KR102498546B1 - 항체를 분비하는 대식세포의 제조방법 및 이를 이용한 항암치료 기술 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항체를 분비하는 대식세포 제조방법 및 이를 이용한 항암치료 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물세포의 형질전환을 증가시키는 플라스미드, 항체를 발현하는 플라스미드, 상기 플라스미드로 형질전환되어 항체를 분비하는 대식세포 및 상기 대식세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명을 통해 제조된 항체를 분비하는 대식세포는 암세포 특이적 항원을 인지할 수 있는 항체를 분비하여 암세포를 효과적으로 제거할 수 있다. 특히 본 발명을 통해 제조된 대식세포는 고형암 부위로 이동하여 항암 항체를 분비함으로서 암세포를 옵소닌화하여 대식작용을 통해 제거하고, 이렇게 소화된 항원들은 후천 면역을 활성화시키는 연쇄 반응을 통해 추가적인 항암 효과를 유도할 수 있어서 매우 효과적인 암 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명이 제공하는 동물세포용 플라스미드는 매우 높은 효율로 동물세포를 형질전환할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
본 발명을 통해 제조된 항체를 분비하는 대식세포는 암세포 특이적 항원을 인지할 수 있는 항체를 분비하여 암세포를 효과적으로 제거할 수 있다. 특히 본 발명을 통해 제조된 대식세포는 고형암 부위로 이동하여 항암 항체를 분비함으로서 암세포를 옵소닌화하여 대식작용을 통해 제거하고, 이렇게 소화된 항원들은 후천 면역을 활성화시키는 연쇄 반응을 통해 추가적인 항암 효과를 유도할 수 있어서 매우 효과적인 암 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명이 제공하는 동물세포용 플라스미드는 매우 높은 효율로 동물세포를 형질전환할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
Description
본 발명은 항체를 분비하는 대식세포의 제조방법 및 이를 이용한 항암치료 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물세포의 형질전환을 증가시키는 플라스미드, 항체를 발현하는 플라스미드, 상기 플라스미드로 형질전환되어 항체를 분비하는 대식세포 및 상기 대식세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
세포치료제는 살아있는 세포를 체외에서 물리적, 화학적, 생물학적 방법으로 조작하여 질병을 치료할 수 있는 기능을 갖게 하는 치료제이다. 세포치료제에는 주로 면역세포, 줄기세포, 연골세포, 피부세포 등이 사용되는데 혈액암의 일종인 백혈병을 치료하는 데 사용하는 골수이식 또한 세포치료제의 좋은 예시이다. 최근 이러한 세포치료제를 이용하여 암을 치료하려는 시도가 각광을 받고 있는데, 이를 면역항암치료(tumor immunotherapy)라 부른다. 면역항암치료는 면역세포들을 이용한 항암치료로, 암의 특정 항원을 인지할 수 있는 항체를 이용하여 개체의 면역 반응을 통해 암을 제거하는 치료 기술이다. 면역항암치료의 경우 기존의 정상세포 또한 파괴가 되던 화학적, 방사선 요법에 비해 암세포만을 특이적으로 표적 치료가 가능하기 때문에, 기존 치료 요법에서 나타나던 면역력 약화나 탈모 등의 부작용을 줄일 수 있다는 장점이 있다. 면역항암치료는 크게 암 특이적 단일클론항체(monoclonal antibodies; mAbs)를 이용한 방법과 암 특이적 항원을 인지하는 항체를 T 세포 혹은 자연살해세포 (NK cell) 표면에 발현시켜주는 세포치료(Adoptive cellular therapy; ACT)로 크게 나뉘어 질 수 있다. 후자의 대표적 면역항암요법이 chimeric antigen receptor-T (CAR-T) 세포로, 최근 미국 식품의약국(Food and Drug Administration; FDA)의 승인을 받아 악성 B세포종양 치료제로써 사용이 되고 있다. CAR-T 세포의 경우 백혈병 치료에는 탁월한 효과를 보이는 반면에, 고형암 주변에 나타나는 산성, 저산소 환경에 잘 적응하지 못하는 T 세포의 특성 때문에 고형암에는 큰 효과를 보이지 못하는 것으로 보고되고 있다.
이러한 CAR-T를 개선하기 위해 다양한 그룹에서 자연살해세포(natural killer cell; NK cell)나 대식세포(macrophages)를 이용한 항암 세포치료제 개발에 집중하고 있다. 대식세포는 우리 몸의 가장 기본적인 면역체계를 책임지는 세포로, 박테리아나 바이러스와 같은 비자기(non-self) 물질을 인식하여 제거하는 세포들로, 우리 몸의 다양한 조직에 존재하고 있다. T 세포와 달리 대식세포는 산성, 저산소 환경에서도 잘 적응하며, 다량의 채취가 용이하고, 실제로 다양한 보고에 따르면 많은 수의 대식세포가 고형암 주변에서 관찰되고 있다. 이러한 특성 때문에 암세포 특정 항원을 인식하는 CAR를 발현시킨 CAR-macrophages 세포를 이용한 항암 치료 방법을 위한 연구가 진행중에 있다.
