WO2022186625A1 - 키메릭 항원 수용체-대식 세포의 제조 방법 및 그 세포의 용도 - Google Patents

키메릭 항원 수용체-대식 세포의 제조 방법 및 그 세포의 용도 Download PDF

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김병수
강미경
박희호
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서울대학교산학협력단
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    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a chimeric antigen receptor-macrophage and to the use of the cell.
  • Cancer immunotherapy which has recently been emerging, is a treatment that more specifically removes cancer cells by utilizing the body's own immune system.
  • immune cell therapy is a method of treating cancer by reinforcing the anticancer function of immune cells obtained from the patient's blood and injecting them back into the patient's body.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • CAR-T cell therapy is currently showing a high response rate and cure rate in blood cancer.
  • the therapeutic efficacy is limited, and the time and cost of CAR-T cell production are high, which hinders the clinical application of CAR-T cell therapeutics.
  • the limited therapeutic effect in solid cancer is because it is difficult for CAR-T cells to enter the cancer tissue due to the tumor microenvironment in solid cancer, and the suppressed immune response interferes with the anticancer function of CAR-T cells.
  • CAR-T cells use a viral gene carrier in the manufacturing process. Therefore, there are risks such as the possibility of developing immunogenicity after CAR-T cells are injected into the patient, and the possibility that the transferred gene may additionally activate cancer-related genes in the CAR-T cells.
  • the present invention solves the above problems and has been devised in response to the above necessity.
  • the object of the present invention is to produce a combination of a non-viral gene delivery system and a CAR gene, thereby reducing the risk that existing therapeutic agents use a viral gene delivery system. is to provide a way.
  • Another object of the present invention is to provide a method for reducing the cost and time required to produce CAR-expressing macrophages in vitro by inducing CAR-macrophages in situ by delivering CAR genes directly into the body.
  • Another object of the present invention is to provide a CAR macrophage-based therapeutic agent that has a high anticancer therapeutic effect in solid cancer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising a complex of a plasmid DNA containing a gene encoding a chimeric antigen receptor (CAR) and a non-viral carrier, or CAR macrophages transformed by the complex. to provide.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising a complex of a plasmid DNA containing a gene encoding a chimeric antigen receptor (CAR) and a non-viral carrier, or CAR macrophages transformed by the complex. to provide.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the plasmid DNA contains a chimeric antigen receptor (CAR) gene.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • a chimeric antigen receptor may be one comprising an antigen binding domain that binds to a disease antigen.
  • the disease antigen may be an antigen that is overexpressed in cancer cells.
  • these include, for example, Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK), CD19, HER2, CD22, CD30, CD73, CD123, FLT3, B-cell maturation antigen, PD-1 MUC16, MSLN, gp100, MART-1, Melna-A, MAGE- A3, MAGE-C2, Mammaglobin-A, proteinsase-3, mucin-1, HPV E6, LMP2, PSMA, GD2, hTERT, PAP, ERG, NA17, GM3, EPhA2, NA17-A, TRP-1, TRP-2 , NY-ESO-1, CEA, CA 125, AFP, Survivin, AH1, ras, G17DT, MUC1, E75, p53, PSA, HCG, PRAME, WT1, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, E7, etc. may be.
  • ALK Anaplastic Lymp
  • the antigen-binding domain is a single-chain variable fragment (scFv) of an antibody that binds to the antigen, and may be used without limitation as long as it is an scFv of an antibody against a target disease antigen.
  • scFv single-chain variable fragment
  • a chimeric antigen receptor may further comprise a hinge region, a transmembrane domain, a costimulatory domain or a signaling domain in addition to the antigen binding domain.
  • a known configuration may be used without limitation for each region and domain of the CAR.
  • the hinge region may be a hinge derived from CD8, CD28, etc., but is not limited thereto.
  • the transmembrane domain may be a CD28-derived transmembrane domain, but is not limited thereto.
  • costimulatory domain a costimulatory domain derived from CD28, CD27, CD134, CD137, etc. may be used, but is not limited thereto. One or more than one may be used.
  • the signaling domain may be a CD3-zeta-derived signaling domain, but is not limited thereto.
  • the CAR preferably further includes all or part of the components described in FIG. 11, but is not limited thereto.
  • the plasmid DNA may further comprise a gene encoding interferon-gamma (IFN- ⁇ ) to induce the M1 macrophage phenotype.
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • the origin of interferon gamma is not limited, and those derived from mice, humans, etc. may be used.
  • the complex may be formed by binding of plasmid DNA and a non-viral carrier.
  • plasmid DNA and a non-viral carrier.
  • means, methods, and combinations known in the art may be applied without limitation.
  • the non-viral carrier refers to a non-viral gene carrier, not a viral carrier such as adenovirus.
  • Any gene carrier that is not derived from a virus can be used without limitation, and the complex can be easily formed by electrostatic interaction with plasmid DNA.
  • a cationic molecule can be used in terms of formation.
  • the cationic molecule refers to a molecule having a positive charge at neutral pH, and may have a nitrogen atom.
  • Cationic molecules include, for example, polyethyleneimine, mannosylated polyethyleneimine, mannosylated cholesterol-polyethylenimine, PEG-polyethyleneimine-cholesterol, cationic lipids, poly[(2-dimethylamino)ethyl methacrylate methacrylate-based polymers, polycations including chitosan and beta-cyclodextrins, polyamidoamines, dendrimers -Cholesterol-containing liposomes and cationic ionizable lipids and PEG-cholesterol-containing liposomes can be used.
  • a mannosylated cationic molecule may be used, and more preferably, a mannosylated polyethyleneimine or a mannosylated liposome may be used.
  • Mannosylated polyethyleneimine is a polymer in which mannose is bonded to the amino group of PEI.
  • MPITC ⁇ -d-Mannopyranosylphenyl isothiocyanate
  • PEI may be branched PEI (branched PEI), and the molecular weight thereof may be, for example, 1000 to 100000, 10000 to 50000, etc., but is not limited thereto.
  • plasmid DNA and the non-viral carrier are combined with an electrostatic attraction to form a complex, they are transferred into macrophages and can be controlled to have an appropriate level of attraction so that the carrier can later be released.
  • This can be controlled, for example, by adjusting the ratio of nitrogen (N) in the cationic molecule to phosphorus (P) in the plasmid DNA.
  • a ratio (N/P, element ratio) of nitrogen (N) of the non-viral carrier cationic molecule to phosphorus (P) of the plasmid DNA may be 4 to 30. Within the above range, it may be 4 to 30, 4 to 25, 4 to 20, 4 to 15, 4 to 10, 4 to 8, and the like.
  • the complex may further include a transposase plasmid.
  • a transposase plasmid This may be, for example, a piggybac transposase plasmid.
  • the transposase plasmid may be included in a mixture with plasmid plasmid DNA and a non-viral carrier during the preparation of the complex.
  • CAR macrophages are macrophages transformed with the complex to express CAR.
  • CAR macrophages express the CAR, and since the CAR may include an antigen-binding domain for a disease antigen, CAR macrophages may exhibit drug efficacy against the disease.
  • the macrophage may be, for example, bone marrow drived macrophage (BMDM) or a macrophage cell line (J774A.1, RAW 264.7, etc.), but is not limited thereto.
  • BMDM bone marrow drived macrophage
  • J774A.1, RAW 264.7, etc. a macrophage cell line
  • CAR macrophages can be prepared by treating macrophages with the complex and transforming macrophages.
  • the transformation may be performed in vivo or in vitro.
  • the cancer to be prevented or treated by the pharmaceutical composition of the present invention can be determined according to the type of the antigen-binding domain included in the CAR, and the type of the antigen-binding domain that can be introduced into the CAR is not limited, so the type of the cancer is limited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by mixing one or more of pharmaceutically acceptable carriers, that is, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and these components. It can be used, and may further include other conventional additives, such as antioxidants and buffers, if necessary. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders and/or lubricants may be additionally added to form an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • pharmaceutically acceptable carriers that is, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and these components.
  • composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but is preferably formulated as an injection or inhalant.
  • the method of administering the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be administered parenterally or orally, such as intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, inhalation or topical application, depending on the desired method.
  • the dosage varies according to the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of disease.
  • the daily dose refers to an amount of a therapeutic substance according to one aspect sufficient to treat a disease state alleviated by being administered to a subject in need of treatment.
  • the effective amount of a therapeutic agent will depend on the particular compound, the disease state and its severity, and the individual in need of treatment, which can be routinely determined by one of ordinary skill in the art.
  • the dosage for the human body of the composition according to one aspect may vary depending on the patient's age, weight, sex, dosage form, health status, and disease degree.
  • ⁇ Based on an adult patient weighing 70 kg, for example, about 1,000-10,000 cells/time, 1,000-100,000 cells/time, 1,000-1000,000 cells/time, 1,000-10,000,000, 1,000-100,000,000 cells/time, 1,000 to 1,000,000,000 cells/time, 1,000 to 10,000,000,000 cells/time, may be administered in divided doses once or several times a day at regular time intervals, or may be administered several times at regular time intervals.
  • the present invention also relates to a method for producing CAR macrophages, comprising transforming the macrophages with a complex of a plasmid DNA containing a gene encoding a chimeric antigen receptor and a non-viral carrier.
  • Plasmid DNA containing a gene encoding a chimeric antigen receptor, a non-viral carrier, a complex thereof, and a macrophage may be within the scope of the above-described examples.
  • the transformation may be performed by treating the macrophages with the complex, and the transformation method, means, conditions, etc. may be as known in the art.
  • the transformation may be performed in vivo or in vitro.
  • the complex When carried out in the body, the complex may be administered to an individual, and the complex may be in contact with macrophages in the body. When it is carried out in vitro, it may be carried out by treating macrophages with the complex.
  • the present invention may further include preparing the complex by mixing the plasmid DNA and the non-viral carrier in the following ratio.
  • N is the nitrogen of the non-viral carrier cationic molecule
  • P is the phosphorus of the plasmid DNA
  • the ratio is the number of elements
  • Equation 1 the plasmid DNA and the non-viral carrier are combined with an appropriate attractive force, so that delivery to macrophages and subsequent elimination of the viral carrier are easy.
  • an appropriate attractive force within the above range, it may be 4 to 30, 4 to 25, 4 to 20, 4 to 15, 4 to 10, 4 to 8, and the like.
  • the present invention also provides a method for providing information for diagnosis of cancer, comprising the step of contacting a CAR macrophage with a sample isolated from a subject.
  • CAR macrophages are macrophages transformed with the complexes described above.
  • CAR macrophages bind to cancer cells having an antigen that binds to the antigen-binding domain, and by the binding, it is possible to know whether the cancer cells are present or not, thereby providing information on whether cancer is present.
  • the present invention provides an effective immunocancer treatment means by producing a CAR gene conjugate using a non-viral gene delivery system and delivering it specifically to macrophages in vivo.
  • the present invention will also be a technique for ensuring stability from immune response using a non-viral gene delivery system.
  • it is advantageous in terms of commercialization in that it reduces the complicated in vitro therapeutic manufacturing process by directly transferring the gene in vivo, reduces the economic burden on the patient by reducing the production cost, and can be administered directly to the patient when the therapeutic agent is needed.
  • the present invention is also a cancer that can apply the anticancer effect of CAR-based therapeutics as a therapeutic agent that shows anticancer effect in solid cancer, unlike CAR-T cells, which are existing anticancer drugs, have little therapeutic effect in solid cancer due to the cancer-friendly effect of the tumor microenvironment. It has the effect of contributing to broadening the range of types.
  • FIG. 1 shows the insertion of the pCAR-IFN-g gene on the non-viral piggybac plasmid vector and the viral pCDH plasmid vector by double digestion through treatment with two types of restriction enzymes, and in the case of the piggybac plasmid vector It was delivered to BMDM by mixing with M PEI, and in the case of pCDH plasmid vector, a lentivirus was made and treated in BMDM at each concentration, and transduction was confirmed 72 hours later.
  • Figure 2 is to confirm the expression of ALK (AnapIastic Lymphoma Kinase) gene by reverse transcription polymerase chain reaction using intracellular mRNA, ALK gene cDNA-specific primers were prepared through organic synthesis,
  • FIG. 3 confirms that ALK overexpression occurs in most neuroblastomas based on previous studies. Therefore, in order to confirm ALK overexpression in neuroblastoma, the target antigen ALK gene in B16F10 (ATCC), NIH/3T3 (ATCC), Neuro2A (ATCC) cell lines to qualitatively and quantify the level of ALK gene expression on Neuro2A, one of the target carcinomas. The overexpression of neuroblastoma-specific ALK was confirmed on Neuro2A by reverse transcription polymerase chain reaction.
