CN115747168A - 表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途 - Google Patents

表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115747168A
CN115747168A CN202211374453.1A CN202211374453A CN115747168A CN 115747168 A CN115747168 A CN 115747168A CN 202211374453 A CN202211374453 A CN 202211374453A CN 115747168 A CN115747168 A CN 115747168A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
car
cell
macrophages
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211374453.1A
Other languages
English (en)
Inventor
S·吉尔
M·克利切斯基
C·H·祝恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Pennsylvania Penn
Original Assignee
University of Pennsylvania Penn
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Pennsylvania Penn filed Critical University of Pennsylvania Penn
Publication of CN115747168A publication Critical patent/CN115747168A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/001112—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001166—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/001168—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/464468—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/892—Reproductive system [uterus, ovaries, cervix, testes]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

本发明名称为“表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途”。本发明包括用于治疗癌症——无论实体肿瘤还是血液恶性病——的方法和组合物。通过在单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞中表达嵌合抗原受体，修饰的细胞被募集到肿瘤微环境，在此其通过浸润肿瘤和杀死靶细胞而充当有效的免疫效应物。一个方面包括修饰的细胞和包含该修饰的细胞的药物组合物，用于过继性细胞疗法和治疗与免疫抑制相关的疾病或状况。

Description

表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途
本申请是分案申请，原申请的申请日为2016年7月28日、申请号为201680054514.2、发明名称为“表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途”。
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)有权要求2015年7月28日提交的美国临时专利申请No.62/197,675的优先权，其整体通过引用被并入在此。
发明背景
癌症免疫治疗已经在多种实体肿瘤和血液恶性病(hematologic malignancies)的设定中被证实具有令人激动的临床结果。内源性免疫系统一般对恶性细胞不具有反应性，或者关于身体对于恶性细胞存在的反应可以具有积极免疫抑制性。增强肿瘤治疗的一种方式是通过白细胞基因改造来迫使免疫系统进行肿瘤识别。可以将T细胞改造以表达包含细胞外目标抗体和细胞内信号传导结构域的合成免疫受体，其被称为嵌合抗原受体(CAR)。已经显示表达针对CD19的CAR的T细胞具有显著的抗白血病效力，其中已经在90％的被治疗急性淋巴母细胞白血病患者中实现了完全缓解(Maude,et al.,NEJM,vol.371:1507-17,2014)。这些结果伴随着的T细胞增殖和明确记录的T细胞在如此治疗的白血病患者的肿瘤部位中的浸润。尽管在造血系统恶性病中证实了高响应率，但实体肿瘤中(以及在某些淋巴肿瘤中)的CAR T细胞功效可能有限。对此可能的解释包括T细胞浸润实体肿瘤的能力可能削弱、通行不良、免疫抑制性肿瘤微环境和实体肿瘤细胞上极少肿瘤特异性表达。
本领域需要更有效的组合物和通过这种组合物提高对肿瘤细胞的特异性和提高在实体肿瘤和血液恶性病中的肿瘤部位中的浸润来治疗癌症的方法。本发明满足了这种需要。
发明概述
如本文所公开的，本发明包括应用具有目标效应活性的吞噬细胞的组合物和方法。
一方面，本发明包括包含嵌合抗原受体(CAR)的修饰细胞，其中CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和刺激和/或共刺激分子细胞内结构域，并且其中细胞是具有目标效应活性的单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。
另一方面，本发明包括包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的修饰细胞，其中核酸序列包含编码抗原结合结构域的核酸序列、编码跨膜结构域的核酸序列和编码刺激和/或共刺激分子细胞内结构域的核酸序列，并且其中细胞是表达CAR并具有目标效应活性的单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。
再另一方面，本发明包括对细胞进行修饰的方法，包括将嵌合抗原受体(CAR)引入单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞中，其中CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和刺激和/或共刺激分子细胞内结构域，并且其中细胞是表达CAR并具有目标效应活性的单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。
又一方面，本发明包括包含根据本文所述的方法修饰的细胞的组合物。
在本文所述的本发明的上述方面或任何其它方面的各种实施方式中，CAR的抗原结合结构域包含选自单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、单链可变片段和其抗原结合片段的抗体。在另一实施方式中，CAR的抗原结合结构域选自抗CD 19抗体、抗HER2抗体和其片段。在又一实施方式中，CAR的细胞内结构域包含双重信号传导结构域。
在另一实施方式中，目标效应活性针对特异性结合CAR的抗原结合结构域的、靶细胞上的抗原。在又一实施方式中，目标效应活性选自吞噬、目标的细胞的细胞毒性(targeted cellular cytotoxicity)、抗原呈递和细胞因子分泌。
在另一实施方式中，组合物还包含选自下列的用剂：核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合。
在另一实施方式中，修饰细胞具有至少一个上调的M1标志物和至少一个下调的M2标志物。在又一实施方式中，修饰细胞被遗传修饰以表达CAR。在再另一实施方式中，通过抑制CD47或SIRPa活性来增强目标效应活性。
在另一实施方式中，将CAR引入细胞包括引入编码CAR的核酸序列，如电穿孔编码CAR的mRNA或用包含编码CAR的核酸序列的病毒载体转导细胞。
在另一实施方式中，目标效应活性针对特异性结合CAR的抗原结合结构域的、靶细胞上的抗原。在另一实施方式中，目标效应活性选自吞噬、目标的细胞的细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌。
在另一实施方式中，本文所述的方法还包括抑制CD47或SIRPα活性以增强目标效应活性，如通过使细胞与阻断性抗CD47或阻断性抗SIRPα抗体接触。在再另一实施方式中，方法还包括修饰细胞以将用剂递送至靶标，其中该用剂选自核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合。
一方面，本发明包括包含本文所述细胞的药物组合物。
另一方面，本发明包括本文所述修饰细胞在制备用于治疗对其有需要的对象中的免疫应答的药物中的用途。在再另一方面，本发明包括本文所述修饰细胞在制备用于治疗对其有需要的对象中的肿瘤或癌症的药物中的用途。
再另一方面，本发明包括治疗对象中与肿瘤或癌症相关的疾病或病症的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本文所述修饰细胞的药物组合物。
还另一方面，本发明包括治疗对象的肿瘤的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本文所述修饰细胞的药物组合物。
另一方面，本发明包括刺激对象中对靶肿瘤细胞或肿瘤组织的免疫应答的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本文所述修饰细胞的药物组合物。
附图简述
当结合附图阅读时，以下对本发明优选实施方式的详细描述将得到更好理解。以示例本发明为目的，附图中示出了目前优选的实施方式。然而，应理解，本发明不限于附图中所示的实施方式的确切安排和手段。
图1A是显示嵌合抗原受体(CAR)的概念图的一系列图，该嵌合抗原受体(CAR)由如下基因/基因-产物构成：含有具有靶向功能的细胞外结构域、铰链结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域(一个或多个)、和/或用于可被分泌或不可被分泌的另外的基因产物的化学计量共表达的2A(P2A、T2A)，该另外的基因产物包括任何基因/转录物/蛋白质，包括但不限于细胞因子、单克隆抗体、抗体片段、单链可变片段、酶、另外的受体、显性负性受体、肿瘤相关抗原(一种或多种)、以及其任何组合。另外，CAR构建体可以包括CRISPR/Cas9基因编辑物的共递送，或者被引入在CRISPR/Cas9预编辑细胞的环境中。
图1B是显示CAR构建体的具体实例的一系列图，包括CARMA-ζ、CARMA-γ和CARMA-Dectin，其分别包含抗原特异性scFv、CD8铰链、CD8跨膜、以及CD3ζ、FcεRI通用γ亚单位、或Dectin-1的细胞内结构域。
图2A是显示在慢病毒转导后髓样细胞表面上表达的CAR19z的图。CAR19z慢病毒以三倍稀释(稀释剂，dilutor)滴定，并用于转导1e5/0.1mL mRFP+THP1细胞。mRFP是通过髓样细胞系THP1的慢病毒转导而表达的报告基因(红色荧光蛋白)。这些细胞在暴露于化学PMA后可被诱导分化成巨噬细胞。THP1细胞在转导后24小时被收获，并用生物素化蛋白L然后抗生蛋白链菌素-APC染色，以获得CAR表面表达。
图2B是显示通过FACS扩增和分选转导后的THP1细胞以生成100％CAR19z阳性mRFP+THP1亚系的图。
图2C显示了抗CD19、抗HER2和抗间皮素慢病毒CAR构建体在THP1巨噬细胞上的表达，其中CAR(+)事件在右上象限中。
图3A是显示利用THP1巨噬细胞模型进行的CARMA亚系生成、利用1ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)进行的分化和体外吞噬试验的概况的流程图。
图3B是显示通过基于荧光显微术的吞噬试验证明，抗-CD19 CAR巨噬细胞(而野生型(Wt)巨噬细胞则否)吞噬表达CD19的K562肿瘤细胞的图。
图3C是显示通过基于荧光显微术的吞噬试验证明，抗HER2 CAR巨噬细胞(而野生型(Wt)巨噬细胞则否)吞噬表达HER2的K562肿瘤细胞的图。
图3D是显示通过基于荧光显微术的吞噬试验证明，抗间皮素CAR巨噬细胞(而野生型(Wt)巨噬细胞则否)吞噬表达间皮素的K562肿瘤细胞的图。
图3E是代表性FACS作图，显示CARMA肿瘤吞噬通过基于流式细胞术的试验被验证，其中抗CD19的mRFP+CARMA与CD19+GFP+K562细胞被共培养，并且双阳性事件被定量。
图3F是显示在CARMA吞噬功能列表中使用的标准10x视野中的mRFP的图像。
图3G是显示在CARMA吞噬功能列表中使用的标准10x视野中的覆盖(overlay)的图像。
图3H是显示基于FACS的mRFP/GFP双阳性事件被定义为吞噬事件并且通过AmnisImagestream FACS分析被验证的一系列图像。所示事件基于双阳性事件被门控(gated)并通过Amnis Imagestream吞噬-侵蚀(erode)算法进行从高到低排序。
图3I是显示通过共聚焦显微术进一步证明了在THP-1细胞系模型中通过mRFP+CARMA对肿瘤细胞的吞噬，证实GFP+肿瘤细胞通过三维共焦z型堆叠重建已经被完全封闭在吞噬体内的一系列图像。
图3J是单个CARMA细胞显示随时间推移的遭遇(命运，fate)——其中接触和免疫突触形成是第一步，导致吞噬性吞食、用GFP损失作为细胞死亡标志的肿瘤降解、吞噬体分解、和吞噬体修复——表明CARMA在肿瘤细胞吞噬后存活的一系列图像。
图3K显示了CARMA一次吞噬多个肿瘤细胞的能力。
图4A是显示利用针对CD19+(靶标)或CD19-(对照)GFP+K562肿瘤细胞的体外吞噬试验测试的抗CD19 CAR巨噬细胞的图。只有抗原负载肿瘤细胞被吞噬，证明了CARMA的抗原特异性。为了证明CARMA功能中细胞内信号传导结构域的需要，使用CAR19-Δζ构建体(其缺少细胞内信号传导结构域)。
图4B是显示不能吞噬肿瘤细胞的CAR19-Δζ巨噬细胞的图。
图4C是通过体外基于萤光素酶的特异性溶解试验显示CAR19-Δζ巨噬细胞具有显著降低的抗肿瘤功能的图。
图4D是显示在R406(Syk抑制剂)存在下进行的体外CARMA吞噬试验的图。R406独立地根除了CARMA的吞噬功能，表明巨噬细胞中的CAR信号传导依赖于Syk并导致肌动蛋白聚合和NMIIA介导的吞噬功能。
图4E是显示在细胞松弛素D(肌动蛋白聚合抑制剂)存在下进行的体外CARMA吞噬试验的图。细胞松弛素D独立地根除了CARMA的吞噬功能，表明巨噬细胞中的CAR信号传导依赖于Syk并导致肌动蛋白聚合和NMIIA介导的吞噬功能。
图4F是显示在blebbistatin(非肌肉性肌球蛋白IIA抑制剂)存在下进行的体外CARMA吞噬试验的图。Blebbistatin独立地根除了CARMA的吞噬功能，表明巨噬细胞中的CAR信号传导依赖于Syk并导致肌动蛋白聚合和NMIIA介导的吞噬功能。
图5A是显示相对于同种型对照，靶肿瘤细胞系上的CD47表达的流式细胞术图。这些实验中使用了K562和K562-CD19+(K19)，两者都是高CD47表达细胞系。
图5B是显示添加抗CD47单克隆抗体选择性地增强CAR(但不增强Wt)巨噬细胞介导的、靶抗原负载肿瘤细胞的吞噬的图。Wt或CAR19ζ巨噬细胞与CD19+K562肿瘤细胞，与0、0.01、0.10、1.00或10.0mcg/mL抗CD47单克隆抗体一起培育。
图5C是显示添加抗SIRPα单克隆抗体选择性地增强CAR(但不增强Wt)巨噬细胞介导的、靶抗原负载肿瘤细胞的吞噬的图。Wt或CAR19ζ巨噬细胞与CD19+K562肿瘤细胞，与0、0.01、0.10、1.00或10.0mcg/mL抗SIRPα单克隆抗体一起培育。
图5D是证明用抗SIRPα单克隆抗体阻断CD47/SIRPα轴增强CAR巨噬细胞的多吞噬性(polyphagocytic)(定义为一次吞食2个或更多个肿瘤细胞的巨噬细胞)的图。
图5E是显示体外吞噬试验的图。为了控制CD47/SIRPα阻断单克隆抗体的增加的调理作用，在体外吞噬试验中使用结合CD47但不阻断CD47到达SIRPα结合位点的对照抗CD47单克隆抗体(克隆2D3)。只有阻断该结合位点的克隆(抗CD47，克隆B6H12)或SIRPα受体的阻断会直接导致CARMA肿瘤吞噬增强。
图5F是显示针对抗原阴性(CD19阴性)肿瘤细胞的体外吞噬的图。为了测试CAR巨噬细胞上的CD47/SIRPα轴的阻断是否导致抗原特异性丧失，在抗CD47或抗SIRPα单克隆抗体存在下进行针对抗原阴性(CD19阴性)肿瘤细胞的体外吞噬，并且没有可观察到的吞噬。
图5G是显示通过敲除THP1巨噬细胞上的SIRPα受体和比较在不存在或存在SIRPα抗体的情况下CARMA或SIRPα-KO CARMA的肿瘤吞噬来测试CARMA吞噬增强在SIRPα阻断单克隆抗体存在下的特异性的图。CRISPR/Cas9用于SIRPα删除，并且在功能测定之前对细胞进行SIRPα阴性分选。敲除SIRPα增强了CARMA功能，并且将抗SIRPα添加回到敲除后的细胞中不能进一步增强吞噬。
图6A是显示以剂量依赖性方式，在48小时时，在体外基于萤光素酶的杀伤试验中，通过CAR19ζCARMA(而非Wt)巨噬细胞(利用THP-1巨噬细胞模型)导致的CD19+GFP+萤光素酶+K562细胞的特异性溶解的图。
图6B是显示以剂量依赖性方式，在48小时时，在体外基于萤光素酶的杀伤试验中，通过CAR19ζ或Wt THP-1单核细胞(未分化，因此是单核细胞而非巨噬细胞的模型)导致的肿瘤细胞的特异性溶解的图。
图6C是显示在不存在或存在10μg/mL抗SIRPα单克隆抗体的情况下，在与Wt或CAR19ζ巨噬细胞体外48小时共培养后，源自萤光素酶阳性CD19+K562肿瘤细胞的、萤光素酶驱动性生物发光的一组图像。
图6D是显示Wt或CAR19ζ巨噬细胞+/-抗SIRPα单克隆抗体的特异性溶解的图。
图7A是显示具有FcεRI通用γ(CAR19γ、CARMA19γ)亚单位细胞内结构域的CAR构建体被生成，封装到慢病毒中，和用于在三倍连续稀释的慢病毒滴定度下转导THP-1髓样细胞的一系列图。CAR19γ在THP-1巨噬细胞上被表达。
图7B是显示100％CAR阳性分选和用于体外功能表征的CAR19γ巨噬细胞或CAR19ζ巨噬细胞的图。CAR19ζ和CAR19γ巨噬细胞都吞噬CD19+肿瘤细胞，并且都显示与通过加入抗SIRPα单克隆抗体而导致的CD47/SIRPα轴阻断的协同作用。
图7C是显示R406 Syk抑制体外吞噬试验的图，证明CAR19ζ和CAR19γ巨噬细胞都通过Syk进行信号传导以驱动肿瘤吞噬。
图7D是显示在各种E：T比下，在共培养24小时后，在体外基于萤光素酶的特异性溶解试验中CAR19ζ和CAR19γTHP1巨噬细胞(而Wt THP1巨噬细胞则否)有效杀死CD19+肿瘤细胞的图。
图8A是显示巨噬细胞通过组成型表达的病原体识别受体对感染的保守分子信号如病原体相关分子模式(patterns)做出响应的图。
图8B是显示利用CAR巨噬细胞进行的体外吞噬试验的图，该CAR巨噬细胞独立地以TLR1-9配体或介质对照预处理以增强CARMA的肿瘤吞噬功能。TLR1、2、4、5和6的配体增强了CARMA的吞噬功能。
图8C是显示在TLR3或TLR6配体浓度范围内增强或不增强肿瘤细胞的CARMA吞噬的TLR配体之间的差异的图。
图9A是显示β-葡聚糖(酵母产物)与巨噬细胞表面上的Dectin-1结合并导致激活和效应功能的图。为了测试β-葡聚糖增强CARMA功能的能力，在不存在或存在5mcg/mLβ-葡聚糖的情况下进行体外肿瘤吞噬试验。β-葡聚糖增强CAR(而不增强Wt)巨噬细胞的吞噬能力。
图9B是一系列图，显示在存在0、0.5、5或50μg/mLβ-葡聚糖的情况下在各种效应物(effector，E)：靶标(target，T)比例下进行的体外基于萤光素酶的特异性溶解试验，以测试β-葡聚糖增强CARMA肿瘤杀伤的能力。β-葡聚糖增强通过CAR(而不增强Wt)THP-1巨噬细胞导致的抗原负载肿瘤细胞的特异性溶解。
图10A是显示生成由Dectin-1细胞内信号传导结构域构成的CAR构建体的一系列图。这些构建体被封装到慢病毒中并用于在三倍连续稀释的慢病毒滴定度下转导THP-1髓样细胞。
图10B是显示在表达CD8TM-Dectin1 CAR构建体的巨噬细胞的表面上检测CAR的图。
图10C是显示在表达DectinTM-Dectin1 CAR构建体的巨噬细胞的表面上检测CAR的图。
图10D是显示在体外萤光素酶杀伤试验中测试CD8TM-Dectin1 CAR和DectinTM-Dectin1 CAR巨噬细胞的图。两种构建体均显示肿瘤细胞的特异性溶解。
图10E是显示在体外肿瘤吞噬试验中针对K562(对照)或K19(靶标)肿瘤细胞测试的Dectin1-CAR巨噬细胞的图。Dectin1-CAR巨噬细胞选择性地吞噬负载同源抗原的肿瘤细胞。
图10F是显示Dectin-1 CAR巨噬细胞显示吞噬多种肿瘤细胞的能力的一系列图。
图10G是显示体外肿瘤吞噬试验的图。Dectin1-CAR巨噬细胞显示与SIRPα阻断或与TLR配体预处理的协同作用。
图11A是显示相对于同种型对照，三种不同CD19+靶细胞系中钙网织蛋白水平的一系列图。
图11B是显示三种不同CD 19+靶细胞系中钙网织蛋白表达的标准化平均荧光强度的图。
图11C是显示低水平钙网织蛋白适度保护靶细胞(特别是Nalm6和JEKO细胞系)免受CAR19z巨噬细胞吞噬的图。这些数据表明，钙网织蛋白沉积/诱导的开发利用可以用作另外的手段以增加CARMA效应功能。
图12A是显示抗HER2 CAR构建体被克隆到mRNA表达质粒中，体外转录，并且mRNA被直接电穿孔到原生人单核细胞中的一系列图。
图12B是一系列图，显示抗HER2 CAR mRNA电穿孔到原生人单核细胞源巨噬细胞(primary human monocyte derived macrophages)(充分分化)中的效率在79.7％。
图12C是显示下列的图：虽然mRNA电穿孔导致单核细胞和巨噬细胞的高CAR转染效率，但CAR表达因mRNA降解而是短暂的，在体外电穿孔后第2天达到峰值并到第7天消失。
图13A是显示通过IP注射被注射以1E6 SKOV3 CBG/GFP+人卵巢癌细胞(HER2+卵巢癌的转移性腹膜内癌扩散的模型)的NSGS小鼠的图。小鼠被共同注射以模仿物(mock)电穿孔或抗HER2 CAR mRNA电穿孔的原生人巨噬细胞(1:1的E:T比)，并对肿瘤负荷成像。CAR巨噬细胞显示经过约两周的肿瘤生长边际减少。肿瘤负荷被生物发光定量的第一个时间点是治疗后24小时，表明CAR单核细胞和巨噬细胞在该第一个24小时内具有活性。
图13B是显示通过IP注射被注射以1E6 SKOV3 CBG/GFP+人卵巢癌细胞的NSGS小鼠——HER2+卵巢癌的转移性腹膜内癌扩散的模型——的图。小鼠被共同注射以模仿物电穿孔或抗HER2 CAR mRNA电穿孔的原生人单核细胞(1:1的E:T比)，并对肿瘤负荷成像。CAR单核细胞显示经过约两周的肿瘤生长边际减少。肿瘤负荷被生物发光定量的第一个时间点是治疗后24小时，表明CAR单核细胞和巨噬细胞在该第一个24小时内具有活性。
图14A是显示利用多种CAR构建体测试CAR转基因至原生人单核细胞源巨噬细胞的慢病毒递送的一系列图。CAR19通过慢病毒转导被递送至人巨噬细胞，在对照vs CAR19慢病毒(MOI 10)组中显示4.27％和38.9％的转导效率。
图14B是一系列代表性FACS作图，显示原生人巨噬细胞中抗HER2 CAR的表达，在对照和MOI 10CAR LV条件之间转导效率分别为1.47％和18.1％。
图15A是在显示抗CD19的转导效率在转导中点(第4天)达到峰值的一系列图。通过使CD14+选择的细胞(来自正常供体血液析离术(apheresis)产物)在GM-CSF条件培养基中分化7天而生成单核细胞源巨噬细胞。为了优化通过慢病毒转导进行的CAR递送，在单核细胞至巨噬细胞分化过程的不同时间点利用抗CD19慢病毒转导巨噬细胞。
图15B是在显示抗HER2的转导效率在转导中点(第4天)达到峰值的一系列图。通过使CD14+选择的细胞(自正常供体血液析离术产物)在GM-CSF条件培养基中分化7天而生成单核细胞源巨噬细胞。为了优化通过慢病毒转导进行的CAR递送，在单核细胞至巨噬细胞分化过程的不同时间点利用抗HER2慢病毒转导巨噬细胞。
图15C是显示吞噬效力趋势顺应CAR转导效率的一系列图，在分化过程中第4天转导的巨噬细胞为峰值。
图16A是显示考虑到mRNA电穿孔是短暂的并且慢病毒仅适度有效且需要高滴度而测试将转基因递送至原生人巨噬细胞的可选转导方法的一系列图。腺病毒(重组型，复制缺陷型)被确定为原生人巨噬细胞转导的有效方法。测试原生人巨噬细胞上，相对于同种型对照，Coxackie腺病毒受体(Ad5的停靠蛋白)和CD46(Ad35的停靠蛋白)的表达，并且CD46(但Coxackie腺病毒受体则否)被高度表达。因此，嵌合Ad5f35腺病毒被用于原生人巨噬细胞转导，并且通过标准分子生物学技术被改造以表达抗HER2的嵌合抗原受体(GFP和空白Ad5f35病毒用作对照)。
图16B是显示在1000的MOI下Ad5f35将转基因(GFP用作模型转基因)有效递送到人巨噬细胞中，并且通过在IVIS光谱上的GFP信号定量监测到表达随着时间推移而走高的图。
图16C是显示在跨越上至10,000的MOI宽范围的不同时间点的原生人巨噬细胞的转导动力学比较的图。
图16D是在宽范围的病毒MOI下，在转导后48小时，Ad5f35转导的人巨噬细胞上的抗HER2 CAR表达的一系列代表性FACS作图。
图16E是Ad5f35-GFP转导的原生人巨噬细胞的一系列代表性荧光显微术图像，其中最高转导效率显示在MOI为1000时。
图17A是显示通过FACS分析在体外吞噬试验中测试的原生人CARMA的一系列图。巨噬细胞(未转导，或抗HER2 CAR)在与GFP+SKOV3卵巢癌细胞共培养之前用DiI染色。通过DiI/GFP双阳性事件定义的吞噬被测量在CAR组中处于26.6％的水平，在对照组中处于4.55％的水平。
图17B是视觉显示这些双阳性事件代表吞噬的一系列图。为了验证DiI/GFP双阳性事件是吞噬事件并且不是双联体(doublets)，细胞松弛素D(吞噬抑制剂)被添加到实验组中，并且充分根除CAR介导的吞噬以降至1.74％。为了进一步验证原生人CAR巨噬细胞能够吞噬肿瘤细胞，双阳性事件通过Amnis Imagestream FACS被门控，并且通过Amnis吞噬-侵蚀算法被从高到低排序。
图17C是显示与SKOV3-GFP共培养的、Dil染色的CAR-HER2巨噬细胞的共焦显微镜图像的一系列图。
图18是显示CAR(但UTD则否)人巨噬细胞吞噬乳腺癌细胞的图。利用单核细胞源巨噬细胞的Ad5f35-CAR转导生成抗HER2 CAR原生人巨噬细胞。这些细胞(或对照未转导细胞)用作SKBR3人乳腺癌细胞的体外基于FACS的吞噬试验中的效应物。此外，抗SIRPα单克隆抗体的添加增强了CARMA(但不增强UTD巨噬细胞)对乳腺癌细胞的吞噬。这些结果证明，THP-1模型中观察到的CD47/SIRPα轴阻断与CARMA之间的协同作用平移到了原生人巨噬细胞研究。
图19是一系列代表性的FACS作图，显示CARMA呈现pH-Rodo Green大肠杆菌(E.coli)颗粒的完整吞噬。为了证明CAR巨噬细胞仍然是抗微生物意义上的功能性先天免疫细胞，而没有丧失对传染性刺激应答的能力，在基于FACS的大肠杆菌吞噬试验中使用未转导的对照或CAR巨噬细胞。
图20A是显示在体外基于萤光素酶的杀伤试验中作为效应细胞测试的原生人抗HER 2CARMA的图。在共培养48小时后，抗HER2 CARMA(但对照UTD巨噬细胞则否)导致HER2+K562细胞(但缺少HER2表达的对照K562细胞则否)特异性溶解。
图20B是显示利用SKBR3乳腺癌细胞作为靶标、体外基于萤光素酶的杀伤试验的图。CARMA(但对照UTD或对照空白Ad5f35转导的巨噬细胞则否)在共培养48小时后对两种模型均具有显著的抗肿瘤活性。
图20C是显示利用SKOV3卵巢癌细胞作为靶标、体外基于萤光素酶的杀伤试验的图。CARMA(但对照UTD或对照空白Ad5f35转导的巨噬细胞则否)在共培养48小时后对两种模型均具有显著的抗肿瘤活性。
图20D是显示在杀伤试验中CD47/SIRPα轴阻断之间的协同作用的图。将SKOV3卵巢癌细胞与培养基、对照未转导巨噬细胞、抗HER2 CARMA、抗HER2 CARMA+抗CD47mAB(10mcg/mL)或抗HER2 CARMA+抗SIRPα(10mcg/mL)共培养，并且连续测量萤光素酶信号。CARMA导致到第13天完全的肿瘤根除，而在存在阻断CD47/SIRPα轴的情况下，肿瘤根除的动力学甚至更快。
图20E是显示与β-葡聚糖的协同作用的图，其在THP-1巨噬细胞CARMA模型中被证实，并且CARMA的β-葡聚糖预处理导致肿瘤杀伤动力学增强。
