptor 1 do vírus da hepatite A (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); panexina 3 (PANX3); receptor acoplado à proteína G 20 (GPR20); complexo de antígeno linfocítico 6, locus K 9 (LY6K); receptor olfativo 51E2 (OR51E2); proteína de Fase de Leitura Alternada TCR Gama (TARP); proteína de tumor de Wilms (WT1); antígeno de câncer de testículo 1 (NY-ESO-1); antígeno de câncer de testículo 2 (LAGE-1a); antígeno associado a melanoma 1 (MAGE-A1); gene variante de translocação ETS 6, situado no cromossomo 12p (ETV6-AML); proteína de esperma 17 (SPA17); Família de Antígeno X, Membro 1A (XAGE1); receptor de superfície celular de ligação a angiopoietina 2 (Tie 2); antígeno 1 de melanoma e câncer de testículo (MAD-CT-1); antígeno 2 de melanoma e câncer de testículo (MAD-CT-2); antígeno relacionado a Fos 1; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; prosteina; sobrevivência; telomerase; antígeno tumoral-1 de carcinoma da próstata (PCTA-1 ou Galectina 8), antígeno de melanoma reconhecido por células T 1 (MelanA ou MART1); sarcoma de ratos (Ras) mutante; transcriptase reversa de Telomerase humana (hTERT); pontos de ruptura de translocação de sarcoma; inibidor de melanoma de apoptose (ML-IAP); ERG (gene de fusão ETS de protease transmembranar, serina 2 (TMPRSS2)); N-Acetil glucosaminil-transferase V (NA17); proteína Pax-3 de caixa pareada (PAX3); receptor de andrógeno; Ciclina B1; homólogo derivado de neroblastoma de oncogene vital de mioelocitomatose aviária myc (MYCN); Membro da família de Homólogos Ras C (RhoC); proteína 2 relacioanda a tirosinase (TRP-2); Citocromo P450 1B1 (CYP1B1); fator de ligação a CCCTC tipo (proteína de dedo de zinco) (BORIS ou Irmão do Regulador de Sítios Impressos), Antigeno de Carcinoma de Células Escamosas reconhecido por Células T 3 (SART3); proteína Pax-5 de caixa pareada (PAX5); proteína de ligação a proacrosina sp32 (OY-TES1); proteína tirosina quinase específica a linfócito (LCK); proteína 4 de quinase âncora A 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, ponto de ruptura X 2 (SSX2); Receptor para Produtos Finais de Glicação Avançada (RAGE-1); renal ubíquo 1 (RU1); renal ubíquo 2 (RU2); legumaina; vírus de papiloma humano E6 (HPV E6); vírus de papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterase intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; receptor 1 tipo imunoglobulina associada a leucócito (LAIR1); fragmento Fc de receptor IgA (FCAR ou CD89); membro 2 da subfamília A de receptor tipo imunoglobulina associada a leucócito (LILRA2); membro da família tipo molécula CD300 f (CD300LF); domínio de lectina tipo C família 12 membro A (CLEC12A); antígeno de célula estromal de medula óssea 2 (BST2); receptor tipo 2 de hormônio tipo mucina contendo módulo tipo EGF (EMR2); antígeno de linfócito 75 (LY75); Glipicano-3 (GPC3); receptor Fc tipo 5 (FCRL5); e polipeptídeo tipo lambda de imunoglobulina 1 (IGLL1).

[0215]O domínio de ligação ao antígeno pode incluir qualquer domínio que se ligue ao antígeno e pode incluir, sem limitação, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo sintético, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo não humano, e qualquer fragmento do mesmo. Logo, em uma modalidade, a porção de domínio de ligação ao antígeno compreende um anticorpo de mamífero ou um fragmento do mesmo. Em outra modalidade, o domínio de ligação ao antígeno do CAR é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD19, um anticorpo anti-HER2, e um fragmento do mesmo.

[0216]Em alguns exemplos, o domínio de ligação ao antígeno é derivado a partir da mesma espécie na qual o CAR será ultimamente usado. Por exemplo, para uso em seres humanos, o domínio de ligação ao antígeno do CAR compreende um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, ou um fragmento dos mesmos.

[0217]Em alguns aspectos da invenção, o domínio de ligação ao antígeno é operacionalmente ligado a outro domínio do CAR, tal como o domínio transmembranar ou o domínio intracelular, para expressão na célula. Em uma modalidade, um ácido nucleico que codifica o domínio de ligação ao antígeno é operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica um domínio transmembranar e um ácido nucleico que codifica um domínio intracelular.

Domínio transmembranar

[0218]Em relação ao domínio transmembranar, o CAR pode ser projetado para compreender um domínio transmembranar que conecta o domínio de ligação ao antígeno do CAR ao domínio intracelular. Em uma modalidade, o domínio transmembranar é naturalmente associado a um ou mais domínios no CAR. Em alguns casos, o domínio transmembranar pode ser selecionado ou modificado por substituição de aminoácido para evitar a ligação desses domínios aos domínios transmembranares de proteínas de membrana superficial iguais ou diferentes para minimizar interações com outros membros do complexo receptor.

[0219]O domínio transmembranar pode ser derivado seja a partir de uma fonte natural ou a partir de uma forma sintética. Quando a fonte for natural, o domínio pode ser derivado a partir de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembranar. As regiões transmembranas de uso particular nesta invenção podem ser derivadas (isto é, compreende pelo menos as regiões transmembranares de) a partir da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de célula T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, receptor tipo Toll 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, e TLR9. Em alguns casos, uma variedade de dobradiças humanas pode ser empregada, bem como incluindo a dobradiça Ig humana (imunoglobulina).

[0220]Em uma modalidade, o domínio transmembranar pode ser sintética, sendo que nesse caso o mesmo compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos, tais como leucina e valina. De preferência, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembranar sintético.

Domínio intracelular

[0221]O domínio intracelular ou, de outro modo, o domínio citoplásmico do CAR, inclui um domínio intracelular igual ou similar à sinalização intracelular quimérica descrita no presente documento, e é responsável pela ativação da célula na qual o CAR é expressado.

[0222]Em uma modalidade, o domínio intracelular do CAR inclui um domínio responsável pela ativação e/ou transdução de sinal.

[0223]Exemplos de um domínio intracelular para uso na invenção incluem, mas não se limitam a, porção citoplásmica de um receptor superficial, molécula co- estimulatória, e qualquer molécula que atue em conjunto para iniciar a transdução de sinal no monócito, macrófago ou célula dendrítica, bem como qualquer derivado ou variante desses elementos e qualquer sequência sintética que tenha a mesma capacidade funcional.

[0224]Exemplos do domínio intracelular incluem um fragmento ou domínio de uma ou mais moléculas ou receptores incluindo, sem limitação, TCR, CD3 zeta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD86, FcR gama comum, FcR beta (Fc Épsilon R1b), CD79a, CD79b, Fcgama RIIa, DAP10, DAP12, receptor de célula T (TCR), CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 associado à função de linfócito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligante que se liga especificamente a CD83, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA- 1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, receptor tipo Toll 1 (TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, outras moléculas co-estimulatórias descritas no presente documento, qualquer derivado, variante, ou fragmento dos mesmos, qualquer sequência sintética de uma molécula co-estimulatória que tenha a mesma capacidade funcional, e qualquer combinação dos mesmos.

[0225]Em uma modalidade, o domínio intracelular do CAR compreende domínios de sinalização duplos, tais como 41BB, CD28, ICOS, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, cadeia beta de receptor CD116, CSF1-R, LRP1/CD91, SR-A1, SR-A2, MARCO, SR-CL1, SR-CL2, SR-C, SR-E, CR1, CR3, CR4, dectina 1, DEC-205, DC-SIGN, CD14, CD36, LOX-1, CD11b, juntos a quaisquer domínios de sinalização listados no parágrafo anterior e qualquer combinação. Em outra modalidade, o domínio intracelular do CAR inclui qualquer porção de uma ou mais moléculas co-estimulatória, tal como pelo menos um domínio de sinalização de CD3, cadeia Fc épsilon RI gama, qualquer derivado ou variante do mesmo, qualquer sequência sintética do mesmo que tenha a mesma capacidade funcional, e qualquer combinação dos mesmos.

[0226]Entre o domínio de ligação ao antígeno e o domínio transmembranar do CAR, ou entre o domínio intracelular e o domínio transmembranar do CAR, um domínio espaçador pode ser incorporado. Conforme o uso em questão, o termo “domínio espaçador” significa, em geral, qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo que funcione para ligar o domínio transmembranar a qualquer domínio de ligação ao antígeno ou domínio intracelular na cadeia de polipeptídeo. Em uma modalidade, o domínio espaçador pode compreender até 300 aminoácidos, de preferência, 10 a 100 aminoácidos e, com a máxima preferência, 25 a 50 aminoácidos. Em outra modalidade, um ligante de oligopeptídeo ou polipeptídeo curto, de preferência, entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento pode formar a ligação entre o domínio transmembranar e o domínio intracelular do CAR. Um exemplo de um ligante inclui um dupleto glicina-serina.

Anticorpos humanos

[0227]Pode ser preferível usar anticorpos humanos ou fragmentos dos mesmos ao usar o domínio de ligação ao antígeno de um CAR. Anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de indivíduos humanos. Os anticorpos humanos podem ser feitos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo métodos de exibição de fagos usando bibliotecas de anticorpos derivadas a partir de sequências de imunoglobulina humana, incluindo aperfeiçoamentos a essas técnicas. Consulte, também, as Patentes nos U.S. 4.444.887 e 4.716.111; e as Publicações PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741; estando cada uma dessas incorporadas ao presente documento em suas totalidades a título de referência.

[0228]Os anticorpos humanos também podem ser produzidos usando camundongos transgênicos que podem ser incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, os complexos de gene de imunoglobulina humana de cadeia pesada e cadeia leve podem ser introduzidos aleatoriamente ou por recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongos. Alternativamente, a região variável humana, região constante, e região de diversidade podem ser introduzidas em células-tronco embrionárias de camundongos além dos genes humanos de cadeia pesada e cadeia leve. Os genes de imunoglobulina de camundongos de cadeia pesada e cadeia leve podem ser tornados separadamente não funcionais ou simultaneamente com a introdução de loci de imunoglobulina humana por recombinação homóloga. Por exemplo, descreveu-se que a deleção homozigoto do gene de região de união (JH) de cadeia pesada de anticorpo gene em camundongos mutantes quiméricos e de linhagem germinativa resulta em uma inibição completa de produção de anticorpos endógenos. As células-tronco embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastócitos para produzir camundongos quiméricos. Os camundongos quiméricos são, então, reproduzidos para produzir uma ninhada homozigoto que expressa anticorpos humanos. Os camundongos transgênicos são imunizados da maneira normal com um antígeno selecionado, por exemplo, todo ou uma porção de um polipeptídeo da invenção. Os anticorpos voltados contra o alvo de escolha podem ser obtidos a partir dos camundongos imunizados transgênicos usando uma tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana albergado pelos camundongos transgênicos são redispostos durante a diferenciação de células B, e, subsequentemente, são submetidos à troca de classe e mutação somática. Logo, usando essa técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis, incluindo, sem limitação, IgG1 (gama 1) e IgG3. Para uma visão geral dessa tecnologia para produzir anticorpos humanos, vide, Lonberg and Huszar (Int. Rev. Immunol., 13:6593 (1995)). Para uma discussão detalhada dessa tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir esses anticorpos, vide, por exemplo, as Publicações nos PCT WO 98/24893, WO 96/34096, e WO 96/33735; e as Patentes nos U.S. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; e 5.939.598, estando cada uma dessas incorporadas ao presente documento em suas totalidades a título de referência. Além disso, empresas como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) e Genpharm (San Jose, Calif.) podem estar engajadas em proporcionar anticorpos humanos voltados contra um antígeno selecionado usando uma tecnologia similar àquela descrita anteriormente. Para uma discussão específica de transferência de um arranjo de genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana em camundongos mutantes de linhagem germinativa que resultarão na produção de anticorpos humanos mediante um desafio de antígenos vide, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); e Duchosal et al., Nature, 355:258 (1992).

[0229]Os anticorpos humanos também podem ser derivados a partir de bibliotecas de exibição de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309 (1996)). Pode-se usar a tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)) para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de gene de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. De acordo com essa técnica, os genes de domínio de anticorpo V são clonados em moldura em um gene de proteína de revestimento principal ou secundário de um bacteriófago filamentoso, como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos de anticorpo funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Devido ao fato de partícula filamentosa conter uma cópia de DNA de fita simples do genoma de fago, as seleções baseadas em propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades. Logo, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição de fagos pode ser realizada e uma variedade de formatos; para sua análise vide, por exemplo, Johnson, Kevin S, and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser usadas para exibição de fagos. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolou um arranjo diverso de anticorpos de anti- oxazolona a partir de uma biblioteca combinatória aleatória pequena de genes V derivados a partir dos baços de camundongos não imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos a um arranjo diverso de antígenos (incluindo auto-antígenos) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993). Vide, também, as Patentes nos U.S. 5.565.332 e 5.573.905, estando cada uma dessas incorporadas ao presente documento em suas totalidades a título de referência.

[0230]Os anticorpos humanos também podem ser gerados por células B ativadas in vitro (vide as Patentes nos U.S. 5.567.610 e 5.229.275, estando cada uma dessas incorporadas ao presente documento em suas totalidades a título de referência). Os anticorpos humanos também podem ser gerados in vitro usando técnicas de hibridoma como, sem limitação, aquelas descritas por Roder et al. (Methods Enzymol., 121:140-167 (1986)).

Anticorpos humanizados

[0231]Alternativamente, em algumas modalidades, um anticorpo não humano pode ser humanizado, onde sequências ou regiões específicas do anticorpo são modificadas para aumentar a similaridade a um anticorpo naturalmente produzido em um ser humano. Por exemplo, na presente invenção, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode compreender um scFv de mamífero não humano. Em uma modalidade, a porção de domínio de ligação ao antígeno é humanizada.

[0232]Um anticorpo humanizado pode ser produzido usando uma variedade de técnicas conhecidas na arte, incluindo, sem limitação, enxerto CDR (vide, por exemplo, a Patente Europeia no EP 239,400; Publicação Internacional no WO 91/09967; e Patentes nos U.S. 5.225.539, 5.530.101 e 5.585.089, estando cada uma dessas incorporadas ao presente documento em suas totalidades a título de referência), folheamento ou recomposição (vide, por exemplo, as Patentes Europeias nos EP 592.106 e EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; e Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973, estando cada uma dessas incorporadas ao presente documento em suas totalidades a título de referência), embaralhamento de cadeia (vide, por exemplo, Patente no U.S. 5,565,332, estando incorporada ao presente documento em sua totalidade a título de referência), e as técnicas reveladas, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente no U.S. US2005/0042664, Publicação de Pedido de Patente no U.S. US2005/0048617, Patente no U.S. 6.407.213, Patente no U.S. 5.766.886, Publicação Internacional no WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), e Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994), estando cada uma dessas incorporadas ao presente documento em suas totalidades a título de referência. Geralmente, resíduos nas regiões de moldura serão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo doador CDR para alterar, de preferência, aperfeiçoar a ligação ao antígeno. Essas substituições de moldura são identificadas por métodos notórios na técnica, por exemplo, por modelagem das interações do CDR e resíduos de moldura para identificar resíduos de moldura importantes para ligação ao antígeno e comparação de sequência para identificar resíduos de moldura não usuais em posições particulares. (Vide, por exemplo, Queen et al., Patente no U.S. 5.585.089; e Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323, estando incorporadas ao presente documento em suas totalidades a título de referência.)