  • FIG. 4 shows ALK-specific cells of macrophages expressing the CAR gene through co-culture with the B16F10 cell line (ATCC), the NIH/3T3 cell line (ATCC), or the Neuro2a cell line (ATCC) expressing the ALK gene, which does not express the ALK gene.
  • ALK B16F10 cell line
  • ATCC the NIH/3T3 cell line
  • ATCC the Neuro2a cell line
  • Figure 5 is after co-culture with the Neuro2a cell line (ATCC) expressing the ALK gene for 16 hours, the apoptosis-inducing response according to time was confirmed by live cell imaging using PAULA (Leica microsystems) at 10-minute intervals,
  • Figure 7 is E: T ratio 1:3 after co-culture with BMDM and cancer cells for 24 hours, CAR and GFP co-expressing cells by gene transfer macrophages in co-culture with Neuro2a cells expressing ALK It has been confirmed that the action increases ,
  • FIG. 8 is a diagram confirming that the number of cancer cells is reduced in the situation where the CAR gene is expressed after co-culture was performed for 48 hours with different ratios of RAW264.7 cell line and cancer cells.
  • Figure 10 confirms the change in phagocytosis by gene transfer after co-culture with the RAW 264.7 cell line and cancer cells at a ratio of E:T ratio 1:3 for 24 hours;
  • FIG. 11 is a schematic diagram of the vector plasmid construct of the present invention.
  • FIG. 13 shows that macrophages expressing CAR in cancer tissue (green in FIG. 13) overlap with or close to cancer cells (red in FIG. 13) through immunohistochemical analysis, showing that macrophages expressing CAR are cancer cells observed to prey on
  • FIG. 14 shows changes in liver and kidney-related enzymes [aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT), creatinine and blood urea nitrogen (BUN)] in plasma by extracting blood for each time period from mice treated with nanoparticles. It was confirmed that the difference between the corresponding enzymes in each plasma of mice injected with vehicle and mice injected with MPEI/pCAR-IFN- ⁇ was not statistically significant,
  • control group is a group injected with only a solution containing nanoparticles (Vehicle), a nanoparticle group containing a gene that is not a CAR-M1 inducer (MPEI/Mock), and a nanoparticle group containing only the CAR gene (MPEI/ pCAR) and the M1-inducing factor alone (MPEI/pIFN- ⁇ ), compared with the group treated with MPEI/pCAR-IFN- ⁇ , the cancer growth was most significantly inhibited, and the survival rate of mice also observed an increase,
  • TGF- ⁇ + area involved in the differentiation of Tregs that help cancer growth in cancer tissues was reduced when treated with a group including pIFN- ⁇ (MPEI/pIFN- ⁇ and MPEI/pCAR-IFN- ⁇ ).
  • Figure 26 is the observation that macrophages expressing CAR in cancer tissue [green in Figure 26] phagocytic cancer cells [red in Figure 26] through immunohistochemical analysis,
  • FIG. 28 shows that MPEI/pCAR-IFN- ⁇ does not have significant toxicity in vivo compared to the control group even after intraperitoneal injection into cancer-causing mice.
  • FIG. 30 shows the efficiency of in vivo transformation (CAR gene expression) of macrophages present in the abdominal cavity into CAR macrophages by injecting a complex of CAR/IFN- ⁇ /GFP plasmid DNA and cationic liposome into the abdominal cavity of a mouse.
  • Anti-Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) chimeric antigen receptor (CAR) gene CD8 ⁇ SP of SEQ ID NO: 1, ALK scFv of SEQ ID NO: 2, CD8 ⁇ hinge of SEQ ID NO: 3, CD28 transmembrane of SEQ ID NO: 4 using a gene organic synthesis method domain, CD28 cytoplasmic domain of SEQ ID NO: 5, CD3z (CD247) cytoplasmic domain of SEQ ID NO: 6, Linker of SEQ ID NO: 7, using cleavage sequence
  • the inserted CAR gene is amplified and isolated through PCR, it is inserted into the MCS sequence of lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1 ⁇ -copGFP Cloning and Expression Lentivector purchased from SBI (system biosciences) through infusion method. and cloning to complete the pCDH_CAR plasmid.
  • mice IFNg sequence (SEQ ID NO: 8) present in Interferon Gamma cDNA ORF Clone, Mouse, untagged plasmid purchased from Sino biological was extracted by double digestion by two restriction enzymes KpnI and XbaI, and PCR cloning was performed on pCDH_CAR plasmid. It was inserted and cloned into the 3' end of the CAR gene to complete pCDH_CAR_IFN- ⁇ .
  • lentivirus containing pCDH_CAR plasmid (or pCDH_CAR_IFN- ⁇ ), pCDH_CAR plasmid (or pCDH_CAR_IFN- ⁇ REV), lenti G/P, and VSV-G were mixed with PEI (25k linear, poly ethylene imine) and then at room temperature. After storage for 30 minutes in a lenti-X 293T cell line (TaKaRa bio) for 8 hours.
  • PEI 25k linear, poly ethylene imine
  • the culture medium was filtered with a 0.45 um filter, and centrifuged at 4° C. for 2 hours at a speed of 20000 RPM.
  • the resulting lentivirus pallet was concentrated and diluted to a volume of 1/100.
  • pCDH_CAR plasmid (or pCAR RAW 264.7 cell line transduced with pCDH_CAR_IFN- ⁇ (or pCAR_IFN- ⁇ RAW 264.7 cell line)) was isolated and confirmed through cell line selection.
  • the pB_CAR plasmid was completed by inserting and cloning into the MCS sequence of the nonviral PB-CMV-MCS-EF1 ⁇ -GreenPuro PiggyBac cDNA Cloning and Expression Vector purchased from SBI (system biosciences) through infusion method. did.
  • Interferon Gamma cDNA ORF Clone Mouse, mouse IFNg sequence existing in untagged plasmid purchased from Sino biological company is extracted by double digestion by two restriction enzymes KpnI and XbaI, and 3' of CAR gene through PCR cloning on pB_CAR plasmid PB_CAR_IFN- ⁇ or less pCAR-IFN- ⁇ was completed by insertion and cloning at the end.
  • Mannosylated polyethyleneimine (PEI) (Jet PEI-Mac, polyplus-transfection, hereafter MPEI), pCAR (or pCAR-IFN- ⁇ and piggybac transposase plasmid are mixed and stored at room temperature for 20 minutes, followed by M2 BMDM (bone marrow drived macrophage)) treated for 2 hours.
  • PEI Mannosylated polyethyleneimine
  • mRNA was isolated from B16F10 (ATCC), NIH/3T3 (ATCC), and Neuro2A (ATCC) using Trizol (Qiagen, Valencia, CA).
  • the mRNA amount isolated from B16F10 (ATCC), NIH/3T3 (ATCC), and Neuro2A (ATCC) was quantified using a NanoDrop spectrometer (ND-2000, NanoDrop Technologies), and a certain amount of mRNA was quantified in AccuPower®Master Mix (Bioneer). ) and 1:1, incubated at 70°C for 5 minutes, stored on ice, treated at 42°C for 60 minutes to synthesize cDNA, and treated at 94°C for 5 minutes to inactivate RTase. .
  • cDNA derived from B16F10 (ATCC), NIH/3T3 (ATCC), Neuro2A (ATCC) was mixed with SYBR green-based TOPreal TM qPCR 2X PreMIX (Enzynomics), 10 pmol/ ⁇ l Forward primer, and 10 pmol/ ⁇ l Reverse primer. After treatment at 95°C for 15 minutes, the three-step treatment process of 10 seconds at 95°C, 15 seconds at 62°C, and 20 seconds at 72°C was repeated 55 times to confirm the expression of ALK in real time.
  • MPEI, pCAR-IFN- ⁇ and piggybac transposase plasmid were mixed, stored at room temperature for 20 minutes, and then treated in M2 BMDM (bone marrow drived macrophage) for 2 hours.
  • StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent (thermo-fisher scientific) was treated at room temperature for 10 to 15 minutes to float MPEI/pCAR-IFN- ⁇ -treated M2 BMDM, and then centrifuged at 1500 RPM for 5 minutes. The cell pellet was resuspended in RPMI 1640 (gibco, supplemented 10% FBS, 1% pen-strep, 20 ng/ml M-CSF).
  • M2 BMDM treated with MPEI/pCAR-IFN- ⁇ was stained using CellTraceTM Cell Proliferation Kit (thermofisher scientific).
  • BMDM stained with CellTraceTM Cell Proliferation Kit (thermofisher scientific) and Neuro2A (ATCC) expressing ALK gene were treated at a concentration of 1:3 in a 24-well plate (SPL), and co-culture was performed for 16 hours.
  • BMDM green
  • MPEI/pCAR-IFN- ⁇ completely removed Neuro2A (ATCC, white) from the bottom surface after 710 minutes, and at 960 minutes, it was removed from the bottom surface. It was confirmed that apoptosis was induced as Neuro2A (ATCC) cells were reduced.
  • MPEI, pCAR, and piggybac transposase plasmid were mixed, stored at room temperature for 20 minutes, and then treated in M2 BMDM (bone marrow drived macrophage) for 2 hours.
  • StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent (thermo-fisher scientific) was treated at room temperature for 10 to 15 minutes to float MPEI/pCAR-treated M2 BMDM, and then centrifuged at 1500 RPM for 5 minutes to obtain a cell pellet in RPMI. 1640 (gibco, supplemented 10% FBS, 1% pen-strep, 20 ng/ml M-CSF) was resuspended.
  • MPEI/pCAR-treated M2 BMDMs were stained using CellTraceTM Cell Proliferation Kit (thermofisher scientific).
  • BMDM stained with CellTraceTM Cell Proliferation Kit (thermofisher scientific) and Neuro2A (ATCC) expressing ALK gene were treated at a concentration of 1:3 in a 24-well plate (SPL), and co-culture was performed for 24 hours.
  • the number of Neuro2A was reduced by about 25% under the condition of NIH/3T3 (ATCC), and the decrease in the cell ratio of NIH/3T3 (ATCC) by MPEI/pCAR-treated M2 BMDM in the co-culture condition with NIH/3T3 (ATCC) Compared with the cell ratio of NIH/3T3 (ATCC) by M2 BMDM treated with MPEI/pGFP in co-culture conditions with /3T3 (ATCC), results were not valid.
  • the ratio of Neuro2A (ATCC) cells decreases as the ratio of BMDM, which is an effector cell, increases in the E:T ratio. Therefore, it was confirmed that the decrease in the ratio of Neuro2a (ATCC) cells was specifically shown in the E:T ratio of 1:3.
  • RAW 264.7 ATCC
  • SPL 6 well plate
  • Isolated RAW 264.7 cells which are effector cells, and NIH/3T3, which do not express ALK, stained with CellTraceTM Red Cell Proliferation Kit (thermo-fisher scientific), which are target cells, were evaluated at an E:T ratio of 1:1, 1:3, and 1, respectively. After co-culture at a ratio of :5, 48 hours later, analysis was performed by flow rate cell analysis using a FACS calibur (BD Biosciences).
  • a decrease in the cell ratio of Neuro2A (ATCC) was observed in the CAR-expressing RAW264.7 cell line and the ALK-expressing Neuro2a co-culture condition, and E:T of 1:3 in the co-culture condition with Neuro2A (ATCC)
  • the number of Neuro2A (ATCC) decreased by about 81%
  • the decrease in the cell ratio of NIH/3T3 (ATCC) by the RAW264.7 cell line expressing CAR in the co-culture condition with NIH/3T3 (ATCC) In this co-culture condition with NIH/3T3 (ATCC), effective results were obtained by comparing the cell ratio of NIH/3T3 (ATCC) to the RAW264.7 cell line in which CAR is not expressed.
  • a decrease in the cell ratio of Neuro2A was observed in the CAR-expressing RAW264.7 cell line and the ALK-expressing Neuro2a co-culture condition, and E:T of 1:3 in the co-culture condition with Neuro2A (ATCC)
  • the number of Neuro2A was reduced by about 57% under the condition of ratio, and the decrease in the cell ratio of NIH/3T3 (ATCC) by the RAW264.7 cell line expressing CAR in the co-culture condition with NIH/3T3 (ATCC)
  • NIH/3T3 ATCC
  • the ratio of Neuro2A (ATCC) cells decreases as the ratio of BMDM, which is an effector cell, increases in the E:T ratio. Therefore, it was confirmed that the decrease in the ratio of Neuro2a (ATCC) cells was specifically shown in the E:T ratio of 1:3.
  • a decrease in the cell ratio of Neuro2A was observed in the CAR-expressing RAW264.7 cell line and the ALK-expressing Neuro2a co-culture condition, and E:T of 1:3 in the co-culture condition with Neuro2A (ATCC) Under the condition of ratio, the number of macrophage cells was confirmed to be about 8%.