图20F是显示CARMA暴露于LPS(TLR-4配体)或聚IC(TLR-3配体)导致抗肿瘤效果的调节的图。
图21是显示在体外萤光素酶试验中原生人CARMA清除肿瘤的能力的一系列图。将GFP+SKOV3卵巢癌细胞与对照UTD巨噬细胞、对照UTD巨噬细胞+10mcg/mL曲妥珠单抗(trastuzumab)、对照空白Ad5f35病毒转导的巨噬细胞、或抗HER2原生人CARMA共培养。CARMA(但对照条件则否)能够清除肿瘤细胞。
图22A是显示通过FACS测量M1标志物CD80/CD86的剂量依赖性上调和M2标志物CD163的剂量依赖性下调的图。巨噬细胞是能够接受不同功能特征的表型塑性细胞(phenotypically plastic cells)，通常被分为M1和M2巨噬细胞分类——其中M1是炎性/活化的，并且M2是免疫抑制性/促进肿瘤的。M1和M2标志物在用Ad5f35 CAR病毒转导原生人巨噬细胞后48小时被测量。
图22B是显示对M1和M2标志物的影响是CAR表达还是Ad5f35转导的结果的一系列图。对巨噬细胞不转导，以空白Ad5f35转导，或以抗HER2 Ad5f35转导，并且空白/CARAd5f35显示相同的表型转变模式。
图22C是显示暴露于抑制性细胞因子的CARMA在48小时时在基于萤光素酶的体外特异性溶解试验中保持其杀伤活性的图。对照UTD巨噬细胞用抑制性细胞因子处理，显示增强的肿瘤生长。
图22D是显示人CAR巨噬细胞对免疫抑制的抗性的一组图，对照UTD、空白Ad5f35或抗HER2 CAR Ad5f35转导的巨噬细胞被暴露于10ng/mL的IL-4(典型M2诱导细胞因子)或此前显示使巨噬细胞在共培养期间下转(subvert)成M2的癌细胞(SKOV3，卵巢癌细胞系；HDLM2，霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤细胞系)。对照UTD巨噬细胞上调CD206(通过STAT6磷酸化对IL-4做出刺激特异性响应的M2标志物)。空白Ad5f35，更甚者CAR-Ad5f35转导的巨噬细胞，显示了对IL-4和肿瘤诱导的M2表型下转的抗性。
图22E是显示暴露于IL-4 24小时以极化成M2(或否)的对照UTD或抗-HER2 CAR巨噬细胞的代谢表型和氧消耗速率的图。
图22F是显示表型、代谢和功能试验表明CARMA对M2下转具有抗性的图。
图23A是显示在0(UTD)至1000范围内的MOI下，用Ad5f35-CAR-HER2转导的原生人正常供体单核细胞(通过CD14阳性选择而纯化)的图。在转导后48小时通过FACS测量CAR表达。Ad5f35有效生成CAR单核细胞，并且表达在1000的MOI下达到峰值。
图23B是显示原生单核细胞转导效率的图。
图23C是显示在上至1000的MOI下单核细胞保持高活力(通过FACS Live/DeadAqua分析测量)的图。
图23D是显示CAR(但未转导的(UTD)则否)人单核细胞上调M1活化标志物的一系列图。
图23E是显示因CAR(但未转导的(UTD)则否)人单核细胞而下调的M2标志物的一系列图。
图24A是显示通过体外基于萤光素酶的杀伤试验评估的HER2+SKBR3细胞(人乳腺癌)的抗HER2 CAR单核细胞杀伤作用的图。
图24B是显示通过体外基于萤光素酶的杀伤试验评估的HER2+SKOV3细胞(人卵巢癌)的抗HER2 CAR单核细胞杀伤作用的图。
图25A是用于体内建模人HER2(+)卵巢癌异种移植物的NOD-scid IL2Rg-null-IL3/GM/SF、NSG-SGM3(NSGS)小鼠的示意图。在第0天，对小鼠腹膜内(IP)注射以7.5E5叩头虫(click beetle)绿色萤光素酶(CBG luc)阳性/绿色荧光蛋白(GFP)阳性SKOV3卵巢癌细胞——作为腹膜内癌扩散的模型，实体恶性病的侵袭性固有转移性模型。小鼠未经处理(仅肿瘤)，或者在第0天通过IP注射被注射以单剂量的4E6未转导的人巨噬细胞(UTD)或CAR-HER2人巨噬细胞(CARMA)。
图25B是显示利用生物发光(总通量；光子/秒)作为肿瘤负荷代表连续成像的小鼠的图。
图25C是显示接受CARMA处理的小鼠的存活百分比的图。CARMA处理的小鼠的肿瘤负荷降低大约两个数量级。
图25D是显示相对于未处理的小鼠或UTD巨噬细胞处理的小鼠，经CARMA处理的小鼠有30天的存活收益(p＝0.018)的一组图像。
图25E是显示获自第36天死亡的小鼠并基于FACS分析通过人CD45表达评估过继转移的人巨噬细胞的存在的肿瘤的一组图。
图26A是显示无转导的(UTD)或用不具有转基因的空白Ad5f35病毒体(空白/空(empty))或Ad5f35-CAR-HER2-ζ(CARMA)以1000的感染倍数转导的人巨噬细胞转导后48小时通过FACS分析验证的表面CAR表达的图。
图26B是显示在通过空白Ad5f35或CAR-HER2-ζAd5f35转导的细胞中经评估证实M1巨噬细胞极化的表面标志物的一组图。M1标志物(HLA DR、CD86、CD80、PDL1)被上调，而M2标志物(CD206、CD163)被下调。
图26C是用于HER2+转移性卵巢癌的IP模型并且分为4个处理组(每组n＝5)的NSGS小鼠的示意图。小鼠不被处理，或在第0天被给予1E7未转导巨噬细胞、空白Ad5f35转导的巨噬细胞、或CAR-HER2-ζ转导的巨噬细胞的IP注射。
图26D是显示通过连续生物发光成像监测的肿瘤负荷的一组图像，其中代表性数据显示在肿瘤植入后第27天。
图26E是显示通过连续生物发光成像监测的肿瘤负荷的图，其中代表性数据显示在肿瘤植入后第27天。
图27A是用于HER2+转移性卵巢癌的IP模型并分为4个处理组(每组n＝5)的NSGS小鼠的示意图，该处理组包括无处理和在第0天IP给予3E6、1E7或2E7 CAR-HER2-ζ人巨噬细胞。
图27B是显示通过连续生物发光成像监测的肿瘤负荷的图。在此模型中观察到对巨噬细胞数量的剂量依赖性响应。
图27C是显示每只小鼠3E6、1E7或2E7巨噬细胞的CAR-HER2巨噬细胞单剂量导致植入后第36天的剂量依赖性肿瘤根除(相对于未处理的小鼠)的图。
图28是关于CARMA提出的治疗方法的示例。简而言之，从外周血选择患者单核细胞，将其离体分化和转导以表达CAR，与协同化合物一起进行共刺激(或否)，和静脉内、腹膜内、肿瘤内、通过介入性放射学程序、或通过其它途径注射回患者中。注意，分化过程可以被跳过，并且单核细胞可以被转导和输注回患者中。单核细胞来源还可以是HLA匹配的供体。
详细描述
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。尽管在测试本发明的实践中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，本文对优选的材料和方法进行了描述。在描述和主张本发明的过程中，将使用以下术语。
还要理解，本文使用的术语仅仅以描述具体实施方式为目的，而非意图限制。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指代一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”意为一个元素或多于一个元素。
当涉及诸如量、持续时间等的可测量值时，本文所用的“约”意指包括指定值的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1，还更优选±0.1％的变化，因为这样的变化适于实施本公开的方法。
如本文所用，“激活(活化，activation)”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖或已被刺激以发挥其效应作用的单核细胞/巨噬细胞的状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生、吞噬、细胞信号传导、靶细胞杀伤或抗原加工和呈递相关。术语“活化的单核细胞/巨噬细胞”是指，除其它事项外，正在进行细胞分裂或发挥效应作用的单核细胞/巨噬细胞。
本文使用的术语“用剂”或“生物剂”或“治疗剂”是指可被本文描述的修饰细胞表达、释放、分泌或递送至靶标的分子。该用剂包括但不限于核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子(例如小分子)、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任意组合。该用剂可以结合靶或靶细胞上存在的任何细胞部分，如受体、抗原决定簇或其它结合位点。该用剂可以扩散或被运送到细胞内，在此其可以在细胞内起作用。
如本文所用，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或源自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体一般是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlowet al.,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,New York；Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et al.,1988,Science242:423-426)。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且指代完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，“抗体重链”是指所有抗体分子其天然存在构象中存在的两种类型的多肽链中的较大者。
如本文所用，“抗体轻链”是指所有抗体分子其天然存在构象中存在的两种类型的多肽链中的较小者。α和β轻链是指两个主要抗体轻链同种型。
如本文所用，术语“合成抗体”是指利用重组DNA技术生成的抗体，如，例如，本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语还应被解释意为通过合成编码抗体的DNA分子(并且该DNA分子表达抗体蛋白质)或限定抗体的氨基酸序列而生成的抗体，其中该DNA或氨基酸序列已利用本领域可获得和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
如本文所用，术语“抗原”或“Ag”被定义为引起免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生，或特定免疫学感受态细胞的激活，或两者兼之。本领域技术人员将会理解，任何大分子，包括基本上所有蛋白质或肽，都可充当抗原。而且，抗原可以来源于重组DNA或基因组DNA。技术人员将会理解，包含编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原无需纯粹地由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以引起期望的免疫应答的各种组合排列。而且，技术人员将理解抗原完全无需由“基因”编码。显而易见，抗原可以被合成生成或可以源自生物样品。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
本文使用的术语“抗肿瘤效果”是指可以通过肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加或与癌性状况相关的各种生理症状减轻而展现的生物学效果。“抗肿瘤效果”还可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体预防肿瘤最初发生的能力而展现。
根据本发明，术语“自身抗原”是指任何被免疫系统识别为外源的自体抗原。自身抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
本文使用的术语“自身免疫性疾病”被定义为由自身免疫应答引起的障碍(disorder)。自身免疫性疾病是对自体抗原不适当和过度反应的结果。自身免疫性疾病的实例包括但不限于Addision病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩氏病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本病、溶血性贫血、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常天疱疮、银屑病、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、Sjogren综合征、脊椎关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等。
如本文所用，术语“自体的”意指源自同一个体、稍后被重新引入该个体的任何材料。
“同种的”是指源自同一物种的不同动物的移植物。
“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
如本文所用的术语“癌症”被定义为以异常细胞快速和不受控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和类似癌症。在某些实施方式中，癌症是甲状腺髓样癌。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指经改造以在免疫效应细胞上表达并且特异性结合抗原的人工T细胞表面受体。CAR可以用作通过过继性细胞转移的治疗。将单核细胞从患者(血液、肿瘤或腹水)取出并修饰，使得其表达具体抗原形式的特异性受体。在一些实施方式中，例如，对肿瘤相关抗原具有特异性的CAR已被表达。CAR还可以包含细胞内激活结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区域的细胞外结构域。在一些方面，CAR包含与CD3-ζ跨膜和细胞内结构域融合的、单链可变片段(scFv)衍生的单克隆抗体的融合体。CAR设计的特异性可以源于受体(例如，肽)的配体。在一些实施方式中，CAR可通过重新定向表达对肿瘤相关抗原具有特异性的该CAR的单核细胞/巨噬细胞来靶向癌症。
术语“嵌合细胞内信号传导分子”是指包含一种或多种刺激和/或共刺激分子的一个或多个细胞内结构域的重组受体。嵌合细胞内信号传导分子基本上缺少细胞外结构域。在一些实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子包含另外的结构域，如跨膜结构域、可检测标签和间隔结构域。
如本文所用，术语“保守序列修饰”意图指代不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和删除。修饰可以通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，被引入本发明的抗体中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基置换，并且可以利用本文所述的功能试验来测试改变后的抗体的抗原结合能力。
如本文使用的术语“共刺激配体”包括抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突状细胞、B细胞和类似细胞)上的这样的分子：特异性结合单核细胞/巨噬细胞上的同源共刺激分子，从而提供介导单核细胞/巨噬细胞响应——包括但不限于增殖、激活、分化和类似响应——的信号。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体和与B7-H3特异性结合的配体的激动剂或抗体。共刺激配体还包括与存在于单核细胞/巨噬细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体等，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
“共刺激分子”是指先天免疫细胞上的用于增高或减弱初始刺激的分子。例如，病原体相关的模式识别受体，如TLR(增高)或CD47/SIRPα轴(减弱)，是先天免疫细胞上的分子。共刺激分子包括但不限于TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、通用FcRγ、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉的(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、本文所述的其它共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段、具有相同作用能力的共刺激分子的任何合成序列、和其任何组合。
如本文所用，“共刺激信号”是指与主信号如巨噬细胞上CAR的激活结合导致巨噬细胞激活的信号。
术语“细胞毒性的”或“细胞毒性”是指杀伤性或破坏性细胞。在一个实施方式中，代谢增强的细胞的细胞毒性被提高，例如，增加巨噬细胞的细胞溶解活性。
“疾病”是动物的如下健康状态：其中动物不能维持稳态，并且其中如果疾病没有减轻，则动物的健康持续恶化。相比之下，动物的“障碍”是动物的如下健康状态：其中动物能够维持稳态，但是其中动物的健康状态没有障碍不存在时好。如不加以治疗，障碍不一定会导致动物健康状态进一步下降。
“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文所述有效实现具体生物学效果或提供治疗或预防效益的、化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的效果可以包括但不限于通过本领域任何适合手段确定的抗肿瘤活性。
“编码”是指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中的特定核苷酸序列充当用于合成生物过程中具有限定的核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)序列或限定的氨基酸序列的其它聚合物(多聚体，polymer)和大分子的模板的固有性质以及由此产生的生物学性质。因此，基因编码蛋白质——如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生该蛋白质。用作基因或cDNA的转录模板的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常被提供在序列表中)和非编码链都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
如本文所用，“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统内或在生物体、细胞、组织或系统内产生的任何材料。
如本文所用，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外引入或在生物体、细胞、组织或系统外产生的任何材料。
如本文所用，术语“扩增”是指数量增加，如单核细胞/巨噬细胞数量增加。在一个实施方式中，离体扩增的单核细胞/巨噬细胞的数量相对于原来存在于培养物中的数量增加。在另一实施方式中，离体扩增的单核细胞/巨噬细胞的数量相对于培养物中的其它细胞类型增加。如本文所用，术语“离体”是指已经从活生物体(例如，人)移出并在生物体外(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。
如本文所用，术语“表达”被定义为具体核苷酸序列通过其启动子驱动的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含充足的用于表达的顺式作用元件(cis-acting elements)；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，如包含该重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，“同源”是指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子之间——如两个DNA分子或两个RNA分子之间——或两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当两个分子中的亚单位位置均被相同的单体亚单位占据时；例如，如果两个DNA分子中每一个中的一个位置均被腺嘌呤占据，则其在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，十个亚单位长度的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或同源，则这两个序列是90％同源的。应用于核酸或蛋白质时，本文使用的“同源”是指具有约50％序列同一性的序列。更优选地，同源序列具有约75％的序列同一性，甚至更优选具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体和导入的CDR或框架序列中均找不到的残基。这些修饰被进行以进一步改进和优化抗体性能。总体上，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个可变结构域，一般两个可变结构域，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的。更多细节参见Jones et al.,Nature,321:522-525,1986；Reichmann et al.,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
“全人”是指其中整个分子是人来源的或由与人形式抗体相同的氨基酸序列组成的免疫球蛋白，如抗体。
如本文所用的“同一性”是指两个聚合物分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，如两个多肽分子之间，的亚单位序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置处具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子中的每一个中的一个位置被精氨酸占据，则其在该位置处具有同一性。同一性或在比对中两个氨基酸序列在相同位置处具有相同残基的程度通常以百分比表示。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或同一位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半位置(例如，10个氨基酸长度的聚合物中的5个位置)相同，则两个序列具有50％同一性；如果90％的位置(例如10个中的9个)匹配或相同，则两个氨基酸序列具有90％同一性。
“基本上同一”意为多肽或核酸分子呈现与参考氨基酸序列(例如，本文所述的氨基酸序列中的任何一个)或核酸序列(例如，本文所述的核酸序列中的任何一个)至少50％的同一性。优选地，这样的序列在氨基酸或核酸水平上具有与用于比较的序列至少60％，更优选80％或85％，以及更优选90％、95％或甚至99％的同一性。
引导核酸序列(guide nucleic acid sequence)可以与双链DNA靶位点的一条链(核苷酸序列)互补。引导核酸序列与靶序列之间的互补百分比可以是至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。引导核酸序列的长度可以是至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多个核苷酸。在一些实施方式中，引导核酸序列包含10至40个核苷酸的连续段。可变靶向结构域可以由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如本文描述的修饰)或其任何组合构成。
序列同一性一般用序列分析软件(例如，Genetics Computer Group,Universityof Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)、BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程序)。这样的软件通过分配与各种取代、删除和/或其它修饰的同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守取代一般包括以下分组中的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3和e-100之间的概率评分表示密切相关的序列。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为充当抗体的一类蛋白质。B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。这类蛋白质包括的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物如唾液、眼泪、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和生殖泌尿道粘液分泌物中的一级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数对象的初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。其是凝集、补体固定和其它抗体响应中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒方面是重要的。IgD是没有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可以充当抗原受体。IgE是通过在暴露于过敏原后引起介体从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放而介导立即超敏反应的免疫球蛋白。
如本文所用，术语“免疫应答(响应，response)”被定义为在淋巴细胞将抗原分子识别为外源并引起抗体形成和/或激活淋巴细胞以根除该抗原时发生的对抗原的细胞响应。
如本文所用，“说明材料”包括可用于传达本发明组合物和方法的有用性的出版物、记录、图或任何其它表达介质。例如，本发明的试剂盒的说明材料可以例如被附于含有本发明的核酸、肽和/或组合物的容器，或者与含有核酸、肽和/或组合物的容器一起装运。可选地，说明材料可以与容器分开装运，目的是说明材料和化合物被接受者配合地使用。
“分离的”是指自天然状态改变或移出的。例如，活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。“分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境如例如宿主细胞中。
如本文所用，“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于能够感染非分裂细胞；其可以将大量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此其是基因传递载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。衍生自慢病毒的载体提供了实现体内显著水平基因转移的手段。
如本文所用，术语“修饰”意为本发明的分子或细胞的状态或结构改变。分子可以以多种方式被修饰，包括化学、结构和功能修饰。细胞可以通过核酸引入而被修饰。
如本文所用，术语“调节”是指，与不存在治疗或化合物的对象中的应答水平相比，和/或与其它方面相同但未经治疗的对象的应答水平相比，介导对象中的应答水平的可检测的增加或减少。该术语包括干扰和/或影响天然信号或应答，由此介导对象(优选人)的有益治疗响应。
在本发明的环境中，对于常出现的核酸碱基使用以下缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶(胞苷，cytosine)，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，“U”是指尿苷。
除非另外指明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，使得编码该蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以含有内含子(一个或多个)。
术语“可操作地连接”是指调控序列与异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当使第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列被可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。总体上，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在连接两个蛋白编码区需要时处于相同的阅读框中。