[0233]Um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo a partir de uma fonte que seja não humana. Esses resíduos de aminoácido não humanos são geralmente referidos como resíduos de “importação”, que são tipicamente tomados a partir de um domínio variável de “importação”. Logo, os anticorpos humanizados compreendem um ou mais CDRs de moléculas de imunoglobulina não humanas e regiões de moldura de humanos. A humanização de anticorpos é notória na técnica e pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), substituindo-se CDRs de roedores ou sequências de CDR pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano, isto é, enxerto CDR (EP 239.400; Publicação PCT no WO 91/09967; e Patentes nos U.S. 4.816.567; 6.331.415; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 6.548.640, estando os conteúdos incorporados ao presente documento em suas totalidades a título de referência). Nesses anticorpos quiméricos humanizados, substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos CDR e, possivelmente, alguns resíduos de moldura (FR) são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. A humanização de anticorpos também pode ser alcançada por folheamento ou recomposição (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); e Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) ou embaralhamento de cadeia (Patente no U.S. 5.565.332), estando os conteúdos incorporados ao presente documento em suas totalidades a título de referência.

[0234]A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leve como pesado, que será usada na produção de anticorpos humanizados serve para reduzir a antigenicidade. De acordo com o suposto método de “melhor ajuste”, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é triada em relação à biblioteca inteira de sequências de domínio variável humano conhecidas. A sequência humana que seja mais próxima àquela do roedor é, então, aceita como a moldura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987), estando os conteúdos incorporados ao presente documento em suas totalidades a título de referência). Outro método usa uma moldura particular derivada a partir da sequência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma moldura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993), estando os conteúdos incorporados ao presente documento em suas totalidades a título de referência).

[0235]Os anticorpos podem ser humanizados retendo alta afinidade pelo antígeno alvo e possuindo outras propriedades biológicas favoráveis. De acordo com um aspecto da invenção, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e familiares aos indivíduos versados na técnica. Programas computacionais se encontram disponíveis que ilustram e exibem prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de sequências de imunoglobulina candidata selecionada. A inspeção dessas exibições permite uma análise do papel de probabilidade dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para ligar o antígeno alvo. Dessa forma, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptoras e de importação ide modo que a característica de anticorpo desejada, tal como uma afinidade aumentada pelo antígeno alvo, seja alcançada. Em geral, os resíduos CDR são diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação ao antígeno.

[0236]Um anticorpo humanizado retém uma especificidade antigênica similar como o anticorpo original. No entanto, usando determinados métodos de humanização, a afinidade e/ou a especificidade de ligação do anticorpo ao antígeno alvo podem ser aumentadas usando métodos de “evolução direcionada,” conforme descrito por Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151 (1999), estando os conteúdos incorporados ao presente documento em suas totalidades a título de referência.

Vetores

[0237]Um vetor pode ser usado para introduzir o CAR em um monócito, macrófago ou célula dendrítica conforme descrito no presente documento. Em um aspecto, a invenção inclui um vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um CAR conforme descrito no presente documento. Em uma modalidade, o vetor compreende um vetor de plasmídeo, um vetor viral, retrotransposão (por exemplo, piggyback, sleeping beauty), vetor de inserção sítio- direcionado (por exemplo CRISPR, nucleases de dedo de Zn, TALEN), ou vetor de expressão suicida, ou outro vetor conhecido na técnica.

[0238]Todas as construções mencionadas anteriormente são capazes de duas plasmídeos de vetor lentiviral de terceira geração, outros vetores virais, ou RNA aprovado par auso em células humanas. Em uma modalidade, o vetor é um vetor viral, tal como um vetor lentiviral. Em outra modalidade, o vetor é um vetor de RNA.

[0239]A produção de qualquer uma das moléculas descritas no presente documento pode ser verificada por sequenciamento. A expressão das proteínas de comprimento completo pode ser verificada usando imunoblot, imuno-histoquímica, citometria de fluxo ou outra tecnologia bem conhecida e disponível na técnica.

[0240]A presente invenção também proporciona um vetor no qual o DNA da presente invenção é inserido. Vetores, incluindo aqueles derivados a partir de retrovírus como lentivírus, são ferramentas adequadas para alcançar uma transferência de gene a longo prazo visto que permitem uma integração estável a longo prazo de um transgene e sua propagação em células filhas. Os vetores lentivirais têm a vantagem adicional em relação a vetores derivados a partir de onco- retrovírus, como vírus de leucemia de murinos, caracterizados pelo fato de que podem transduzir células de não proliferação, como hepatócitos. Os mesmos também apresentam a vantagem adicional de resultar em baixa imunogenicidade no indivíduo no qual eles são introduzidos.

[0241]A expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos é tipicamente alcançada ligando-se operacionalmente um ácido nucleico ou porções do mesmo a um promotor, e incorporando-se a construção em um vetor de expressão. O vetor é geralmente capaz de replicação em uma célula de mamífero, e/ou também capaz de integração no genoma celular do mamífero. Vetores típicos contêm terminadores de transcrição e translação, sequências de iniciação, e promotores úteis para regulação da expressão da sequência de ácido nucleico desejada.

[0242]O ácido nucleico pode ser clonado em qualquer número de diferentes tipos de vetores. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser clonado em um vetor incluindo, sem limitação, um plasmídeo, um fagemídeo, um derivado de fago, um vírus animal, e um cosmídeo. Os vetores de interesse particular incluem vetores de expressão, vetores de replicação, vetores de geração de sonda e vetores de sequenciamento.

[0243]O vetor de expressão pode ser proporcionado a uma célula sob a forma de um vetor viral. A tecnologia de vetor viral é notória na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 a 4, Cold Spring Harbor Press, NY), e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Os vírus, que são úteis como vetores incluem, mas não se limitam a, retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados, vírus da herpes e lentivírus. Em geral, um vetor adequado contém uma origem de replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promotora, sítios de endonuclease de restrição conveniente, e um ou mais marcadores selecionáveis, (por exemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; e Patente no U.S. 6.326.193).

[0244]Elementos promotores adicionais, por exemplo, acentuadores, regulam a frequência de iniciação transcricional. Tipicamente, os mesmos ficam situados na região 30-110 bp a montante do sitio inicial, embora uma série de promotores tenham sido recentemente mostrados contendo elementos funcionais a jusante do sítio inicial. O espaçamento entre os elementos promotores frequentemente é flexível, de modo que a função do promotor seja preservada quando elementos forem invertidos ou movidos um em relação ao outro. No promotor de timidina quinase (tk), o espaçamento entre os elementos promotores pode ser aumentado para 50 bp antes que a atividade comece a declinar. Dependendo do promotor, parece que elementos individuais podem funcionar seja cooperativa ou independentemente para ativar a transcrição.

[0245]Um exemplo de um promotor é a sequência promotora de citomegalovírus precoce imediato (CMV). Essa sequência promotora é uma sequência promotora constitutiva forte capaz de acionar altos níveis de expressão de qualquer sequência de polinucleotídeo operacionalmente ligada à mesma. No entanto, outras sequências promotoras constitutivas também podem ser usadas, incluindo, sem limitação, promotor precoce de vírus 40 de símios (SV40), vírus tumoral mamário de camundongo (MMTV), promotor de repetição terminal longa (LTR) de vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor MoMuLV, um promotor de vírus de leucemia em aves, um promotor precoce imediato do vírus de Epstein- Barr, um promotor do vírus de sarcoma de Rous, o promotor de fator-lα de alongamento, bem como promotores de gene humano como, sem limitação, o promotor de actina, o promotor de miosina, o promotor de hemoglobina, e o promotor de creatina quinase. Ademais, a invenção não deve se limitar ao uso de promotores constitutivos. Os promotores induzíveis também são contemplados como parte da invenção. O uso de um promotor induzível proporciona uma comutação molecular capaz de ativar a expressão da sequência de polinucleotídeo que é operacionalmente ligada quando essa expressão for desejada, ou desativar a expressão quando a mesma não for desejada. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não se limitam a, um promotor de metalotionina, um promotor de glucocorticoide, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina.

[0246]A fim de avaliar a expressão de um polipeptídeo ou porções do mesmo, o vetor de expressão a ser introduzido em uma célula também pode conter um gene marcador selecionável ou um gene repórter, ou ambos, para facilitar a identificação e a seleção de células de expressão da população de células que se imagina ser transfectada ou infectada através de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser transportado em um pedaço separado de DNA e usado em um procedimento de co-transfecção. Tanto os marcadores selecionáveis como os genes repórteres podem ser flanqueados com sequências regulatórias apropriadas para permitir a expressão nas células hospedeiras. Os marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes resistentes a antibiótico, como neo e similares.

[0247]Os genes repórteres sã usados para identificar células potencialmente transfectadas e para avaliar a funcionalidade de sequências regulatórias. Em geral, um repórter é um gene que não está presente nem é expressado pelo organismo ou tecido receptor e que codifica um polipeptídeo cuja expressão é manifestada por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A expressão do gene repórter é avaliada em um tempo adequado após o DNA ter sido introduzido nas células receptoras. Os genes repórteres adequados podem incluir genes que codificam luciferase, beta-galactosidase, cloranfenicol acetil transferase, fosfatase alcalina secretada, ou gene de proteína fluorescente verde (por exemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Os sistemas de expressão adequados são notórios e podem ser preparados usando técnicas conhecidas ou comercialmente obtidas. Em geral, a construção com a região de flanqueamento 5' mínima que mostra o maior nível de expressão de gene repórter é identificada como o promotor. Essas regiões promotoras podem ser ligadas a um gene repórter e usadas para avaliar agentes para a capacidade de modular uma transcrição acionada por promotor.

Introdução de ácidos nucleicos

[0248]Em um aspecto, a invenção inclui um método para modificar uma célula que compreende introduzir um receptor de antígeno quimérico (CAR) no monócito, macrófago ou célula dendrítica, em que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar e um domínio intracelular de uma molécula co-estimulatória, e em que a célula é um monócito, macrófago ou célula dendrítica que expressa o CAR e possui atividade efetora direcionada. Em uma modalidade, introduzir o CAR na célula compreende introduzir uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR. Em outra modalidade, introduzir a sequência de ácido nucleico compreende eletroporar um mRNA que codifica o CAR.

[0249]Os métodos para introduzir e expressar genes, como CAR, em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser prontamente introduzido em uma célula hospederia, por exemplo, célula de mamífero, bacteriana, levedura ou inseto por qualquer método na técnica. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido em uma célula hospedeira por meios físicos, químicos ou biológicos.

[0250]Os métodos físicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeamento de partícula, microinjeção, eletroporação, e similares. Os métodos para produzir células que compreendem vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são notórios na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 a 4, Cold Spring Harbor Press, NY). Os ácidos nucleicos podem ser introduzidos em células alvo usando métodos comercialmente disponíveis que incluem eletroporação (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Alemanha)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass., EUA) ou Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo., EUA), Multiporator (Eppendort, Hamburgo, Alemanha). Os ácidos nucleicos também podem ser introduzidos em células usando transfecção mediada por lipossomo catiônico usando lipofecção, usando encapsulação de polímero, usando transfecção mediada por peptídeo, ou usando sistemas de entrega de partículas biolísticas como “pistolas de gene” (vide, por exemplo, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).

[0251]Os métodos biológicos para introduzir um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Os vetores de RNA incluem vetores tendo um promotor de RNA e/ outros domínios relevantes para produção de uma transcrição de RNA. Os vetores virais, e, essencialmente, vetores retrovirais, se tornaram o método mais amplamente usado para inserir genes em células de mamíferos, por exemplo, seres humanos. Outros vetores virais podem ser derivados a partir de lentivírus, poxvírus, vírus herpes simplex, adenovírus e vírus adeno-associados, e similares. Vide, por exemplo, as Patentes nos U.S. 5.350.674 e 5.585.362.

[0252]Os meios químicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, tais como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, esferas, e sistemas baseado em lipídeos incluindo emulsões óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomos. Um sistema coloidal exemplificador para uso como um veículo de entrega in vitro e in vivo consiste em um lipossomo (por exemplo, uma vesícula membranar artificial).

[0253]No caso onde um sistema de entrega não viral é utilizado, um veículo de entrega exemplificador é um lipossomo. O uso de formulações de lipídeo é contemplado para a introdução dos ácidos nucleicos em uma célula hospedeira (in vitro, ex vivo ou in vivo). Em outro aspecto, o ácido nucleico pode ser associado a um lipídeo. O ácido nucleico associado a um lipídeo pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossomo, intercalado na bicamada de lipídeo de um lipossomo, fixado a um lipossomo através de uma molécula de ligação que é associada ao lipossomo e ao oligonucleotídeo, aprisionado em um lipossomo, complexado com um lipossomo, disperso em uma solução contendo um lipídeo, misturado com um lipídeo, combinado com um lipídeo, contido como uma suspensão em um lipídeo, contido ou complexado com uma micela, ou, de outro modo, associado a um lipídeo. Composições associadas a lipídeo, lipídeo/DNA ou lipídeo/vetor de expressão não se limitam a qualquer estrutura particular em uma solução. Por exemplo, eles podem estar presentes em uma estrutura de bicamada, como micelas, ou com uma estrutura “colapsada”. Os mesmos podem ser simplesmente intercalados em uma solução, possivelmente formando agregados que não sejam uniformes em tamanho ou formato. Os lipídeos são substâncias graxas que podem ser lipídeos de ocorrência natural ou sintéticos. Por exemplo, os lipídeos incluem gotículas graxas que ocorrem naturalmente no citoplasma, bem como a casse de compostos que contém hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, tais como ácidos graxos, álcoois, aminas, amino álcoois e aldeídos

[0254]Os lipídeos adequados para uso podem ser obtidos a partir de fontes comerciais. Por exemplo, dimiristil fosfatidilcolina (“DMPC”) pode ser obtido junto a Sigma, St. Louis, MO, EUA; dicetil fosfato (“DCP”) pode ser obtido junto a K & K Laboratories (Plainview, NY, EUA); colesterol (“Choi”) pode ser obtido junto a Calbiochem-Behring; dimiristil fosfatidilglicerol (“DMPG”) e outros lipídeos podem ser obtidos junto a Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL., EUA). Soluções estoque de lipídeos em clorofórmio ou clorofórmio/metanol podem ser armazenadas a cerca de -200C. O clorofórmio é usado como o único solvente visto que é mais prontamente evaporado do que metanol. “Lipossomo” é um termo genérico que abrange uma variedade de veículos de lipídeo único e multilamelar formados pela geração de bicamadas de lipídeo confinadas ou agregados. Os lipossomos podem ser caracterizados como tendo estruturas vesiculares com uma membrana de bicamada de fosfolipídeo e um meio aquoso interno. Os lipossomos multilamelares têm múltiplas camadas de lipídeo separadas por um meio aquoso. Eles se formam espontaneamente quando fosfolipídeos forem suspensos em um excesso de solução aquosa. Os componentes de lipídeo são submetidos à auto-redisposição antes da formação de estruturas fechadas e aprisionam água e solutos dissolvidos entre as bicamadas de lipídeo (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). No entanto, as composições que têm estruturas diferentes em solução em relação à estrutura vesicular normal também são abrangidas. Por exemplo, os lipídeos podem assumir uma estrutura micelar ou meramente existir como agregados não uniformes de moléculas de lipídeo. Contemplam-se, também, complexos de lipofectamina- ácido nucleico.