  • polyethyleneimine (MPEI), a cationic polymer with a mannose group, and CAR and M1 inducer genes are diluted in 150 mM NaCl, and nitrogen present in PEI (nitrogen ) and the mixing ratio of phosphate present in the gene, that is, Nitrogen/phosphate (N/P) at 6, and react at room temperature for 30 minutes to complete nanoparticles. At this time, the GFP fluorescent gene was included in the gene.
  • MPEI polyethyleneimine
  • N/P Nitrogen/phosphate
  • mice Six-week-old female A/J mice were purchased from Central Laboratory Animals (Korea) and bred in a kennel with a one-week acclimatization period. After the acclimatization period was completed, the mice were anesthetized with IFRAN solution, and then 1 ⁇ 10 6 RFP-expressing cancer cells were injected subcutaneously for cancer modeling. - ⁇ nanoparticles were directly injected into the cancer tissue.
  • the cancer was separated from the main organs and subjected to fluorescence imaging, and after the cancer tissue was made into a single cell, specific markers of various immune cells (dendritic cells: CD11c, B cells: CD19, macrophages: CD11b, Immunostaining was performed with CD4 T cells: CD4, CD8 T cells: CD8), and the expression of CAR in tissues and cells was confirmed using FACS CantoII (BD Biosciences).
  • CAR expression was the highest in cancer tissues compared to other organs, and compared to other immune cells (dendritic cells, B cells and T cells) in cancer tissues. It was confirmed that CAR was most expressed in phagocytes.
  • the cancer tissue was extracted 24 hours after injection of the control group and MPEI/pCAR-IFN- ⁇ and fixed in 4% paraformaldehyde solution. Then, the tissue was frozen with a cryo-tissue embedding agent (OCT compound), and the cancer tissue was sectioned into 10 ⁇ m using a cryosectioning machine to prepare a tissue slide.
  • OCT compound cryo-tissue embedding agent
  • CAR-expressing macrophages To identify CAR-expressing macrophages, immunohistochemistry was performed using a fluorescent antibody binding to GFP, and RFP-expressing cancer cells and GFP-expressing macrophages were identified through a fluorescence microscope. CAR-expressing macrophages in cancer tissues overlapped with cancer cells or appeared close to the fluorescence, so it could be observed that CAR-expressing macrophages predated cancer cells.
  • mice 6-week-old female A/J mice were purchased from Central Laboratory Animals (Korea) and bred in a kennel with a one-week acclimatization period. After the acclimatization period was completed, the mice were anesthetized with iPran solution, and then 1 ⁇ 10 6 cancer cells were injected subcutaneously for cancer modeling.
  • One group (Vehicle) and MPEI/pCAR-IFN- ⁇ nanoparticles were directly injected into the cancer tissue.
  • liver and kidney-related enzymes [aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT), creatinine and blood urea nitrogen (BUN)] was confirmed using a DRI-CHEM 3500S chemistry analyzer (Fujifilm, Japan).
  • cancer-modeled mice were prepared as in Example 8, and then nanoparticles were directly injected into the cancer to measure changes in cancer size.
  • the group injected only with a solution containing nanoparticles (Vehicle), the nanoparticle group containing a gene that is not a CAR-M1 inducer (MPEI/Mock), the nanoparticle group containing only the CAR gene (MPEI/pCAR), and M1
  • MPEI/pIFN- ⁇ A group of nanoparticles (MPEI/pIFN- ⁇ ) containing only inducing factors was established.
  • cancer tissues were isolated and fixed in 4% paraformaldehyde solution. Then, the tissue was frozen with a cryo-tissue embedding agent (OCT compound), and the cancer tissue was sectioned into 10 ⁇ m using a cryosectioning machine to prepare a tissue slide. Thereafter, the cancer tissue slides were analyzed with a light microscope by staining the nuclear membrane of the cells with a hematoxylin solution and the cytoplasm of the cells with an eosin solution. Cancer cells have a high ratio of cell nucleus to cytoplasm. In the MPEI/pCAR-IFN- ⁇ treatment group, it was observed that the ratio of cytoplasm to nucleus was decreased.
  • OCT compound cryo-tissue embedding agent
  • Apoptotic cells were labeled in green through PROMEGA's DeadEndTM Fluorometric TUNEL System protocol and observed through a fluorescence microscope. As a result, the most apoptotic cells were observed in the MPEI/pCAR-IFN- ⁇ treatment group. .
  • cDNA complementary DNA
  • qRT-PCR real-time polymerase chain reaction
  • Cancer tissue was separated into single cells, and specific markers of immune cells were labeled using a fluorescent antibody, and numerical and functional changes of immune cells before and after MPEI/pCAR-IFN- ⁇ treatment were confirmed through flow cytometry.
  • the expression level of the M1 marker (CD86) in the MPEI/pCAR-IFN- ⁇ treatment group was significantly higher than that of other groups, and the expression level of the M2 marker (CD163) was significantly reduced.
  • the tissue was frozen with a cryo-tissue embedding agent (OCT compound), and the cancer tissue was sectioned into 10 ⁇ m using a cryosectioning machine to prepare a tissue slide.
  • OCT compound a cryo-tissue embedding agent
  • the prepared cancer tissue slides were labeled with specific markers of immune cells using a fluorescent antibody and analyzed through a fluorescence microscope. It was confirmed that significantly high, and the expression level of the M2 marker (Arginase-1) was significantly reduced.
  • cancer tissue was obtained, separated into single cells, and specific markers of immune cells were labeled using an antibody with fluorescence.
  • Cytotoxicity T before and after MPEI/pCAR-IFN- ⁇ treatment through flow cytometry Numerical and functional changes of cell regulatory T cells were confirmed.
  • the CD3 and CD8 markers expressed on the cell membrane were stained, and then the Granzyme B marker was subjected to intracellular staining. And as a result of analyzing the difference in the amount of cells expressing all of CD3, CD8 and Granzyme B between groups through flow cytometry, the group injected directly with MPEI/pCAR-IFN- ⁇ attacked cancer compared to other groups.
  • the number of activated cytotoxic T cells is increased.
  • the substance (Granzyme b) related to the activated function of cytotoxic T cells increased through CAR expression-dependent macrophage phagocytosis and cancer antigen It was found that the presentation had an effect on the activation of cytotoxic T cells.
  • CD3, CD4, and CD25 markers expressed on the cell membrane were first stained, and then, Foxp3 marker was subjected to intracellular staining. And as a result of analyzing the difference in the amount of cells expressing all of CD3, CD4, CD25, and Foxp3 between groups through flow cytometry, the amount of Treg that interferes with anticancer immunity was the highest in the group treated with MPEI/pCAR-IFN- ⁇ . decrease was confirmed.
  • the tissue was frozen with a cryo-tissue embedding agent (OCT compound), and the cancer tissue was sectioned into 10 ⁇ m using a cryosectioning machine to prepare a tissue slide.
  • OCT compound a cryo-tissue embedding agent
  • the prepared cancer tissue slide was labeled with TGF - ⁇ using a fluorescent antibody and analyzed through a fluorescence microscope. IFN- ⁇ ) was decreased, which may be attributed to the decrease in the number of TGF- ⁇ -secreting M2 macrophages due to pIFN- ⁇ transduction. Since TGF- ⁇ is involved in Treg differentiation, it can be seen that the amount of Treg may be decreased due to the decrease of TGF- ⁇ .
  • the amount of inflammatory factors (TNF- ⁇ and IFN- ⁇ ) involved in the anticancer function in the cancer tissue was increased as a result of confirming the change in inflammation-related factors by enzyme-linked immunoassay (ELISA) by isolating cancer tissue and extracting only proteins. It was confirmed that the amount of factors (IL-4 and IL-10) involved in inhibiting the anticancer function decreased. From the above results, it can be concluded that the nanoparticles prepared in the present invention are effective in changing the immune environment in cancer tissues to be non-cancer-friendly and inhibiting cancer growth.
  • nanoparticles were prepared as in Example 7 above, and after cancer modeling in mice 4 On the first day, MPEI/pCAR-IFN- ⁇ nanoparticles were injected intraperitoneally.
  • the cancer was separated from the main organs and subjected to fluorescence imaging, and after the cancer tissue was made into a single cell, specific markers of various immune cells (dendritic cells: CD11c, B cells: CD19, macrophages: CD11b, Immunostaining was performed with CD4 T cells: CD4, CD8 T cells: CD8), and the expression of CAR in tissues and cells was confirmed using FACS CantoII (BD Biosciences).
  • CAR expression was the highest in cancer tissues compared to other organs, and compared to other immune cells (dendritic cells, B cells and T cells) in cancer tissues. It was confirmed that CAR was most expressed in phagocytes.
  • the cancer tissue was extracted 24 hours after injection of the control group and MPEI/pCAR-IFN- ⁇ and fixed in 4% paraformaldehyde solution. Then, the tissue was frozen with a cryo-tissue embedding agent (OCT compound), and the cancer tissue was sectioned into 10 ⁇ m using a cryosectioning machine to prepare a tissue slide.
  • OCT compound cryo-tissue embedding agent
  • CAR-expressing macrophages To identify CAR-expressing macrophages, immunohistochemistry was performed using a fluorescent antibody binding to GFP, and RFP-expressing cancer cells and GFP-expressing macrophages were identified through a fluorescence microscope. CAR-expressing macrophages in cancer tissues overlapped with cancer cells or appeared close to the fluorescence, so it could be observed that CAR-expressing macrophages predated cancer cells.
  • mice 6-week-old female A/J mice were purchased from Central Laboratory Animals (Korea) and bred in a kennel with a one-week acclimatization period. After the acclimatization period was completed, the mice were anesthetized with iPran solution, and then 1 ⁇ 10 6 cancer cells were injected subcutaneously for cancer modeling.
  • One group (Vehicle) and MPEI/pCAR-IFN- ⁇ nanoparticles were injected intraperitoneally.
  • liver and kidney-related enzymes [aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT), creatinine and blood urea nitrogen (BUN)] was confirmed using a DRI-CHEM 3500S chemistry analyzer (Fujifilm, Japan).
  • DOPE diphosphatidylethanolamine
  • DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane
  • cholesterol 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane
  • PE-PEG 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)) (4 types) Molar ratio of components 1: 1: 0.1: 0.1)
  • the mixture was passed through a membrane having a pore size of 1000 nm and 200 nm (extrusion) to prepare a liposome.
  • RAW 264.7 cells a macrophage cell line
  • 10% fetal bovine serum-DMEM high medium in a 6-well plate with 30-40% Grow to confluency.
  • the lipoplex containing CAR-IFN- ⁇ -GFP pDNA is added at a concentration of 5 ug DNA/ml and cultured. After 2 days, GFP-expressing cells were examined by FACS (FIG. 29).
  • lipoplex containing 100 ug CAR-IFN- ⁇ -GFP pDNA was injected into the abdominal cavity of C57BL/6 mice. After extracting cells in the abdominal cavity after 6 hours, APC (CD45, lymphocyte marker) + , PE/Cy7 (CD11b, macrophage marker) + cells expressing GFP (FITC) among double positive cells were analyzed by FACS (Fig. 30).

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Abstract

본 발명은 본 발명은 비바이러스성 유전자 전달체와 키메릭 항원 수용체 유전자의 결합체를 사용하는 단계를 포함하는 키메릭 항원 수용체를 발현하는 CAR-M1 대식 세포를 체외 및 체내에서 제조하는 방법, 그 방법에 의하여 제조된 CAR- M1 대식 세포 및 그 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 CAR- M1 대식 세포는 체내 대식세포에 특이적으로 키메릭 항원 수용체와 IFN―γ를 코딩하는 유전자를 전달하여 체내에서 제조되므로 체외 세포치료제 배양 및 제조 단계가 필요없어서 치료제 제조 원가가 절감되고, 바이러스 벡터를 사용한 유전자 전달에 의한 CAR-M1 대식 세포 제조에 비해서 비바이러스성 벡터를 사용하여 더욱 안전한 치료법이고, 고형암에 침투하는 대식세포 고유의 특성과 암세포 포식작용이 향상된 CAR-M1 대식 세포로 인해 높은 고형암 항암효율의 장점을 가진 새로운 치료제 후보 물질이다.

Description

키메릭 항원 수용체-대식 세포의 제조 방법 및 그 세포의 용도
본 발명은 키메릭 항원 수용체-대식 세포의 제조 방법 및 그 세포의 용도에 관한 것이다.
최근 부각되고 있는 암 면역치료법 (cancer immunotherapy)은 인체 고유의 면역 시스템을 활용하여 암세포를 보다 특이적으로 제거하는 치료법이다.
이 중 면역세포 치료는 환자의 혈액에서 얻은 면역세포의 항암 기능을 강화하여, 이를 다시 환자 몸에 주입하여 암을 치료하는 방법이다.