术语“过度表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过度表达”旨在表示来自患者的特定组织或器官内的疾病区域如实体肿瘤的细胞中肿瘤抗原的表达水平相对于来自该组织或器官的正常细胞中的表达水平异常。具有以肿瘤抗原过度表达为特征的实体肿瘤或血液恶性病的患者可通过本领域已知的标准试验来确定。
免疫原性组合物的“肠胃外”给予包括例如皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、瘤内(i.t.)或腹膜内(i.p.)、或胸骨内注射或输注技术。
如本文所用，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有如下公知常识：核酸是多核苷酸，其可被水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域任何可利用的手段(非限制地包括重组手段，即利用普通克隆技术和PCRTM由重组文库或细胞基因组克隆核酸序列)以及通过合成手段获得的所有核酸序列。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必定含有至少两个氨基酸，并且对于可构成蛋白质或肽序列的氨基酸最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语既指代短链(其在本领域中也常被称为例如肽、寡肽和低聚物)，也指代较长链(其总体上在本领域被称为蛋白质，其中有很多种类)。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白及其它。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用，术语“启动子”被定义为启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞的合成机构或引入的合成机构识别的DNA序列。
如本文所用，术语“启动子/调控序列”意为与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物的表达所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其它情况下，该序列还可以包括基因产物表达所需的增强子序列和其它调控元件。启动子/调控序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
“组成型”启动子是在细胞的大多数或全部生理条件下，在与编码或限定基因产物的多核苷酸可操作地连接时导致基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
“诱导型”启动子是基本上只有在与启动子相对应的诱导物在细胞中存在时，才在与编码或限定基因产物的多核苷酸可操作地连接时导致基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
“组织特异性”启动子是基本上只有在细胞是与启动子相对应的组织类型的细胞时，才在与编码或限定基因的多核苷酸可操作地连接时导致基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“免疫抑制抗性”是指对免疫系统活性或激活的抑制不存在或抑制减少。
“信号转导途径”是指对信号从细胞一部分向细胞另一部分的传递有影响的各种信号转导分子之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并将信号跨过细胞的质膜传递的分子和分子复合物。
“单链抗体”是指通过重组DNA技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链和轻链片段经由氨基酸改造段(an engineered span of amino acids)连接至Fv区域。生成单链抗体的各种方法是已知的，包括在美国专利号4,694,778；Bird(1988)Science 242:423-442；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Ward et al.(1989)Nature 334:54454；Skerra et al.(1988)Science 242:1038-1041中描述的那些。
如本文关于抗体所使用的术语“特异性结合”意为识别特定抗原但不实质上识别或结合样品中的其它分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的一种抗原的抗体也可以结合来自一个或多个物种的该种抗原。但是，这种交叉物种反应性本身并不使抗体为特异性的归类发生改变。在另一个实例中，特异性结合一种抗原的抗体也可以结合该抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不使抗体为特异性的归类发生改变。在一些情况下，术语“特异性的结合”或“特异性结合”可在涉及抗体、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用时使用，意指该相互作用取决于化学物种上具体结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合特定的蛋白质结构而非总体上识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则包含表位A(或游离的无标记A)的分子的存在在包含带标记“A”和该抗体的反应中将使与抗体结合的带标记A的量减少。
术语“刺激”意为通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合，从而介导信号转导事件(如但不限于，经由Fc受体机构或经由合成CAR的信号转导)引起的初次应答(primary response)。刺激可以介导某些分子的表达改变，如TGF-β下调和/或细胞骨架结构重整和类似情况。
本文使用的术语“刺激分子”意为单核细胞/巨噬细胞上的、与抗原呈递细胞上存在的同源刺激配体特异性结合的分子。
如本文所用，“刺激配体”意为在存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突状细胞、B细胞和类似细胞)或肿瘤细胞上时可以与单核细胞/巨噬细胞上的同源结合伴侣(在本文中称为“刺激分子”)特异性结合从而介导免疫细胞的应答(包括但不限于激活、免疫应答的启动、增殖和类似应答)的配体。刺激配体在本领域中是公知的，并且包括Toll样受体(TLR)配体、抗toll样受体抗体、激动剂和单核细胞/巨噬细胞受体抗体等。另外，细胞因子，如干扰素-γ，是巨噬细胞的有效刺激剂。
术语“对象”旨在包括其中可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。如本文使用的“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，如羊科、牛科、猪科、犬科、猫科和鼠科的哺乳动物。优选地，对象是人。
如本文所用，“基本上纯化的”细胞是基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指代已经与在其天然存在状态下其通常相关的其它细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群指代均质的细胞群。在其它情况下，此术语仅指已经与在其天然状态下其天然相关的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，细胞被体外培养。在其它实施方式中，细胞不被体外培养。
“靶位点”或“靶序列”是指限定结合分子可以在足以使结合发生的条件下特异性结合的核酸部分的基因组核酸序列。
“靶/靶标”意为身体内需要治疗的细胞、器官或位点。
如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指响应于抗原的呈递而参与T细胞激活的膜蛋白复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合物分子结合的抗原。TCR由α(a)和β(β)链的异二聚体构成，尽管在一些细胞中TCR由γ和δ(γ/δ)链组成。TCR可以以α/β和γ/δ形式存在，其在结构上相似但具有不同的解剖学位置和功能。每个链由两个细胞外结构域、一个可变和恒定结构域构成。在一些实施方式中，任何包含TCR的细胞上的TCR可以被修饰，包括例如辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、天然杀伤性T细胞和γδT细胞。
如本文所用，术语“治疗性”意为治疗和/或预防。治疗效果通过疾病状态的抑制、缓解或根除而获得。
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是已经以外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原生对象细胞和其后代。
本文所用的“治疗”疾病意为降低对象所经历的疾病或障碍的至少一种征兆或症状的频率或严重程度。
如本文所用，术语“肿瘤”是指组织的异常生长，其可以是良性的、癌前的、恶性的或转移的。
如本文所用，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”意为启动子相对于多核苷酸处于恰当的位置和定向以控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。
“载体”是包含分离的核酸并且可被用于将该分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。多种载体在本领域已知，包括但不限于线性多核苷酸、与离子型或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸到细胞中转移的非质粒和非病毒化合物，如，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体和类似物。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和类似载体。
范围：贯穿本公开，本发明的各个方面可以以范围形式展示。应理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明的范围的僵硬限制。因此，范围的描述应该被认为是已具体公开了该范围内所有可能的子范围以及个体数值。例如，诸如1至6的范围描述应被认为已具体公开了子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的个体数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这不论范围宽度地适用。
描述
越来越多的证据表明巨噬细胞在多种癌症的肿瘤微环境中是丰富的，在此其可以采用经典地(classically)活化的(M1，抗肿瘤)或者可选地活化的(M2，促肿瘤)表型。巨噬细胞是先天免疫系统的有效效应物，并且能够具有至少三种不同的抗肿瘤功能：吞噬、细胞的细胞毒性和抗原呈递，以策划适应性免疫应答。虽然T细胞需要通过T细胞受体或嵌合免疫受体进行的抗原依赖性活化，但是巨噬细胞可以以各种方式被活化。直接的巨噬细胞活化是非抗原依赖性的，依靠诸如通过Toll样受体(TLR)进行病原体相关分子模式识别的机制。免疫复合物介导的活化是抗原依赖性的，但需要抗原特异性抗体存在并且抑制性CD47-SIRPα相互作用不存在。
肿瘤相关巨噬细胞已显示通过肿瘤微环境可以程序重排，成为微环境中的关键免疫抑制参与者。因此，遗传改造巨噬细胞以防止免疫抑制遗传程序重排的发生的能力将是本领域的垂直性进展。
本发明包括用于治疗对象的恶性病的组合物和方法。本发明包括在单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞中表达嵌合抗原受体。这种修饰细胞被招募到肿瘤微环境，在此其通过浸润肿瘤和杀死靶细胞而充当有效的免疫效应物。
嵌合抗原受体(CAR)
在本发明的一个方面，修饰的单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞通过在其中表达CAR而生成。因此，本发明包括CAR和编码CAR的核酸构建体，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。
一方面，本发明包括包含嵌合抗原受体(CAR)的修饰细胞，其中CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激分子细胞内结构域，并且其中细胞是具有目标效应活性的单核细胞、巨噬细胞、或树突状细胞。另一方面，本发明包括包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的修饰细胞，其中核酸序列包含编码抗原结合结构域的核酸序列、编码跨膜结构域的核酸序列和编码共刺激分子细胞内结构域的核酸序列，并且其中细胞是表达CAR并具有目标效应活性的单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。在一个实施方式中，目标效应活性针对靶细胞上的、特异性结合CAR的抗原结合结构域的抗原。在另一实施方式中，目标效应活性选自吞噬、目标的细胞的细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌。
抗原结合结构域
在一个实施方式中，本发明的CAR包含结合靶细胞上的抗原的抗原结合结构域。可充当与CAR的抗原结合结构域结合的抗原的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌细胞相关的那些。
抗原结合结构域的选择取决于靶细胞表面上存在的抗原的类型和数量。例如，抗原结合结构域可被选择以识别充当靶细胞上与具体疾病状态相关的细胞表面标志物的抗原。
在一个实施方式中，抗原结合结构域结合肿瘤抗原，如目标肿瘤或癌症的特异性抗原。在一个实施方式中，本发明的肿瘤抗原包含一种或多种抗原癌症表位。肿瘤相关抗原的非限制性实例包括CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚胎抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD 117)；白介素-13受体亚单位α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1、细胞表面相关物(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；Ephrin B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome、Macropain)亚单位β型9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区域(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；岩藻糖GM1；唾液酸路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志7相关物(TEM7R)；claudin 6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组D成员(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD 179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性(placenta-specific)1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(glycoceramide)的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；Wilms肿瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；幸存(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝集素8(Galectin 8))，被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印迹位点调节因子兄弟(Brother of the Regulator ofImprinted Sites))、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白(proacrosin)结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异的蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(renal ubiquitous 1)(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；legumain；人乳头瘤病毒E6(UPVE6)；人乳头瘤病毒E7(UPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样蛋白2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3，GPC3)；Fc受体样蛋白5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
抗原结合结构域可以包括与抗原结合的任何结构域，并且可以包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体和其任何片段。因此，在一个实施方式中，抗原结合结构域部分包含哺乳动物抗体或其片段。在另一实施方式中，CAR的抗原结合结构域选自抗CD19抗体、抗HER2抗体和其片段。
在一些情况下，抗原结合结构域源自CAR将最终所用于的相同物种。例如，对于用于人，CAR的抗原结合结构域包含人抗体、人源化抗体或其片段。
在本发明的一些方面，抗原结合结构域被可操作地连接至CAR的另一结构域，如跨膜结构域或细胞内结构域，以在细胞中表达。在一个实施方式中，编码抗原结合结构域的核酸被可操作地连接至编码跨膜结构域的核酸和编码细胞内结构域的核酸。
跨膜结构域
就跨膜结构域而言，CAR可被设计以包含将CAR的抗原结合结构域连接至细胞内结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，跨膜结构域天然地与CAR中的一个或多个结构域相关(结合，associated)。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸取代修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然或合成来源。在来源天然的情况下，该结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。本发明具体应用的跨膜区可以源自以下(即，包含以下的至少跨膜区(一个或多个))：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。在一些情况下，还可以使用多种人铰链，包括人Ig(免疫球蛋白)铰链。
在一个实施方式中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。优选地，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
细胞内结构域
CAR的细胞内结构域或否则细胞质结构域包括与本文其它部分描述的嵌合细胞内信号传导分子相似或相同的细胞内结构域，并负责表达CAR的细胞的活化。
在一个实施方式中，CAR的细胞内结构域包括负责信号激活和/或转导的结构域。
用于本发明的细胞内结构域的实例包括但不限于表面受体的细胞质部分、共刺激分子、和共同作用以启动单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞中的信号转导的任何分子、以及这些元件的任何衍生物或变体和具有相同作用能力的任何合成序列。
细胞内结构域的实例包括来自一种或多种分子或受体的片段或结构域，包括但不限于TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、通用FcRγ、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述的其它共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段、具有相同作用能力的共刺激分子的任何合成序列、和其任何组合。
在一个实施方式中，CAR的细胞内结构域包含双重信号传导结构域，如41BB、CD28、ICOS、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、CD116受体β链、CSF1-R、LRP1/CD91、SR-A1、SR-A2、MARCO、SR-CL1、SR-CL2、SR-C、SR-E、CR1、CR3、CR4、dectin1、DEC-205、DC-SIGN、CD14、CD36、LOX-1、CD11b，连同上述段落中列出的信号传导结构域中的任意种的任何组合。在另一实施方式中，CAR的细胞内结构域包括一种或多种共刺激分子的任何部分，如来自CD3的至少一个信号传导结构域、FcεRIγ链、其任何衍生物或变体、其任何具有相同作用能力的合成序列、和其任何组合。
在CAR的抗原结合结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的细胞内结构域和跨膜结构域之间，可以并入间隔结构域。如本文所使用的，术语“间隔结构域”总体上意为作用以将跨膜结构域连接至多肽链中的抗原结合结构域或细胞内结构域的任何寡肽或多肽。在一个实施方式中，间隔结构域可包含上至300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，和最优选25至50个氨基酸。在另一实施方式中，短小寡肽或多肽连接体，优选2至10个氨基酸之间的长度，可以形成CAR的跨膜结构域和细胞内结构域之间的连接。连接体的实例包括甘氨酸-丝氨酸双联体。
人抗体
可优选在利用CAR的抗原结合结构域时使用人抗体或其片段。完全人抗体对于人对象的治疗性治疗是特别期望的。人抗体可以通过多种本领域已知的方法制备，包括利用由人免疫球蛋白序列获得的抗体文库进行的噬菌体展示方法，包括对这些技术的改进。另参见，美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；其每一个均整体通过引用并入本文。
人抗体还可以利用不能表达功能性内源免疫球蛋白但能够表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠生成。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机地或通过同源重组被引入小鼠胚胎干细胞。可选地，除了人重链和轻链基因之外，人可变区、恒定区和多样性区域(diversity region)也可被引入小鼠胚胎干细胞中。可以通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座而分别地或同时地使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因无作用。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失(homozygousdeletion)导致内源性抗体产生的完全抑制。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以生成嵌合小鼠。然后使嵌合小鼠繁殖以产生表达人抗体的纯合子代。用选择的抗原(例如本发明的多肽的全部或部分)以普通方式对转基因小鼠进行免疫化。针对选择的靶标的抗体可以使用常规的杂交瘤技术从免疫化的转基因小鼠获得。通过转基因小鼠获得的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，并且随后经历种类转换(class switching)和体细胞突变。因此，利用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体，包括但不限于IgG1(γ1)和IgG3。关于用于产生人抗体的这种技术的概况，参见Lonberg和Huszar(Int.Rev.Immunol.,13:65-93(1995))。关于这种用于产生人抗体和人单克隆抗体的技术和生产这种抗体的方案的详细讨论，参见例如PCT公开号WO 98/24893、WO 96/34096、和WO96/33735；和美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，其均整体通过引用并入本文。此外，诸如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Genpharm(San Jose,Calif.)的公司可参与使用与上述技术类似的技术来提供针对选定抗原的人抗体。关于在抗原挑战时将导致人抗体产生的种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列的具体讨论，参见例如Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann et al.,Year in Immunol.,7:33(1993)；和Duchosal et al.,Nature,355:258(1992)。
人抗体也可以由噬菌体展示文库获得(Hoogenboom et al.,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)；Vaughan et al.,NatureBiotech.,14:309(1996))。噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature,348:552-553(1990)可用于，由来自未免疫化供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库，体外产生人抗体和抗体片段。根据此技术，抗体V结构域基因被框内克隆到丝状噬菌体如M13或fd的主要或次要外壳蛋白(coat protein)基因中，并在噬菌体颗粒的表面上作为功能性抗体片段展示。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能特性的选择也导致呈现这些特性的抗体的编码基因的选择。因此，噬菌体模仿B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行；其综述参见例如Johnson,Kevin S,and Chiswell,David J.,CurrentOpinion in Structural Biology3:564-571(1993)。V基因区段的若干来源可用于噬菌体展示。Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)从源自未免疫化小鼠的脾的V基因小型随机组合文库分离出多种抗
Figure BDA0003925947150000271
唑酮抗体。可以构建来自未免疫化人供体的V基因库，并且可以基本上按照Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)或Griffith et al.,EMBO J.,12:725-734(1993)描述的技术分离针对多种抗原(包括自身抗原)的抗体。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905，其均整体通过引用并入本文。
人抗体也可以通过体外活化B细胞产生(参见，美国专利号5,567,610和5,229,275，其整体均通过引用并入本文)。人抗体也可以利用杂交瘤技术体外产生，如但不限于Roder et al.(Methods Enzymol.,121:140-167(1986))描述的杂交瘤技术。
人源化抗体