[0255]Independentemente do método usado para introduzir ácidos nucleicos exógenos em uma célula hospedeira ou, de outro modo, expor uma célula às moléculas descritas no presente documento, a fim de confirmar a presença dos ácidos nucleicos na célula hospedeira, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Esses ensaios incluem, por exemplo, ensaios “biológicos moleculares” bem conhecidos pelos indivíduos versados na técnica, tais como Southern e Northern blotting, RT-PCR e PCR; ensaios “bioquímicos”, como detectar a presença ou ausência de um peptídeo particular, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e Western blots) ou por ensaios descritos no presente documento para identificar agentes que se enquadram no escopo da invenção.

[0256]Em uma modalidade, uma ou mais sequências de ácido nucleico são introduzidas por um método selecionado a partir do grupo que consiste em transduzir a população de células, transfectar a população de células, e eletroporar a população de células. Em uma modalidade, uma população de células compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico descritas no presente documento.

[0257]Em uma modalidade, os ácidos nucleicos introduzidos na célula são RNA. Em outra modalidade, o RNA é mRNA que compreende RNA transcrito in vitro ou RNA sintético. O RNA é produzido por transcrição in vitro usando um template gerado por reação em cadeia de polimerase (PCR). DNA de interesse de qualquer fonte pode ser diretamente convertido por PCR em um template para síntese de mRNA in vitro usando iniciadores apropriados e RNA polimerase. A fonte do DNA pode ser, por exemplo, DNA genômico, DNA de plasmídeo, DNA de fago, cDNA, sequência de DNA sintético ou qualquer outra fonte apropriada de DNA. O template desejado para transcrição in vitro é um CAR.

[0258]PCR pode ser usado para gerar um template para transcrição in vitro de mRNA que é, então, introduzido em células. Os métodos para realizar PCR são bem conhecidos na técnica. Os iniciadores para uso em PCR são projetados para ter regiões que sejam substancialmente complementares a regiões do DNA a ser usado como um template para o PCR. “Substancialmente complementar”, conforme o uso em questão, se refere a sequências de nucleotídeos onde a maioria ou todas as bases na sequência de iniciador é complementar, ou uma ou mais bases são não complementares, ou defasados. Sequências substancialmente complementares são capazes de têmpera ou se hibridizarem com o alvo de DNA pretendido sob condições de têmpera usadas para PCR. Os iniciadores podem ser projetados para que sejam substancialmente complementares a qualquer porção do template de DNA. Por exemplo, os iniciadores podem ser projetados para amplificar a porção de um gene que seja normalmente transcrito em células (a fase de leitura aberta), incluindo 5' e 3' UTRs. Os iniciadores também podem ser projetados para amplificar uma porção de um gene que codifica um domínio de interesse particular. Em uma modalidade, os iniciadores são projetados para amplificar a região de codificação de um cDNA humano, incluindo todos ou porções dos 5' e 3' UTRs. Os iniciadores úteis para PCR são gerados por métodos sintéticos que sejam bem conhecidos na técnica. “Iniciadores dianteiros” são iniciadores que contêm uma região de nucleotídeos que sejam substancialmente complementares a nucleotídeos no template de DNA que estão a montante da sequência de DNA que deve ser amplificada. “A montante” é usado no presente documento para se referir a um local 5, à sequência de DNA a ser amplificada em relação ao filamento de codificação. “Iniciadores reversos” são iniciadores que contêm uma região de nucleotídeos que sejam substancialmente complementares a um template de DNA de fita dupla que estejam a jusante da sequência de DNA que deve ser amplificada. O termo “a jusante” é usado no presente documento para se referir a um local 3' à sequência de DNA a ser amplificada em relação ao filamento de codificação.

[0259]As estruturas químicas que têm a capacidade de promover estabilidade e/ou eficiência de translação do RNA também podem ser usadas. De preferência, o RNA tem 5' e 3' UTRs. Em uma modalidade, o 5' UTR está entre zero e 3000 nucleotídeos de comprimento. O comprimento de sequências 5' e 3' UTR a serem adicionadas à região de codificação pode ser alterado por diferentes métodos, incluindo, sem limitação, projetar iniciadores para PCR que sofrem têmpera em diferentes regiões dos UTRs. Usando essa abordagem, um indivíduo com conhecimento comum na técnica pode modificar os comprimentos de 5' e 3' UTR exigidos para alcançarem uma eficiência de translação ideal seguindo a transfecção do RNA transcrito.

[0260]Os 5' e 3' UTRs podem ser de ocorrência natural, 5' e 3' UTRs endógenos para o gene de interesse. Alternativamente, as sequências de UTR que não sejam endógenas ao gene de interesse podem ser adicionadas incorporando-se as sequências de UTR nos iniciadores dianteiros e reversos ou por quaisquer outras modificações do template. O uso de sequências de UTR que não são endógenas ao gene de interesse pode ser útil para modificar a estabilidade e/ou a eficiência de translação do RNA. Por exemplo, sabe-se que elementos ricos em AU em sequências de 3' UTR podem reduzir a estabilidade de mRNA. Portanto, 3' UTRs podem ser selecionados ou projetados para aumentar a estabilidade do RNA transcrito com base nas propriedades de UTRs que são bem conhecidos na técnica.

[0261]Em uma modalidade, o 5' UTR pode conter a sequência de Kozak do gene endógeno. Alternativamente, quando um 5' UTR que não seja endógeno ao gene de interesse estiver sendo adicionado por PCR conforme descrito anteriormente, uma sequência de Kozak consenso pode ser reprojetada adicionando-se a sequência de 5' UTR. As sequências de Kozak podem aumentar a eficiência de translação de algumas transcrições de RNA, mas não parece que é necessário que todos os RNAs permitam uma translação eficiente. A exigência por sequências de Kozak para muitos mRNAs é conhecida na técnica. Em outras modalidades, o 5' UTR pode ser derivado a partir de um vírus de RNA cujo genoma de RNA é estável em células. Em outras modalidades, vários análogos de nucleotídeo podem ser usados no 3' ou 5' UTR para impedir a degradação de exonuclease do mRNA.

[0262]Para permitir a síntese de RNA a partir de um template de DNA sem a necessidade por clonagem de gene, um promotor de transcrição deve ser ligado ao template de DNA a montante da sequência a ser transcrita. Quando uma sequência que funciona como um promotor para uma RNA polimerase for adicionada à extremidade 5' do iniciador dianteiro, o promotor de RNA polimerase se torna incorporado ao produto PCR a montante da fase de leitura aberta que deve ser transcrita. Em uma modalidade, o promotor é um promotor T7 polimerase, conforme descrito no presente documento. Outros promotores úteis incluem, mas não se limitam a, promotores de RNA polimerase T3 e SP6. As sequências de nucleotídeo consenso para promotores T7, T3 e SP6 são conhecidas na técnica.

[0263]Em uma modalidade, o mRNA tem uma terminação na extremidade 5' e uma cauda 3' poli(A) que determina a ligação de ribossomo, iniciação de translação e estabilidade de mRNA na célula. Em um template de DNA circular, por exemplo, o DNA de plasmídeo, RNA polimerase produzem um produto concatamérico longo que não é adequado para expressão em células eucarióticas. A transcrição de DNA de plasmídeo linearizado na extremidade do 3' UTR resulta em mRNA de tamanho normal que não seja eficaz em transfecção eucariótica mesmo se for poliadenilado após transcrição.

[0264]Em um template de DNA linear, RNA polimerase de fago T7 pode estender a extremidade 3' da transcrição além da última base do template (Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).

[0265]O método convencional de integração de estiramentos poliA/T em um template de DNA é a clonagem molecular. No entanto, a sequência poliA/T integrada ao DNA de plasmídeo pode causar instabilidade de plasmídeo, sendo esse o motivo pelo qual os templates de DNA de plasmídeo obtidos a partir de células bacterianas são geralmente altamente contaminados com deleções e outras aberrações. Isso torna procedimentos de clonagem não apenas trabalhosos e demorados, mas geralmente não confiáveis. Esse é o motivo pelo qual permite-se uma construção de templates de DNA com um estiramento poliA/T 3' sem uma clonagem altamente desejável.

[0266]O segmento poliA/T do template de DNA transcricional pode ser produzido durante PCR utilizando-se um iniciador reverso contendo uma cauda poliT, como a cauda 100T (o tamanho pode ser de 50-5000 T), ou após PCR por qualquer outro método, incluindo, sem limitação, ligação de DNA ou recombinação in vitro. As caudas poli(A) também proporcionam estabilidade aos RNAs e reduzem sua degradação. Em geral, o comprimento de uma cauda poli(A) se correlaciona positivamente com a estabilidade do RNA transcrito. Em uma modalidade, a cauda poli(A) está entre 100 e 5000 adenosinas.

[0267]As caudas poli(A) de RNAs podem ser adicionalmente estendidas seguindo uma transcrição in vitro com o uso de uma polimerase poli(A), tal como E. coli poliA polimerase (E-PAP). Em uma modalidade, aumentar o comprimento de uma cauda poli(A) de 100 nucleotídeos a entre 300 e 400 nucleotídeos resulta em cerca de um aumento de duas vezes na eficiência de translação do RNA. Adicionalmente, a ligação de diferentes grupos químicos à extremidade 3' pode aumentar a estabilidade de mRNA. Essa ligação pode conter nucleotídeos modificados/artificiais, aptâmeros e outros compostos. Por exemplo, análogos de ATP podem ser incorporados na cauda poli(A) usando poli(A) polimerase. Os análogos de ATP podem aumentar adicionalmente a estabilidade do RNA.

[0268]As terminações 5' também proporcionam estabilidade a moléculas de RNA. Em uma modalidade preferencial, RNAs produzidos pelos métodos revelados no presente documento incluem uma terminação 5'. A terminação 5' é proporcionada usando técnicas conhecidas na técnica e descritas no presente documento (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

[0269]Os RNAs produzidos pelos métodos revelados no presente documento também podem conter uma sequência de sítio de entrada de ribossomo interno (IRES). A sequência IRES pode ser qualquer sequência projetada viral, cromossômica ou artificial que inicia o ribossomo independente de terminação que se liga ao mRNA e facilita a iniciação de translação. Quaisquer solutos adequados para eletroporação celular, que pode conter fatores que facilitam a permeabilidade e a viabilidade celular como açúcares, peptídeos, lipídeos, proteínas, antioxidantes e tensoativos podem ser incluídos.

[0270]Alguns vetores de RNA transcritos in vitro (IVT-RNA) são conhecidos na literatura que são utilizados de maneira padronizada como um template para transcrição in vitro e que foram geneticamente modificados de modo que as transcrições de RNA estabilizado sejam produzidas. Atualmente, os protocolos usados na técnica se baseiam em um vetor de plasmídeo com a estrutura a seguir: um promotor de 5' RNA polimerase que permite transcrição de RNA, seguido por um gene de interesse que é flanqueado seja 3' e/ou 5' por regiões não transladadas (UTR), e um cassete de 3' poliadenil contendo de 50 a 70 A nucleotídeos. Antes da transcrição in vitro, o plasmídeo circular é linearizado a jusante do cassete de poliadenil por enzimas de restrição tipo II (sequência de reconhecimento corresponde ao sítio de clivagem). Logo, o cassete de poliadenil corresponde à última sequência poli(A) na transcrição. Como resultado desse procedimento, alguns nucleotídeos permanecem como parte do sítio de clivagem de enzima após a linearização e estendem ou mascaram a sequência poli(A) na extremidade 3'. Não fica claro se esse overhang não fisiológico afeta a quantidade de proteína produzida intracelularmente a partir dessa construção.

[0271]Em um aspecto, a construção de RNA é entregue nas células por eletroporação. Vide, por exemplo, as formulações e metodologia de eletroporação de construções de ácido nucleico em células de mamífero conforme ensinado em US 2004/0014645, US 2005/0052630A1, US 2005/0070841A1, US 2004/0059285A1, US 2004/0092907A1. Os vários parâmetros incluindo resistência de campo elétrico necessária para eletroporação de qualquer tipo celular são geralmente conhecidos na literatura de pesquisa relevante bem como várias patentes e pedidos no campo. Vide, por exemplo, a Patente no U.S. 6.678.556, Patente no U.S. 7.171.264, e Patente no U.S. 7.173.116. O aparelho para aplicação terapêutica de eletroporação se encontra comercialmente disponível, por exemplo, como o Sistema de Terapia de Eletroporação de DNA MedPulser™ (Inovio/Genetronics, San Diego, Calif., EUA), e é descrito em patentes como Patente no U.S. 6.567.694; Patente no U.S. 6.516.223, Patente no U.S. 5.993.434, Patente no U.S. 6.181.964, Patente no U.S. 6.241.701, e Patente no U.S. 6.233.482; a eletroporação também pode ser usada para transfecção de células in vitro conforme descrito, por exemplo, em US20070128708A1. A eletroporação também pode ser utilizada para entregar ácidos nucleicos em células in vitro. De modo correspondente, a administração mediada por eletroporação em células de ácidos nucleicos incluindo construções de expressão utilizando qualquer dentre os múltiplos dispositivos disponíveis e sistemas de eletroporação conhecidos pelos indivíduos versados na técnica apresentam um novo meio animador para entregar um RNA de interesse a uma célula alvo.

Fontes de Células

[0272]Em uma modalidade, células fagocíticas são usadas nas composições e métodos descritos no presente documento. Uma fonte de células fagocíticas, tais como monócitos, macrófagos e/ou células dendríticas, é obtida a partir de um indivíduo. Exemplos não limitantes de indivíduos incluem seres humanos, cães, gatos, camundongos, ratos e espécies transgênicas dos mesmos. De preferência, o indivíduo é um ser humano. As células podem ser obtidas a partir de uma série de fontes, incluindo células mononucleares de sangue periférico, medula óssea, tecido de linfonodo, tecido do baço, cordão umbilical e tumores. Em determinadas modalidades, pode-se usar qualquer número de monócito, macrófago, célula dendrítica ou linhagens celulares progenitoras disponíveis na técnica. Em determinadas modalidades, as células podem ser obtidas a partir de uma unidade de sangue coletado a partir de um indivíduo usando qualquer número de técnicas conhecidas pelos artesãos versados, tal como separação de Ficoll. Em uma modalidade, as células do sangue em circulação de um indivíduo são obtidas por aferese ou leucaferese. Tipicamente, o produto de aferese contém linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, hemácias e plaquetas. As células coletadas por aferese podem ser lavadas para remover a fração de plasma e colocar as células em um tampão ou meio apropriado, como uma solução salina tamponada de fosfato (PBS) ou uma solução de lavagem desprovida de cálcio e pode ser desprovida de magnésio ou pode ser desprovida de muitos, senão todos, os cátions divalentes, para etapas de processamento subsequentes. Após a lavagem, as células podem ser ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis, como, por exemplo, PBS isento de Ca, isento de Mg. Alternativamente, os componentes indesejáveis da amostra de aferese podem ser removidos e as células diretamente ressuspensas em um meio de cultura.