특히 최근에 미국 식품의약품청의 승인을 받은 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor) T세포 (이하 “세포”라 한다) 치료법은 환자로부터 얻은 T세포를 유전공학적인 방법을 통해 특정 암세포를 인식하여 제거할 수 있도록 만들어진 CAR-T세포를 이용한다.
CAR-T세포 치료제는 현재 혈액암에서 높은 반응율 및 완치율을 보이고 있다. 하지만 고형암에서는 치료 효능이 제한적이고, CAR-T세포 제작에 시간과 비용이 많이 든다는 점이 CAR-T 세포 치료제의 임상적용을 저해한다.
고형암에서의 제한적인 치료 효과는 고형암 내 종양미세환경으로 인해 CAR-T세포가 암 조직 내로 진입하기 어렵고, 억제된 면역반응이 CAR-T세포의 항암기능을 방해하기 때문이다.
또한 CAR-T 세포는 제작과정에서 바이러스성 유전자 전달체를 이용한다. 때문에 CAR-T 세포가 환자에 주입된 후 면역원성 발생 가능성, 전달한 유전자가 CAR-T 세포 내에서 암 관련 유전자를 추가적으로 활성화시킬 가능성 등과 같은 위험성이 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 비바이러스성 유전자 전달체와 CAR 유전자의 결합체를 제작하여 기존 치료제가 바이러스성 유전자 전달체를 이용하여 발생했던 위험을 줄이는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 체내에 직접 CAR 유전자를 전달하여 원 위치(in situ)에서 CAR-대식세포를 유도함으로써 체외에서 CAR 발현 대식세포를 제작하는데 필요한 비용과 시간을 절감하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 고형암에서 높은 항암 치료효과를 보이는 CAR 대식 세포 기반 치료제를 제공하는데 있다.
본 발명은 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 유전자가 포함된 플라스미드 DNA와 비바이러스성 전달체의 복합체, 또는 상기 복합체에 의해 형질 전환된 CAR 대식세포를 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
플라스미드 DNA는 키메릭 항원 수용체 (CAR) 유전자를 포함한다.
키메릭 항원 수용체 (CAR)는 질환 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 것일 수 있다.
질환 항원은 암세포에 과발현되는 항원일 수 있다. 이는 예를 들면 ALK(Anaplastic Lymphoma Kinase), CD19, HER2, CD22, CD30, CD73, CD123, FLT3, B-cell maturation antigen, PD-1 MUC16, MSLN, gp100, MART-1, Melna-A, MAGE-A3, MAGE-C2, Mammaglobin-A, proteinsase-3, mucin-1, HPV E6, LMP2, PSMA, GD2, hTERT, PAP, ERG, NA17, GM3, EPhA2, NA17-A, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, CEA, CA 125, AFP, Survivin, AH1, ras, G17DT, MUC1, E75, p53, PSA, HCG, PRAME, WT1, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, E7 등일 수 있다.
항원 결합 도메인은 상기 항원에 결합하는 항체의 scFv(single-chain variable fragment)로서, 이는 타겟인 질환 항원에 대한 항체의 scFv라면 제한 없이 사용될 수 있다.
키메릭 항원 수용체 (CAR)는 항원 결합 도메인 외에도 힌지 영역, 막관통 도메인, 보조자극 도메인 또는 신호전달 도메인을 더 포함할 수 있다.
CAR의 각 영역 및 도메인에는 공지된 구성이 제한없이 사용될 수 있다.
힌지 영역은 CD8, CD28 등으로부터 유래한 힌지가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
막관통 도메인은 CD28 유래 막관통 도메인이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보조자극 도메인은 CD28, CD27, CD134, CD137 등으로부터 유래한 보조자극 도메인이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이는 하나 또는 둘 이상 사용될 수 있다.
신호전달 도메인은 CD3-zeta 유래 신호전달 도메인이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
CAR는 도 11에 기재된 구성요소의 전부 또는 일부를 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
플라스미드 DNA는 M1 대식세포 표형형을 유도하기 위해서 인터페론-감마(IFN-γ)를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
인터페론 감마의 유래는 제한되지 않으며, 마우스, 인간 등에서 유래한 것을 사용할 수 있다.
복합체는 플라스미드 DNA와 비바이러스성 전달체의 결합으로 형성된 것일 수 있다. 그 결합에는 당 분야에 공지된 수단, 방법, 결합이 제한 없이 적용될 수 있다.
비바이러스성 전달체는 아데노바이러스 등의 바이러스성 전달체가 아닌, 비바이러스성 유전자 전달체를 의미하는 것으로서, 바이러스 유래가 아닌 모든 유전자 전달체가 제한 없이 사용될 수 있으며, 플라스미드 DNA와 정전기적 상호작용으로 복합체를 쉽게 형성한다는 측면에서 바람직하게는 양이온성 분자를 사용할 수 있다.
양이온성 분자는 중성의 pH에서 양전하를 띠는 분자를 의미하는 것으로, 질소 원자를 갖는 것일 수 있다.
양이온성 분자는 예를 들면 폴리에틸렌이민, 만노실화된 폴리에틸렌이민, 만노실화된 콜레스테롤-폴리에틸렌이민, PEG-폴리에틸렌이민-콜레스테롤, 양이온성 lipid, 폴리[(2-다이메틸아미노)에틸 메타크릴에이트를 포함하는 메타크릴레이트 기반 폴리머, 키토산 및 베타-사이클로덱스트린을 포함하는 폴리양이온, 폴리아미도아민, 덴드리머, 분해 가능한 폴리(β에스테르), 폴리(락틱-코-글리코리드산), 만노실화된 리포좀, PEG-콜레스테롤 함유 리포좀 및 양이온성 ionizable lipid와 PEG-콜레스테롤 함유 리포좀 등을 사용할 수 있다. 대식세포를 타겟팅화한다는 측면에서 바람직하게는 만노실화된 양이온성 분자를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 만노실화된 폴리에틸렌이민 또는 만노실화된 리포좀을 사용할 수 있다.
만노실화된(Mannosylated) 폴리에틸렌이민은 PEI의 아미노기에 만노스가 결합된 중합체이다. 예를 들면 α-d-Mannopyranosylphenyl isothiocyanate (MPITC)가 결합된 것일 수 있다. PEI는 분지화된 PEI(Branched PEI)일 수 있고, 그 분자량은 예를 들면 1000 내지 100000, 10000 내지 50000 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
플라스미드 DNA와 비바이러스성 전달체가 정전기적 인력으로 결합되어 복합체를 형성한 경우, 이들이 대식세포 내로 전달되고, 추후 전달체가 이탈될 수 있도록 적정 수준의 인력을 갖도록 조절될 수 있다. 이는 예를 들면 양이온성 분자의 질소(N)와 플라스미드 DNA의 인(P)의 비율을 조절함으로써 조절될 수 있다. 예를 들면 상기 복합체는 상기 비바이러스성 전달체 양이온성 분자의 질소(N)와 상기 플라스미드 DNA의 인(P)의 비율(N/P, 원소비)이 4 내지 30일 수 있다. 상기 범위 내에서 4 내지 30, 4 내지 25, 4 내지 20, 4 내지 15, 4 내지 10, 4 내지 8 등일 수 있다.
상기 복합체는 트랜스포제이즈 플라스미드(transposase plasmid)를 더 포함할 수 있다. 이는 예를 들면 piggybac　트랜스포제이즈 플라스미드일 수 있다.
트랜스포제이즈 플라스미드는 복합체 제조시에 플라스미드 플라스미드 DNA, 비바이러스성 전달체와 함께 혼합되어 포함될 수 있다.
CAR 대식세포는 상기 복합체로 형질전환되어 CAR를 발현하는 대식세포이다.
CAR 대식세포는 상기 CAR를 발현하는 것이고, 상기 CAR는 질환항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함할 수 있으므로, CAR 대식세포는 해당 질환에 대한 약효를 나타낼 수 있다.
대식세포는 예를 들면 BMDM(bone marrow drived macrophage) 혹은 대식세포 세포주 (J774A.1, RAW 264.7 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
대식세포에 상기 복합체를 처리하여, 대식세포를 형질전환시킴으로써 CAR 대식세포가 제조될 수 있다. 상기 형질전환은 체내 또는 체외에서 수행된 것일 수 있다.
CAR에 포함되는 항원 결합 도메인의 종류에 따라 본 발명의 약학 조성물의 예방 또는 치료 대상인 암은 결정될 수 있고, CAR에 도입될 수 있는 항원 결합 도메인의 종류는 제한되지 않으므로, 상기 암은 그 종류는 제한되지 않는다. 예를 들면, 뇌암, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 백혈병, 폐암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신장암, 위암, 고환암, 자궁암, 혈관 종양, 편평세포암종, 선암종, 소세포 암종, 흑색종, 신경교종, 신경아세포종, 육종, 후두암, 이하선암, 담도암, 갑상선암, 광선각화증, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 샘낭암종, 선종, 선 평편상피암종, 항문관암, 항문암, 항문직장암, 성상세포종, 큰질어귀샘암, 기저세포 암종, 담즙암, 골암, 골수암, 기관지암, 기관지샘 암종, 카시노이드, 담관암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 투명세포 암종, 결합조직암, 낭선종, 소화계통암, 십이지장암, 내분비계암, 내배엽동종양, 자궁내막증식증, 자궁내막모양 선암종, 내피세포암, 뇌실막세포, 상피세포암, 안와암, 국소결절성 과증식, 담낭암, 날문방암, 위 기저부 암, 가스트린종, 교모세포종, 신경모세포종, 글루카곤종, 심장암, 혈관아세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간샘종, 간 선종증, 간담도암, 간세포 암종, 호지킨병, 회장암, 인슐린종, 상피내 신생물, 상피내 편평세포 신생물, 간내 담도암, 침윤성 편평세포암종, 공장암, 관절암, 골반암, 거대 세포 암종, 대장암, 림프종, 악성 중피세포 종양, 수아세포종, 수질상피종, 뇌막암, 중피암, 전이성 암종, 구강암, 점막표피모양 암종, 다발성 골수종, 근육암, 비강관암, 신경계암, 비-상피 피부암, 비-호지킨 림프종, 연맥 세포 암종, 핍지교종암, 구강암, 골육종, 유두상 장액성 선암종, 음경암, 인두암, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가육종, 폐 아세포종, 직장암, 신세포 암종, 호흡계 암, 망막아세포종, 장액성 암종, 부비강암, 피부암, 소세포 암종, 소장암, 평활근육암, 연조직암, 소마토스타틴-분비 종양, 척추암, 편평세포암종, 선조 근육암, 중피세포하층암, T 세포 백혈병, 설암, 요관암, 요도암, 자궁경부암, 자궁몸통암, 질암, VIPoma, 외음부암, 고분화 암종 및 윌름 종양 등일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 즉 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및/또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제 또는 흡입제로 제제화하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
일일투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로서 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 일 양상에 따른 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 일 양상에 따른 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 예를 들어 약 1,000~10,000 세포/회,1,000~100,000세포/회, 1,000~1000,000 세포/회, 1,000~10,000,000, 1,000~100,000,000 세포/회,1,000~1,000,000,000 세포/회, 1,000~10,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 유전자가 포함된 플라스미드 DNA와 비바이러스성 전달체의 복합체로 대식세포를 형질 전환시키는 단계를 포함하는 CAR 대식세포의 제조 방법에 관한 것이다.
키메릭 항원 수용체를 코딩하는 유전자가 포함된 플라스미드 DNA, 비바이러스성 전달체, 이들의 복합체 및 대식세포는 전술한 예시의 범위 내의 것일 수 있다.
상기 형질 전환은 상기 복합체를 대식세포에 처리하여 수행될 수 있고, 형질전환 방법, 수단, 조건 등은 당 분야에 공지된 바에 의할 수 있다.
상기 형질전환은 체내에서 또는 체외에서 수행될 수 있다. 체내에서 수행되는 경우 상기 복합체를 개체에 투여하여, 체내에서 상기 복합체와 대식세포가 접촉하여 수행될 수 있다. 체외에서 수행되는 경우 대식세포에 상기 복합체를 처리하여 수행될 수 있다.
본 발명은 상기 플라스미드 DNA와 상기 비바이러스성 전달체를 다음의 비율로 혼합하여 상기 복합체를 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
[수학식 1]
4≤N/P≤30.
(N은 비바이러스성 전달체 양이온성 분자의 질소이고, P는 플라스미드 DNA의 인이며, 상기 비율은 원소 개수비임).
상기 수학식 1을 만족하는 경우, 플라스미드 DNA와 비바이러스성 전달체가 적정 인력으로 결합되어, 대식세포까지의 전달 및 이후 바이러스성 전달체의 탈락 등이 용이하다. 상기 범위 내에서 4 내지 30, 4 내지 25, 4 내지 20, 4 내지 15, 4 내지 10, 4 내지 8 등일 수 있다.