可选地，在一些实施方式中，可将非人抗体人源化，其中抗体的具体序列或区域被修饰以增加与人天然产生的抗体的相似性。例如，在本发明中，抗体或其片段可以包含非人哺乳动物scFv。在一个实施方式中，抗原结合结构域部分被人源化。
人源化抗体可以利用多种本领域已知的技术生成，包括但不限于CDR移植(参见，例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其整体均通过引用并入本文)、镶盖或表面重修(resurfacing)(参见，例如，欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka et al.,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguska etal.,1994,PNAS,91:969-973，其均整体通过引用并入本文)、链替换(chain shuffling)(参见例如美国专利号5,565,332，其整体通过引用并入本文)、以及在例如美国专利申请公开号US2005/0042664、美国专利申请公开号US2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号WO 9317105、Tan et al.,J.Immunol.,169:1119-25(2002)、Caldas et al.,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)、Morea et al.,Methods,20(3):267-79(2000)、Baca et al.,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)、Roguska et al.,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)、Couto et al.,Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995)、Couto et al.,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)、和Pedersen et al.,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)中公开的技术，其均整体通过引用并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变，优选改善，抗原结合。这些框架取代通过本领域公知的方法确定，例如通过建模CDR和框架残基的相互作用以确定对于抗原结合重要的框架残基和序列比较以确定具体位置处的异常框架残基。(参见例如Queen et al.,美国专利号5,585,089；和Riechmann et al.,1988,Nature,332:323，其整体通过引用并入本文。)
人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其一般取自“输入”可变结构域。因此，人源化抗体包含来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和来自人的框架区。抗体的人源化在本领域公知，并且可以基本上按照Winter和其同事的方法(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列，即CDR-移植(EP239,400；PCT公开号WO 91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640；其内容整体通过在此引用并入本文)来进行。在这样的人源化嵌合抗体中，显著小于完整人可变结构域(的序列)已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体一般是其中一些CDR残基和可能地一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代的人抗体。抗体的人源化还可通过镶盖和表面重修(EP592,106；EP519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka et al.,Protein Engineering,7(6):805-814(1994)；和Roguska et al.,PNAS,91:969-973(1994))或链替换(美国专利号5,565,332)来实现，其内容整体通过引用并入本文。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择是要降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对整个文库的已知人可变结构域序列筛选啮齿动物抗体可变结构域的序列。然后接受与啮齿动物最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims etal.,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容整体通过引用并入本文)。另一种方法利用了由具有轻链或重链具体亚组的所有人抗体的共有序列获得的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993)，其内容整体通过在此引用并入本文)。
抗体可被人源化，保持对靶抗原的高亲和力并且具有其它有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，人源化抗体通过利用母体序列和人源化序列的三维模型进行母体序列和各种概念人源化产物的分析的方法来制备。三维免疫球蛋白模型是常用的，并且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序是可利用的，其示例和展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些展示的考察能够分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能的影响，即分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体序列和输入序列中选择和组合FR残基，从而获得期望的抗体特征，如增加的对靶抗原的亲和力。总体上，CDR残基直接并且最实质地参与影响抗原结合。
人源化抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。然而，利用某些人源化方法，抗体与靶抗原结合的亲和性和/或特异性可以利用“定向演变(directed evolution)”方法而增加，如Wu et al.,J.Mol.Biol.,294:151(1999)所述，其内容整体通过在此引用并入本文。
载体
如本文其它部分所述，可以利用载体将CAR引入单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。一方面，本发明包括包含编码本文所述CAR的核酸序列的载体。在一个实施方式中，载体包括质粒载体、病毒载体、逆转录转座子(例如，背负型(piggyback)、睡美人型)、定点插入载体(例如，CRISPR、Zn指核酸酶、TALEN)或自杀表达载体、或本领域中的其它已知载体。
上述所有构建体都能够与批准用于人细胞的第三代慢病毒载体质粒、其它病毒载体或RNA一起使用。在一个实施方式中，载体是病毒载体，如慢病毒载体。在另一实施方式中，载体是RNA载体。
本文描述的任何分子的产生可以通过测序来验证。全长蛋白质的表达可以利用免疫印迹、免疫组织化学、流式细胞术或本领域公知的和可获得的其它技术来验证。
本发明还提供了其中插入了本发明的DNA的载体。载体，包括来自逆转录病毒如慢病毒的那些载体，是适于实现长期基因转移的工具，因为其允许转基因的长期稳定整合和在子细胞中的传播。慢病毒载体相对于源自癌-逆转录病毒(onco-retroviruse)的载体如鼠白血病病毒具有附加优点，在于其可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。其还具有在其被引入的对象中产生低免疫原性的附加优点。
天然或合成的核酸的表达一般通过如下实现：将核酸或其部分可操作地连接至启动子，和将该构建体并入表达载体。载体是总体上能够在哺乳动物细胞中复制，和/或还能够整合到哺乳动物的细胞基因组中的载体。一般的载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调控期望的核酸序列的表达的启动子。
核酸可以被克隆到任何数量的不同类型的载体中。例如，核酸可被克隆到如下载体中：包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的，并且被描述于例如Sambrook et al.,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)以及其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。总体上，适当的载体含有在至少一种生物体中有作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种可选择的标志物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
另外的启动子元件，例如增强子，调节转录启动的频率。一般，这些位于起始位点上游30-110bp区域，尽管最近已经显示多种启动子在起始位点下游也包含功能性元件。启动子元件之间的间距常常是灵活的，使得在元件颠倒或相对于彼此移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距可以在活性开始下降前增加到50bp。根据启动子，呈现个体元件可以共同地或独立地作用以激活转录。
启动子的实例是即时早期细胞巨化病毒(CMV)启动子序列。此启动子序列是能够驱动其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。然而，也可使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即时早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、延伸因子-1α启动子、以及人基因启动子——如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了能够打开其所可操作地连接的多核苷酸序列的表达(在期望这样的表达时)或者关闭该表达(在不期望表达时)的分子开关。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫因启动子、糖皮质素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估多肽或其部分的表达，待引入到细胞中的表达载体还可以含有选择性标志物基因或报告基因或两者，以促进表达细胞从拟通过病毒载体转染或感染的细胞群的鉴定和选择。在其它方面，选择性标志物可以被携载在DNA的单独一段上并用于共转染程序。选择性的标志物和报告基因均可以在旁侧具有适当的调控序列，以能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标志物包括例如抗生素抗性基因，如neo和类似物。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评价调控序列的功能性。总体上，报告基因是这样的基因：不存在于受体生物体或组织中或不被受体生物体或组织表达，并且编码多肽，该多肽的表达通过一定的可容易检测的性质(例如酶活性)表现。报告基因的表达在DNA已被引入受体细胞后一段适当时间被评估。适当的报告基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Teiet al.,2000FEBS Letters 479:79-82)。适当的表达系统是公知的，并且可以利用已知技术制备或商业获得。总体上，具有显示报告基因最高表达水平的最小5'侧翼区的构建体被确定为启动子。这样的启动子区域可以与报告基因连接，并用于评价用剂的调节启动子驱动的转录的能力。
核酸的引入
一方面，本发明包括对细胞进行修饰的方法，包括将嵌合抗原受体(CAR)引入单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞，其中CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激分子细胞内结构域，并且其中细胞是表达CAR并具有目标效应活性的单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。在一个实施方式中，将CAR引入细胞包括引入编码CAR的核酸序列。在另一实施方式中，引入该核酸序列包括电穿孔编码CAR的mRNA。
在细胞中引入和表达基因如CAR的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，载体可以通过本领域的任何方法被容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物学手段被转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙析出、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔和类似方法。用于生成包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。参见例如Sambrook et al.,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)。可利用商业上可获得的方法将核酸引入靶细胞，方法包括电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg，德国)。核酸还可利用如下被引入细胞：利用阳离子脂质体介导的转染利用脂转染、利用聚合物包封、利用肽介导的转染、或利用生物射弹粒子递送系统如“基因枪”(参见例如Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。
用于将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括DNA和RNA载体的使用。RNA载体包括具有RNA启动子和/或用于产生RNA转录物的其它相关结构域的载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为用于将基因插入(嵌入，inserting)哺乳动物(例如人细胞)的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和腺相关病毒和类似物。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和脂质基系统——包括水包油乳液、微团(micelle)、混合微团和脂质体。用作体外和体内递送媒介的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介是脂质体。脂质制剂的使用被考虑用于将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，可以将核酸与脂质关联。与脂质关联的核酸可以被包封在脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸均结合的连接分子附接至脂质体，截留(entrap)在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含或复合于微团，或以其它方式与脂质关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何具体结构。例如，其可以以双层结构存在，如微团般，或具有“塌陷”结构。其也可以简单地被散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是可以天然存在的脂肪物质或合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及包含长链脂肪族烃和其衍生物的化合物种类，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO获得；双十六烷基磷酸酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的原液可以被储存在约-20℃。氯仿被用作唯一的溶剂是因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是上位概念，其包括通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层次的和多层次的脂质媒介。脂质体可以表征为具有囊泡结构——具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层次脂质体具有被水性介质分隔的多个脂质层。其在磷脂悬浮在过量水溶液中时自发地形成。脂质组分在封闭结构形成前经历自我重排，并将水和溶解的溶质截留在脂质双层之间(Ghosh et al.,1991Glycobiology 5:505-10)。但是，具有不同于普通囊泡结构的溶液结构的组合物也被包括在内。例如，脂质可呈现微团结构或仅仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑脂转染胺(lipofectamine)-核酸复合物。
无论什么方法用于将外源核酸引入宿主细胞中或以其它方式将细胞暴露于本文所述分子，为了确认核酸在宿主细胞中的存在，可以进行多种试验。试验这种试验包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”试验，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”试验，如检测具体肽存在或不存在——例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文描述的鉴定落入本发明范围的用剂的试验。
在一个实施方式中，核酸序列中的一种或多种通过选自以下的方法被引入：转导细胞群、转染细胞群、和电穿孔细胞群。在一个实施方式中，细胞群包含本文所述的核酸序列中的一种或多种。
在一个实施方式中，引入细胞的核酸是RNA。在另一实施方式中，RNA是包括体外转录的RNA或合成的RNA在内的mRNA。RNA通过体外转录利用聚合酶链反应(PCR)生成的模板而产生。来自任何来源的目的DNA可通过PCR直接转化成模板，用于利用适当的引物和RNA聚合酶进行的体外mRNA合成。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它适当的DNA来源。体外转录期望的模板是CAR。
PCR可用于生成用于mRNA体外转录的模板，然后将mRNA引入细胞中。进行PCR的方法在本领域是公知的。用于PCR的引物被设计以具有与用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”是指这样的核苷酸序列：其中引物序列中的大部分或全部碱基是互补的，不然一个或多个碱基是非互补的或错配的。基本上互补的序列能够在用于PCR的复性条件下与目的DNA靶标一起复性或杂交。引物可被设计以与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，引物可被设计以扩增在细胞中正常转录的基因部分(开放阅读框)——包括5'和3'UTR。引物还可被设计以扩增编码具体目的结构域的基因部分。在一个实施方式中，引物被设计以扩增人cDNA的编码区——包括5'和3'UTR的全部或部分。可用于PCR的引物通过本领域公知的合成方法生成。“正向引物”是含有与DNA模板上待扩增DNA序列上游的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。“上游”在本文中用于指代相对于编码链而言待扩增DNA序列的5'向位置。“反向引物”是含有与待扩增DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。“下游”在本文中用于指代相对于编码链，待扩增DNA序列的3'向位置。
还可以利用具有促进RNA的稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度在0至3000个核苷酸之间。待添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度可通过不同的方法改变，包括但不限于设计与UTR的不同区域复性的PCR引物。利用这种方法，本领域普通技术人员可以在转录的RNA转染后修饰改进实现最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可以是目的基因的天然存在的内源5'和3'UTR。可选地，对于目的基因而言非内源的UTR序列可以通过将UTR序列并入正向和反向引物或通过模板的任何其它修饰来添加。对于目的基因非内源的UTR序列的使用可有效用于改进RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富AU元件可降低mRNA的稳定性。因此，3'UTR可基于本领域公知的UTR性质被选择或设计以增加转录RNA的稳定性。
在一个实施方式中，5'UTR可以含有内源基因的Kozak序列。可选地，当对于目的基因非内源的5'UTR如上所述被通过PCR添加时，可通过添加5'UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可提高一些RNA转录物的翻译效率，但看起来不是所有RNA实现有效翻译都需要的。多种mRNA对Kozak序列的需求在本领域已知。在其它实施方式中，5'UTR可以源自其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其它实施方式中，可以在3'或5'UTR中应用各种核苷酸类似物来阻碍mRNA的外切核酸酶降解。
为了实现从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，转录启动子应在待转录序列上游被附接到DNA模板。当充当RNA聚合酶启动子的序列被添加到正向引物的5'端时，RNA聚合酶启动子将在待转录开放阅读框上游被并入PCR产物。在一个实施方式中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其它部分所述。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个实施方式中，mRNA在5'端和3'聚(A)尾上都具有帽，其确定核糖体结合、翻译开始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板(例如质粒DNA)上，RNA聚合酶产生长连环产物，该长连环产物不适于在真核细胞中表达。在3'UTR末端处线性化的质粒DNA的转录产生正常尺寸的mRNA，该mRNA不有效真核转染——即使其在转录后被聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以使转录物的3'端延伸超过模板的最后一个碱基(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nachevaand Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。
将聚A/T段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的聚A/T序列可导致质粒不稳定，这是为何由细菌细胞中获得的质粒DNA模板经常被缺失(deletions)和其它畸变(aberrations)高度污染。这致使克隆程序不仅费力费时，而且还常常不可靠。这是为何高度期望允许在无克隆的情况下用聚A/T 3'段构建DNA模板的方法。
转录DNA模板的聚A/T区段可以通过利用含有聚T尾如100T尾(尺寸可以是50-5000T)的反向引物在PCR过程中生成，或者在PCR后通过任何其它方法生成，方法包括但不限于DNA连接或体外重组。聚(A)尾还提供给RNA稳定性和减少其降解。总体上，聚(A)尾的长度与转录RNA的稳定性正相关。在一个实施方式中，聚(A)尾在100至5000个腺苷之间。
在利用聚(A)聚合酶如大肠杆菌(E.coli)聚A聚合酶(E-PAP)进行体外转录后，RNA的聚(A)尾可被进一步延伸。在一个实施方式中，将聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加至300和400个核苷酸之间导致RNA的翻译效率约两倍增加。另外，不同化学基团至3'端的附接可增加mRNA稳定性。这种附接可以包含修饰的/人工的核苷酸、适体和其它化合物。例如，可以利用聚(A)聚合酶将ATP类似物并入聚(A)尾中。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供稳定性。在优选的实施方式中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。5'帽利用本领域已知和本文描述的技术来提供(Cougot,et al.,Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,et al.,RNA,7:1468-95(2001)；Elango,etal.,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
通过本文公开的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是启动不依赖于帽的核糖体与mRNA的结合并促进翻译启动的、任何病毒的、染色体的或人工设计的序列。任何适于细胞电穿孔的溶质可以被包括在内，其可以包含促进细胞渗透性和活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
文献中已知一些体外转录的RNA(IVT-RNA)载体，其以标准化的方式被用作体外转录的模板，并且其已被遗传修饰，修饰方式使得稳定化的RNA转录物生成。目前本领域中采用的方案基于具有以下结构的质粒载体：能够实现RNA转录的5'RNA聚合酶启动子，然后目的基因——其3'和/或5'侧翼为非翻译区(UTR)，以及含有50-70个A核苷酸的3'聚腺苷酸盒。在体外转录之前，通过II型限制酶(识别序列对应于切割位点)，在聚腺苷酸盒的下游，使环状质粒线性化。聚腺苷酸盒因此对应于转录物中后来的聚(A)序列。此程序的结果是，在线性化后一些核苷酸仍是酶切割位点的一部分，并延伸或遮蔽3'端处的聚(A)序列。不清楚这种非生理学悬垂(overhang)是否影响由这种构建体胞内产生的蛋白质量。
一方面，RNA构建体通过电穿孔被递送到细胞中。参见例如US 2004/0014645、US2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中教导的将核酸构建体电穿孔到哺乳动物细胞中的制剂和方法。任何已知细胞类型的电穿孔所需的包括电场强度在内的各种参数在本领域的相关研究文献中以及多个专利和申请中是总体上已知的。参见例如美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗性应用的设备可以商业获得，例如MedPulserTMDNA电穿孔治疗系统(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，并且被描述于专利如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482中；电穿孔也可用于体外细胞转染，如在US20070128708A1中所述。电穿孔还可以用于在体外将核酸递送到细胞中。因此，利用本领域技术人员已知的多种可用装置和电穿孔系统中的任一种进行的、包括表达构建体在内的核酸在细胞中的电穿孔介导式给予呈现出将目的RNA递送至靶细胞的令人振奋的新手段。
细胞来源