[0273]Em outra modalidade, as células são isoladas do sangue periférico lisando-se as hemácias e depletando-se os linfócitos e hemácias, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente PERCOLL™. Alternativamente, as células podem ser isoladas do cordão umbilical. Em qualquer evento, uma subpopulação específica dos monócitos, macrófagos e/ou células dendríticas pode ser adicionalmente isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa.

[0274]As células mononucleares isoladas podem ser depletadas de células que expressam determinados antígenos, incluindo, sem limitação, CD34, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 ou CD20. A depleção dessas células pode ser realizada usando um anticorpo isolado, uma amostra biológica que compreende um anticorpo, tal como fluido de ascites, um anticorpo ligado a um suporte físico, e um anticorpo ligado à célula.

[0275]O enriquecimento de uma população de monócito, macrófago e/ou célula dendrítica por seleção negativa pode ser realizado usando uma combinação de anticorpos direcionados para marcadores superficiais exclusivos às células negativamente selecionadas. Um método preferencial é a classificação e/ou seleção celular através de imunoaderência magnética negativa ou citometria de fluxo que usa um coquetel de anticorpos monoclonais direcionados a marcadores de superfície celular presentes nas células negativamente selecionadas. Por exemplo, o enriquecimento de uma população celular para monócitos, macrófagos e/ou células dendríticas por seleção negativa pode ser realizado usando um coquetel de anticorpo monoclonal que tipicamente inclui anticorpos a CD34, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19 ou CD20.

[0276]Durante o isolamento de uma população desejada de células por seleção positiva ou negativa, a concentração de células e superfície (por exemplo, partículas como microesferas) pode ser variada. Em determinadas modalidades, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual as microesferas e células são misturadas (isto é, aumentar a concentração de células), garantir um contato máximo das células e microesferas. Por exemplo, em uma modalidade, utiliza-se uma concentração de 2 bilhões de células/ml. Em uma modalidade, utiliza- se uma concentração de 1 bilhão de células /ml. Em uma a modalidade adicional, mais de 100 milhões de células/ml são usadas. Em uma modalidade adicional, utiliza-se uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 milhões de células/ml. Em ainda outra modalidade, utiliza-se uma concentração de células de 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/ml. Em modalidades adicionais, podem-se usar concentrações de 125 ou 150 milhões de células/ml. O uso de altas concentrações de células pode resultar em um rendimento celular aumentado, ativação celular e expansão celular.

[0277]Em uma modalidade, uma população de células compreende os monócitos, macrófagos ou células dendríticas da presente invenção. Exemplos de uma população de células incluem, mas não se limitam a, células mononucleares de sangue periférico, células sanguíneas de cordão umbilical, uma população purificada de monócitos, macrófagos ou células dendríticas, e uma linhagem celular. Em outra modalidade, as células mononucleares de sangue periférico compreendem a população de monócitos, macrófagos, ou células dendríticas. Em ainda outra modalidade, as células purificadas compreendem a população de monócitos, macrófagos ou células dendríticas.

[0278]Em outra modalidade, as células têm marcadores M1 suprarregulados (upregulated) e marcadores M2 infrarregulados (downregulated). Por exemplo, pelo menos um marcador M1, tal como HLA DR, CD86, CD80 e PDL1, é suprarregulado (upregulated) na célula fagocítica. Em outro exemplo, pelo menos um marcador M2, como CD206, CD163, é infrarregulado (downregulated) na célula fagocítica. Em uma modalidade, as células têm pelo menos um marcador M1 suprarregulado (upregulated) e pelo menos um marcador M2 infrarregulado (downregulated).

[0279]Em ainda outra modalidade, a atividade efetora direcionada na célula fagocítica é aprimorada pela inibição da atividade de CD47 ou SIRPα. A atividade de CD47 e/ou SIRPα pode ser inibida tratando-se a célula fagocítica com um anticorpo anti-CD47 ou anti-SIRPα. Alternativamente, a atividade de CD47 ou SIRPα pode ser inibida por qualquer método conhecido pelos indivíduos versados na técnica.

Expansão de células

[0280]Em uma modalidade, as células ou população de células que compreende monócitos, macrófagos ou células dendríticas são culturadas para expansão. Em outra modalidade, as células ou população de células que compreende células progenitoras são culturadas para diferenciação e expansão de monócitos, macrófagos ou células dendríticas. A presente invenção compreende expandir uma população de monócitos, macrófagos ou células dendríticas que compreendem um receptor de antígeno quimérico conforme descrito no presente documento.

[0281]Conforme demonstrado pelos dados revelados no presente documento, a expansão das células pelos métodos revelados no presente documento pode ser multiplicada por cerca de 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1.000 vezes, 2.000 vezes, 3.000 vezes, 4.000 vezes, 5.000 vezes, 6.000 vezes, 7.000 vezes, 8.000 vezes, 9.000 vezes, 10.000 vezes, 100.000 vezes, 1.000.000 vezes, 10.000.000 vezes, ou maior, e qualquer e todos os números inteiros ou parciais entre esses intervalos. Em uma modalidade, as células se expandem na faixa de cerca de 20 vezes a cerca de 50 vezes.

[0282]Após a cultura, as células podem ser incubadas em um meio celular em um aparelho de cultura por um período de tempo ou até que as células alcancem uma confluência ou alta densidade celular para passagem ideal antes de passar as células a outro aparelho de cultura. O aparelho de cultura pode ser qualquer aparelho de cultura comumente usado para culturar células in vitro. De preferência, o nível de confluência é 70% ou maior antes de passar as células a outro aparelho de cultura. Com mais preferência, o nível de confluência é 90% ou maior. Um período de tempo pode ser qualquer tempo adequado para a cultura de células in vitro. O meio de cultura pode ser substituído durante a cultura das células em qualquer tempo. De preferência, o meio de cultura é substituído cerca de a cada 2 a 3 dias. As células são, então, colhidas do aparelho de cultura ao qual as células podem ser usadas imediatamente ou armazenadas para uso em um momento posterior.

[0283]A etapa de cultura conforme descrito no presente documento (contato com agentes conforme descrito no presente documento) pode ser muito curta, por exemplo, menor que 24 horas, como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 horas. A etapa de cultura conforme descrito no presente documento (contanto com agentes conforme descrito no presente documento) pode ser mais longa, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou mais dias.

[0284]Em uma modalidade, as células podem ser culturadas por várias horas (cerca de 3 horas) a cerca de 14 dias ou qualquer valor horário inteiro entre esse intervalo. As condições apropriadas para cultura celular incluem um meio apropriado (por exemplo, meio completo de macrófago, DMEM/F12, DMEM/F12-10 (Invitrogen)) que pode conter fatores necessários para proliferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, soro bovino fetal ou humano), L-glutamina, insulina, M- CSF, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF-beta, e TNF-α. ou quaisquer outros aditivos para o crescimento de células conhecidos pelos artesãos versados. Outros aditivos para o crescimento de células incluem, mas não se limitam a, tensoativo, plasmanato, e agentes de redução como N-acetil-cisteina e 2-mercaptoetanol. Os meios podem incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, e X- Vivo 20, Optimizer, com aminoácidos adicionados, piruvato de sódio, e vitaminas, sejam isentas de soro ou suplementadas com uma quantidade apropriada de soro (ou plasma) ou um conjunto definido de hormônios, e/ou uma quantidade de citocinas suficiente para o crescimento e expansão das células. Antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina, são incluídos somente em culturas experimentais, não em culturas de células que devam ser infundidas em um indivíduo. As células alvo são mantidas sob condições necessárias para suportar o crescimento, por exemplo, uma temperatura apropriada (por exemplo, 37° C) e atmosfera (por exemplo, ar mais 5% de CO2).

[0285]O meio usado para culturar as células pode incluir um agente que pode ativar as células. Por exemplo, um agente que seja conhecido na técnica para ativar o monócito, macrófago ou célula dendrítica é incluído no meio de cultura.

Terapia

[0286]As células modificadas descritas no presente documento podem ser incluídas em uma composição para tratamento de um indivíduo. Em um aspecto, a composição compreende a célula modificada que compreende o receptor de antígeno quimérico descrito no presente documento. A composição pode incluir uma composição farmacêutica e incluir, ainda, um carreador farmaceuticamente aceitável. Pode-se administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica que compreende as células modificadas.

[0287]Em um aspecto, a invenção inclui um método para tratar uma doença ou afecção associada a um tumor ou câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende a célula modificada descrita no presente documento. Em outro aspecto, a invenção inclui um método para tratar um tumor sólido em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende a célula modificada descrita no presente documento. Em outro aspecto, a invenção inclui um método para estimular uma resposta imune a uma célula tumoral alvo ou tecido tumoral em um indivíduo que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende a célula modificada descrita no presente documento. Em ainda outro aspecto, a invenção inclui o uso da célula modificada descrita no presente documento na fabricação de um medicamento destinado ao tratamento de uma resposta imune em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em ainda outro aspecto, a invenção inclui o uso da célula modificada descrita no presente documento na fabricação de um medicamento destinado ao tratamento de um tumor ou câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[0288]As células modificadas geradas conforme descrito no presente documento possuem atividade efetora direcionada. Em uma modalidade, as células modificadas têm uma atividade efetora direcionada voltada contra um antígeno em uma célula alvo, como através de uma ligação específica a um domínio de ligação ao antígeno de um CAR. Em outra modalidade, a atividade efetora direcionada inclui, mas não se limita a, fagocitose, citotoxicidade celular direcionada, apresentação de antígeno e secreção de citocina.

[0289]Em outra modalidade, a célula modificada descrita no presente documento tem a capacidade de entregar um agente, um agente biológico ou um agente terapêutico ao alvo. A célula pode ser modificada ou modificada por engenharia genética para entregar um agente a um alvo, em que o agente é selecionado a partir do grupo que consiste em um ácido nucleico, um antibiótico, um agente anti-inflamatório, um anticorpo ou fragmentos de anticorpo do mesmo, um fator de crescimento, uma citocina, uma enzima, uma proteína, um peptídeo, uma proteína de fusão, uma molécula sintética, uma molécula orgânica, um carboidrato, ou similares, um lipídeo, um hormônio, um microssomo, um derivado ou uma variação do mesmo, e qualquer combinação dos mesmos. Como um exemplo não limitante, um macrófago modificado com um CAR que direciona um antígeno tumoral é capaz de secretar um agente, como uma citocina ou anticorpo, para auxiliar na função de macrófago. Anticorpos, como mAB anti-CD47/antiSIRPα, também podem auxiliar na função de macrófago. Em ainda outro exemplo, o macrófago modificado com um CAR que direciona um antígeno tumoral é modificado por engenharia genética para codificar um siRNA que auxilia a função de macrófago infraregulando- se genes inibitórios (isto é, SIRPα). Outro exemplo, o macrófago CAR é modificado por engenharia genética para expressar uma versão negativa dominante (ou, de outro modo, mutada) de um receptor ou enzima que auxilia na função de macrófago.

[0290]Em uma modalidade, o macrófago é modificado por múltiplos genes, em que pelo menos um gene inclui um CAR e pelo menos outro gene compreende um elemento genético que aprimora a função de macrófago CAR. Em outra modalidade, o macrófago é modificado por múltiplos genes, em que pelo menos um gene inclui um CAR e pelo menos outro gene auxilia ou reprograma a função de outras células imunes (como células T em um microambiente de tumor).

[0291]Ademais, as células modificadas podem ser administradas a um animal, de preferência, um mamífero, com ainda mais preferência, um ser humano, para suprimir uma reação imune, como aquela comum a doenças autoimunes como as diabetes, psoríase, artrite reumatoide, esclerose múltipla, GVHD, indução de tolerância de aloenxerto de aprimoramento, rejeição a transplante, e similares. Além disso, as células da presente invenção podem ser usadas para tratar qualquer afecção na qual uma resposta imune reduzida ou, de outro modo, inibida, especialmente uma resposta imune mediada por célula, é desejável para tratar ou aliviar a doença. Em um aspecto, a invenção inclui tratar uma afecção, como uma doença autoimune, em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende uma população das células descritas no presente documento. Além disso, as células da presente invenção podem ser administradas como pré- tratamento ou condicionamento antes do tratamento com uma imunoterapia anticâncer alternativa, incluindo, sem limitação, células T CAR, linfócito infiltrante de tumor, ou um inibidor de ponto de verificação.

[0292]Exemplos de doenças autoimunes incluem, mas não se limitam a, Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA, que é uma doença viral com um componente autoimune), alopecia areata, espondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídica, doença de Addison autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune do ouvido interno (AIED), síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS), púrpura trombocitopênica autoimune (ATP), doença de Behcet, cardiomiopatia, dermatite hepetiforme; síndrome de disfunção imune de fadiga crônica (CFIDS), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIPD), pendigigênio cicatricial, doença aglutinina fria, síndrome da crista, doença de Crohn, doença de Degos, dermatomiosite-juvenil, lúpus discoide, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, doença de Graves, síndrome de Guillain- Barre, tireoidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura de trombocitopenia idiopática (ITP), nefropatia de IgA, diabetes mellitus insulino- dependente, artrite crônica juvenil (doença de Still), artrite reumatóide juvenil, doença de Meniere, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, miastenia gravis, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, policondrite, síndromes poligelares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, febre reumática, artrite reumatóide, sarcoidose, escleroderma (esclerose sistêmica progressiva (PSS), também conhecida como esclerose sistêmica (SS)), síndrome de Sjogren, síndrome do homem rígido, lúpus eritematoso sistêmico, arterite de Takayasu, arterite temporal/arterite de células gigantes, colite ulcerosa, uveíte, vitiligo e granulomatose de Wegener.

[0293]As células também podem ser usadas para tratar distúrbios inflamatórios. Exemplos de distúrbios inflamatórios incluem, mas não se limitam a, distúrbios inflamatórios crônicos e agudos. Exemplos de distúrbios inflamatórios incluem doença de Alzheimer, asma, alergia atópica, alergia, aterosclerose, asma brônquica, eczema, glomerulonefrite, doença do enxerto vs. hospedeiro, anemias hemolíticas, osteoartrite, sepse, acidente vascular cerebral, transplante de tecido e órgãos, vasculite, retinopatia diabética e lesão pulmonar induzida por ventilação.

[0294]As células da presente invenção podem ser usadas para tratar cânceres. Os cânceres incluem tumores que não são vascularizados, ou ainda não sejam substancialmente vascularizados, bem como tumores vascularizados. Os cânceres podem compreender tumores não sólidos (como tumores hematológicos, por exemplo, leucemias e linfomas) ou podem compreender tumores sólidos. Os tipos de cânceres a serem tratados com as células da invenção incluem, mas não se limitam a, carcinoma, blastoma e sarcoma, e determinadas malignâncias de leucemia ou linfoide, tumores benignos e malignos, e malignâncias, por exemplo, sarcomas, carcinomas e melanomas. Tumores/cânceres adultos e tumores/cânceres pediátricos também são incluídos.