또한 본 발명은 CAR 대식세포를 개체로부터 분리된 표본과 접촉시키는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
CAR 대식세포는 전술한 복합체로 형질전환된 대식세포이다.
CAR 대식세포는 그 항원 결합 도메인에 결합하는 항원을 갖는 암세포에 결합하는 바, 그 결합에 의해 그 암세포의 존재 여부를 알 수 있고, 이에 의해 암에 걸렸는지에 대한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명은 비바이러스성 유전자 전달체를 이용해 CAR 유전자 결합체를 제작하고, 이를 생체 내 대식세포 특이적으로 전달하여 효과적인 면역암치료 수단을 제공한다.
본 발명은 또한 비바이러스성 유전자 전달체를 사용하여 면역반응으로부터의 안정성을 확보하는 기술이 될 것이다. 그리고 생체 내에 유전자를 직접 전달하여 복잡한 체외 치료제 제조 과정을 줄이면서 생산 원가를 절감하여 환자의 경제적 부담을 줄이고, 치료제 필요 시에 환자에게 바로 투여 가능하다는 점에서 상업화 측면에 장점이 있다.
본 발명은 또한 기존 항암치료제인 CAR-T세포가 종양미세환경의 암 친화적인 영향으로 고형암에서 치료효과가 적은 것과 달리 고형암에서 항암효과를 보이는 치료제로 CAR 기반 치료제의 항암효과를 적용할 수 있는 암 종류의 범위를 넓히는데 기여하는 효과가 있다.
도 1은 두 종류의 제한효소 처리를 통해 double digestion을 진행하여 비바이러스성 piggybac plasmid vector 및 바이러스성 pCDH plasmid vector 상의 pCAR-IFN-g 유전자의 삽입을 전기영동을 통해 확인하였으며, piggybac plasmid vector의 경우　M PEI와의 혼합을 통해 BMDM에 전달하고,　pCDH plasmid vector의 경우 렌티바이러스를 만들어 각각의 농도별로 BMDM에 처리한 뒤　형질도입을 72시간 뒤에 확인하였으며,
도 2는 ALK(AnapIastic Lymphoma Kinase) 유전자의 발현을 세포 내 mRNA를 이용한 역전사 중합효소 연쇄반응으로 확인하기 위해, ALK 유전자 cDNA 특이적인 primer 두 종을 유기합성을 통해 제작하였으며,
도 3는 기존 연구를 바탕으로 대부분의 신경모세포종(Neuroblastoma)에서 ALK의 과발현이 발생하는 것을 확인하였다. 따라서 신경모세포종에서의 ALK 과발현을 확인하기 위해 대상 암종 중 하나인 Neuro2A 상의 ALK 유전자 발현 정도를 정성 및 정량하기 위해 B16F10(ATCC), NIH/3T3(ATCC), Neuro2A(ATCC) 세포주에서 대상 항원 ALK 유전자의 발현을 역전사 중합효소 연쇄반응으로 신경모세포종 특이적인 ALK의 과발현을 Neuro2A 상에서 확인하였으며,
도 4은 ALK 유전자를 발현하지 않는 B16F10 세포주(ATCC), NIH/3T3 세포주(ATCC) 또는 ALK 유전자를 발현하는 Neuro2a 세포주(ATCC)와의 공배양을 통해 CAR 유전자를 발현하는 대식세포의 ALK 특이적인 세포 사멸 능력 확인 및 대식작용을 확인하기 위한 실험 순서이며,
도 5는 ALK 유전자를 발현하는 Neuro2a 세포주(ATCC)와의 공배양을 16시간 동안 진행한 후 시간에 따른 세포 사멸유도 반응을 10분 간격으로 PAULA(Leica microsystems)을 이용해 live cell imaging 확인하였으며,
도 6는 BMDM과 암세포의 비율을 달리하여 공배양을 24시간 동안 진행한 후 유속세포 분석을 통해 살아있는　암세포의 비율을 분석함. CAR 유전자가 발현되는 상황에서 살아있는 암세포의 수가 줄어드는 것을 확인하였으며,
도 7은 E:T ratio 1:3의 비율로 BMDM과 암세포와의 공배양을 24시간 동안 진행한 이후 유전자 전달에 의한 CAR와 GFP 동시발현 세포가 ALK를 발현하는　Neuro2a세포와의 공배양에서 대식 작용의 증가하는 것을　확인하였으며,
도 8은 RAW264.7 세포주와 암세포의 비율을 달리하여 공배양을 48시간 동안 진행한 후 CAR 유전자가 발현되는 상황에서 암세포의 수가 줄어드는 것을 확인한 그림으로,
CAR발현 세포가 ALK를 발현하는　살아 있는 Neuro2a세포의 비율이 줄어드는 것을　확인하였으며,
도 9은 RAW264.7 세포주와 암세포의 비율을 달리하여 공배양을 48시간 동안 진행한 후 CAR 유전자가 발현되는 상황에서 대식작용이 늘어나는 것을 확인한 그림으로,
CAR발현 세포가 ALK를 발현하는　Neuro2a 세포와의 공배양에서　대식 작용의 증가하는 것을　확인하였으며,
도 10는 E:T ratio 1:3의 비율로 RAW 264.7 세포주와 암세포와의 공배양을 24시간 동안 진행한 이후 유전자 전달에 의한 대식 작용의 변화를 확인하였으며,
도 11은 본 발명의 vector plasmid construct 모식도.
도 12는 나노입자가 담긴 용액만 주사한 그룹 (Vehicle)과 비교하였을 때, MPEI/pCAR-IFN-γ를 주사한 마우스에서 다른 장기들 대비 암 조직에서 CAR발현이 가장 높았고, 암 조직 내에서는 다른 면역 세포들 (수지상세포, B세포 및 T세포) 대비 대식세포에서 CAR이 가장 많이 발현됐음을 확인하였고,
도 13은 면역조직화학분석을 통해 암 조직 내 CAR을 발현한 대식세포[도 13에서 초록색]가 암세포[도 13에서 빨간색]와 형광이 겹치거나, 가까이 나타나는 것을 통해 CAR을 발현한 대식세포가 암세포를 포식하는 것을 관찰하였고,
도 14는 나노입자를 처리한 마우스에서 시간 대 별로 피를 추출하여 혈장 내 간과 신장관련 효소들 [aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT), creatinine 그리고 blood urea nitrogen (BUN)]의 변화를 확인해 vehicle를 주사한 마우스와 MPEI/pCAR-IFN-γ를 주사한 마우스의 각 혈장 내 해당 효소들의 차이는 통계적으로 유의하지 않은 것을 확인하였고,
도 15와 도 16은 대조군은 나노입자가 담긴 용액만 주사한 그룹 (Vehicle), CAR-M1유도인자가 아닌 유전자를 포함한 나노입자 그룹(MPEI/Mock), CAR 유전자만을 포함한 나노입자 그룹 (MPEI/pCAR), 그리고 M1유도 인자만을 포함한 나노입자 그룹(MPEI/pIFN-γ)과 비교했을 때, MPEI/pCAR-IFN-γ를 처리한 그룹에서 통계적으로 유의하게 가장 암 성장이 저해되었고, 마우스의 생존율도 증가했음을 관찰하였으며,
도 17와 도 18은 hematoxylin and eosin (H&E) 염색과 TUNEL assay를 통해 암세포의 성장이 가장 저해된 MPEI/pCAR-IFN-γ처리 그룹에서 세포질 대비 세포핵 비율이 감소되어 있고, 가장 많은 apoptotic cell이 관찰됨을 확인하였고,
도 19, 도 20 및 도 21은 qRT-PCR, 유세포분석 및 면역조직화학분석을 통해 MPEI/pCAR-IFN-γ처리 후 마우스내 항암기능과 관련된 면역세포의 수 혹은 기능이 유의하게 증가한 것을 확인하였고,
도 22은 유세포분석을 통해 MPEI/pCAR-IFN-γ 을 주사한 그룹에서 다른 그룹들에 비해 암을 공격하는 활성화된 세포독성T세포의 수 및 기능이 증가되어 있고, 항암면역을 방해하는 조절T세포(Treg)은 양이 가장 감소하였고, 면역활성화의 지표가 되는 CD8+T세포/ Treg의 비율 값이 가장 큰 것을 통해 항암 면역이 활성화되는 것을 확인하였으며,
도 23은 암 조직 내 암 성장을 돕는 Treg의 분화에 관여하는 TGF-β+면적이 pIFN-γ 을 포함한 그룹 (MPEI/pIFN-γ 와 MPEI/pCAR-IFN-γ)을 처리했을 때 감소한 것을 확인한 것이며,
도 24은 암 조직 내에 항암 기능에 관여하는 염증 인자 (TNF-α 와 IFN-γ)의 양은 증가하였고, 항암 기능을 저해하는데 관여하는 인자 (IL-4와 IL-10)의 양은 감소한 것도 확인한 것이며,
도 25는 MPEI/pCAR-IFN-γ이 복강 주사하였을 때도 상당 수의 나노입자가 암에 축적되고 암 조직 내 대식세포에서 CAR이 발현됨을 확인하였고,
도 26은 면역조직화학분석을 통해 암 조직 내 CAR을 발현한 대식세포 [도 26에서 초록색]가 암세포[도 26에서 빨간색]를 포식하는 것을 관찰한 것이며,
도 27은 MPEI/pCAR-IFN-γ이 복강 주사하였을 때도 암 직접 주사를 하였을 때와 유사하게 암 성장 억제 효과가 있음을 확인하였으며,
도 28은 MPEI/pCAR-IFN-γ 가 암을 걸리 마우스에 복강 주사 후에도 체내에서 대조군 대비 유의한 독성을 가지지 않는 것을 확인한 것이다.
도 29는 CAR/IFN-γ/GFP 플라스미드 DNA와 양이온성 리포좀의 복합체를 in vitro 대식세포 배양에 첨가하여 대식세포를 CAR 대식세포로 in vitro 형질전환시킨 (CAR 유전자 발현) 효율을 나타낸 것이다.
도 30은 CAR/IFN-γ/GFP 플라스미드 DNA와 양이온성 리포좀의 복합체를 마우스 복강에 주사하여 복강에 존재하는 대식세포를 CAR 대식세포로 in vivo 형질전환시킨 (CAR 유전자 발현) 효율을 나타낸 것이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1
유전자 유기합성법을 이용하여 anti-Anaplastic Lymphoma Kinase(ALK) chimeric antigen receptor(이하 CAR)유전자(서열번호 1의 CD8α SP, 서열번호 2의 ALK scFv, 서열번호 3의 CD8α hinge, 서열번호 4의 CD28 transmembrane domain, 서열번호 5의 CD28 cytoplasmic domain, 서열번호 6의 CD3z (CD247) cytoplasmic domain, 서열번호 7의 Linker, cleavage sequence 사용)를 합성하여 pUC-AMP vector에 삽입하여 증폭한 뒤, pUC-AMP vector내에 삽입되어있는 CAR 유전자를 PCR을 통해 증폭하여 분리한 후, in fusion방식을 통해 SBI(system biosciences)社에서 구매한 렌티바이러스성 pCDH-CMV-MCS-EF1α-copGFP Cloning and Expression Lentivector의 MCS 서열에 삽입 및 클로닝하여 pCDH_CAR plasmid를 완성하였다.
Sino biological 社에서 구입한 Interferon Gamma cDNA ORF Clone, Mouse, untagged plasmid 내에 존재하는 mouse IFNg 서열(서열번호 8)을 KpnI 과 XbaI 두가지 제한효소에 의한 double digetion으로 추출하고, pCDH_CAR plasmid 상에 PCR cloning을 통해 CAR 유전자의 3' 말단에 삽입 및 클로닝하여 pCDH_CAR_IFN-γ를 완성하였다.
pCDH_CAR plasmid(또는 pCDH_CAR_IFN-γ)를 내재한 렌티바이러스를 제작하기 위해 pCDH_CAR plasmid(또는 pCDH_CAR_IFN-γREV), lenti G/P, VSV-G를 PEI(25k linear, poly ethylene imine)와 혼합한 뒤, 상온에서 30분간 보관한 뒤 lenti-X 293T 세포주 (TaKaRa bio)에 8시간 동안 처리한다.
이후 72시간 뒤에 배양액을 0.45 um의 filter로 여과한 뒤, 2시간 동안 4℃에서 20000 RPM의 속도로 원심분리하여 생긴 렌티바이러스 pallet을 100분의 1의 부피로 농축 희석하여 준비하였다.