在一个实施方式中，吞噬细胞被用于本文所述的组合物和方法中。吞噬细胞的来源，如单核细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞，获自对象。对象的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。优选地，对象是人。细胞可以获自多种来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织、脐带和肿瘤。在某些实施方式中，可以使用本领域可获得的任何数量的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或祖细胞系。在某些实施方式中，细胞可以利用技术人员已知的任何数量的技术如Ficoll分离而从采自对象的血液单位获得。在一个实施方式中，来自个体的循环血液的细胞通过血液析离术或白细胞提取法获得。血液析离术产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核血液白细胞(白血细胞，white blood cell)、血液红细胞(红血细胞，red blood cell)和血小板。通过血液析离术收集的细胞可被洗涤以根除血浆部分和使细胞处于适当的缓冲剂或介质，如磷酸缓冲盐水(PBS)或洗涤液——其缺少钙，以及可以缺少镁或者可缺少多种(即便不是全部)二价阳离子——以用于后续的处理步骤。在洗涤后，细胞可被重新悬浮于多种生物相容性缓冲剂中，如无钙、无Mg的PBS。可选地，可将血液析离术样品的不期望组分根除，并将细胞直接重新悬浮于培养基中。
在另一实施方式中，通过溶解血液红细胞和耗尽淋巴细胞和血液红细胞(例如通过经PERCOLLTM梯度离心)，从外周血分离细胞。可选地，可以从脐带分离细胞。在任何情况下，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离单核细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞的具体亚群。
如此分离的单核细胞可不含表达某些抗原的细胞，该抗原包括但不限于CD34、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19或CD20。这些细胞的耗尽可以利用分离的抗体、包含抗体的生物样品如腹水、与结合于物理支持物的抗体和细胞结合的抗体来完成。
通过阴性选择导致的单核细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞群的富集可以利用针对阴性选择的细胞的特异性表面标志物的抗体组合来实现。优选的方法是通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术(其利用针对阴性选择的细胞上存在的表面标志物的单克隆抗体的混合物)进行的细胞分选和/或选择。例如，通过阴性选择导致的单核细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞的细胞群富集可以利用单克隆抗体混合物来实现，该单克隆抗体混合物一般包括对CD34、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19或CD20的抗体。
在通过阳性选择或阴性选择进行的期望细胞群的分离期间，细胞和表面(例如，颗粒，如珠粒)的浓度可变。在某些实施方式中，可期望显著减少珠粒和细胞混合在一起所在的体积(volume)(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠粒的最大限度接触。例如，在一个实施方式中，采用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，采用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步实施方式中，采用大于1亿个细胞/ml。在进一步实施方式中，采用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施方式中，采用7500、8000、8500、9000、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可以采用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。采用高浓度的细胞可以导致增加的细胞收率、细胞活化和细胞扩增。
在一个实施方式中，细胞群包括本发明的单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。细胞群的实例包括但不限于外周血单核细胞、脐带血细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的纯化群体、以及细胞系。在另一实施方式中，外周血单核细胞包括单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的群体。在又一实施方式中，纯化的细胞包括单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的群体。
在另一实施方式中，细胞已经上调M1标志物和下调M2标志物。例如，至少一种M1标志物，如HLA DR、CD86、CD80和PDL1，在吞噬细胞中被上调。在另一个实例中，至少一种M2标志物，如CD206、CD163，在吞噬细胞中被下调。在一个实施方式中，细胞具有至少一种上调的M1标志物和至少一种下调的M2标志物。
在又一实施方式中，通过抑制CD47或SIRPα活性，来增强吞噬细胞中的目标效应活性。可以通过用抗CD47或抗SIRPα抗体处理吞噬细胞来抑制CD47和/或SIRPα活性。可选地，可通过本领域技术人员已知的任何方法来抑制CD47或SIRPα活性。
细胞的扩增
在一个实施方式中，培养包括单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的细胞或细胞群以扩增。在另一实施方式中，培养包括祖细胞的细胞或细胞群以分化和扩增单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。本发明包括扩增如本文所述的包含嵌合抗原受体的单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的群体。
本文公开的数据证明，通过本文公开的方法扩增细胞可翻倍约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多，以及其间的任何和全部完整或部分整数。在一个实施方式中，细胞扩增在约20倍至约50倍的范围内。
在培养后，细胞可以在培养设备中的细胞培养基中被培育一定时间段或直到细胞达到汇合或最佳传代的高细胞密度，然后将细胞送到另一培养设备。该培养设备可以是常用于体外培养细胞的任何培养设备。优选地，在将细胞送到另一培养设备之前，汇合水平为70％或更高。更优选地，汇合水平为90％或更高。时间段可以是适于体外细胞培养的任何时间。培养基可以在细胞培养期间在任何时间被更换。优选地，培养基约每2到3天更换。然后从培养设备收获细胞，此后细胞可被立即使用或储存以备以后使用。
本文所述的培养步骤(与本文所述的用剂接触)可以很短，例如少于24小时，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23小时。本文进一步描述的培养步骤(与本文所述的用剂接触)可以较长，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或更多天。
在一个实施方式中，细胞可被培养几个小时(约3小时)至约14天或其间任何小时整数值。适于细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，巨噬细胞完全培养基、DMEM/F12、DMEM/F12-10(Invitrogen))，该培养基可含有增殖和活力所需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、L-谷氨酰胺、胰岛素、M-CSF、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α，或技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)、和还原剂如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15、和X-Vivo 20、Optimizer、并添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适量血清(或血浆)或限定一组激素，和/或对于细胞生长和扩增足量的细胞因子(一种或多种)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅被包括在实验培养物中，而不在将要灌注到对象中的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气+5％CO2)。
用于培养细胞的培养基可以包括能活化细胞的用剂。例如，本领域已知活化单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的用剂被包括在培养基中。
治疗
本文所述的修饰细胞可以被包括在用于治疗对象的组合物中。一方面，该组合物包含修饰细胞，该修饰细胞包含本文所述的嵌合抗原受体。该组合物可以包括药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。治疗有效量的包含修饰细胞的药物组合物可被给予。
一方面，本发明包括治疗对象的与肿瘤或癌症相关的疾病或状况的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本文所述修饰细胞的药物组合物。另一方面，本发明包括治疗对象的实体肿瘤的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本文所述修饰细胞的药物组合物。另一方面，本发明包括刺激对象对靶肿瘤细胞或肿瘤组织的免疫应答的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本文所述修饰细胞的药物组合物。再另一方面，本发明包括本文所述的修饰细胞在制备用于治疗对其有需要的对象的免疫应答的药物中的用途。在又一方面，本发明包括本文所述的修饰细胞在制备用于治疗对其有需要的对象中的肿瘤或癌症的药物中的用途。
如本文所述生成的修饰细胞具有目标效应活性。在一个实施方式中，修饰细胞具有针对靶细胞上的抗原的目标效应活性，如通过与CAR的抗原结合结构域的特异性结合。在另一实施方式中，目标效应活性包括但不限于，吞噬、目标的细胞的细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌。
在另一实施方式中，本文所述的修饰细胞具有将用剂，生物剂或治疗剂，递送至靶标的能力。细胞可被修饰或改造以将用剂递送至靶标，其中该用剂选自核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、和其任意组合。作为非限制性实例，用靶向肿瘤抗原的CAR修饰的巨噬细胞能够分泌诸如细胞因子或抗体的用剂，以协助巨噬细胞功能。抗体，如抗CD47/抗SIRPαmAB，也可协助巨噬细胞功能。在又一实例中，用靶向肿瘤抗原的CAR修饰的巨噬细胞被改造以编码siRNA，该siRNA通过下调抑制基因(即SIRPα)协助巨噬细胞功能。另一实例，CAR巨噬细胞被改造以表达协助巨噬细胞功能的受体或酶的显性负性(或其它方式突变)形式。
在一个实施方式中，巨噬细胞被以多种基因修饰，其中至少一种基因包括CAR并且至少一种其它基因包含增强CAR巨噬细胞功能的遗传元件。在另一实施方式中，巨噬细胞被以多种基因修饰，其中至少一种基因包括CAR并且至少一种其它基因协助或程序重排其它免疫细胞(如肿瘤微环境内的T细胞)的功能。
此外，修饰细胞可以被给予动物，优选哺乳动物，甚至更优选人，以抑制免疫反应，如对于自身免疫疾病如糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、GVHD、增强的同种异体移植物耐受诱导(enhancing allograft tolerance induction)、移植物排斥和类似疾病常见的那些免疫反应。另外，本发明的细胞可以用于治疗任何如下状况：其中减少的或以其它方式被抑制的免疫应答，特别是细胞介导的免疫应答，对治疗或缓解疾病是期望的。一方面，本发明包括治疗对象中的状况，如自身免疫性疾病，包括向对象给予治疗有效量的包含本文所述的细胞群的药物组合物。另外，本发明的细胞可以在用替代性抗癌免疫治疗(包括但不限于CAR T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞或检查点抑制剂)治疗之前作为预治疗或调节来给予。
自身免疫性疾病的实例包括但不限于，获得性免疫缺陷综合征(AIDS，其为具有自身免疫成分的病毒性疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性Addison病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病(Behcet's disease)、心肌病、腹腔口炎性腹泻-疱疹样皮炎(celiac sprue-dermatitis hepetiformis)、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、crest综合征、克罗恩氏病、德戈斯病、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖性糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯蒂尔病)、幼年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合性结缔组织疾病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血(pernacious anemia)、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏现象、瑞特氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性全身性硬化(PSS)，也称作全身性硬化(SS))、Sjogren综合征、僵人综合征、全身性红斑狼疮、Takayasu动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。
该细胞也可以用来治疗炎性疾病。炎性疾病的实例包括但不限于慢性和急性炎症性疾病。炎性疾病的实例包括阿尔茨海默氏病、哮喘、特应性过敏、过敏、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、脓毒症、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病和呼吸机引起的肺损伤。
本发明的细胞可以用于治疗癌症。癌症包括没有血管化或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体肿瘤(如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或可以包括实体肿瘤。用本发明的细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤、以及某些白血病或淋巴恶性病、良性和恶性肿瘤、和恶性病(malignancy)，例如肉瘤、癌和黑素瘤。还包括成年人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也被包括在内。
实体肿瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体肿瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成其的细胞类型命名(如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体肿瘤(如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性病、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、Wilms肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannoma)、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、menangioma、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液(或血原性)癌症的实例包括白血病——包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓原性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓原性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良。
本发明的细胞可以以在适当临床前和临床实验和试验中确定的剂量和途径以及次数给予。细胞组合物可以以这些范围内的剂量多次给予。本发明细胞的给予可以与本领域技术人员所确定的可用于治疗期望疾病或状况的其它方法组合。
待给予的本发明细胞可以相对于治疗进行的对象是自体的、同种异体的或异种的。
本发明细胞的给予可以以本领域技术人员已知的任何便利方式进行。本发明的细胞可以通过气雾吸入、注射、摄入、转输、植入或移植被给予对象。本文所述的组合物可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内来给予。在其它情况下，本发明的细胞被直接注射到对象的炎症部位、对象的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤和类似位置中。
药物组合物
本发明的药物组合物可以包含本文所述的细胞——与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸缓冲盐水和类似物；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选被配制用于静脉内给予。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)疾病的方式被给予。给药的数量和频率将通过诸如患者状况和患者疾病类型和严重程度的因素确定，尽管适当的剂量可通过临床试验确定。
当表示“免疫有效量”、“抗免疫应答有效量”、“免疫应答抑制有效量”或“治疗量”时，待给予的本发明组合物的确切量可以由医师考虑患者(对象)的年龄、体重、免疫应答和状况的个体差异来确定。总体上可以说，包含本文所述细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，优选105至106个细胞/kg体重——包括这些范围内的所有整数值——的剂量被给予。本文所述的细胞组合物还可以以这些剂量被多次给予。细胞可以通过使用在免疫治疗中公知的输注技术来给予(参见例如Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可以容易被医药领域的技术人员通过监测患者的疾病征兆和相应地调整治疗而确定。
在某些实施方式中，可期望向对象给予单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞，然后随后根据本发明重新抽取血液(或进行血液析离术)，活化来自其中的单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞，并且对再输注患者以这些活化的细胞。此过程可以每几周多次进行。在某些实施方式中，细胞可以由10ml至400ml的抽血活化。在某些实施方式中，细胞由20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml的抽血活化。不受理论束缚，利用这种多次抽血/多次再输注方案，可以选择出特定的细胞群。
在本发明的某些实施方式中，细胞被利用本文所述的方法或本领域已知的其它方法修饰，其中细胞被扩增至治疗水平，结合(例如，在前、同时或在后)任何数量的相关治疗模式被给予患者，该相关治疗模式包括但不限于药剂治疗，如抗病毒疗法、西多福韦(cidofovir)和白介素-2、阿糖胞苷(Cytarabine)(也称为ARA-C)或那他珠单抗(natalizumab)治疗——用于MS患者——或用于PML患者的治疗。在进一步的实施方式中，本发明的细胞可以与CART细胞疗法、化学疗法、放射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫烧蚀剂(immunoablative agent)如抗CD52抗体阿仑珠单抗(alemtuzumab)(CAM PATH)、抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素(cytoxin)、氟达拉宾(fludaribine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐照组合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶神经钙蛋白(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu et al.,Cell 66:807-815,1991；Henderson et al.,Immun.73:316-321,1991；Bierer et al.,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物结合(例如，在前、同时或在后)下列被给予患者：骨髓移植、淋巴细胞烧蚀治疗——利用化学治疗剂如氟达拉滨、外束放射治疗(XRT)、环磷酰胺，Rituxan或抗体如OKT3或CAMPATH。例如，在一个实施方式中，对象可经受高剂量化学疗法然后外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施方式中，在移植之后，对象接受本发明细胞的输注。在另外的实施方式中，细胞可以在手术之前或之后被给予。
待给予对象的上述治疗的剂量将随待治疗状况和治疗接受者的确切属性而相异。对人给予的剂量缩放(scaling)可以根据本领域接受的实践进行。例如，对于成年患者，CAMPATH的剂量总体上在1至约100mg的范围内，通常每天给予，给予1至30天的时间。优选的日剂量为每天1至10mg，尽管在一些情况下可以采用每天上至40mg的较大剂量(描述于美国专利号6,120,766)。
应该理解，可用于本发明的方法和组合物不限于实施例中提出的具体制剂。下文实施例的提出是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的细胞、扩增和培养方法以及治疗方法的完整公开和描述，而不旨在限制发明人视为其发明的范围。
除非另有说明，本发明的实践利用了分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都充分处于技术人员的知识范围内。这样的技术在文献中被充分解释，如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,fourth edition(Sambrook,2012)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“Culture of AnimalCells”(Freshney,2010)；“Methods in Enzymology”“Handbook of ExperimentalImmunology”(Weir,1997)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller andCalos,1987)；“Short Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,2002)；“PolymeraseChain Reaction:Principles,Applications and Troubleshooting”,(Babar,2011)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan,2002)。这些技术适用于生成本发明的多核苷酸和多肽，并且因此可以在制造和实践本发明时考虑。下文部分将讨论特别有效用于具体实施方式的技术。
实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不意图进行限制，除非另有说明。因此，本发明绝不应被解释为受限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而显而易见的任何和所有改动。
无进一步描述时，认为本领域的普通技术人员能够利用前文描述和下文示例性实施例来制备和应用本发明的化合物以及实践请求保护的方法。因此，下文工作实施例具体地指出了本发明的优选实施方式，而不被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
现对这些实验中使用的材料和方法进行描述。
细胞培养：将THP1、K562、SKOV3、SKBR3、HDLM2、MD468和所有细胞系在补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI 1640中在37℃、5％CO2下培养。通过mRFP+细胞系的慢病毒转导和FACS纯化而生成THP1 mRFP+亚系(Wt)。利用THP1 mRFP+亚系生成THP1 mRFP+CAR19z+(CAR19z；CARMA19z)、THP1 mRFP+CAR19Δz+(CAR19Δz；CARMA19Δz)、THP1 mRFP+MesoZ+和THP1 mRFP+CARHer2z+(CARHer2z；CARMAHer2z)亚系。通过在培养基中用1ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯培养细胞48小时，诱导单核细胞分化。
原生人巨噬细胞：利用Miltenyi CD14 MicroBeads(Miltenyi,130-050-201)从正常供体血液析离术产物纯化原生人单核细胞。将单核细胞在MACS GMP细胞分化袋(Miltenyi,170-076-400)中，在补充有5％人AB血清的X-Vivo培养基或补充有10％胎牛血清、青霉素/链霉素、glutamax和10ng/mL重组人GM-CSF(PeproTech,300-03)的RPMI 1640中培养7天。在第7天收获巨噬细胞，并将其在FBS+10％DMSO中冷冻保存，待后续使用。
吞噬试验：以1ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯使Wt或CARMA mRFP+THP1亚系分化48小时。将GFP+抗原负载肿瘤亚系，即K562 CD19+GFP+细胞，在PMA冲洗后以1:1的比例加入分化的THP1巨噬细胞。将巨噬细胞与靶肿瘤细胞共培养4小时，并利用EVOS FL自动细胞成像系统通过荧光显微术定量吞噬。三个视野的平均值被认为是n，并且所有情况都一式三份定量。在BD LSR-Fortessa上分析基于FACS的吞噬。利用FlowJo(Treestar,Inc.)分析流式细胞术数据。活体单线态门控的(live,singlets gated)mRFP/GFP双阳性事件被认为是吞噬。通过在指定浓度的共培养开始时添加阻断性单克隆抗体(小鼠抗人CD47克隆B6H12，eBioscience#14-0479-82；小鼠抗人CD47克隆2D3作为阴性对照，eBioscience#14-0478-82；小鼠抗人SIRPα克隆SE5A5，BioLegend#323802)，进行CD47/SIRPα轴阻断。通过在共培养时添加TLR1-9激动剂(人TLR1-9激动剂试剂盒；Invivogen#tlrl-kit1hw)，进行TLR共刺激。
体外杀伤试验：在不同的效应物与靶标的比例下(始于30：1，并以三倍稀释减少)，将Wt或CAR负载巨噬细胞与抗原负载型或对照叩头虫绿色荧光素酶(CBG)/绿色荧光蛋白(GFP)阳性靶肿瘤细胞共培养。使用IVIS光谱成像系统(Perkin Elmer)，利用生物发光成像来确定肿瘤负荷。特异性溶解百分比如下计算：
％特异性溶解＝((经处理的孔-仅肿瘤的孔)/(最大杀伤-仅肿瘤的孔)*100)
延时显微术：CAR介导的吞噬的荧光延时视频显微术利用EVOS FL自动细胞成像系统进行。每40秒捕获图像，捕获18小时。用FIJI成像软件进行图像分析。
慢病毒的产生和转染：通过GeneArt(Life Technologies)从头合成嵌合抗原受体构建体，并将其如前所述将其克隆到慢病毒载体中。如前所述利用HEK293T细胞产生浓集的慢病毒。