[0295]Os tumores sólidos são massas anormais de tecido que geralmente não contêm cistos ou áreas líquidas. Os tumores sólidos podem ser benignos ou malignos. Diferentes tipos de tumores sólidos são nomeados pelo tipo de células que os formam (como sarcomas, carcinomas e linfomas). Exemplos de tumores sólidos, como sarcomas e carcinomas, incluem fibrosarcoma, mixosarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, osteossarcoma e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, malignidade linfóide, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinona de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de glândulas sudoríparas, carcinoma medular da tireoide, carcinoma papilar da tireoide, carcinoma de glândulas sebáceas de feocromocitomas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, câncer do colo do útero, tumor testicular, seminoma, carcinoma da bexiga, melanoma e tumores do SNC (como um glioma (como glioma do tronco encefálico e gliomas mistos), asma de glioblastoma (também conhecida como glioblastoma multiforme), linfoma do SNC, germinoma, meduloblastoma, Schannannoma craniopharyogioma, ependimoma, pinealoma, hemangiobla estoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma e metástases cerebrais).

[0296]Os cânceres hematológicos são cânceres do sangue ou da medula óssea. Exemplos de cânceres hematológicos (ou hematogenosos) incluem leucemias, incluindo leucemias agudas (como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielográfica aguda e mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia), leucemias crônicas (como leucemia miococítica crônica (granulocítica), leucemia mielóide crônica e leucemia linfocítica crônica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin (formas indolentes e de alto grau), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença da cadeia pesada, síndrome mielodisplásica, leucemia de células pilosas e mielodisplasia.

[0297]As células da invenção podem ser administradas em dosagens e rotas e em tempos a serem determinados em experimentação e ensaios pré-clínicos e clínicos apropriados. As composições celulares podem ser administradas várias vezes em dosagens dentro dessas faixas. A administração das células da invenção pode ser combinada com outros métodos úteis para tratar a doença ou afecção desejada conforme determinado pelos indivíduos versados na técnica.

[0298]As células da invenção a serem administradas podem ser autólogas, alogênicas ou xenogênicas em relação ao indivíduo sendo submetido à terapia.

[0299]A administração das células da invenção pode ser realizada de qualquer maneira conveniente conhecida pelos indivíduos versados na técnica. As células da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo por aerossol inalação, injeção, ingestão, transfusão, implante ou transplante. As composições descritas no presente documento podem ser administradas a um paciente de modo transarterial, subcutâneo, intradérmico, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por injeção intravenosa (i.v.), ou intraperitoneal. Em outros casos, as células da invenção são injetadas diretamente em um sítio de inflamação no indivíduo, um sítio de doença local no indivíduo, um linfonodo, um órgão, um tumor, e similares.

Composições farmacêuticas

[0300]As composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender as células conforme descrito no presente documento, em combinação com um ou mais carreadores farmacêutica ou fisiologicamente aceitáveis, diluentes ou excipientes. Essas composições podem compreender tampões como uma solução salina tamponada neutra, uma solução salina tamponada de fosfato e similares; carboidratos tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos tal como glicina; antioxidantes; agentes quelantes como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. De preferência, as composições da presente invenção são formuladas para administração intravenosa.

[0301]As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de modo apropriado à doença a ser tratada (ou evitada). A quantidade e frequência de administração serão determinadas por esses fatores como a condição do paciente, e o tipo e a gravidade da doença do paciente, embora dosagens apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos.

[0302]Quando “uma quantidade imunologicamente eficaz”, “uma quantidade eficaz de resposta anti-imune”, “uma quantidade eficaz de inibição de resposta imune”, ou “quantidade terapêutica” for indicada, a quantidade precisa das composições da presente invenção a serem administradas pode ser determinada por um médico considerando-se as diferenças individuais de idade, peso, resposta imune, e condição do paciente (indivíduo). Em geral, pode-se declarar que uma composição farmacêutica que compreende as células descritas no presente documento pode ser administrada em uma dosagem de 104 a 109 células/kg de peso corporal, de preferência, 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro desses intervalos. As composições celulares descritas no presente documento também podem ser administradas várias vezes nessas dosagens. As células podem ser administradas utilizando-se técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia (vide, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988). A dosagem ideal e o regime de tratamento para um paciente particular podem ser prontamente determinados por um indivíduo versado na técnica da medicina monitorando-se o paciente por sinais de doença e ajustando-se o tratamento de modo correspondente.

[0303]Em determinadas modalidades, pode ser desejável administrar monócitos, macrófagos ou células dendríticas a um indivíduo e, então, extrair subsequentemente sangue (ou ter uma aferese realizada), ativar os monócitos, macrófagos, ou células dendríticas de acordo com a presente invenção, e reinfundir o paciente com essas células ativadas. Esse processo pode ser realizado várias vezes por algumas semanas. Em determinadas modalidades, as células podem ser ativadas a partir das coletas de sangue de 10 ml a 400 ml. Em determinadas modalidades, as células são ativadas a partir das coletas de sangue de 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, ou 100 ml. Sem se ater à nenhuma teoria, usando esse protocolo de coleta de sangue múltipla/reinfusão múltipla, podem-se selecionar determinadas populações de células.

[0304]Em determinadas modalidades da presente invenção, as células são modificadas usando os métodos descritos no presente documento, ou outros métodos conhecidos na técnica onde as células são expandidas a níveis terapêuticos, são administradas a um paciente em conjunto (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) com qualquer número de modalidades de tratamento relevantes, incluindo, sem limitação, um tratamento com agentes como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, Citarabina (também conhecido como ARA-C) ou tratamento com natalizumab para pacientes MS ou tratamentos para pacientes PML. Em modalidades adicionais, as células da invenção podem ser usadas em combinação com uma terapia celular CART, quimioterapia, radiação, agentes imunossupressivos, como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato, e FK506, anticorpos, ou outros agentes imunoablativos como anticorpo anti-CD52 alemtuzumab (CAM PATH), anticorpos anti-CD3 ou outras terapias de anticorpo, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas, e irradiação. Esses fármacos inibem a calcineurina de fosfatase dependente de cálcio (ciclosporina e FK506) ou inibir a quinase p70S6 que é importante para uma sinalização induzida por fator de crescimento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). Em uma modalidade adicional, as composições celulares da presente invenção são administradas a um paciente em conjunto (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) com transplante de medula óssea, terapia ablativa de linfócito usando agentes quimioterapêuticos como, fludarabina, terapia por radiação em feixes externos (XRT), ciclofosfamida, Rituxan, ou anticorpos como OKT3 ou CAMPATH. Por exemplo, em uma modalidade, os indivíduos podem ser submetidos a um tratamento padrão com quimioterapia de alta dosagem segunda por transplante de célula-tronco de sangue periférico. Em determinadas modalidades, após o transplante, os indivíduos receberam uma infusão das células da presente invenção. Em uma modalidade adicional, as células podem ser administradas antes ou após a cirurgia.

[0305]A dosagem dos tratamentos anteriores a ser administrada a um indivíduo variará com a natureza precisa da afecção sendo tratada e com o receptor do tratamento. O escalonamento de dosagens para administração em seres humanos pode ser realizado de acordo com as práticas aceitas na técnica. A dose para CAMPATH, por exemplo, geralmente estará na faixa de 1 a cerca de 100 mg para um paciente adulto, geralmente administrado diariamente por um período entre 1 e 30 dias. A dose diária preferencial é de 1 a 10 mg ao dia, embora, em alguns casos, doses maiores de até 40 mg ao dia podem ser usadas (descritas na Patente no U.S. 6.120.766).

[0306]Deve-se compreender que o método e as composições que seriam úteis na presente invenção não se limitam às formulações particulares apresentadas nos exemplos. Os exemplos a seguir são apresentados para proporcionar aos indivíduos com conhecimento comum na técnica uma revelação completa e uma descrição de como produzir e usar as células, métodos e expansão e cultura, e métodos terapêuticos da invenção, e não são destinados a limitarem o escopo do que os inventores consideram como sendo sua invenção.

[0307]A prática da presente invenção emprega, exceto onde indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estejam dentro da alçada do artesão versado. Essas técnicas são explicadas completamente na literatura, como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, quarta edição (Sambrook, 2012); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Culture of Animal Cells” (Freshney, 2010); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1997); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Short Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 2002); “Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting”, (Babar, 2011); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 2002). Essas técnicas são aplicáveis à produção dos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção, e, como tais, podem ser considerados na produção e prática da invenção. Técnicas particularmente úteis para modalidades particulares serão discutidas nas seções que se seguem.

EXEMPLOS EXPERIMENTAIS

[0308]A invenção será adicionalmente descrita em detalhes com referência aos exemplos experimentais a seguir. Esses exemplos são proporcionados apenas por propósitos de ilustração, e não são destinados a serem limitantes, exceto onde especificado em contrário. Logo, a invenção não deve, de forma alguma, ser construída como sendo limitada aos exemplos a seguir, mas, ao invés disso, deve ser construída para abranger toda e qualquer variação que se torne evidente como resultado dos ensinamentos fornecidos no presente documento.

[0309]Sem a necessidade de uma descrição adicional, acredita-se que um indivíduo com conhecimento comum na técnica possa, usando a descrição precedente e os exemplos ilustrativos a seguir, produzir e utilizar os compostos da presente invenção e praticar os métodos reivindicados. Portanto, os exemplos funcionais a seguir apontam especificamente as modalidades preferenciais da presente invenção, e não devem ser construídos como limitantes, de forma alguma, ao restante da revelação.

[0310]Agora, descrevem-se os materiais e métodos empregados nesses experimentos.

[0311]Cultura celular: THP1, K562, SKOV3, SKBR3, HDLM2, MD468, e todas as linhagens celulares foram culturadas em RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10% e penicilina/estreptomicina a 37C em CO2 a 5%. Um THP1 mRFP+ sub-linha (Wt) foi gerado por transdução lentiviral e purificação FACS de mRFP+ linhagens celulares. THP1 mRFP+ sub-linha foi usado para gerar sub-linhas THP1 mRFP+ CAR19z+ (CAR19z; CARMA19z), THP1 mRFP+ CAR19Δz+ (CAR19Δz; CARMA19Δz), THP1 mRFP+ MesoZ+ e THP1 mRFP+ CARHer2z+ (CARHer2z; CARMAHer2z). Uma diferenciação de monócito foi induzida culturando- se as células durante 48 horas com 1ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato em um meio de cultura.

[0312]Macrófagos humanos primários: Monócitos humanos primários foram purificados a partir de um produto de aferese de doador normal usando Miltenyi CD14 MicroBeads (Miltenyi, 130-050-201). Os monócitos foram culturados em um meio X-Vivo suplementado com soro AB humano a 5% ou RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%, com penicilina/estreptomicina, glutamax, e 10ng/mL de GM-CSF humano recombinante (PeproTech, 300-03) durante 7 dias em Bolsas de Diferenciação Celular MACS GMP (Miltenyi, 170-076-400). Os macrófagos foram coletados no dia 7 e criopreservados em FBS + 10% DMSO pendente de uso subsequente.

[0313]Ensaio de fagocitose: Wt ou CARMA mRFP+ THP1 sub-linhas foram diferenciadas durante 48 horas com 1ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato. GFP+ sub-linhas tumorais portando antígeno, isto é, K562 CD19+ GFP+ células, foram adicionados aos macrófagos THP1 diferenciados em uma razão 1:1 seguindo uma lavagem com PMA. Os macrófagos foram co-culturados com células tumorais alvo durante 4 horas, e a fagocitose foi quantificada por microscopia fluorescente usando o Sistema de Imageamento Celular EVOS FL Auto. Uma média de três campos de visão foi considerada como n, e todas as condições foram quantificadas em triplicatas. A fagocitose baseada em FACS foi analisada em um BD LSR-Fortessa. FlowJo (Treestar, Inc.) foi usado para analisar os dados citométricos de fluxo. Eventos positivos vivos duplos de mRFP/GFP dependentes de singletos foram considerados fagocitose. Um bloqueio de eixo CD47/SIRPα foi realizada através da adição de anticorpos monoclonais de bloqueio na iniciação da co-cultura em concentrações indicadas (CD47 clone B6H12 anti-humano de camundongo, eBioscience #14-0479-82; CD47 clone 2D3 anti-humano de camundongo como controle negativo, eBioscience #14-0478-82; SIRPα clone SE5A5 anti-humano de camundongo, BioLegend #323802). Um coestímulo TLR foi realizado adicionando-se agonistas TLR1-9 (kit agonista TLR 1-9 humano; Invivogen #tlrl-kit1hw) no momento da co-cultura.

[0314]Ensaio de extermínio in vitro: Macrófagos portando Wt ou CAR foram co-culturados com células tumorais alvo de luciferase verde de besouro-saltador (CBG)/proteína fluorescente verde (GFP) portando antígeno ou de controle em razões variáveis entre efetor e alvo (iniciando em 30:1 e diminuindo em diluidores de três vezes). Utilizou-se um imageamento bioluminescente para determinar a carga tumoral, usando o Sistema de Imageamento de Espectro IVIS (Perkin Elmer). A lise específica percentual foi calculada da seguinte forma: % de lise específica = ((Poço tratado - poço contendo somente tumor)/(extermínio máximo - poço contendo somente tumor)*100)

[0315]Microscopia por lapso de tempo: Realizou-se uma microscopia de vídeo por lapso de tempo RFluorescente de fagocitose mediada por CAR usando o Sistema de Imageamento Celular EVOS FL Auto. As imagens foram capturadas a cada 40 segundos durante 18 horas. A análise da imagem foi realizada com um software de imageamento FIJI.

[0316]Produção e transfecção lentiviral: Construções de receptor de antígeno quimérico foram sintetizadas novamente por GeneArt (Life Technologies) e clonadas em um vetor lentiviral conforme previamente descrito. O lentivírus concentrado foi gerado usando células HEK293T conforme previamente descrito.

[0317]Produção e transfecção adenoviral: Vetores adenovirais qjuiméricos Ad5f35 que codificam GFP, CAR, ou nenhum transgene sob um promotor CMV foram produzidos ne titulados de acordo com o procedimento de biologia molecular padrão. Os macrófagos humanos primários foram transduzidos com multiplicidades variáveis de infecção e serialmente imageado para expressão e viabilidade de GFP usando o Sistema de Imageamento Celular EVOS FL Auto. A expressão de CAR foi avaliada por análise FACS ou expressão de CAR superficial usando um antígeno marcado com His e anticorpo secundário anti-His-APC (R&D Biosystems Clone AD1.1.10).