농축된 pCDH_CAR plasmid(또는 pCDH_CAR_IFN-γ)를 내재한 렌티바이러스를 3 MOI의 농도로 complete DMEM, high glucose(supplemented with 10% FBS, 1% pen-strep and 4 ug/ml polybrene)에 첨가한 뒤, 24시간 동안 RAW 264.7 세포주에 첨가한다.
렌티바이러스 처리 72시간 뒤 세포주 선별을 통해 pCDH_CAR plasmid(또는 pCDH_CAR_IFN-γ가 형질도입된 pCAR RAW 264.7 세포주(또는 pCAR_IFN-γ RAW 264.7 세포주)를 순수 분리하여 확인하였다.
실시예 2
유전자 유기합성법을 이용하여 anti-Anaplastic Lymphoma Kinase(ALK) chimeric antigen receptor(이하 CAR)유전자를 합성하여 pUC-AMP vector에 삽입하여 증폭한 뒤, pUC-AMP vector내에 삽입되어있는 CAR 유전자를 PCR을 통해 증폭하여 분리한 후, in fusion방식을 통해 SBI(system biosciences)社에서 구매한 비바이러스성 PB-CMV-MCS-EF1α-GreenPuro PiggyBac cDNA Cloning and Expression Vector의 MCS 서열에 삽입 및 클로닝하여 pB_CAR plasmid를 완성하였다.
Sino biological 社에서 구입한 Interferon Gamma cDNA ORF Clone, Mouse, untagged plasmid 내에 존재하는 mouse IFNg 서열을 KpnI 과 XbaI 두가지 제한효소에 의한 double digetion으로 추출하고, pB_CAR plasmid 상에 PCR cloning을 통해 CAR 유전자의 3' 말단에 삽입 및 클로닝하여 PB_CAR_IFN-γ이하 pCAR-IFN-γ를 완성하였다.
Mannosylated polyethyleneimine(PEI)(Jet PEI-Mac, polyplus-transfection, 이하 MPEI), pCAR(또는 pCAR-IFN-γ와 piggybac　transposase plasmid를 혼합한 뒤 20분간 상온에서 보관한 뒤 M2 BMDM(bone marrow drived macrophage)에 2시간 동안 처리한다.
이 후 72 시간 뒤에 pCAR(또는 pCAR-IFN-γ유전자의 발현을 확인하였다.
pCAR(또는 pCAR-IFN-γ) 유전자를 발현하는 BMDM 및 RAW 264.7 세포주의 항원 특이적 세포사멸 능력 및 대식 작용의 증가를 관찰하였다.
실시예 3
Trizol (Qiagen, Valencia, CA)을 이용해 B16F10(ATCC), NIH/3T3(ATCC), Neuro2A(ATCC)에서 mRNA를 순수 분리하였다.
B16F10(ATCC), NIH/3T3(ATCC), Neuro2A(ATCC)에서 분리된 mRNA를 NanoDrop spectrometer(ND-2000, NanoDrop Technologies)를 이용해 mRNA 양을 정량하고, 일정한 양의 mRNA를 AccuPower®Master Mix(Bioneer)와 1:1로 희석한 후 70℃에서 5분간 incubation한 후 얼음에 보관한 후 42°C에서 60분 동안 처리하여 cDNA로 합성하고, 94°C에서 5 분 동안 처리하여 RTase를 불활성화하였다.
B16F10(ATCC), NIH/3T3(ATCC), Neuro2A(ATCC)에서 유래된 cDNA를 SYBR green-based TOPrealTM qPCR 2X PreMIX(Enzynomics), 10 pmol/μl Forward primer, 10 pmol/μl Reverse primer와 혼합하여 95℃에서 15분동안 처리한 후 95℃에서 10초, 62℃에서 15초, 72℃에서 20초 동안의 세단계의 처리과정을 55번 반복하여 ALK의 발현을 실시간으로 확인하였다.
실시예 4
MPEI, pCAR-IFN-γ와 piggybac　transposase plasmid를 혼합한 뒤 20분간 상온에서 보관한 뒤 M2 BMDM(bone marrow drived macrophage)에 2시간 동안 처리하였다.
이 후 24시간 뒤에 StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent(thermo-fisher scientific)를 10 ~ 15분간 상온에서 처리하여 MPEI/pCAR-IFN-γ가 처리된 M2 BMDM을 부유시킨 뒤 1500 RPM, 5분동안 원심분리하여 세포 pellet을 RPMI 1640(gibco, supplemented 10% FBS, 1% pen-strep, 20 ng/ml M-CSF)로 재부유 시켜주었다.
이 후 CellTrace™Cell Proliferation Kit(thermofisher scientific)를 이용해 MPEI/pCAR-IFN-γ가 처리된 M2 BMDM을 염색하였다.
CellTrace™Cell Proliferation Kit(thermofisher scientific)로 염색된 BMDM과 ALK 유전자를 발현하는 Neuro2A(ATCC)를 1:3의 농도로 24 well plate(SPL)에 처리하여 공배양을 16시간동안 진행하였다.
이 떄 공배양되는 세포는 PAULA(leica microsystems)를 이용해 10분 간격으로 time-lapse를 진행하여 16시간까지 관찰하였다.
공배양 조건에서 관찰한 결과 710분 이후부터 MPEI/pCAR-IFN-γ가 처리된 BMDM(초록색)이 Neuro2A(ATCC, 흰색)를 바닥면에서 완전힌 떼어내었고, 960분에서는 바닥면에서 떼어내진 Neuro2A(ATCC) 세포가 축소되면서 사멸이 유도되는 것을 확인하였다.
실시예 5
MPEI, pCAR 와 piggybac　transposase plasmid를 혼합한 뒤 20분간 상온에서 보관한 뒤 M2 BMDM(bone marrow drived macrophage)에 2시간 동안 처리하였다.
이 후 24시간 뒤에 StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent(thermo-fisher scientific)를 10 ~ 15분간 상온에서 처리하여 MPEI/pCAR가 처리된 M2 BMDM을 부유시킨 뒤 1500 RPM, 5분동안 원심분리하여 세포 pellet을 RPMI 1640(gibco, supplemented 10% FBS, 1% pen-strep, 20 ng/ml M-CSF)로 재부유 시켜주었다.
이 후 CellTrace™Cell Proliferation Kit(thermofisher scientific)를 이용해 MPEI/pCAR가 처리된 M2 BMDM을 염색하였다.
CellTrace™Cell Proliferation Kit(thermofisher scientific)로 염색된 BMDM과 ALK 유전자를 발현하는 Neuro2A(ATCC)를 1:3의 농도로 24 well plate(SPL)에 처리하여 공배양을 24시간 동안 진행하였다.
분석을 진행한 결과 MPEI/pCAR가 처리된 M2 BMDM과 ALK를 발현하는 Neuro2a와의 공배양 조건에서 Neuro2A(ATCC)의 세포비율이 감소하는 것이 관찰되었고, Neuro2A(ATCC)와의 공배양조건에서 1:1의 E:T ratio의 조건에서 Neuro2A(ATCC)의 수가 가장 많이 감소하였지만, NIH/3T3(ATCC)와의 공배양 조건에서 MPEI/pCAR가 처리된 M2 BMDM에의한 NIH/3T3(ATCC)의 세포 비율의 감소 폭이 NIH/3T3(ATCC)와의 공배양 조건에서 MPEI/pGFP가 처리된 M2 BMDM에의한 NIH/3T3(ATCC)의 세포 비율과 비교하여 유효한 결과를 나타내었다.
MPEI/pCAR가 처리된 M2 BMDM과 ALK를 발현하는 Neuro2a와의 공배양 조건에서 Neuro2A(ATCC)의 세포비율이 감소하는 것이 관찰되었고, Neuro2A(ATCC)와의 공배양조건에서 1:3의 E:T ratio의 조건에서 Neuro2A(ATCC)의 수가 약 25% 감소하였고, NIH/3T3(ATCC)와의 공배양 조건에서 MPEI/pCAR가 처리된 M2 BMDM에 의한 NIH/3T3(ATCC)의 세포 비율의 감소 폭이 NIH/3T3(ATCC)와의 공배양 조건에서 MPEI/pGFP가 처리된 M2 BMDM에의한 NIH/3T3(ATCC)의 세포 비율과 비교하여 유효하지 않은 결과를 나타내었다.
따라서 E:T ratio에서 Effector cell 인 BMDM의 비율이 늘어날수록 Neuro2A(ATCC)세포의 비율이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 따라서 1:3의 E:T ratio에서 가장 Neuro2a(ATCC)세포 비율의 감소폭이 특이적으로 나타나는 것으로 확인되었다.
MPEI/pCAR가 처리된 M2 BMDM과 ALK를 발현하는 Neuro2a와의 공배양 조건에서 Neuro2A(ATCC)의 세포비율이 감소하는 것이 관찰되었고, Neuro2A(ATCC)와의 공배양조건에서 1:3의 E:T ratio의 조건에서 대식 작용을 한 세포의 수가 약 6% 비율로 확인 되었다.
이는 NIH/3T3(ATCC)와의 공배양 조건에서 MPEI/pCAR가 처리된 M2 BMDM에 의한 NIH/3T3(ATCC)와의 1:3 E:T ratio로 공배양한 조건에서 MPEI/pGFP가 처리된 M2 BMDM에의한 NIH/3T3(ATCC)의 세포 비율과 비교하여 유효한 결과를 나타내었다.
실시예 6
RAW 264.7(ATCC) 세포주를 5 x 105 cells/well의 농도로 6 well plate(SPL)에 seeding 한 뒤 16시간 이후 pCDH_CAR plasmid를 내재하고 있는 렌티바이러스를 24시간 동안 처리한 후 FACS AriaII(BD Biosciences)를 통해 CAR를 발현하는 RAW 264.7 세포만을 분리하였다.
이 후 분리된 CAR를 발현하는 RAW 264.7 cell line을 CellTrace™Cell Proliferation Kit(thermofisher scientific)으로 염색하였다.
Effector cell인 분리된 RAW 264.7 세포와 target cell인 CellTrace™Red Cell Proliferation Kit(thermo-fisher scientific)으로 염색된 ALK를 발현하는 Neuro2A를 Effector cells : Target cells ratio(이하 E:T ratio) 각각 1:1, 1:3, 1:5의 비율로 공배양을 진행한 뒤 48시간 이후FACS calibur(BD Biosciences)를 이용한 유속세포분석을 통해 분석하였다.
Effector cell인 분리된 RAW 264.7 세포와 target cell인 CellTrace™Red Cell Proliferation Kit(thermo-fisher scientific)으로 염색된 ALK를 발현하지 않는 NIH/3T3를 E:T ratio 각각 1:1, 1:3, 1:5의 비율로 공배양을 진행한 뒤 48시간 이후 FACS calibur(BD Biosciences)를 이용한 유속 세포 분석을 통해 분석하였다.
CAR가 발현되는 RAW264.7 cell line 과 ALK를 발현하는 Neuro2a와의 공배양 조건에서 Neuro2A(ATCC)의 세포비율이 감소하는 것이 관찰되었고, Neuro2A(ATCC)와의 공배양조건에서 1:3의 E:T ratio의 조건에서 Neuro2A(ATCC)의 수가 약 81% 감소하였고, NIH/3T3(ATCC)와의 공배양 조건에서 CAR가 발현되는 RAW264.7 cell line에의한 NIH/3T3(ATCC)의 세포 비율의 감소 폭이 NIH/3T3(ATCC)와의 공배양 조건에서 CAR가 발현되지않는 RAW264.7 cell line에의한 NIH/3T3(ATCC)의 세포 비율과 비교하여 유효한 결과를 나타내었다.
CAR가 발현되는 RAW264.7 cell line 과 ALK를 발현하는 Neuro2a와의 공배양 조건에서 Neuro2A(ATCC)의 세포비율이 감소하는 것이 관찰되었고, Neuro2A(ATCC)와의 공배양조건에서 1:3의 E:T ratio의 조건에서 Neuro2A(ATCC)의 수가 약 57% 감소하였고, NIH/3T3(ATCC)와의 공배양 조건에서 CAR가 발현되는 RAW264.7 cell line에 의한 NIH/3T3(ATCC)의 세포 비율의 감소 폭이 NIH/3T3(ATCC)와의 공배양 조건에서 CAR가 발현되지않는 RAW264.7 cell line에 의한 NIH/3T3(ATCC)의 세포 비율과 비교하여 유효하지 않은 결과를 나타내었다.
따라서, E:T ratio에서 Effector cell인 BMDM의 비율이 늘어날수록 Neuro2A(ATCC)세포의 비율이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 따라서 1:3의 E:T ratio에서 가장 Neuro2a(ATCC)세포 비율의 감소폭이 특이적으로 나타나는 것으로 확인되었다.