腺病毒的生产和转染：按照标准分子生物学程序生成并滴定在CMV启动子下编码GFP、CAR或不编码转基因的Ad5f35嵌合腺病毒载体。将原生人巨噬细胞以不同的感染倍数转导，并利用EVOS FL自动细胞成像系统连续成像，以获得GFP表达和活力。通过利用His-标记的抗原和抗His-APC二级抗体(R&D Biosystems Clone AD1.1.10)进行的表面CAR表达的FACS分析，评估CAR表达。
流式细胞术：在BD LSR Fortessa上进行FACS。用生物素化蛋白L(GenScriptM00097)和抗生蛋白链菌素APC(BioLegend，#405207)或His-标记的抗原和抗-His-APC二级抗体(R&D Biosystems Clone AD1.1.10)检测表面CAR表达。在染色之前用人Trustain FcX(BioLegend，#422301)阻断Fc受体。以小鼠IgG1κAPC同种型对照用于背景确定，利用小鼠抗人CD47 APC(eBioscience#17-0479-41)，来确定CD47表达。利用小鼠抗钙网织蛋白PE克隆FMC75(Abcam#ab83220)确定钙网织蛋白表达。所有流式结果都基于活体(Live/Dead AquaFixable Dead Cell Stain,Life Technologies L34957)单个细胞进行门控。
Imagestream细胞术：在ImageStream Mark II成像流式细胞仪(EMD Millipore)上进行FACS和单个细胞荧光成像。简言之，在固定和ImageStream数据采集之前，将mRFP+或DiI染色的巨噬细胞(CAR或对照)与GFP+肿瘤细胞共培养4小时。利用ImageStream软件(EMDMillipore)分析数据。
RNA电穿孔：利用标准分子生物学技术，在T7启动子控制下将CAR构建体克隆到体外转录质粒中。利用mMessage mMachine T7 Ultra体外转录试剂盒(Thermo Fisher)，将CAR mRNA体外转录，用RNEasy RNA纯化试剂盒(Qiagen)纯化，和用BTX ECM850电穿孔仪(BTX Harvard Apparatus)电穿孔到人巨噬细胞中。利用FACS分析测定电穿孔后不同时间点的CAR表达。
TLR/Dectin-1预处理：体外吞噬或杀伤试验之前在Wt或CAR巨噬细胞中的TLR或Dectin-1预处理通过如下进行：在共培养之前，将细胞分别与推荐剂量的TLR 1-9激动剂(人TLR1-9激动剂试剂盒，Invivogen)或β-葡聚糖(MP Biomedicals，LLC)预培育30分钟。在未预处理情况和预处理情况之间比较Wt或CAR巨噬细胞的体外作用。
巨噬细胞/单核细胞表型：以下表面标志物作为巨噬细胞/单核细胞免疫表型FACS套组的一部分被评估，以获得M1/M2区分：CD80、CD86、CD163、CD206、CD11B、HLA-DR、HLA-A/B/C、PDL1、和PDL2(BioLegend)。TruStain FcX用于免疫染色之前的Fc受体阻断。在表型评估之前，巨噬细胞/单核细胞暴露于或不暴露于活化条件，即48小时Ad5f35转导。
海马试验：利用海马试验(Seahorse XF，Agilent)确定巨噬细胞的代谢表型和氧消耗。在分析前使对照或CAR巨噬细胞暴露于培养基对照或免疫抑制细胞因子24小时。贯穿整个海马试验，细胞相继用寡霉素(oligomycin)、FCCP和鱼藤酮(retenone)处理。试验每个条件6次重复进行。
体内试验：将NOD-scid IL2Rg-null-IL3/GM/SF、NSG-SGM3(NSGS)小鼠用于人异种移植模型。对植入以CBG-萤光素酶阳性人SKOV3卵巢癌细胞的小鼠或者不进行处理，或者用不同剂量的未转导的、空白Ad5f35转导的或Ad5f35 CAR-HER2转导的人巨噬细胞进行处理。进行串联生物发光成像以监测肿瘤负荷(IVIS Spectrum，Perkin Elmer)。处死后收获器官和肿瘤用于FACS分析。利用Kaplan-Meier分析来监测和比较总体存活。
现描述实验结果。
图1A是嵌合抗原受体(CAR)的示意图，该嵌合抗原受体(CAR)由如下基因/基因-产物构成：该基因/基因-产物含有具有靶向功能的细胞外结构域、铰链结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域(一个或多个)、和/或用于可被分泌或不可被分泌的另外的基因产物的化学计量共表达的2A(P2A、T2A)，该另外的基因产物包括任何基因/转录物/蛋白质，包括但不限于细胞因子、单克隆抗体、抗体片段、单链可变片段、酶、另外的受体、显性负性受体、肿瘤相关抗原(一种或多种)、以及其任何组合。另外，CAR构建体可以包括CRISPR/Cas9基因编辑物的共递送，或者被引入CRISPR/Cas9预编辑细胞的环境中。CAR构建体的具体实例在图1B中被建模，包括CARMA-ζ、CARMA-γ和CARMA-Dectin，其分别包含抗原特异性scFv、CD8铰链、CD8跨膜、和CD3ζ、FcεRI通用γ亚单位、或Dectin-1的细胞内结构域。
图2A是显示在慢病毒转导后在髓样细胞表面上表达的CAR19z的图。CAR19z慢病毒以三倍稀释滴定，并用于转导1e5/0.1mL mRFP+THP1细胞。mRFP是通过髓样细胞系THP1的慢病毒转导而表达的报告基因(红色荧光蛋白)。这些细胞在暴露于化学PMA后可被诱导以分化成巨噬细胞。THP1细胞在转导后24小时被收获，并用生物素化的蛋白L然后抗生蛋白链菌素-APC染色，以获得CAR表面表达。转导后的THP1细胞被扩增和通过FACS分选以生成100％CAR19z阳性mRFP+THP1亚系(图2B)。图2C显示在THP1巨噬细胞上抗CD19、抗HER2和抗间皮素慢病毒CAR构建体的表达，其中CAR(+)事件在右上象限中。
图3A是显示利用THP1巨噬细胞模型进行的CARMA亚系生成，以1ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)进行的分化和体外吞噬试验的概况的流程图。抗-CD19、抗HER2和抗间皮素CAR巨噬细胞(而野生型(Wt)巨噬细胞则否)分别吞噬表达CD19、HER2或间皮素的吞噬的K562肿瘤细胞，如通过基于荧光显微术的吞噬试验证明(图3B-3D)。CARMA肿瘤吞噬通过基于流式细胞术的试验被进一步验证，其中将抗CD19的mRFP+CARMA与CD19+GFP+K562细胞一起共培养，并定量双阳性事件(显示代表性FACS作图——图3E)。显示了在CARMA吞噬功能列表中使用的标准10x视野，单独mRFP(图3F)或覆盖(图3G)。基于FACS的mRFP/GFP双阳性事件被定义为吞噬事件，并且如此通过Amnis Imagestream FACS分析验证。所示事件基于双阳性事件被门控，并通过Amnis Imagestream吞噬-侵蚀算法从高到低排序(图3H)。THP-1细胞系模型中通过mRFP+CARMA对肿瘤细胞的吞噬通过共聚焦显微术被进一步证明，证实GFP+肿瘤细胞通过三维共焦z型堆叠重建已经被完全封闭在吞噬体内(图3I)。图3J显示单个CARMA细胞随时间推移的遭遇——其中接触和免疫突触形成是第一步，导致吞噬细胞吞食、用GFP损失作为细胞死亡标志的肿瘤降解、吞噬体分解、和吞噬体修复——证明了CARMA在肿瘤细胞吞噬后存活。图3K显示了CARMA一次吞噬多个肿瘤细胞的能力。
利用针对CD19+(靶标)或CD19-(对照)GFP+K562肿瘤细胞的体外吞噬试验，测试抗CD19 CAR巨噬细胞。证明CARMA的抗原特异性的是，只有抗原负载肿瘤细胞被吞噬(图4A)。为了证明CARMA功能对细胞内信号传导结构域的需要，使用CAR19-Δζ构建体(其缺少细胞内信号传导结构域)。CAR19-Δζ巨噬细胞不能吞噬肿瘤细胞，并且通过体外基于萤光素酶的特异性溶解试验，具有显著降低的抗肿瘤功能(图4B和4C)。在R406(Syk抑制剂)、细胞松弛素D(肌动蛋白聚合抑制剂)或blebbistatin(非肌肉性肌球蛋白IIA抑制剂)存在下进行体外CARMA吞噬试验。R406、细胞松弛素D和blebbistatin独立地根除了CARMA的吞噬功能，表明巨噬细胞中的CAR信号传导是Syk依赖性的并导致肌动蛋白聚合和NMIIA介导的吞噬功能(图4D-4F)。
图5A是显示相对于同种型对照，靶肿瘤细胞系上的CD47表达的流式细胞术图。在这些实验中使用了K562和K562-CD19+(K19)，两者都是高CD47表达细胞系。
图5B是显示添加抗CD47单克隆抗体选择性地增强CAR(但不增强Wt)巨噬细胞介导的靶抗原负载肿瘤细胞吞噬的图。Wt或CAR19ζ巨噬细胞与CD19+K562肿瘤细胞，与0、0.01、0.10、1.00或10.0mcg/mL的抗CD47单克隆抗体一起被培育。
图5C是显示添加抗SIRPα单克隆抗体选择性地增强CAR(但不增强Wt)巨噬细胞介导的靶抗原负载肿瘤细胞吞噬的图。Wt或CAR19ζ巨噬细胞与CD19+K562肿瘤细胞，与0、0.01、0.10、1.00或10.0mcg/mL的抗SIRPα单克隆抗体一起被培育。
图5D是证明用抗SIRPα单克隆抗体阻断CD47/SIRPα轴增强CAR巨噬细胞的多吞噬性(定义为一次吞食2个或更多个肿瘤细胞的巨噬细胞)的图。
为了控制CD47/SIRPα阻断单克隆抗体的增加的调理作用，在体外吞噬试验中使用结合CD47但不阻断CD47到达SIRPα结合位点的对照抗CD47单克隆抗体(克隆2D3)。只有阻断该结合位点的克隆(抗CD47，克隆B6H12)或SIRPα受体的阻断会直接导致CARMA肿瘤吞噬增强(图5E)。
为了测试CAR巨噬细胞上的CD47/SIRPα轴的阻断是否导致抗原特异性丧失，在抗CD47或抗SIRPα单克隆抗体存在下进行针对抗原阴性(CD19阴性)肿瘤细胞的体外吞噬，并且没有可观察到的吞噬(图5F)。
通过敲除THP1巨噬细胞上的SIRPα受体和比较在不存在或存在SIRPα抗体的情况下CARMA或SIRPα-KO CARMA的肿瘤吞噬，测试CARMA吞噬增强在SIRPα阻断单克隆抗体存在下的特异性。CRISPR/Cas9用于SIRPα删除，并且在功能测定之前对细胞进行SIRPα阴性分选。敲除SIRPα增强了CARMA功能，并且将抗SIRPα添加回到敲除后的细胞中不能进一步增强吞噬(图5G)。
图6A显示以剂量依赖性方式，在48小时时，在体外基于萤光素酶的杀伤试验中，通过CAR19ζCARMA(而非Wt)巨噬细胞(利用THP-1巨噬细胞模型)导致的CD19+GFP+萤光素酶+K562细胞的特异性溶解。
图6B是显示以剂量依赖性方式，在48小时时，在体外基于萤光素酶的杀伤试验中，通过CAR19ζ或Wt THP-1单核细胞(未分化，因此是单核细胞而非巨噬细胞的模型)导致的肿瘤细胞的特异性溶解的图。
图6C是显示在不存在或存在10mcg/mL抗SIRPα单克隆抗体的情况下，在与Wt或CAR19ζ巨噬细胞体外48小时共培养后，源自萤光素酶阳性CD19+K562肿瘤细胞的、萤光素酶驱动性生物发光的一组图像。图6D是显示Wt或CAR19ζ巨噬细胞+/-抗SIRPα单克隆抗体的特异性溶解的图。
具有FcεRI通用γ(CAR19γ、CARMA19γ)亚单位细胞内结构域的CAR构建体被生成，封装到慢病毒中，并用于在三倍连续病毒稀释中转导THP-1髓样细胞。CAR19γ在THP-1巨噬细胞上被表达(图7A)。
CAR19γ巨噬细胞或CAR19ζ巨噬细胞被100％CAR阳性分选，并用于体外功能表征。CAR19ζ和CAR19γ巨噬细胞都吞噬CD19+肿瘤细胞，并且都显示与通过加入抗SIRPα单克隆抗体而导致的CD47/SIRPα轴阻断的协同作用(图7B)。
R406 Syk抑制体外吞噬试验中证明，CAR19ζ和CAR19γ巨噬细胞都通过Syk进行信号传导以驱动肿瘤吞噬(图7C)。
在各种E：T比下，在共培养24小时后，在体外基于萤光素酶的特异性溶解试验中CAR19ζ和CAR19γTHP1巨噬细胞均(而Wt THP1巨噬细胞则否)有效杀死CD19+肿瘤细胞(图7D)。
作为先天性免疫系统的白血细胞，巨噬细胞通过组成型表达的病原体识别受体对感染的保守分子信号如病原体相关分子模式做出响应。Toll样受体是表征最充分的病原体识别受体，并且已知其激活巨噬细胞。
为了增强CARMA的肿瘤吞噬功能，利用独立地以TLR1-9配体或介质对照预处理的CAR巨噬细胞，进行体外吞噬试验。TLR1、2、4、5和6的配体增强了CARMA的吞噬功能(图8A)。这表明TLR配体可在生产过程中被用于预处理CARMA，或者TLR信号传导结构域可以被编码到CAR构建体中以增大CAR信号传导和下游效应作用——作为新的二代/后代CARMA构建体。
图8B和8C显示增强或不增强肿瘤细胞的CARMA吞噬的TLR配体之间的差异在宽范围的TLR3或TLR6配体浓度内都存在。
β-葡聚糖(酵母产物)与巨噬细胞表面上的Dectin-1结合并导致激活和效应功能。为了测试β-葡聚糖增强CARMA功能的能力，在不存在或存在5mcg/mLβ-葡聚糖的情况下进行体外肿瘤吞噬试验。β-葡聚糖增强CAR(而不增强Wt)巨噬细胞的吞噬能力(图9A)。
为了测试β-葡聚糖增强CARMA肿瘤杀伤的能力，在存在0、0.5、5或50mcg/mLβ-葡聚糖的情况下，在各种E：T比下进行体外基于萤光素酶的特异性溶解试验。β-葡聚糖增强通过CAR(而不增强通过Wt)THP-1巨噬细胞导致的抗原负载肿瘤细胞的特异性溶解(图9B)。这些结果表明可以将β-葡聚糖用作CARMA制备过程中的佐剂，或者可以将Dectin-1细胞内信号传导结构域编码到CAR转基因中。
鉴于β-葡聚糖增强CARMA的功能，生成由Dectin-1细胞内信号传导结构域构成的CAR构建体(图10A)。这些构建体被封装到慢病毒中，并用于在三倍连续稀释的慢病毒滴定度下转导THP-1髓样细胞。在CD8TM-Dectin1 CAR和DectinTM-Dectin1 CAR构建体中，在表面上检测到CAR(图10B和10C)。将细胞进行100％阳性分选，并用于下游体外功能实验。
在体外萤光素酶杀伤试验中测试了CD8TM-Dectin1 CAR和DectinTM-Dectin1 CAR巨噬细胞。两种构建体均显示了肿瘤细胞的特异性溶解(图10D)。
针对K562(对照)或K19(靶标)肿瘤细胞，在体外肿瘤吞噬试验中测试了Dectin1-CAR巨噬细胞，并且Dectin1-CAR巨噬细胞选择性地吞噬了负载同源抗原的肿瘤细胞(图10E)。Dectin-1 CAR巨噬细胞显示了吞噬多种肿瘤细胞的能力(图10F)。
在体外肿瘤吞噬试验中，Dectin1-CAR巨噬细胞显示了与SIRPα阻断或与TLR配体预处理的协同作用(图10G)。
图11A是显示相对于同种型对照，三种不同CD19+靶细胞系中钙网织蛋白水平的图。图11B是显示三种不同CD 19+靶细胞系中钙网织蛋白表达的标准化平均荧光强度的图。
图11C是显示低水平钙网织蛋白适度保护靶细胞(特别是Nalm6和JEKO细胞系)免受CAR19z巨噬细胞吞噬的图。这些数据表明，钙网织蛋白沉积/诱导的开发利用可以用作另外的手段以增加CARMA效应功能。
为了验证和测试CAR在原生人单核细胞源巨噬细胞中的作用，测试了几种基因递送方法。在图12A中，抗HER2 CAR构建体被克隆到mRNA表达质粒中，体外转录，并且mRNA被直接电穿孔到原生人单核细胞中。图13A显示了相对于模仿物电穿孔的细胞的门控策略、活力和84.3％的转染效率。图12B显示了抗HER2 CAR mRNA电穿孔到原生人单核细胞源巨噬细胞(充分分化)中的效率在79.7％。
图12C是显示下列的图：虽然mRNA电穿孔导致单核细胞和巨噬细胞的高CAR转染效率，但CAR表达因mRNA降解而是短暂的，在体外电穿孔后第2天达到峰值并到第7天消失。
NSGS小鼠通过IP注射被注射以1E6 SKOV3 CBG/GFP+人卵巢癌细胞(HER2+卵巢癌的转移性腹膜内癌扩散的模型)。小鼠被共同注射以模仿物电穿孔的或抗HER2 CAR mRNA电穿孔的原生人单核细胞或原生人巨噬细胞(1:1的E:T比)，并对肿瘤负荷成像。CAR巨噬细胞(图13A)和CAR单核细胞(图13B)显示经过约两周的肿瘤生长边际减少。肿瘤负荷被生物发光定量的第一个时间点是治疗后24小时，表明CAR单核细胞和巨噬细胞在该第一个24小时内具有活性。
使用多种CAR构建体测试了CAR转基因至原生人单核细胞源巨噬细胞的慢病毒递送。在图14A中，CAR19通过慢病毒转导被递送至人巨噬细胞，在对照vs CAR19慢病毒(MOI10)组中显示4.27％和38.9％的转导效率。显示了FACS门控策略。
图14B是代表性FACS作图，显示原生人巨噬细胞中抗HER2 CAR的表达，其中在对照和MOI 10CAR LV条件之间转导效率分别为1.47％和18.1％。
通过使CD14+选择的细胞(来自正常供体血液析离术产物)在GM-CSF条件培养基中分化7天而生成了单核细胞源巨噬细胞。为了优化通过慢病毒转导进行的CAR递送，在单核细胞至巨噬细胞分化过程的不同时间点利用抗CD19和抗HER2慢病毒转导巨噬细胞。对于抗CD19和抗HER2 CAR构建体，转导效率均在转导中点(第4天)达到峰值(图15A和15B)。将抗CD19 CAR原生人巨噬细胞用于针对CD19+GFP+K562肿瘤细胞的基于体外基于FACS的吞噬试验，其中CD11b+/GFP+事件被定义为吞噬事件。在此试验中使用如图15A中的不同时间点转导的巨噬细胞。图15C显示吞噬效力趋势顺应CAR转导效率的一系列图，在分化过程中第4天转导的巨噬细胞为峰值。
考虑到mRNA电穿孔是短暂的并且慢病毒仅适度有效且需要高滴度，测试将转基因递送至原生人巨噬细胞的可选转导方法。腺病毒(重组型，复制缺陷型)被确定为原生人巨噬细胞转导的有效方法。测试原生人巨噬细胞上，相对于同种型对照，Coxackie腺病毒受体(Ad5的停靠蛋白)和CD46(Ad35的停靠蛋白)的表达，并且CD46(但Coxackie腺病毒受体则否)被高度表达(图16A)。因此，嵌合Ad5f35腺病毒被用于原生人巨噬细胞转导，并且通过标准分子生物学技术被改造以表达抗HER2的嵌合抗原受体(GFP和空白Ad5f35病毒用作对照)。
图16B显示了在1000的MOI下Ad5f35将转基因(GFP用作模型转基因)有效递送到人巨噬细胞中，并且通过在IVIS光谱上的GFP信号定量监测到，表达随着时间推移而走高。图16C比较了在跨越上至10,000的MOI宽范围的不同时间点的原生人巨噬细胞的转导动力学在上至10,000的广泛范围的MOI中不同时间点的原生人巨噬细胞的转导动力学。
图16C显示在宽范围的病毒MOI下，在转导后48小时，Ad5f35转导的人巨噬细胞上的抗HER2 CAR表达的一系列代表性FACS作图。
图16D显示Ad5f35-GFP转导的原生人巨噬细胞的代表性荧光显微术图像，其中最高转导效率显示在MOI为1000时。
通过FACS分析在体外吞噬试验中测试了原生人CARMA。巨噬细胞(未转导，或抗HER2 CAR)在与GFP+SKOV3卵巢癌细胞共培养之前用DiI染色。通过DiI/GFP双阳性事件定义的吞噬被测量在CAR组中处于26.6％的水平，并且在对照组中处于4.55％的水平(图17A)。为了验证DiI/GFP双阳性事件是吞噬事件并且不是双联体，细胞松弛素D(吞噬抑制剂)被添加到实验组中，并且充分根除CAR介导的吞噬以降至1.74％。为了进一步验证原生人CAR巨噬细胞能够吞噬肿瘤细胞，双阳性事件通过Amnis Imagestream FACS被门控，并且通过Amnis吞噬-侵蚀算法被从高到低排序，视觉上证明这些双阳性事件代表了吞噬(图17B)。此外，Dil染色的CAR-HER2巨噬细胞与SKOV3-GFP一起被共培养，并通过共焦显微镜成像，并且吞噬得到了验证。
利用单核细胞源巨噬细胞的Ad5f35-CAR转导，生成了抗HER2 CAR原生人巨噬细胞。这些细胞(或对照未转导细胞)用作SKBR3人乳腺癌细胞的体外基于FACS的吞噬试验中的效应物。图18证明了CAR(但UTD则否)人巨噬细胞吞噬了乳腺癌细胞。此外，抗SIRPα单克隆抗体的添加增强了CARMA(但不增强UTD巨噬细胞)对乳腺癌细胞的吞噬。这些结果证明，THP-1模型中观察到的CD47/SIRPα轴阻断与CARMA之间的协同作用平移到了原生人巨噬细胞研究。
巨噬细胞是先天免疫系统的白血细胞，因此具有前哨(sentinel)抗微生物特性。为了证明CAR巨噬细胞在抗微生物意义上仍然是有作用的先天免疫细胞，并且没有丧失对感染性刺激做出响应的能力，在基于FACS的大肠杆菌吞噬试验中使用了对照未转导型或CAR巨噬细胞。图19是代表性FACS作图，显示CARMA呈现pH-Rodo Green大肠杆菌颗粒的完整吞噬。
原生人抗HER 2CARMA在体外基于萤光素酶的杀伤试验中作为效应细胞被测试。在共培养48小时后，抗HER2 CARMA(但对照UTD巨噬细胞则否)导致HER2+K562细胞(但缺少HER2表达的对照K562细胞则否)特异性溶解(图20A)。为了证明CARMA杀伤可以在生理水平上平移到表达HER2的肿瘤细胞(与通过慢病毒转导以过表达HER2的K562-HER2相反)，SKBR3乳腺癌细胞和SKOV3卵巢癌细胞被用作靶标。CARMA(但对照UTD或对照空白Ad5f35转导的巨噬细胞则否)在共培养48小时后对两种模型均具有显著的抗肿瘤活性(图20B和20C)。为了在杀伤试验中测试CD47/SIRPα轴阻断之间的协同作用，将SKOV3卵巢癌细胞与培养基、对照未转导的巨噬细胞、抗HER2 CARMA、抗HER2 CARMA+抗CD47 mAB(10mcg/mL)或抗HER2 CARMA+抗SIRPα(10mcg/mL)共培养，并连续测量萤光素酶信号。CARMA导致到第13天完全肿瘤根除，而在阻断CD47/SIRPα轴存在的情况下，肿瘤根除的动力学甚至更快(图20D)。在THP-1巨噬细胞CARMA模型中证实的与β-葡聚糖的协同作用在相似的实验中被测试，并且CARMA的β-葡聚糖预处理导致增强的肿瘤杀伤动力学(图20E)。CARMA暴露于LPS(TLR-4配体)或Poly-IC(TLR-3配体)导致抗肿瘤效果的调节(图20F)。
通过图20A-20F中的萤光素酶试验证明了原生人CARMA体外清除肿瘤的能力。为了验证这些结果，将GFP+SKOV3卵巢癌细胞与对照UTD巨噬细胞、对照UTD巨噬细胞+10mcg/mL曲妥珠单抗、对照空白Ad5f35病毒转导的巨噬细胞或抗HER2原生人CARMA共培养。CARMA(但对照条件则否)能够清除肿瘤细胞(图21)。
巨噬细胞是能够接受不同功能特征的表型塑性细胞，通常被分为M1和M2巨噬细胞分类——其中M1是炎性/活化的，并且M2是免疫抑制性/促进肿瘤的。在用Ad5f35 CAR病毒转导原生人巨噬细胞后48小时，通过FACS测量到M1标志物CD80/CD86的剂量依赖性上调和M2标志物CD163的剂量依赖性下调(图22A)。为了测试这种效果是CAR表达还是Ad5f35转导的结果，对巨噬细胞不转导、以空白Ad5f35转导，或以抗HER2Ad5f35转导，并且空白/CARAd5f35显示了相同的表型转变模式(图22B)。
实体肿瘤微环境是总体上免疫抑制性的，并可导致巨噬细胞极化至M2状态。为了测试CARMA(其由于病毒转导而M1极化)是否对免疫抑制性细胞因子介导的M2下转具有抗性，使对照未转导型或抗HER2 CAR人巨噬细胞，在与SKOV3卵巢癌细胞共培养之前，暴露于IL-4、IL-10或IL-13以24小时。用抑制性细胞因子处理的对照UTD巨噬细胞导致肿瘤生长增强，而暴露于抑制性细胞因子的CARMA在基于萤光素酶的体外特异性溶解试验中在48小时时维持其杀伤活性(图22C)。
为了进一步测试人CAR巨噬细胞对免疫抑制的抵抗，使对照UTD、空白Ad5f35或抗HER2 CAR Ad5f35转导的巨噬细胞暴露于10ng/mL的IL-4(典型M2诱导细胞因子)或此前显示使巨噬细胞在共培养期间下转成M2的癌细胞(SKOV3，卵巢癌细胞系；HDLM2，霍奇金淋巴瘤细胞系)。对照UTD巨噬细胞上调了CD206(通过STAT6磷酸化对IL-4做出刺激特异性响应的M2标志物)。空白Ad5f35，更甚者CAR-Ad5f35转导的巨噬细胞，显示了对IL-4和肿瘤诱导的M2表型下转的抗性(图22D)。
为了进一步表征CAR巨噬细胞的表型，利用海马试验测量氧消耗以探测代谢表型。M2巨噬细胞的基础氧消耗速率高于M0或M1巨噬细胞，因为ATP产生对氧化磷酸化的依赖性更高。使对照UTD或抗HER2 CAR巨噬细胞暴露于IL-4以24小时以极化成M2(或否)，并测量氧消耗速率。对照UTD巨噬细胞显示了M2巨噬细胞的特征性的增加的基础氧消耗特征，而CARMA对IL-4未做响应，表明其对M2下转具有抗性(图22E)。这些数据利用表型、代谢和功能试验结合说明，CARMA抵抗M2下转。
在0(UTD)至1000范围内的MOI下，用Ad5f35-CAR-HER2转导了原生人正常供体单核细胞(通过CD14阳性选择而纯化)。在转导后48小时通过FACS测量CAR表达。通过Ad5f35有效生成CAR单核细胞，并且表达在1000的MOI下达到峰值(图23A和23B)。在上至1000的MOI下，单核细胞保持高活力(通过FACS Live/Dead Aqua分析测量)(图23C)。通过FACS所分析，CAR(但未转导型(UTD)则否)人单核细胞上调了M1活化标志物(图23D)和下调了M2标志物(图23E)，证实了在转导后48小时的M1单核细胞表型。
通过在一定范围的效应物：靶标(E:T)比例下的体外基于萤光素酶的杀伤试验，评估了抗HER2 CAR单核细胞杀伤。在体外将未转导型(UTD)或CAR-HER2-ζ(CAR)单核细胞与HER2+SKBR3(人乳腺癌)或HER2+SKOV3(人卵巢癌)细胞共培养。计算和确定共培养开始后24、48和96小时时的特异性溶解。CAR(但UTD则否)单核细胞在体外溶解乳腺癌和卵巢癌细胞(图24A和24B)。
NOD-scid IL2Rg-null-IL3/GM/SF、NSG-SGM3(NSGS)小鼠被用于在体内建模人HER2(+)卵巢癌异种移植物。在第0天，对小鼠腹膜内(IP)注射以7.5E5叩头虫绿色萤光素酶(CBG luc)阳性/绿色荧光蛋白(GFP)阳性SKOV3卵巢癌细胞——作为腹膜内癌扩散的模型，实体恶性病的侵袭性固有转移性模型。小鼠未经处理(仅肿瘤)，或者在第0天通过IP注射被注射以单剂量的4E6未转导型或CAR-HER2(CARMA)人巨噬细胞(示意图，图25A)。利用生物发光(总通量；光子/秒)作为肿瘤负荷代表，对小鼠进行连续成像。接受CARMA处理的小鼠的肿瘤负荷减少约两个数量级(图25B和25C)。相对于未处理的或UTD巨噬细胞处理的小鼠，以CARMA处理的小鼠具有30天的存活效益(p＝0.018)(图25D)。为了证明巨噬细胞到实体肿瘤结节中的通行，从第36天死亡的小鼠收获肿瘤，并且基于FACS分析经由人CD45表达来评估过继转移的人巨噬细胞的存在(图25E)。
对人巨噬细胞不进行转导(UTD)或以缺乏转基因的空白Ad5f35病毒体(空白)或Ad5f35-CAR-HER2-ζ(CARMA)在1000的感染倍数下进行转导。转导后48小时通过FACS分析验证了表面CAR表达(图26A)。评估表面标志物以证实空白Ad5f35或CAR-HER2-ζAd5f35转导的细胞中的M1巨噬细胞极化。M1标志物(HLA DR、CD86、CD80、PDL1)被上调，而M2标志物(CD206、CD163)被下调(图26B)。NSGS小鼠被再次用于HER2+转移性卵巢癌的IP模型，并且被分为四个处理组(每组n＝5)。小鼠不被处理，或在第0天被给予1E7未转导巨噬细胞、空白Ad5f35转导的巨噬细胞、或CAR-HER2-ζ转导的巨噬细胞的IP注射(图26C)。通过连续生物发光成像监测肿瘤负荷，其中代表性数据显示在肿瘤植入后第27天(图26D和26E)。在治疗后第20天，CARMA处理的小鼠的肿瘤负荷比未处理的小鼠小约2400倍。
NSGS小鼠被用于HER2+转移性卵巢癌的IP模型，并被分为4个处理组(每组n＝5)，包括无处理和在第0天IP给予3E6、1E7或2E7的CAR-HER2-ζ人巨噬细胞(图27A)。通过连续生物发光成像监测肿瘤负荷，并在此模型中观察到巨噬细胞数量依赖性剂量响应(图27B)。每只小鼠3E6、1E7或2E7巨噬细胞的CAR-HER2巨噬细胞单剂量导致植入后第36天的剂量依赖性肿瘤根除(相对于未处理的小鼠)(图27C)。
图28关于CARMA提出的治疗方法的示例。简而言之，从外周血选择患者单核细胞，将其离体分化和转导以表达CAR，与协同性化合物一起进行共刺激(或否)，并静脉内、腹膜内、肿瘤内、通过介入性放射学程序、或通过其它路径注射回患者中。注意，分化过程可以被跳过，并且单核细胞可以被转导和输注回患者中。单核细胞来源还可以是HLA匹配的供体。
其它实施方式
本文对变量的任何定义中的元素罗列记载包括该变量被定义为所列元素中的任何单个元素或组合(或子组合)。本文的实施方式的记载包括作为任何单个实施方式或与任何其它实施方式或其部分组合的实施方式。
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容其整体在此通过引用并入本文。虽然已经参考具体实施方式公开了本发明，但显然本领域技术人员可以在未偏离本发明的实际精神和范围的情况下想到本发明的其它实施方式和变型。所附权利要求意图被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。