[0318]Citometria de fluxo: FACS foi realizado em um BD LSR Fortessa. A expressão de CAR superficial foi detectada com uma proteína L biotilinada (GenScript M00097) e estreptavidina APC (BioLegend, #405207) ou antígeno marcado com His e anticorpo secundário anti-His-APC (R&D Biosystems Clone AD1.1.10). Os receptores Fc foram bloqueados com Human Trustain FcX (BioLegend, #422301) antes da coloração. A expressão CD47 foi determinada usando CD47 APC anti-humano de camundongo (eBioscience #17-0479-41) com controle de isotipo de IgG1 kappa APC de camundongo para determinação antecedente. A expressão de calreticulina foi determinada com um PE clone FMC75 anti-calreticulina de camundongo (Abcam #ab83220). Todos os resultados de fluxo são dependentes de células únicas vivas (Live/Dead Aqua Fixable Dead Cell Stain, Life Technologies L34957).

[0319]Citometria de fluxo com imagem: FACS com imageamento fluorescente de célula única foi realizado em um Citômetro de Fluxo de Imageamento ImageStream Mark II (EMD Millipore). Resumidamente, macrófagos tingidos mRFP+ ou DiI (CAR ou controle) foram co-culturados com GFP+ células tumorais durante 4 horas, antes da fixação e aquisição de dados ImageStream. Os dados foram analisados usando um software ImageStream (EMD Millipore).

[0320]Eletroporação de RNA: Construções de CAR foram clonadas em plasmídeos de transcrição in vitro sob o controle de um promotor T7 usando técnicas de biologia molecular padrão. mRNA CAR foi transcrito in vitro usando um kit de transcrição in vitro mMessage mMachine T7 Ultra (Thermo Fisher), purificado usando um kit de purificação RNEasy RNA (Qiagen), e eletroporado em macrófagos humanos usando um eletroporador BTX ECM850 (BTX Harvard Apparatus). A expressão de CAR foi ensaiada em pontos de tempo variáveis pós-eletroporação usando análise FACS.

[0321]Primação TLR/Dectina-1: Primação TLR ou Dectina-1 em macrófagos Wt ou CAR antes da fagocitose in vitro ou ensaios de extermínio foi realizado pré- incubando-se as células com doses recomendadas de agonistas TLR 1-9 (Human TLR1-9 Agonist Kit, Invivogen) ou beta-glucan (MP Biomedicals, LLC), respectivamente, durante 30 minutos antes da co-cultura. A função in vitro de macrófagos Wt ou CAR foi comparada entre as condições não primadas e primadas.

[0322]Fenótipo de Macrófago/Monócito: Os marcadores superficiais a seguir foram avaliados como parte de um painel FACS de imunofenótipo de macrófago/monócito, para distinção M1/M2: CD80, CD86, CD163, CD206, CD11B, HLA-DR, HLA-A/B/C, PDL1 e PDL2 (BioLegend). TruStain FcX foi usado para bloqueio de receptor Fc antes da imunocoloração. Macrófagos/monócitos foram expostos a condições de ativação, isto é, transdução Ad5f35 durante 48 horas, ou não, antes da avaliação de fenótipo.

[0323]Ensaio Seahorse: O consumo de fenótipo metabólico e oxigênio de macrófagos foi determinado usando o ensaio Seahorse (Seahorse XF, Agilent). Os macrófagos de controle ou CAR foram expostos a um controle de meio ou citocinas imunossupressivas durante 24 horas antes da análise. As células foram tratadas com oligomicina, FCCP, e rotenona sequencialmente ao longo do ensaio Seahorse. O ensaio foi realizado com 6 réplicas por condição.

[0324]Ensaios in nivo: Camundongos NOD-scid IL2Rg-null-IL3/GM/SF, NSG- SGM3 (NSGS) foram usados para modelos de xenoenxerto humano. Os camundongos enxertados com células de câncer ovariano SKOV3 humano positivo CBG-luciferase foram deixados sem tratamento, ou tratados com macrófagos humanos não transduzidos, transduzidos com Ad5f35 vazio, ou transduzidos com Ad5f35 CAR-HER2 em diferentes doses. O imageamento bioluminescente serial foi realizado para monitorar a carga tumoral (IVIS Spectrum, Perkin Elmer). Os órgãos e o tumor foram coletados após sacrifício para análise FACS. A sobrevivência geral foi monitorada e comparada usando uma análise Kaplan-Meier.

[0325]Agora, descrevem-se os resultados dos experimentos.

[0326]A Figura 1A é um diagrama conceitual de um receptor de antígeno quimérico (CAR) composto por um produto gene/gene contendo um domínio extracelular com função de direcionamento, um domínio de dobradiça, um domínio transmembranar, um domínio de sinalização intracelular e/ou um 2A (P2A, T2A) para coexpressão estequiométrica de um produto de gene adicional que pode, ou não, ser secretado, incluindo qualquer gene/transcrição/proteína, incluindo, sem limitação, uma citocina, anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, fragmento variável de cadeia simples, enzima, receptor adicional, receptor negativo dominante, antígeno associado a tumor, e qualquer combinação dos mesmos. Além disso, a construção CAR pode incluir a co-entrega de material de edição genética CRISPR/Cas9, ou ser introduzido no contexto de uma célula pré-editada CRISPR/Cas9. Exemplos específicos de construções CAR são modelados na Figura 1B, incluindo CARMA-Z, CARMA-y, e CARMA-Dectina, que contêm um scFv específico a antígeno, dobradiça CD8, transmembrana CD8, e um CD3 Z, subunidade y de FcεRI comum, ou o domínio intracelular de Dectina-1, respectivamente.

[0327]A Figura 2A é um gráfico que mostra CAR19z expressado na superfície de células mieloides pós transdução lentiviral. O lentivíirus CAR19z foi titulado em diluidores de três vezes e usado para transduzir 1e5/0,1mL de mRFP + células THP1. mRFP é um gene repórter (proteína fluorescente vermelha) que foi expressado por transdução lentiviral da linhagem celular mieloide THP1. Essas células podem ser induzidas para se diferenciarem em macrófagos mediante a exposição ao PMA químico. As células THP1 foram coletadas 24 horas pós- transdução e tingidas para expressão superficial CAR com uma proteína L biotinilada seguida por estreptavidina-APC. As células THP1 transduzidas foram expandidas e classificadas por FACS para gerar uma sub-linha 100% CAR19z positiva mRFP + THP1 (Figura 2B). A Figura 2C demonstra a expressão de construções CAR lentiviral anti-CD19, anti-HER2 e anti-mesotelina em macrófagos THP1, com eventos CAR(+) no quadrante superior direito.

[0328]A Figura 3A é um fluxograma que mostra a visão geral de geração de sub-linha CARMA usando um modelo de macrófago THP1, diferenciação com 1ng/mL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), e ensaio de fagocitose in vitro. Os macrófagos CAR anti-CD19, anti-HER2 e anti-mesotelina, porém não macrófagos tipo selvagem (Wt), células tumorais K562 submetidas à fagocitose que expressaram CD19, HER2 ou mesotelina, respectivamente, conforme demonstrado por ensaios de fagocitose baseados em microscópio fluorescente (Figuras 3B a 3C). A fagocitose tumoral de CARMA foi adicionalmente validada por um ensaio baseado em citometria de fluxo, em que mRFP+ CARMA contra CD19 foram co-culturados com células CD19+ GFP+ K562 e eventos positivos duplos foram quantificados (gráfico FACS representativo mostrado - Figura 3E). Um campo de visão padrão de 10x usado na tabulação de função de fagocitose de CARMA é mostrado, tanto mRFP individualmente (Figura 3F) como sobreposto (Figura 3G). Os eventos positivos duplos de mRFP/GFP baseados em FACS foram definidos como eventos fagocíticos, e foram validados como por análise FACS Amnis Imagestream. Os eventos mostrados são selecionados em eventos positivos duplos e ordenados a partir de alto a baixo pelo algoritmo de fagocitose-erode Amnis Imagestream (Figura 3H). A fagocitose de células tumorais por mRFP+ CARMA no modelo de linhagem celular THP-1 foi adicionalmente demonstrada por microscopia confocal, verificando que as células tumorais GFP+ foram completamente encerradas no interior de fagossomas através de reconstruções de pilhas z confocais tridimensionais (Figuras 3I e 3J). A Figura 3K demonstra o destino de uma única célula CARMA ao longo do tempo- com contato e a formação de sinapse imunológica sendo a primeira etapa, levando ao engolfamento fagocítico, degradação do tumor usando a perda de GFP como um marcador de morte celular, divisão de fagossoma e reparo de fagossoma - demonstrando que CARMA sobrevive após a fagocitose de células tumorais. A Figura 3L demonstra a capacidade de CARMA realizar a polifagocitose de muitas células tumorais de uma vez.

[0329]Os macrófagos CAR anti-CD19 foram testados usando um ensaio de fagocitose in vitro contra células tumorais CD19+ (alvo) ou CD19- (controle) GFP+ K562. Demonstrando a especificidade do antígeno de CARMA, apenas as células tumorais portadoras de antígenos foram fagocitadas (Figura 4A). Para demonstrar o requisito do domínio da sinalização intracelular na função CARMA, construtos CAR19-ΔZ (que são desprovidos de um domínio de sinalização intracelular) foram usados. Os macrófagos CAR19-ΔZ não conseguiram realizar a fagocitose de células tumorais e reduziram significativamente a função antitumoral através de um ensaio de lise específico baseado em luciferase in vitro (Figuras 4B e 4C). Os ensaios de fagocitose de CARMA in vitro foram realizados na presença de R406 (inibidor de Syk), citocalasina D (inibidor de polimerização de actina) ou blebistatina (inibidor de miosina IIA não muscular). R406, citocasalina e beblistatina revogaram independentemente a função fagocítica de CARMA, indicando que a sinalização de CAR em macrófagos é dependente de Syk e resulta em polimerização de actina e na função fagocítica mediada por NMIIA (Figuras 4D a 4F).

[0330]A Figura 5A é um gráfico de citometria de fluxo que mostra a expressão de CD47 em linhagens de células alvo tumorais em relação ao controle de isótipo. K562 e K562-CD19+ (K19) foram usadas nesses experimentos, ambas as quais são linhagens celulares que expressam altamente CD47.

[0331]A Figura 5B é um gráfico que mostra que a adição de anticorpo monoclonal anti-CD47 aumentou seletivamente a fagocitose mediada por macrófagos CAR, porém não por Wt de células tumorais portadoras de antígeno. Os macrófagos Wt ou CAR19Z foram incubados com células tumorais CD19+ K562 com 0, 0,01, 0,10, 1,00, ou 10,0 mcg/ml de anticorpo monoclonal anti-CD47.

[0332]A Figura 5C é um gráfico que mostra que a adição de anticorpo monoclonal anti-SIRPα aumentou seletivamente a fagocitose mediada por macrófagos CAR, porém não por Wt de células tumorais portadoras de antígeno. Os macrófagos Wt ou CAR19Z foram incubados com células tumorais CD19+ K562 com 0, 0,01, 0,10, 1,00, ou 10,0 mcg/ml de anticorpo monoclonal anti-SIRPα.

[0333]A Figura 5D é um gráfico que demonstra que o bloqueio do eixo geométrico de CD47/SIRPα com anticorpos monoclonais anti-SIRPα aumentou a polifagocitose (definida como um macrófago que engolfou 2 ou mais células tumorais de uma vez) por macrófagos CAR.

[0334]Para controlar a opsonização adicionada pelos anticorpos monoclonais de bloqueio de CD47/SIRPα, um anticorpo monoclonal anti-CD47 de controle (clone 2D3), que se liga a CD47, porém não bloqueia o CD47 para o sítio de ligação SIRPα, foi usado em um ensaio de fagocitose in vitro. Apenas o clone que bloqueou o sítio de ligação (clone B6H12 Anti-CD47) ou o bloqueio do receptor SIRPα resultou diretamente no aumento de fagocitose de tumor CARMA (Figura 5E).

[0335]Para testar se o bloqueio do eixo geométrico de CD47/SIRPα em macrófagos CAR resulta na perda da especificidade de antígeno, uma fagocitose in vitro contra células tumorais negativas para o antígeno (CD19 negativo) foi conduzida na presença de anticorpo monoclonal Anti-CD47 ou Anti-SIRPα, e não houve fagocitose observável (Figura 5F).

[0336]A especificidade de aumento fagocítico de CARMA na presença de anticorpo monoclonal de bloqueio de SIRPα foi testada por knockout do receptor SIRPα em macrófagos THP1, e comparação de fagocitose tumoral por CARMA ou CARMA SIRPα-KO na ausência ou presença de anticorpo anti-SIRPα. CRISPR/Cas9 foi usado para a deleção de SIRPα, e as células foram classificadas quanto à negatividade de SIRPα antes de ensaios funcionais. A eliminação da função CARMA aprimorada de SIRPα e a adição de anti-SIRPα de volta às células knockout não conseguiram aumentar ainda mais a fagocitose (Figura 5G).

[0337]A Figura 6A demonstra a lise específica de células CD19+ GFP+ Luciferase+ K562 por CARMA CAR19Z, porém não macrófagos Wt (usando o modelo de macrófago THP-1) em um ensaio de ensaio baseado em luciferase in vitro em 48 horas de maneira dose-dependente.

[0338]A Figura 6B é um gráfico que demonstra a lise específica de células tumorais por monócitos THP-1 de CAR19Z ou Wt (indiferenciado, dessa forma, um modelo de monócitos em vez de macrófagos) em um ensaio de extermínio baseado em luciferase in vitro em 48 horas de maneira dose-dependente.

[0339]A Figura 6C é um painel de imagens que mostra a bioluminescência conduzida por luciferase, derivada de células tumorais CD19 + K562 positivas para luciferase, após co-cultura de 48 horas com macrófagos Wt ou CAR19Z in vitro, na ausência ou presença de 10 mcg/ml de anticorpo monoclonal anti-SIRPα. A Figura 6D é um gráfico que demonstra a lise específica de macrófagos Wt ou CAR19Z +/- anticorpo monoclonal anti-SIRPα.

[0340]Os construtos de CAR com um domínio intracelular de subunidade comum de FcεRI y (CAR19y, CARMA19y) foram gerados, embalados em lentivírus, e usados para transduzir células mieloides THP-1 em uma diluição viral serial tripla. CAR19y foi expresso em macrófagos THP-1 Figura 7A).

[0341]Os macrófagos CAR19y ou CAR19Z foram classificados para 100% de positividade de CAR e usados para caracterização funcional in vitro. Os macrófagos CAR19Z e CAR19y realizaram a fagocitose de células tumorais CD19+, e ambos exibiram sinergia com bloqueio do eixo geométrico de CD47/SIRPα pela adição de anticorpo monoclonal anti-SIRPα (Figura 7B)

[0342]Os macrófagos CAR19Z e CAR19y realizam a sinalização através de Syk para conduzir a fagocitose tumoral, conforme demonstrado e um ensaio de fagocitose in vitro de inibição de R406 Syk (Figura 7C).

[0343]Tanto os macrófagos CAR19Z como CAR19y THP1, porém não macrófagos THP1 Wt, exterminaram eficientemente as células tumorais CD19+ em um ensaio de lise específica baseado em luciferase in vitro após 24 horas de co- cultura em várias razões E:T (Figura 7D).