CAR가 발현되는 RAW264.7 cell line 과 ALK를 발현하는 Neuro2a와의 공배양 조건에서 Neuro2A(ATCC)의 세포비율이 감소하는 것이 관찰되었고, Neuro2A(ATCC)와의 공배양조건에서 1:3의 E:T ratio의 조건에서 대식 작용을 한 세포의 수가 약 8% 비율로 확인 되었다.
이는 NIH/3T3(ATCC)와의 공배양 조건에서 CAR가 발현되는 RAW264.7 cell line에 의한 NIH/3T3(ATCC)와의 1:3 E:T ratio로 공배양한 조건에서 CAR가 발현되지않는 RAW264.7 cell line에 의한 NIH/3T3(ATCC)의 세포 비율과 비교하여 유효한 결과를 나타내었다.
실시예 7
만들어진 나노입자가 체내에서 어느 세포 내로 가장 많이 유입되는지 확인하기 위해 만노스기가 붙은 양이온 중합체인 플리에틸렌이민(MPEI)과 CAR과 M1유도인자 유전자를 150 mM NaCl 에 희석하고, PEI에 존재하는 질소 (nitrogen)와 유전자에 존재하는 인(phosphate)의 배합비율 즉 Nitrogen/phosphate (N/P) 을 6 으로 하여 혼합하고 실온에서 30 분 동안 반응시켜 나노입자를 완성한다. 이때 유전자에 GFP 형광 유전자가 포함되게 하였다.
6주령된 암컷 A/J 마우스를 중앙실험동물(한국)에서 구입하여 일주일의 순화기간을 두고 사육장에서 사육하였다. 순화기간이 끝난 마우스는 아이프란액으로 마취한 후, RFP 를 발현하는 1 × 106개의 암세포를 피하에 주사하여 암모델링을 하고, 암의 크기가 약 80mm3에 도달했을 때 MPEI/pCAR-IFN-γ나노입자를 암 조직에 직접 주사하였다.
주사 후 24시간 뒤 주요 장기들과 암을 분리하여 형광이미징을 시행하고, 암 조직을 단일세포로 만든 후 여러가지 면역 세포의 특이적 마커 (수지상세포: CD11c, B세포: CD19, 대식세포: CD11b, CD4 T세포: CD4, CD8 T세포: CD8)들로 면역염색을 진행해 조직 및 세포 내 CAR발현이 어떠한지 FACS CantoII(BD Biosciences)를 사용해 확인하였다.
나노입자가 담긴 용액만 주사한 그룹 (Vehicle)과 비교하였을 때, 다른 장기들 대비 암 조직에서 CAR발현이 가장 높았고, 암 조직 내에서는 다른 면역 세포들 (수지상세포, B세포 및 T세포) 대비 대식세포에서 CAR이 가장 많이 발현됐음을 확인하였다.
면역조직화학분석을 하기 위해 암 조직을 대조군과 MPEI/pCAR-IFN-γ를 주사한 후 24시간이 지난 뒤 적출하여 4% 파라포름알데히드 용액에 고정하였다. 그리고 동결조직 포매제(OCT compound)로 조직을 동결시키고, 동결조직절편기로 암조직을 10 μm로 절편하여 조직슬라이드를 제작하였다.
CAR을 발현한 대식세포를 확인하기 위해 GFP와 결합하는 형광 항체를 사용하여 면역조직염색을 하였고, 형광현미경을 통해 RFP를 발현하는 암세포와 GFP를 발현하는 대식세포를 확인하였다. 암 조직 내 CAR을 발현한 대식세포가 암세포와 형광이 겹치거나, 가까이 나타나는 것을 통해 CAR을 발현한 대식세포가 암세포를 포식하는 것을 관찰할 수 있었다.
실시예 8
나노입자의 체내 독성을 확인하기 위해 6주령 된 암컷 A/J 마우스를 중앙실험동물(한국)에서 구입하여 일주일의 순화기간을 두고 사육장에서 사육하였다. 순화기간이 끝난 마우스는 아이프란액으로 마취한 후, 1 × 106개의 암세포를 피하에 주사하여 암모델링을 하고, 암의 크기가 약 80mm3에 도달했을 때 대조군인 나노입자가 담긴 용액만 주사한 그룹 (Vehicle) 과 MPEI/pCAR-IFN-γ나노입자를 암 조직에 직접 주사하였다.
여러 시간(암모델링 하루 전, 1일 후, 11일 후, 18일 후) 대 별로 마우스의 혈액을 추출하여 혈장 내 간과 신장관련 효소들 [aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT), creatinine 그리고 blood urea nitrogen (BUN)]의 변화를 DRI-CHEM 3500S chemistry analyzer (Fujifilm, Japan)를 사용해 확인하였다.
Vehicle를 주사한 마우스와 MPEI/pCAR-IFN-γ를 주사한 마우스의 각 혈장 내 해당 효소들의 차이는 통계적으로 유의하지 않은 것을 확인할 수 있었고, 이를 통해 MPEI/pCAR-IFN-γ는 체내에서 유의한 독성을 가지지 않는다는 결론을 얻었다.
실시예 9
주사한 MPEI/pCAR-IFN-γ의 암치료 효과를 확인하기 위해 실시예 8와 마찬가지로 암모델링된 마우스를 준비한 후, 나노입자들을 암에 직접 주사하여 암 크기 변화를 측정하였다. 대조군으로는 나노입자가 담긴 용액만 주사한 그룹 (Vehicle), CAR-M1유도인자가 아닌 유전자를 포함한 나노입자 그룹(MPEI/Mock), CAR유전자만을 포함한 나노입자 그룹(MPEI/pCAR), 그리고 M1유도 인자만을 포함한 나노입자 그룹(MPEI/pIFN-γ)을 설정하였다.
다른 대조군 그룹과 비교했을 때, MPEI/pCAR-IFN-γ를 처리한 그룹에서 통계적으로 유의하게 가장 암 성장이 저해되었고, 마우스의 생존율도 증가했음을 관찰하였다.
위와 동일한 방법으로 나노입자들을 처리한 암모델 마우스에서 암모델링 후 16일째에 암 조직을 분리하여 4% 파라포름알데히드 용액에 고정하였다. 그리고 동결조직 포매제(OCT compound)로 조직을 동결시키고, 동결조직절편기로 암조직을 10 μm로 절편하여 조직슬라이드를 제작하였다. 그 후, 암조직 슬라이드를 헤마톡실린 용액으로 세포의 핵막을, 에오신 용액으로 세포의 세포질을 염색하여 광학현미경으로 분석하였다. 암세포는 세포질 대비 세포핵 비율이 높게 관찰된다. MPEI/pCAR-IFN-γ처리 그룹에서 세포질 대비 세포핵 비율이 감소된 것을 관찰하였다.
PROMEGA사의 DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System 프로토콜을 통해 암조직에서 사멸한 세포(apoptotic cell)을 초록색으로 표지하여 형광현미경을 통해 관찰한 결과, MPEI/pCAR-IFN-γ처리 그룹에서 가장 많은 apoptotic cell이 관찰되었다.
실시예 10
실시예 9와 마찬가지로 실험을 진행한 후, 암 조직에서 여러 형태의 샘플을 얻어 MPEI/pCAR-IFN-γ처리 전후의 면역세포의 수적, 기능적 변화를 확인하였다. Quiazol 용액을 이용해 암조직 내 세포에서 RNA를 추출하고 역전사효소(reverse transcriptase)로 complementary DNA(cDNA)를 만들고, 이 cDNA를 이용해 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 진행한 결과, MPEI/pCAR-IFN-γ처리 그룹에서 세포독성T세포의 활성과 관련된 마커 (Granzyme b)와 M1 마커 (Cd80) 의 발현량이 다른 그룹들에 비해 유의하게 높고, M2 마커 (Vegf) 의 발현량은 유의하게 감소함을 확인하였다.
암조직을 단일세포로 분리하여 형광달린 항체를 이용해 면역세포의 특정 마커를 표지하여 유세포분석기를 통해 MPEI/pCAR-IFN-γ처리 전후의 면역세포의 수적, 기능적 변화를 확인하였다. 확인한 결과, MPEI/pCAR-IFN-γ처리 그룹에서 M1 마커 (CD86) 의 발현량이 다른 그룹들에 비해 유의하게 높고, M2 마커 (CD163) 의 발현량은 유의하게 감소하였다.
암조직을 분리하여 4% 파라포름알데히드 용액에 고정한 후 동결조직 포매제(OCT compound)로 조직을 동결시키고, 동결조직절편기로 암조직을 10 μm로 절편하여 조직슬라이드를 제작하였다. 제작된 암조직슬라이드에 형광달린 항체를 이용해 면역세포의 특정 마커를 표지하여 형광현미경을 통해 분석을 진행한 결과, MPEI/pCAR를 처리한 그룹에서 M1 마커 (iNOS) 의 발현량이 다른 그룹들에 비해 유의하게 높고, M2 마커 (Arginase-1) 의 발현량은 유의하게 감소한 것을 확인하였다.
실시예 11
실시예 9와 마찬가지로 실험을 진행한 후, 암 조직을 얻어 단일세포로 분리하여 형광달린 항체를 이용해 면역세포의 특정 마커를 표지하여 유세포분석기를 통해 MPEI/pCAR-IFN-γ처리 전후의 세포독성T세포 조절T세포의 수적, 기능적 변화를 확인하였다. 세포독성T세포의 기능적 변화를 확인하기 위해서 우선 세포막에 발현된 CD3, CD8 마커를 염색한 후 Granzyme B마커는 세포내염색으로 진행하였다. 그리고 유세포분석기를 통해 그룹간 CD3, CD8 및 Granzyme B를 모두 발현하는 세포의 양 차이가 어떠한지 분석한 결과, MPEI/pCAR-IFN-γ 을 암에 직접 주사한 그룹에서 다른 그룹들에 비해 암을 공격하는 활성화된 세포독성T세포의 수가 증가되어 있음을 확인하였다. 특히, pCAR을 포함한 그룹 (MPEI/pCAR와 MPEI/pCAR-IFN-γ) 에서 세포독성T세포의 활성화된 기능과 관련된 물질 (Granzyme b)이 증가한 것을 통해CAR 발현에 따른 대식세포의 포식 및 암항원 제시가 세포독성T세포의 활성화에 영향을 준 것을 알 수 있었다.
조절T세포의 양적 변화를 확인하기 위해서 우선 세포막에 발현된 CD3, CD4, CD25 마커를 염색한 후 Foxp3마커는 세포내염색으로 진행하였다. 그리고 유세포분석기를 통해 그룹간 CD3, CD4, CD25 및 Foxp3를 모두 발현하는 세포의 양 차이가 어떠한지 분석한 결과, MPEI/pCAR-IFN-γ 을 처리한 그룹에서 항암면역을 방해하는 Treg의 양이 가장 감소함을 확인하였다.
면역활성화의 지표가 되는 CD8+T세포/ Treg의 비율 값이 가장 큰 것을 통해 pCAR와 pIFN-γ을 함께 전달했을 경우 가장 통계적으로 유의하게 항암 면역이 활성화되는 것을 확인할 수 있었다.
암조직을 분리하여 4% 파라포름알데히드 용액에 고정한 후 동결조직 포매제(OCT compound)로 조직을 동결시키고, 동결조직절편기로 암조직을 10 μm로 절편하여 조직슬라이드를 제작하였다. 제작된 암조직슬라이드에 형광달린 항체를 이용해 TGF-β를 표지하여 형광현미경을 통해 분석을 진행한 결과, TGF-β+면적이 pIFN-γ 을 포함한 그룹 (MPEI/pIFN-γ 와 MPEI/pCAR-IFN-γ)을 처리했을 때 감소하였는데, 이는 TGF-β 를 분비하는 M2 대식세포의 수가 pIFN-γ 전달로 인해 감소하였기 때문이라고 생각할 수 있다. Treg의 분화에 TGF-β 가 관여하기에 TGF-β 의 감소로 인해 Treg양이 감소되었을 수 있음을 알 수 있었다.
암조직을 분리하여 단백질만을 추출하여 효소결합 면역분석법(ELISA)으로 염증관련 인자의 변화를 확인한 결과, 암 조직 내에 항암 기능에 관여하는 염증 인자 (TNF-α 와 IFN-γ)의 양은 증가하였고, 항암 기능을 저해하는데 관여하는 인자 (IL-4와 IL-10)의 양은 감소한 것을 확인하였다. 위의 결과들을 통해 본 발명에서 제작된 나노입자가 암 조직 내 면역 환경을 암에 비친화적으로 바꾸고, 암 성장을 억제하는데 효과가 있다고 결론 지을 수 있다.
실시예 12
만들어진 나노입자가 암 직접 주사가 아닌 복강주사를 주사하였을 경우에 체내에서 어느 세포 내로 가장 많이 유입되는지 확인하기 위해 앞서 실시예 7에서와 마찬가지로 나노입자를 준비하고, 마우스에 암모델링을 진행한 후 4일 째에 MPEI/pCAR-IFN-γ나노입자를 복강에 주사하였다.