Claims (10)

1.修饰细胞，所述修饰细胞包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和刺激和/或共刺激分子细胞内结构域，并且其中细胞是具有目标效应活性的单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。
2.修饰细胞，所述修饰细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中核酸序列包含编码抗原结合结构域的核酸序列、编码跨膜结构域的核酸序列和编码刺激和/或共刺激分子细胞内结构域的核酸序列，并且其中所述细胞是表达CAR并具有目标效应活性的单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞。
3.权利要求1或2所述的修饰细胞，其中所述CAR的抗原结合结构域包含选自单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、单链可变片段和其抗原结合片段的抗体。
4.权利要求1或2所述的修饰细胞，其中所述CAR的抗原结合结构域选自抗CD19抗体、抗HER2抗体和其片段。
5.权利要求1或2所述的修饰细胞，其中所述CAR的细胞内结构域包含双重信号传导结构域。
6.权利要求1或2所述的修饰细胞，其中所述目标效应活性针对特异性结合所述CAR的抗原结合结构域的、靶细胞上的抗原。
7.权利要求1或2所述的修饰细胞，其中所述目标效应活性选自吞噬、目标的细胞的细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌。
8.权利要求1或2所述的修饰细胞，进一步包含选自下列的用剂：核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合。
9.权利要求1或权利要求2所述的修饰细胞，其中所述修饰细胞具有至少一个上调的M1标志物和至少一个下调的M2标志物。
10.权利要求1或2所述的修饰细胞，其中所述修饰细胞被遗传修饰以表达所述CAR。
CN202211374453.1A 2015-07-28 2016-07-28 表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途 Pending CN115747168A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562197675P 2015-07-28 2015-07-28
US62/197,675 2015-07-28
CN201680054514.2A CN108025024B (zh) 2015-07-28 2016-07-28 表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途
PCT/US2016/044440 WO2017019848A1 (en) 2015-07-28 2016-07-28 Modified monocytes/macrophage expressing chimeric antigen receptors and uses thereof