[0344]Como glóbulos brancos do sistema imune inato, os macrófagos respondem a sinais moleculares conservados de infecção, como padrões moleculares associados a patógenos, através de receptores de reconhecimento de patógenos constitutivamente expressos. Os receptores tipo Toll são os receptores de reconhecimento de patógenos melhor caracterizados, e são conhecidos por ativar macrófagos.

[0345]Para aprimorar a função fagocítica do tumor de CARMA, ensaios de fagocitose in vitro foram conduzidos usando macrófagos CAR que foram iniciados com os ligantes para TLR1-9, independentemente, ou controle de meio. Os ligantes de TLR1, 2, 4, 5 e 6 melhoraram a função fagocítica de CARMA (Figura 8A). Isso sugere que os ligantes de TLR podem ser usados para iniciar o CARMA durante o processo de produção, ou os domínios de sinalização de TLR podem ser codificados no construto CAR para aumentar a sinalização de CAR e a função efetora a jusante como um construto de CARMA de segunda geração/subsequente inovador.

[0346]As Figuras 8B e 8C demonstram que a diferença entre ligantes TLR que aumentaram ou não aumentaram a fagocitose de CARMA de células tumorais se aplica em uma ampla faixa de concentrações de ligante TLR3 ou TLR6.

[0347]β-glucano, um produto de levedura, se liga à Dectina-1 sobre a superfície de macrófagos e resulta na ativação e função efetora. Para testar a capacidade de β-glucano para aumentar a função de CARMA, ensaios de fagocitose tumoral in vitro foram conduzidos na ausência ou presença de 5mcg/ml de β- glucano. O β-glucano aumentou a capacidade fagocítica de macrófagos CAR, porém não de Wt (Figura 9A).

[0348]Para testar a capacidade de β-glucano aumentar o extermínio de tumores de CARMA, ensaios de lise específica baseados em luciferase in vitro foram conduzidos em várias razões E:T, na presença de 0, 0,5, de 50mcg/ml de β-glucano. B-glucano aumentou a lise específica de células tumorais portadoras de antígeno por macrófagos CAR, porém não THP-1 Wt (Figura 9B). Esses resultados indicam que o β-glucano pode ser usado como um adjuvante durante o processo de produção de CARMA, ou o domínio de sinalização intracelular de Dectina-1 pode ser codificado no transgene CAR.

[0349]Dado que o β-glucano melhorou a função de CARMA, construtos CAR compreendidos de um domínio de sinalização intracelular de Dectina-1 foram gerados (Figura 10A). Esses construtos foram embalados em lentivírus e usados para transduzir células mieloides THP-1 em uma diluição em série tripla de títulos lentivirais. O CAR foi detectado sobre a superfície, tanto nos construtos CAR CAR8- Dectina1 como em CAR DectinaTM-Dectina1 (Figuras 10B e 10C). As células foram classificadas quanto a 100% de positividade e usadas para experimentos funcionais a jusante in vitro.

[0350]CAR de CD8TM-Dectina1 e CAR de DectinaTM-Dectina1 testados em um ensaio de extermínio baseado em luciferase in vitro. Ambos os construtos demonstraram lise específica de células tumorais (10D).

[0351]Os macrófagos Dectina1-CAR foram testados em um ensaio de fagocitose tumoral in vitro contra células tumorais K562 (controle) ou K19 (alvo) e células tumorais portadoras de antígeno cognato seletivamente fagocitadas por macrófagos Dectina1-CAR (Figura 10E). Macrófagos CAR de Dectina-1 demonstraram a capacidade de fagocitose de múltiplas células tumorais (Figura 10F).

[0352]Em um ensaio de fagocitose tumoral in vitro, os macrófagos Dectina1- CAR demonstraram sinergia com o bloqueio de SIRPα, ou com a iniciação com um ligante TLR (Figura 10G).

[0353]A Figura 11A é um gráfico que mostra os níveis de calreticulina em três linhagens de células alvo CD19+ diferentes em relação ao controle de isótipo.

[0354]A Figura 11B é um gráfico que mostra a intensidade fluorescente média normalizada de expressão de calreticulina em três linhagens de células alvo CD19+ diferentes.

[0355]A Figura 11C é um gráfico que mostra que baixos níveis de calreticulina protegeram moderadamente as células alvo, especificamente as linhagens celulares Nalm6 e JEKO, contra a fagocitose de macrófago CAR19z. Esses dados sugerem que a exploração de deposição/indução de calreticulina pode ser usada como uma tática adicional para aumentar a função efetora de CARMA.

[0356]Para validar e testar a função de CAR em macrófagos derivados de monócitos humanos primários, várias abordagens de entrega de genes foram testadas. Na Figura 12A, construtos de CAR anti-HER2 clonados em plasmídeos de expressão de mRNA, transcritos in vitro, e o mRNA foi diretamente eletroporado em monócitos humanos primários. A Figura 13A demonstra a estratégia de seleção, viabilidade, e eficiência de transfecção de 84,3% em relação a células eletroporadas simuladas. A Figura 12B demonstra a eficiência de eletroporação de mRNA de CAR anti-HER2 em macrófagos derivados de monócitos humanos primários (completamente diferenciados) em 79,7%.

[0357]A Figura 12C é um gráfico que demonstra que, embora a eletroporação de mRNA resulte em uma alta eficiência de transfecção de CAR tanto de monócitos como macrófagos, a expressão de CAR é temporária devido à degradação de mRNA, atingindo o pico no dia 2 e desaparecendo no dia 7 após a eletroporação in vitro.

[0358]Os camundongos NSGS foram injetados com células de câncer de ovário humanas 1E6 SKOV3 CBG/GFP + através de injeção de IP, um modelo de carcinomatose intraperitoneal metastática de câncer de ovário HER2 +. Os camundongos foram coinjetados com monócitos humanos primários eletroporados simulados ou eletroporados por mRNA de CAR anti-HER2 ou macrófagos humanos primários (razão E:T 1:1) e a carga tumoral foi representada em imagens. Os macrófagos CAR (Figura 13A) e monócitos CAR (Figura 13B) demonstraram redução marginal no crescimento tumoral durante aproximadamente duas semanas. O primeiro ponto de tempo em que a carga tumoral foi quantificada de forma bioluminescente foi 24 horas após o tratamento, demonstrando que monócitos e macrófagos CAR tiveram atividade nas primeiras 24 horas.

[0359]A entrega lentiviral de transgenes CAR a macrófagos derivados de monócito humanos primários foi testada usando múltiplos construtos CAR. Na Figura 14A, o CAR19 foi distribuído a macrófagos humanos através de transdução lentiviral, demonstrando uma eficiência de transdução de 4,27% e 38,9% no grupo controle vs. Grupos lentivirais CAR19 (MOI 10), respectivamente. A estratégia de seleção de FACS é mostrada.

[0360]A Figura 14B é um gráfico FACS representativo que mostram a expressão de CAR anti-HER2 em macrófagos humanos primários, com uma eficiência de transdução de 1,47 e 18,1% entre o controle e condições de MOI 10 CAR LV, respectivamente.

[0361]Os macrófagos derivados de monócitos foram gerados por diferenciação de células CD14+ selecionadas (a partir de produtos de aférese de doadores normais em meios condicionados GM-CSF durante 7 dias. Para otimizar a entrega de CAR através de transdução lentiviral, os lentivírus anti-CD19 e anti-HER2 foram usados para transduzir macrófagos em diferentes pontos do processo de diferenciação de monócito para macrófago. A eficiência da transdução atingiu seu pico no ponto médio de transdução (dia 4), tanto para construtos anti-CD19 como CAR anti-HER2 (Figuras 15A e 15B). Os macrófagos humanos primários CAR anti- CD19 foram usados em um ensaio de fagocitose baseado em FACS in vitro contra células tumorais CD19 + GFP + K562, com os eventos CD11b+/GFP+ sendo definidos como eventos fagocíticos. Os macrófagos transduzidos em diferentes pontos de tempo como na Figura 15A foram usados nesse ensaio. A Figura 15C demonstra que a eficácia da fagocitose evoluiu com a eficiência de transdução de CAR, atingindo seu pico com macrófagos transduzidos no dia 4 durante o processo de diferenciação.

[0362]Abordagens de transdução alternativas para a entrega de transgenes para macrófagos humanos primários foram testadas, uma vez que a eletroporação de mRNA era transitória e o lentivírus era apenas moderadamente eficiente e exigia alto título. O adenovírus (recombinante, deficiente em replicação) foi identificado como uma abordagem eficiente para a transdução de macrófago humano primário. A expressão de Receptor de Adenovírus Coxackie (a proteína de ancoragem para Ad5) e CD46 (a proteína de ancoragem para Ad35) foi testada em relação ao controle do isótipo em macrófagos humanos primários, e CD46, porém não o receptor de Adenovirus Coxackie, foi altamente expresso (Figura 16A). Dessa forma, o adenovírus quimérico Ad5f35 foi utilizado para a transdução de macrófagos humanos primários e foi elaborado através de técnicas padrão de biologia molecular para expressar um receptor de antígeno quimérico (GFP e vírus vazios Ad5f35 foram usados como controles) contra HER2.

[0363]A Figura 16B mostra que, em um MOI de 1000, Ad5f35 distribuiu efetivamente um transgene (GFP foi usado como um modelo de transgene) em macrófagos humanos, e a expressão aumentou ao longo do tempo, conforme monitorado pela quantificação de sinal GFP em um Espectro IVIS. A Figura 16C compara a cinética de transdução de macrófagos humanos primários em pontos de tempo diferentes em uma ampla gama de MOIs - até 10.000.

[0364]A Figura 16C mostra gráficos representativos de FACS de expressão de CAR anti-HER2 em macrófagos humanos transduzidos Ad5f35 48 horas após a transdução, em uma ampla gama de MOIs virais.

[0365]A Figura 16D mostra imagens de microscópio fluorescente de macrófagos humanos primários transduzidos Ad5f35-GFP, com a eficiência de transdução mais alta demonstrada em um MOI de 1000.

[0366]Os CARMA humanos primários foram testados em um ensaio de fagocitose in vitro através de análise FACS. Os macrófagos (CAR não transduzido ou anti-HER2) foram corados com DiI antes da co-cultura com células de câncer de ovário GFP+ SKOV3. Fagocitose, definida por eventos positivos duplos DiI/GFP, foi medida em um nível de 26,6% no grupo CAR e 4,55% no grupo de controle (Figura 17A). Para validar que os dois eventos positivos duplos de DiI/GFP eram eventos fagocíticos e não dupletos, a citocalasina D (um inibidor de fagocitose) foi adicionada a um ramo do experimento e anulou completamente a fagocitose mediada por CAR até 1,74%. Para validar adicionalmente que os macrófagos CAR humanos primários poderiam fagocitar as células tumorais, eventos positivos duplos foram fechados por FACS Amnis Imagestream e ordenados de alto a baixo pelo algoritmo de fagocitose- erode Amnis, demonstrando visualmente que esses eventos positivos duplos representam a fagocitose (Figura 17B). Além disso, os macrófagos CAR-HER2 corados com DiI foram co-culturados com SKOV3-GFP e representados em imagens por microscópio confocal e a fagocitose foi verificada.

[0367]Os macrófagos humanos primários CAR Anti-HER2 foram gerados usando transdução de Ad5f35-CAR de macrófagos derivados de monócitos. Essas células (ou células não transduzidas de controle) foram usadas como efetores em um ensaio de fagocitose baseado em FACS in vitro de células de câncer de mama humanas SKBR3. A Figura 18 demonstra que macrófagos humanos CAR, porém não UTD realizam a fagocitose de células de câncer de mama. Além disso, a adição de anticorpo monoclonal anti-SIRPα aumentou a fagocitose de macrófago CARMA, porém não UTD de células de câncer de mama. Esses resultados demonstram que a sinergia entre o bloqueio do eixo geométrico de CD47/SIRPα observado com CARMA no modelo THP-1 é traduzida para estudos de macrófagos humanos primários.

[0368]Os macrófagos são glóbulos brancos do sistema imune inato e, dessa forma, têm propriedades antimicrobianas sentinela. Para demonstrar que macrófagos CAR ainda são células imunes funcionais inatas no sentido antimicrobiano e não perdem a capacidade de responder a estímulos infecciosos, macrófagos controle não transduzidos ou CAR foram empregados em um ensaio de fagocitose de E.Coli baseado em FACS. A Figura 19 é um gráfico de FACS representativo que mostra que CARMA exibe fagocitose intacta de partículas de E.Coli pH-Rodo Green.

[0369]Os CARMA anti-HER2 humanos primários foram testados como células efetoras em ensaios de extermínio baseados em luciferase in vitro. Os macrófagos CARMA Anti-HER2, porém não UTD de controle, resultaram na lise específica de células HER2+ K562, porém não de células de controle K562, desprovidas de expressão de HER2, após 48 horas de co-cultura (Figura 20A). Para demonstrar que o extermínio de CARMA pode ser traduzido para células tumorais que expressam HER2 em níveis fisiológicos (em oposição a K562-HER2 que é transduzido lentiviralmente para sobre-expressar HER2), células de câncer de mama SKBR3 e células de câncer de ovário SKOV3 foram usadas como alvos. Macrófagos CARMA, porém não UTD de controle ou Ad5f35 Vazio de controle transduzidos, tinham atividade antitumoral significativa contra ambos os modelos após 48 horas de co-cultura (Figuras 20B e 20C). Para testar a sinergia entre o bloqueio do eixo CD47/SIRPα em um ensaio de extermínio, as células de câncer de ovário SKOV3 foram co-culturadas com meios, macrófagos não transduzidos de controle, CARMA anti-HER2, CARMA anti-HER2 + mAB antiCD47 (10mcg/ml) ou CARMA anti-HER2 + anti-SIRPα (10mcg/ml) e o sinal de luciferase foi medido em série. CARMA resultou na erradicação de tumor total no dia 13, enquanto a cinética da erradicação do tumor foi ainda mais rápida na presença de bloqueio do eixo CD47/SIRPα (Figura 20D). A sinergia com β-glucano, que foi demonstrada em um modelo de macrófago CARMA THP-1, foi testada em um experimento similar, e a iniciação de β-glucano do CARMA levou à cinética de extermínio de tumores aprimorada (Figura 20E). A exposição de CARMA a LPS (um ligante de TLR-4) ou Poli-IC (um ligante de TLR-3) resultou em modulação do efeito antitumoral (Figura 20F).

[0370]A capacidade de CARMA humano primário eliminar tumores in vitro foi demonstrada por ensaio de luciferase nas Figuras 20A a 20F. Para validar esses resultados, as células de câncer de ovário GFP + SKOV3 foram co-culturadas com macrófagos UTD de controle, macrófagos UTD de controle mais 10 μc/ml de trastuzumabe, macrófagos transduzidos por vírus Ad5f35 vazio de controle, ou CARMA anti-HER2 humano primário. As condições de CARMA, porém não de controle, foram capazes de eliminar as células tumorais (Figura 21).