주사 후 24시간 뒤 주요 장기들과 암을 분리하여 형광이미징을 시행하고, 암 조직을 단일세포로 만든 후 여러가지 면역 세포의 특이적 마커 (수지상세포: CD11c, B세포: CD19, 대식세포: CD11b, CD4 T세포: CD4, CD8 T세포: CD8)들로 면역염색을 진행해 조직 및 세포 내 CAR발현이 어떠한지 FACS CantoII(BD Biosciences)를 사용해 확인하였다.
나노입자가 담긴 용액만 주사한 그룹 (Vehicle)과 비교하였을 때, 다른 장기들 대비 암 조직에서 CAR발현이 가장 높았고, 암 조직 내에서는 다른 면역 세포들 (수지상세포, B세포 및 T세포) 대비 대식세포에서 CAR이 가장 많이 발현 됐음을 확인하였다.
면역조직화학분석을 하기 위해 암 조직을 대조군과 MPEI/pCAR-IFN-γ를 주사한 후 24시간이 지난 뒤 적출하여 4% 파라포름알데히드 용액에 고정하였다. 그리고 동결조직 포매제(OCT compound)로 조직을 동결시키고, 동결조직절편기로 암조직을 10 μm로 절편하여 조직슬라이드를 제작하였다.
CAR을 발현한 대식세포를 확인하기 위해 GFP와 결합하는 형광 항체를 사용하여 면역조직염색을 하였고, 형광현미경을 통해 RFP를 발현하는 암세포와 GFP를 발현하는 대식세포를 확인하였다. 암 조직 내 CAR을 발현한 대식세포가 암세포와 형광이 겹치거나, 가까이 나타나는 것을 통해 CAR을 발현한 대식세포가 암세포를 포식하는 것을 관찰할 수 있었다.
실시예 13
나노입자의 체내 독성을 확인하기 위해 6주령 된 암컷 A/J 마우스를 중앙실험동물(한국)에서 구입하여 일주일의 순화기간을 두고 사육장에서 사육하였다. 순화기간이 끝난 마우스는 아이프란액으로 마취한 후, 1 × 106개의 암세포를 피하에 주사하여 암모델링을 하고, 암의 크기가 약 80mm3에 도달했을 때 대조군인 나노입자가 담긴 용액만 주사한 그룹 (Vehicle) 과 MPEI/pCAR-IFN-γ나노입자를 복강에 주사하였다.
여러 시간(암모델링 하루 전, 1일 후, 11일 후, 18일 후) 대 별로 마우스의 혈액을 추출하여 혈장 내 간과 신장관련 효소들 [aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT), creatinine 그리고 blood urea nitrogen (BUN)]의 변화를 DRI-CHEM 3500S chemistry analyzer (Fujifilm, Japan)를 사용해 확인하였다.
Vehicle를 주사한 마우스와 MPEI/pCAR-IFN-γ를 주사한 마우스의 각 혈장 내 해당 효소들의 차이는 통계적으로 유의하지 않은 것을 확인할 수 있었고, 이를 통해 MPEI/pCAR-IFN-γ는 체내에서 유의한 독성을 가지지 않는다는 결론을 얻었다.
실시예 14
DOPE (diphosphatidylethanolamine), DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane), cholesterol, PE-PEG (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol) (4가지 성분의 몰비 1 : 1 : 0.1 : 0.1) 혼합물을 Thin film hydration 뒤 1000 nm, 200 nm 구멍 크기를 가진 막을 통과시켜 (extrusion) liposome을 제조하였다.
N/P ratio = Cationic lipid/pDNA = 3의 비율로 liposome과 CAR-IFN-γ-GFP pDNA를 혼합하여 lipoplex를 형성하였다. 이때 CAR-IFN-γ-GFP pDNA와 PiggyBac transposase pDNA를 1:0.4 비율로 혼합 후 사용하였다.
In vitro에서 대식세포에 CAR-IFN-γ-GFP pDNA를 전달하는 효율을 조사하기 위해서, 대식세포 세포주인 RAW 264.7 세포를 10% fetal bovine serum-DMEM high medium으로 6-well plate에서 30~40% confluency로 키운다. 이후 serum free medium으로 교체한 뒤 CAR-IFN-γ-GFP pDNA를 함유하는 lipoplex를 5 ug DNA/ml 농도로 넣어주어 배양한다. 2일 후 FACS로 GFP 발현 세포를 조사하였다(도 29).
In vivo에서 대식세포에 CAR-IFN-γ-GFP pDNA를 전달하는 효율을 조사하기 위해서, C57BL/6 마우스의 복강에 100 ug CAR-IFN-γ-GFP pDNA을 함유한 lipoplex를 주사하였다. 6시간 후 복강에 있는 세포를 추출한 후, APC(CD45, lymphocyte marker)+, PE/Cy7(CD11b, macrophage marker)+ Double positive 세포들 중에서 GFP(FITC)를 발현하는 세포를 FACS로 분석하였다(도 30).

Claims (20)

  1. 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 유전자가 포함된 플라스미드 DNA와 비바이러스성 전달체의 복합체, 또는 상기 복합체에 의해 형질 전환된 CAR 대식세포를 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 ALK(Anaplastic Lymphoma Kinase), CD19, HER2, CD22, CD30, CD73, CD123, FLT3, B-cell maturation antigen, PD-1 MUC16, MSLN, gp100, MART-1, Melna-A, MAGE-A3, MAGE-C2, Mammaglobin-A, proteinsase-3, mucin-1, HPV E6, LMP2, PSMA, GD2, hTERT, PAP, ERG, NA17, GM3, EPhA2, NA17-A, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, CEA, CA 125, AFP, Survivin, AH1, ras, G17DT, MUC1, E75, p53, PSA, HCG, PRAME, WT1, URLC10, VEGFR1, VEGFR2 및 E7으로 이루어진 군에서 선택되는 항원에 특이적으로 결합하는 것인, 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 IFN-γ를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것인, 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 비바이러스성 전달체는 양이온성 분자인, 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 복합체는 상기 비바이러스성 전달체 양이온성 분자의 질소(N)와 상기 플라스미드 DNA의 인(P)의 비율(N/P)이 4 ~ 30인, 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 복합체는 트랜스포제이즈 플라스미드를 더 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 복합체는 상기 플라스미드 DNA, 상기 비바이러스성 전달체 및 트랜스포제이즈 플라스미드를 혼합하여 제조한 것인, 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 양이온성 분자는 폴리에틸렌이민, 만노실화된 폴리에틸렌이민, 만노실화된 콜레스테롤-폴리에틸렌이민, PEG-폴리에틸렌이민-콜레스테롤, 양이온성 lipid, 폴리[(2-다이메틸아미노)에틸 메타크릴에이트를 포함하는 메타크릴레이트 기반 폴리머, 키토산 및 베타-사이클로덱스트린을 포함하는 폴리양이온, 폴리아미도아민, 덴드리머, 분해 가능한 폴리(β에스테르), 폴리(락틱-코-글리코리드산), 만노실화된 리포좀, PEG-콜레스테롤 함유 리포좀 및 양이온성 ionizable lipid와 PEG-콜레스테롤 함유 리포좀으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 CD8 힌지 영역, CD28 막관통 도메인, CD28 보조자극 도메인 또는 CD3 zeta 신호전달 도메인을 더 포함하는 것인, 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 암세포 표면 항원에 결합하는 scFv, 힌지 영역, 막관통 도메인, 세포내 도메인. 보조자극 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 뇌암, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 백혈병, 폐암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신장암, 위암, 고환암, 자궁암, 혈관 종양, 편평세포암종, 선암종, 소세포 암종, 흑색종, 신경교종, 신경아세포종, 육종, 후두암, 이하선암, 담도암, 갑상선암, 광선각화증, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 샘낭암종, 선종, 선 평편상피암종, 항문관암, 항문암, 항문직장암, 성상세포종, 큰질어귀샘암, 기저세포 암종, 담즙암, 골암, 골수암, 기관지암, 기관지샘 암종, 카시노이드, 담관암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 투명세포 암종, 결합조직암, 낭선종, 소화계통암, 십이지장암, 내분비계암, 내배엽동종양, 자궁내막증식증, 자궁내막모양 선암종, 내피세포암, 뇌실막세포, 상피세포암, 안와암, 국소결절성 과증식, 담낭암, 날문방암, 위 기저부 암, 가스트린종, 교모세포종, 신경모세포종, 글루카곤종, 심장암, 혈관아세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간샘종, 간 선종증, 간담도암, 간세포 암종, 호지킨병, 회장암, 인슐린종, 상피내 신생물, 상피내 편평세포 신생물, 간내 담도암, 침윤성 편평세포암종, 공장암, 관절암, 골반암, 거대 세포 암종, 대장암, 림프종, 악성 중피세포 종양, 수아세포종, 수질상피종, 뇌막암, 중피암, 전이성 암종, 구강암, 점막표피모양 암종, 다발성 골수종, 근육암, 비강관암, 신경계암, 비-상피 피부암, 비-호지킨 림프종, 연맥 세포 암종, 핍지교종암, 구강암, 골육종, 유두상 장액성 선암종, 음경암, 인두암, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가육종, 폐 아세포종, 직장암, 신세포 암종, 호흡계 암, 망막아세포종, 장액성 암종, 부비강암, 피부암, 소세포 암종, 소장암, 평활근육암, 연조직암, 소마토스타틴-분비 종양, 척추암, 편평세포암종, 선조 근육암, 중피세포하층암, T 세포 백혈병, 설암, 요관암, 요도암, 자궁경부암, 자궁몸통암, 질암, VIPoma, 외음부암, 고분화 암종 및 윌름 종양으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  12. 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 유전자가 포함된 플라스미드 DNA와 비바이러스성 전달체의 복합체로 대식세포를 형질 전환시키는 단계를 포함하는 CAR 대식세포의 제조 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 플라스미드 DNA와 상기 비바이러스성 전달체를 다음의 비율로 혼합하여 상기 복합체를 제조하는 단계를 더 포함하는, CAR 대식세포의 제조 방법:
    [수학식 1]
    4≤N/P≤30
    (N은 비바이러스성 전달체 양이온성 분자의 질소이고, P는 플라스미드 DNA의 인이며, 상기 비율은 원소 개수비임).
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 대식세포는 체내 또는 체외에서 형질 전환되는, CAR 대식세포의 제조 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 ALK(Anaplastic Lymphoma Kinase), CD19, HER2, CD22, CD30, CD73, CD123, FLT3, B-cell maturation antigen, PD-1 MUC16, MSLN, gp100, MART-1, Melna-A, MAGE-A3, MAGE-C2, Mammaglobin-A, proteinsase-3, mucin-1, HPV E6, LMP2, PSMA, GD2, hTERT, PAP, ERG, NA17, GM3, EPhA2, NA17-A, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, CEA, CA 125, AFP, Survivin, AH1, ras, G17DT, MUC1, E75, p53, PSA, HCG, PRAME, WT1, URLC10, VEGFR1, VEGFR2 및 E7으로 이루어진 군에서 선택되는 항원에 특이적으로 결합하는 것인, CAR 대식세포의 제조 방법.
  16. 청구항 12에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 IFN-γ를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것인, CAR 대식세포의 제조 방법.
  17. 청구항 12에 있어서, 상기 비바이러스성 전달체는 양이온성 분자인, CAR 대식세포의 제조 방법.
  18. 청구항 12에 있어서, 상기 복합체는 트랜스포제이즈 플라스미드를 더 포함하는, CAR 대식세포의 제조 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 양이온성 분자는 폴리에틸렌이민, 만노실화된 폴리에틸렌이민, 만노실화된 콜레스테롤-폴리에틸렌이민, PEG-폴리에틸렌이민-콜레스테롤, 양이온성 lipid, 폴리[(2-다이메틸아미노)에틸 메타크릴에이트를 포함하는 메타크릴레이트 기반 폴리머, 키토산 및 베타-사이클로덱스트린을 포함하는 폴리양이온, 폴리아미도아민, 덴드리머, 분해 가능한 폴리(β에스테르), 폴리(락틱-코-글리코리드산), 만노실화된 리포좀, PEG-콜레스테롤 함유 리포좀 및 양이온성 ionizable lipid와 PEG-콜레스테롤 함유 리포좀으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, CAR 대식세포의 제조 방법.
  20. 청구항 12에 있어서, 상기 플라스미드 DNA는 CD8 힌지 영역, CD28 막관통 도메인, CD28 보조자극 도메인 또는 CD3 zeta 신호전달 도메인을 더 포함하는 것인, CAR 대식세포의 제조 방법.
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