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680054514.2A Division CN108025024B (zh) 2015-07-28 2016-07-28 表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115747168A true CN115747168A (zh) 2023-03-07

Family

ID=57885035

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211374453.1A Pending CN115747168A (zh) 2015-07-28 2016-07-28 表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途
CN201680054514.2A Active CN108025024B (zh) 2015-07-28 2016-07-28 表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680054514.2A Active CN108025024B (zh) 2015-07-28 2016-07-28 表达嵌合抗原受体的修饰单核细胞/巨噬细胞及其用途

Country Status (14)

Country Link
US (12) US11034749B2 (zh)
EP (1) EP3328402A4 (zh)
JP (3) JP7032304B2 (zh)
KR (1) KR20180028533A (zh)
CN (2) CN115747168A (zh)
AU (2) AU2016298229B2 (zh)
BR (1) BR112018001858B1 (zh)
CA (1) CA2992742A1 (zh)
HK (1) HK1256141A1 (zh)
IL (3) IL292507A (zh)
MX (2) MX2018001182A (zh)
RU (1) RU2766690C2 (zh)
WO (1) WO2017019848A1 (zh)
ZA (1) ZA201800611B (zh)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
US10434153B1 (en) 2015-05-20 2019-10-08 Kim Leslie O'Neill Use of car and bite technology coupled with an scFv from an antibody against human thymidine kinase 1 to specifically target tumors
JP7032304B2 (ja) * 2015-07-28 2022-03-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア キメラ抗原受容体を発現する改変された単球／マクロファージおよびその使用
US11352439B2 (en) * 2015-08-13 2022-06-07 Kim Leslie O'Neill Macrophage CAR (MOTO-CAR) in immunotherapy
CN108243607A (zh) 2015-09-09 2018-07-03 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 用于免疫疗法的巨噬细胞的遗传工程
US10875919B2 (en) * 2016-04-26 2020-12-29 Alector Llc Chimeric receptors and methods of use thereof
JOP20190009A1 (ar) 2016-09-21 2019-01-27 Alx Oncology Inc أجسام مضادة ضد بروتين ألفا منظم للإشارات وطرق استخدامها
RU2019112860A (ru) 2016-09-27 2020-10-30 Серо Терапьютикс, Инк. Молекулы химерных интернализационных рецепторов
CN107286246B (zh) * 2016-12-28 2019-12-17 时力生物科技（北京）有限公司 治疗脑胶质瘤的嵌合抗原受体修饰的树突状细胞及其制备方法
KR102508182B1 (ko) * 2017-05-17 2023-03-09 썬더 바이오테크 인크. 형질전환 대식세포, 키메라 항원 수용체, 및 관련 방법
US10415017B2 (en) 2017-05-17 2019-09-17 Thunder Biotech, Inc. Transgenic macrophages, chimeric antigen receptors, and associated methods
RU2020114641A (ru) 2017-09-26 2021-10-27 Серо Терапьютикс, Инк. Молекулы химерных интернализационных рецепторов и способы применения
BR112020013201A2 (pt) * 2017-12-27 2020-12-01 Takeda Pharmaceutical Company Limited nanopartícula lipídica, medicamento, métodos para expressar um receptor, para prevenir ou tratar câncer e para produzir um medicamento, uso da nanopartícula lipídica e do imunócito ex vivo, composição, imunócito ex vivo, e, célula ex vivo
CN108047332B (zh) * 2018-01-15 2021-08-24 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 以cd19为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备和应用
WO2019152781A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified monocytes/macrophages/dendritic cells expressing chimeric antigen receptors and uses in diseases and disorders associated with protein aggregates
WO2019177986A1 (en) * 2018-03-12 2019-09-19 Nantkwest, Inc. Use of cd33car modified high affinity nk cells (t-hank) to reduce myeloid-derived suppressor cells suppressor activity (or reduce negative impact on nk cell activity)
KR20200133376A (ko) 2018-03-21 2020-11-27 알렉소 온콜로지 인크. 신호-조절 단백질 알파에 대한 항체 및 사용 방법
WO2019191340A1 (en) * 2018-03-28 2019-10-03 Cero Therapeutics, Inc. Cellular immunotherapy compositions and uses thereof
AU2019243153A1 (en) * 2018-03-28 2020-10-01 Cero Therapeutics, Inc. Expression vectors for chimeric engulfment receptors, genetically modified host cells, and uses thereof
US20210015865A1 (en) * 2018-03-28 2021-01-21 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptors and uses thereof for neurodegenerative diseases
CN110615843B (zh) * 2018-06-20 2023-05-09 上海隆耀生物科技有限公司 一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体及其应用
EP3824076A1 (en) * 2018-07-19 2021-05-26 Oncohost Ltd Il-31 improves efficacy of macrophage-based adoptive cell therapy for cancer
CN112840211A (zh) * 2018-08-27 2021-05-25 南特生物公司 Rp182组合物及方法
TW202016295A (zh) 2018-08-31 2020-05-01 日商諾伊爾免疫生物科技股份有限公司 Car表現t細胞及car表現載體
CN109266618B (zh) * 2018-10-18 2021-04-23 赛元生物科技(杭州)有限公司 能够靶向肿瘤细胞的巨噬细胞及其制备方法
WO2020097193A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptors for phagocytosis
WO2020180882A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Nkarta, Inc. Cd19-directed chimeric antigen receptors and uses thereof in immunotherapy
US20200283495A1 (en) * 2019-03-08 2020-09-10 ST Phi Therapeutics Chimeric Endocytic Receptors and Method of Use Thereof
US11013764B2 (en) * 2019-04-30 2021-05-25 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof
BR112021021843A8 (pt) * 2019-04-30 2022-06-21 Myeloid Therapeutics Inc Composições de proteínas de fusão quiméricas modificadas e método de uso das mesmas
US20220162644A1 (en) * 2019-05-29 2022-05-26 Orbis Health Solutions, Llc Delivery vectors and particles for expressing chimeric receptors and methods of using the same
WO2020262540A1 (ja) 2019-06-26 2020-12-30 武田薬品工業株式会社 トランスフェクション方法
KR20220063156A (ko) * 2019-07-19 2022-05-17 인스티튜트 구스타브 루시 암세포 요법을 위한 p21 발현 단핵구
CN112279923B (zh) * 2019-07-22 2023-07-18 南京助天中科科技发展有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
WO2021019706A1 (ja) * 2019-07-31 2021-02-04 国立大学法人信州大学 Ｃａｒ発現免疫細胞を含む細胞集団の製造方法
GB2605276A (en) 2019-09-03 2022-09-28 Myeloid Therapeutics Inc Methods and compositions for genomic integration
WO2021055973A2 (en) * 2019-09-20 2021-03-25 Navi Bio-Therapeutics, Inc. Personalized cancer immunotherapy
KR102498546B1 (ko) * 2019-09-27 2023-02-09 한국생명공학연구원 항체를 분비하는 대식세포의 제조방법 및 이를 이용한 항암치료 기술
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
CN110954701B (zh) * 2019-12-18 2023-07-21 重庆医科大学 一种肝纤维化或肝硬化的诊断试剂盒
CN113106067A (zh) * 2020-01-10 2021-07-13 南京大学 一种嵌合抗原受体-单核/巨噬细胞(car-m)的构建及其应用
AU2021285992A1 (en) 2020-06-04 2023-01-05 Carisma Therapeutics Inc. Novel constructs for chimeric antigen receptors
CN111840324B (zh) * 2020-06-16 2023-05-12 上海市第一人民医院 应用于骨肉瘤细胞成像或治疗的Au DENPs-巨噬细胞复合物
AU2021296914A1 (en) * 2020-06-26 2023-01-19 Carisma Therapeutics Inc. mRNA transfection of immune cells
CN111925448B (zh) * 2020-08-03 2022-06-21 山东大学 在体生成car-巨噬细胞的制备方法及肿瘤免疫治疗中的应用
GB202014920D0 (en) 2020-09-22 2020-11-04 Unikum Therapeutics Aps Methods for treating cancer and autoimmune and inflammatory diseases
JP2023549140A (ja) 2020-11-04 2023-11-22 マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド 操作されたキメラ融合タンパク質組成物およびその使用方法
CN112830974B (zh) * 2021-01-08 2022-07-26 深圳市珈钰生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、载体、人树突状细胞、细胞系、实体肿瘤治疗药物及制备方法和应用
JPWO2022153698A1 (zh) * 2021-01-15 2022-07-21
US20240066059A1 (en) * 2021-03-03 2024-02-29 Seoul National University R&Db Foundation Method for producing chimeric antigen receptor-macrophages and use of same cells
WO2022203226A1 (ko) * 2021-03-22 2022-09-29 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
KR20220131801A (ko) 2021-03-22 2022-09-29 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
WO2022203227A1 (ko) * 2021-03-23 2022-09-29 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
KR20220132401A (ko) 2021-03-23 2022-09-30 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
KR20220136876A (ko) 2021-04-01 2022-10-11 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
WO2022211376A1 (ko) * 2021-04-01 2022-10-06 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
WO2022215920A1 (ko) * 2021-04-06 2022-10-13 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
CN114934071B (zh) * 2021-04-30 2023-10-17 四川大学华西医院 一种表达免疫调节因子的car载体及其应用
CN113321743B (zh) * 2021-07-02 2022-10-21 海南精准医疗科技有限公司 一种靶向赖氨酰氧化酶1的嵌合抗原受体及其用途
KR20230089464A (ko) 2021-12-13 2023-06-20 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
KR20230089462A (ko) * 2021-12-13 2023-06-20 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
CN114410588B (zh) * 2022-01-29 2022-11-04 西安电子科技大学 一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用
CN114657143B (zh) * 2022-03-11 2022-10-25 西安电子科技大学 一种肿瘤微环境调控型car-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用
WO2023194608A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Institut Curie Myeloid cells modified by chimeric antigen receptor and uses thereof for anti-cancer therapy
WO2023194607A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Institut Curie Myeloid cells modified by chimeric antigen receptor with cd40 and uses thereof for anti-cancer therapy
WO2023205646A2 (en) * 2022-04-18 2023-10-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Combinational immunotherapies using car-m, car-nk, car-eos, and car-n cells
CN114949190B (zh) * 2022-04-29 2024-04-30 苏州易慕峰生物科技有限公司 抗原递呈细胞及car-t细胞联合在抗肿瘤中的应用
GB202208605D0 (en) 2022-06-13 2022-07-27 Unikum Therapeutics Aps Engineered immune cells
WO2024034656A1 (ja) * 2022-08-09 2024-02-15 Ａｇｃ株式会社 増殖性マクロファージ様細胞（ｐＭＡＣ）の製造方法
CN115957335A (zh) * 2023-01-03 2023-04-14 华中科技大学同济医学院附属协和医院 基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物、制备方法及应用
CN116218786B (zh) * 2023-03-09 2024-01-23 山东大学齐鲁医院 一种多重基因编辑的通用型巨噬细胞及在制备抗肿瘤药物中的应用

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3334764A (en) 1966-10-25 1967-08-08 John P Fouser Infant nurser
US20040053837A1 (en) * 1998-09-30 2004-03-18 Ludwig Institute For Cancer Research Composition and method for modulating vasculogenesis or angiogenesis
WO2002077029A2 (en) 2000-11-07 2002-10-03 City Of Hope Cd19-specific redirected immune cells
JP2005530695A (ja) * 2002-02-15 2005-10-13 ザイコス インク． 生理活性物質を細胞内に導入するエレクトロポレーション法
US7994298B2 (en) 2004-09-24 2011-08-09 Trustees Of Dartmouth College Chimeric NK receptor and methods for treating cancer
JP4843613B2 (ja) * 2004-10-13 2011-12-21 クルセル ホランド ベー ヴェー 改良されたアデノウイルスベクターおよびその使用方法
AP2351A (en) 2004-10-13 2012-01-25 Crucell Holland Bv Improved adenoviral vectors and uses thereof.
RU2433825C2 (ru) 2004-12-06 2011-11-20 Медисинова, Инк. Способ лечения невропатической боли и связанных с ней синдромов
JP4604892B2 (ja) 2005-07-15 2011-01-05 船井電機株式会社 情報記録／再生装置
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
CA2717656A1 (en) 2007-02-23 2008-08-28 Baylor Research Institute Activation of human antigen-presenting cells through clec-6
US8450112B2 (en) 2008-04-09 2013-05-28 Maxcyte, Inc. Engineering and delivery of therapeutic compositions of freshly isolated cells
EP3940060A1 (en) * 2010-02-25 2022-01-19 ABT Holding Company Modulation of macrophage activation
EP2558109A4 (en) * 2010-04-16 2014-09-24 Bellicum Pharmaceuticals Inc METHOD FOR TREATING HARD TUMORS
CN106220739A (zh) * 2010-12-09 2016-12-14 宾夕法尼亚大学董事会 嵌合抗原受体‑修饰的t细胞治疗癌症的用途
JP6053688B2 (ja) * 2011-10-07 2016-12-27 国立大学法人三重大学 キメラ抗原受容体
JP6021617B2 (ja) 2012-12-05 2016-11-09 カンタツ株式会社 撮像レンズ
US9221908B2 (en) 2012-12-12 2015-12-29 Vasculox, Inc. Therapeutic CD47 antibodies
UY35340A (es) 2013-02-20 2014-09-30 Novartis Ag Marcaje efectivo de leucemia humana usando células diseñadas con un receptor quimérico de antígeno anti-cd123
WO2014153114A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to modify cells for therapeutic objectives
DE102013215794A1 (de) 2013-08-09 2015-02-12 Krones Ag Vorrichtung und Verfahren zum Ausrichten von unrunden Behältern
GB201315036D0 (en) 2013-08-22 2013-10-02 Renishaw Plc Apparatus and method for building objects by selective solidification of powder material
RU2764074C2 (ru) 2014-08-28 2022-01-13 Байоатла, Ллк Условно активные химерные антигенные рецепторы для модифицированных т-клеток
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
WO2016149254A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Chimera Bioengineering, Inc. Smart car devices, de car polypeptides, side cars and uses thereof
EP3288569A4 (en) 2015-04-29 2018-12-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof
CN104829733B (zh) * 2015-05-25 2018-06-05 广州百暨基因科技有限公司 抗原结合单元稳定的嵌合抗原受体及制备方法与应用
GB201509413D0 (en) 2015-06-01 2015-07-15 Ucl Business Plc Fusion protein
US20170216354A1 (en) 2015-06-12 2017-08-03 Batu Biologics, Inc. Clinically useful non-antigen pulsed dendritic cells
JP7032304B2 (ja) * 2015-07-28 2022-03-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア キメラ抗原受容体を発現する改変された単球／マクロファージおよびその使用
WO2017025944A2 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 Brigham Young University Macrophage car (moto-car) in imunotherapy
AU2021285992A1 (en) * 2020-06-04 2023-01-05 Carisma Therapeutics Inc. Novel constructs for chimeric antigen receptors

Also Published As

Publication number Publication date
IL256892B (en) 2022-06-01
US20220002376A1 (en) 2022-01-06
AU2016298229A1 (en) 2018-02-08
US11319358B2 (en) 2022-05-03
MX2018001182A (es) 2018-04-20
HK1256141A1 (zh) 2019-09-13
RU2766690C2 (ru) 2022-03-15
US20200247870A1 (en) 2020-08-06
AU2022263479A1 (en) 2022-12-08
US20220002377A1 (en) 2022-01-06
US20220033468A1 (en) 2022-02-03
US20220033466A1 (en) 2022-02-03
US20220041688A1 (en) 2022-02-10
US20220033467A1 (en) 2022-02-03
US11306133B2 (en) 2022-04-19
US11332511B2 (en) 2022-05-17
US11407805B2 (en) 2022-08-09
CN108025024A (zh) 2018-05-11
US11359002B2 (en) 2022-06-14
JP2022028831A (ja) 2022-02-16
US11034749B2 (en) 2021-06-15
RU2018107047A (ru) 2019-08-28
AU2016298229B2 (en) 2022-09-08
JP2018521667A (ja) 2018-08-09
JP2023090882A (ja) 2023-06-29
US20230279074A1 (en) 2023-09-07
CA2992742A1 (en) 2017-02-02
JP7032304B2 (ja) 2022-03-08
EP3328402A1 (en) 2018-06-06
US20220002375A1 (en) 2022-01-06
US11306134B2 (en) 2022-04-19
ZA201800611B (en) 2023-05-31
US20180244748A1 (en) 2018-08-30
US20220281947A1 (en) 2022-09-08
IL297905A (en) 2023-01-01
RU2018107047A3 (zh) 2020-02-27
KR20180028533A (ko) 2018-03-16
US11325963B2 (en) 2022-05-10
US11498954B2 (en) 2022-11-15
BR112018001858B1 (pt) 2022-02-08
MX2022008288A (es) 2022-08-08
IL292507A (en) 2022-06-01
EP3328402A4 (en) 2019-04-03
WO2017019848A1 (en) 2017-02-02
CN108025024B (zh) 2022-11-29
US20220033465A1 (en) 2022-02-03
IL256892A (en) 2018-03-29
BR112018001858A2 (pt) 2018-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11498954B2 (en) Modified monocytes/macrophage expressing chimeric antigen receptors and uses thereof
JP7372728B2 (ja) 改変ｔ細胞に関する方法および組成物
US11890301B2 (en) Methods and compositions for cells expressing a chimeric intracellular signaling molecule
US20240026293A1 (en) Methods and Compositions for Cells Expressing a Chimeric Intracellular Signaling Molecule

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40089233

Country of ref document: HK