[0371]Macrófagos são células fenotipicamente plásticas capazes de adotar diversas características funcionais, comumente separadas nas classificações de macrófago M1 e M2 - sendo M1 inflamatório/ativado e M2 sendo imunossupressor/promotor de tumor. 48 horas após a transdução de macrófagos humanos primários com vírus Ad5f35 CAR, uma supraregulação dose-dependente de marcadores M1 CD80/CD86 e uma infraregulação dose-dependente de marcador CD23 M2, foram medidas por FACS (Figura 22A). Para testar se esse efeito foi um resultado da expressão de CAR ou transdução de Ad5f35, os macrófagos que foram transduzidos com nada, Ad5f35 vazio ou Ad5f35 anti-HER2 e Ad5f35 vazio/CAR mostraram o mesmo padrão de mudança de fenótipo (Figura 22B).

[0372]O microambiente do tumor sólido é, em geral, imunossupressor e pode levar à polarização macrófago para o estado M2. Para testar se o CARMA, que é polarizado por M1 devido à transdução viral, é resistente à subversão mediada por citocina imunossupressora para M2, os macrófagos humanos CAR não transduzidos ou anti-HER2 foram expostos à IL-4, IL-10 ou IL-13 durante 24 horas antes da co- cultura com células de câncer de ovário SKOV3. Os macrófagos UTD de controle condicionados com citocinas supressoras resultaram no aumento do crescimento tumoral, enquanto o CARMA exposto a citocinas supressoras manteve sua atividade de extermínio em um ensaio de lise específica in vitro baseado em luciferase em 48 horas (Figura 22C).

[0373]Para testar adicionalmente a resistência à imunossupressão de macrófagos CAR humanos, macrófagos UTD de controle, Ad5f35 Vazio ou transduzidos por CAR Ad5f35 anti-HER2 foram expostos a 10 ng/ml de IL-4, uma citocina de indução M2 canônica ou células cancerígenas que anteriormente foram mostradas para subverter macrófagos para M2 durante a co-cultura (SKOV3, linhagem de células de câncer de ovário, HDLM2, linhagem de células de linfoma de Hodgkin). Os macrófagos UTD de controle suprarregulam (upregulation) CD206, um marcador M2 que responde especificamente ao estímulo de IL-4 através da fosforilação de STAT6. Ad5f35 vazio, e mais macrófagos transduzidos por CAR- Ad5f35, exibiram resistência à IL-4 e subversão induzida por tumor ao fenótipo M2 (Figura 22D).

[0374]Para caracterizar ainda mais o fenótipo de macrófagos CAR, o fenótipo metabólico foi sondado usando o ensaio Seahorse para medir o consumo de oxigênio. Os macrófagos M2 têm uma taxa de consumo de oxigênio basal mais alta do que os macrófagos M0 ou M1, devido a uma maior dependência de fosforilação oxidativa para a produção de ATP. Os macrófagos UTD de controle ou CAR anti-HER2 foram expostos à IL-4 durante 24 horas para polarizar para M2 (ou não), e a taxa de consumo de oxigênio foi medida. Os macrófagos UTD de controle demonstraram a característica de aumento do consumo de oxigênio basal característica de macrófagos M2, enquanto o CARMA não respondeu à IL-4, sugerindo que é resistente à subversão de M2 (Figura 22E). Esses dados combinados ilustram, usando ensaios fenotípicos, metabólicos e funcionais, que os CARMA são resistentes à subversão de M2.

[0375]Os monócitos doadores normais humanos primários (purificados através de seleção positiva de CD14) foram transduzidos com Ad5f35-CAR-HER2 em MOI’s variando de 0 (UTD) a 1000. A expressão de CAR foi medida através de FACS 48 horas após a transdução. Os monócitos CAR foram eficientemente gerados com Ad5f35, com a expressão atingindo seu pico em um MOI de 1000 (Figuras 23A e 23B). Os monócitos mantiveram alta viabilidade (medida pela análise FACS Live/Dead Aqua) em MOIs de até 1000 (Figura 23C). Os marcadores de ativação M1 suprarregulados (upregulated) por monócitos humanos CAR, porém não transduzidos (UTD) (Figura 23D) e o marcador M2 infraregulado (downregulated) (Figura 23E), conforme analisado pelo FACS, demonstraram um fenótipo de monócito M1 48 horas após a transdução.

[0376]O extermínio de monócitos CAR anti-HER2 foi avaliado através de ensaio de extermínio in vitro baseado em luciferase em uma faixa de razões de efetor:alvo (E: T). Os monócitos não transduzidos (UTD) ou CAR-HER2-zeta (CAR) foram co-culturados com células HER2 + SKBR3 (câncer de mama humano) ou HER2 + SKOV3 (câncer de ovário humano) in vitro. A lise específica foi calculada e determinada 24, 48 e 96 horas após a iniciação da co-cultura. Os monócitos CAR, porém não UTD realizaram a lise de células de câncer de mama e ovário in vitro (Figuras 24A e 24B).

[0377]Os camundongos NOD-scid IL2Rg-null-IL3/GM/SF, NSG-SGM3 (NSGS) foram usados para modelar xenoenxertos de câncer de ovário humano HER2 (+) in vivo. No dia 0, os camundongos foram injetados intraperitonealmente (IP) com células de câncer de ovário SKOV3 positivas para luciferase de cleópteros 7.5E5 (CBG luc)/ positivas para proteína verde fluorescente (GFP) como um modelo de carcinomatose intraperitoneal, um modelo metastático inerentemente agressivo de malignidade sólida. Os camundongos não foram tratados (tumor individualmente), ou injetados com uma dose única de macrófagos humanos 4-E6 não transduzidos (UTD) ou CAR-HER2 (CARMA) no dia 0 através de injeção IP (diagrama esquemático, Figura 25A). Os camundongos foram representados em imagens em série usando bioluminescência (fluxo total, fótons/segundo) como um substituto de carga tumoral. Os camundongos que receberam o tratamento com CARMA tiveram uma redução na carga tumoral de aproximadamente duas ordens de grandeza (Figuras 25B e 25C). Os camundongos tratados com CARMA tiveram um benefício de sobrevivência de 30 dias (p = 0,018) em relação aos camundongos não tratados ou tratados com macrófago UTD (Figura 25D). Para demonstrar o tráfego de macrófagos no nódulo de tumor sólido, os tumores foram coletados de camundongos que morreram no dia 36 e avaliados quanto à presença de macrófagos humanos transferidos de forma adotiva através da expressão de CD45 humano na análise FACS (Figura 25E).

[0378]Os macrófagos humanos foram tanto não transduzidos (UTD) como transduzidos com vírions V5f35 vazios desprovidos de um transgene (Vazio) ou Ad5f35-CAR-HER2-Z (CARMA) em multiplicidades de infecção de 1000. A expressão de CAR de superfície foi verificada por análise FACS 48 horas após a transdução (Figura 26A). Os marcadores de superfície foram avaliados para demonstrar a polarização do macrófago M1 em células transduzidas por V5f35 vazio ou CAR- HER2-Z Ad5f35. Os marcadores M1 (HLA DR, CD86, CD80, PDL1) foram suprarregulados (upregulated) enquanto os marcadores M2 (CD206, CD163) foram infrarregulados (downregulated) (Figura 26B). Os camundongos NSGS foram usados novamente em um modelo IP de câncer de ovário metastático HER2 + e foram estratificados em quatro grupos de tratamento (n = 5 por grupo). Os camundongos não foram tratados ou receberam injeções IP de macrófagos não transduzidos por 1-E7, transduzidos por Ad5f35 vazio ou macrófagos transduzidos por CAR-HER2-Z no dia 0 (Figura 26C). A carga tumoral foi monitorada através de imageamento bioluminescente serial, com dados representativos mostrados no dia 27 após o enxerto tumoral (Figuras 26D e 26E). Os camundongos tratados com CARMA apresentaram carga de tumores aproximadamente 2.400 vezes menor do que os camundongos não tratados no dia 20 após o tratamento.

[0379]Os camundongos NSGS foram usados em um modelo IP de câncer de ovário metastático HER2 + e foram estratificados em quatro grupos de tratamento (n = 5 por grupo), incluindo sem tratamento, e macrófagos humanos 3E6, 1E7, ou 2E7 CAR-HER2-Z, administrados IP no dia 0 (Figura 27A). A carga tumoral foi monitorada através de imageamento bioluminescente serial, e uma resposta dose-dependente do número de macrófagos foi observada nesse modelo (Figura 27B). As doses únicas de macrófagos CAR-HER2 em macrófagos 3E6, 1E7, ou 2E7 por camundongo resultaram na erradicação de tumor dose-dependente (em relação aos camundongos não tratados) no dia 36 após o engolfamento (Figura 27C).

[0380]A Figura 28 é uma ilustração da abordagem terapêutica proposta para CARMA. Em suma, os monócitos de pacientes poderiam ser selecionados a partir do sangue periférico, diferenciados ex vivo e transduzidos para expressar um CAR, coestimulado (ou não) com compostos sinérgicos e injetados novamente no paciente por via intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, através de procedimento radiológico intervencionista, ou por outra via. Salienta-se que o processo diferenciado poderia ser ignorado e os monócitos podem ser transduzidos e infundidos novamente no paciente. A fonte de monócitos também pode ser um doador compatível com HLA.

Outras modalidades

[0381]A citação de uma listagem de elementos em qualquer definição de uma variável no presente documento inclui definições dessa variável como qualquer elemento único ou uma combinação (ou subcombinação) de elementos listados. A citação de uma modalidade no presente documento inclui que a modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou porções das mesmas.

[0382]As revelações de cada patente, pedido de patente e publicação citadas no presente documento se encontram incorporadas ao presente documento em duas totalidades a título de referência. Muito embora esta invenção tenha sido revelada com referência a modalidades específicas, é aparente que outras modalidades e variações desta invenção possam ser desenvolvidas por outros indivíduos versados na técnica sem divergir do verdadeiro âmbito e escopo da invenção. As reivindicações anexas são destinadas a serem construídas para incluírem todas essas modalidades e variações equivalentes.

Claims (25)

1. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma célula modificada compreendendo um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio intracelular de uma molécula estimulatória e/ou co-estimulatória, e em que a célula é um monócito, macrófago ou célula dendrítica que possui atividade efetora direcionada e compreende um componente de adenovírus Ad5f35, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

2. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma célula modificada compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio de ligação ao antígeno, uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio transmembrana e uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio intracelular de uma molécula estimulatória e/ou co-estimulatória, e em que a célula é um monócito, macrófago, ou célula dendrítica que expressa o CAR e possui atividade efetora direcionada e compreende um componente de adenovírus Ad5f35, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno do CAR compreende um anticorpo selecionado dentre o grupo que consiste em um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo sintético, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo de domínio simples, um fragmento variável de cadeia simples, e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno do CAR é selecionado dentre o grupo que consiste em um anticorpo anti-CD19, um anticorpo anti-HER2 e um fragmento dos mesmos.

5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o domínio intracelular do CAR compreende domínios de sinalização duplos.

6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade efetora direcionada é voltada contra um antígeno em uma célula alvo que se liga especificamente ao domínio de ligação ao antígeno do CAR.

7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade efetora direcionada é selecionada dentre o grupo que consiste em fagocitose, citotoxicidade celular direcionada, apresentação de antígeno e secreção de citocina.

8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um agente selecionado dentre o grupo que consiste em um ácido nucleico, um antibiótico, um agente anti- inflamatório, um anticorpo ou fragmentos de anticorpo do mesmo, um fator de crescimento, uma citocina, uma enzima, uma proteína, um peptídeo, uma proteína de fusão, uma molécula sintética, uma molécula orgânica, um carboidrato ou similares, um lipídeo, um hormônio, um microssomo, um derivado ou uma variação dos mesmos, e qualquer combinação dos mesmos.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula modificada tem pelo menos um marcador M1 suprarregulado (upregulated) e pelo menos um marcador M2 infrarregulado (downregulated).

10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula modificada é geneticamente modificada para expressar o CAR.

11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade efetora direcionada é aprimorada pela inibição da atividade de CD47 ou SIRPα.

12. Uso de uma célula modificada compreendendo um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio intracelular de uma molécula estimulatória e/ou co-estimulatória, e em que a célula é um monócito, macrófago ou célula dendrítica que possui atividade efetora direcionada e compreende um componente de adenovírus Ad5f35 ou compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio de ligação ao antígeno, uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio transmembrana e um sequência de ácido nucleico que codifica um domínio intracelular de uma molécula estimulatória e/ou co-estimulatória, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma resposta imune em um indivíduo em necessidade do mesmo.

13. Uso de uma célula modificada compreendendo um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio intracelular de uma molécula estimulatória e/ou co-estimulatória, e em que a célula é um monócito, macrófago ou célula dendrítica que possui atividade efetora direcionada e compreende um componente de adenovírus Ad5f35 ou compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio de ligação ao antígeno, uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio transmembrana e uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio intracelular de uma molécula estimulatória e/ou co-estimulatória, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um tumor ou câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo.

14. Uso da composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença ou condição associada a um tumor ou câncer em um indivíduo.

15. Uso da composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para estimular uma resposta imune a uma célula tumoral alvo ou tecido tumoral em um indivíduo.

16. Método para modificar uma célula CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: introduzir um receptor de antígeno quimérico (CAR) no monócito, macrófago ou célula dendrítica, em que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio intracelular de uma molécula estimulatória e/ou co-estimulatória, e em que a célula é um monócito, macrófago ou célula dendrítica que expressa o CAR e possui atividade efetora direcionada, em que o domínio de ligação ao antígeno do CAR é selecionado dentre o grupo que consiste em um anticorpo anti-CD19, um anticorpo anti-HER2, e um fragmento dos mesmos, e em que o CAR é introduzido pela transdução da célula com um vetor de adenovírus Ad5f35 que compreende a sequência de ácido nucleico que codifica o CAR.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que introduzir o CAR na célula compreende introduzir uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que introduzir a sequência de ácido nucleico compreende eletroporar um mRNA que codifica o CAR.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a atividade efetora direcionada é voltada contra um antígeno em uma célula alvo que se liga especificamente ao domínio de ligação ao antígeno do CAR.

20. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a atividade efetora direcionada é selecionada dentre o grupo que consiste em fagocitose, citotoxicidade celular direcionada, apresentação de antígeno e secreção de citocina.

21. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda inibir a atividade de CD47 ou SIRPα para aprimorar a atividade efetora direcionada.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que inibir a atividade de CD47 ou SIRPα compreende colocar a célula em contato com um anticorpo anti-CD47 de bloqueio ou um anticorpo anti-SIRPα de bloqueio.

23. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio intracelular do CAR compreende domínios de sinalização duplos.

24. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno do CAR compreende um anticorpo selecionado dentre o grupo que consiste em um anticorpo sintético, anticorpo humano, anticorpo humanizado, anticorpo de domínio simples, fragmento variável de cadeia simples e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo.

25. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda modificar a célula para entregar um agente a um alvo, em que o agente é selecionado dentre o grupo que consiste em um ácido nucleico, um antibiótico, um agente anti-inflamatório, um anticorpo ou fragmentos de anticorpo do mesmo, um fator de crescimento, uma citocina, uma enzima, uma proteína, um peptídeo, uma proteína de fusão, uma molécula sintética, uma molécula orgânica, um carboidrato ou similares, um lipídeo, um hormônio, um microssomo, um derivado ou uma variação do mesmo, e qualquer combinação dos mesmos.

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