이러한 항원을 인식하는 세포치료제를 제조하기 위해서는 세포에 유전자를 전달하고, 세포를 형질전환시키는 유전공학적 방법이 중요하다. 유전자를 세포 내로 전달하는 방법은 크게 바이러스성 방법과 비바이러스 방법으로 분류할 수 있다. 바이러스성 전달의 경우 다양한 세포에 유전자를 효율적으로 전달할 수 있다는 장점을 가지고 있으나 안전성 문제와 비용적 문제라는 치료제 개발에 큰 단점을 가지고 있다. 비바이러스성 전달의 경우 바이러스성 전달 방법과는 달리 독성이나 면역반응에 대한 위험이 적고, 생체 내에서 자연적으로 분해될 수 있으며, 비교적 저렴한 비용으로 형질전환을 유도할 수 있는 장점을 가지고 있다. 하지만, 비바이러스성 전달의 경우 면역항암치료에 사용되는 면역세포에 매우 낮은 효율을 보여왔다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하기 위해서 항체를 분비하는 대식세포를 용이하게 제작할 수 있는 기술을 개발하고자 노력하였다. 우선, 대식세포로 비바이러스성 유전자 전달 효율을 향상시키기 위해서 유전자 전달 효율이 큰 폭으로 향상된, CpG 서열이 제거된 작은 플라스미드를 개발하였다. 그리고, 상기 방법을 통해 암세포 특이적인 항원을 인식하는 항체를 분비할 수 있는 대식세포를 제조하였으며, 이를 이용하여 고형암을 제거할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 복제 기점(ori), 선별 마커(selection marker), 박테리아 프로모터, 인핸서와 연결된 포유동물에서 작동하는(operable) 프로모터, 인트론, 항체를 코딩하는 유전자 및 폴리아데닐화 서열로 이루어지며, CpG 모티프(motif)가 결핍된 플라스미드로 형질전환된, 항체를 생산하는 대식세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 종양 항원에 특이적인 항체를 분비하는 상기 대식세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 복제 기점(ori), 선별 마커(selection marker), 박테리아 프로모터, 인핸서와 연결된 포유동물에서 작동하는(operable) 프로모터, 인트론, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 클로닝 영역(MCS) 및 폴리아데닐화 서열로 이루어지며, CpG 모티프(CpG motif)가 결핍된 동물세포용 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 종양 항원에 대한 항체를 생산하는 대식세포의 제조방법을 제공하는 것이다:
(a) 제15항에 따른 플라스미드의 핵산 클로닝 영역(MCS)에 종양 항원에 대한 항체를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; 및 (b) 상기 플라스미드를 대식세포에 형질전환시키는 단계.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 복제 기점(ori), 선별 마커(selection marker), 박테리아 프로모터, 인핸서와 연결된 포유동물에서 작동하는(operable) 프로모터, 인트론, 항체를 코딩하는 유전자 및 폴리아데닐화 서열로 이루어지며, CpG 모티프(motif)가 결핍된 플라스미드로 형질전환된, 항체를 생산하는 대식세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 종양 항원에 특이적인 항체를 분비하는 상기 대식세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 복제 기점(ori), 선별 마커(selection marker), 박테리아 프로모터, 인핸서와 연결된 포유동물에서 작동하는(operable) 프로모터, 인트론, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 클로닝 영역(MCS) 및 폴리아데닐화 서열로 이루어지며, CpG 모티프(CpG motif)가 결핍된 동물세포용 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 종양 항원에 대한 항체를 생산하는 대식세포의 제조방법을 제공한다:
(a) 제15항에 따른 플라스미드의 핵산 클로닝 영역(MCS)에 종양 항원에 대한 항체를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; 및 (b) 상기 플라스미드를 이용하여 대식세포를 형질전환시키는 단계.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서 개발한 CpG 서열이 제거된 재조합 플라스미드는 동물세포에의 형질전환 효율이 높고, 독성이 최소화되며, 발현 기간이 늘어나, 이를 이용할 경우 동물세포에의 형질전환 효율이 현저히 향상되는 것으로 확인되었다.
특히, 동물세포 중 대식세포는 비바이러스성 방법을 통한 형질전환이 어려운 세포로, 형질전환시 낮은 형질전환 효율, 높은 세포독성, 짧은 형질전환 기간을 가지는 문제가 있다. 때문에, 바이러스성 방법을 이용한 대식세포의 형질전환이 주를 이뤄왔다. 하지만, 바이러스성 방법의 경우 예상하지 못한 염색체 삽입 (unintended chromosomal integration)과 종양 형성 및 면역 반응 유발 가능성 등 때문에 임상적으로 적용이 힘든 문제점이 있어 비바이러스성 방법을 통한 형질전환 시스템 개발이 요구되어 왔다.
비바이러스성 방법의 경우 플라스미드의 생산을 위해 대장균 (E. coli)에서 플라스미드를 증폭시키는데, 이 과정 중 동물세포와는 달리 대장균에서는 CpG motif부분에 메틸화가 이루어지지 않는다. 메틸화가 진행되지 않는 CpG motif는 동물의 면역세포로 하여금 Toll-like receptor 9 (TLR9)신호기전을 통해 면역반응을 유발하며, 이것 때문에 동물세포의 독성, 낮은 형질전환 효율, 낮은 발현기간이 나타나게 된다. 따라서, CpG motif가 제거된 플라스미드를 제작하기 위해 지속적으로 연구가 진행중에 있다.
본 발명자들은 이를 해결하기 위해 "pCGfd 플라스미드"를 제작하였다. 플라스미드 복제와 단백질 발현에 필수적인 요소들에서 세포 독성을 초래하는 CpG 모티프(서열)이 모두 제거되어 있는 pCpG-free-Lucia 플라스미드를 backbone으로 하였으며, 형질전환 효율을 높이기 위해 불필요한 서열들을 (scaffold/matrix attachment region 및 β-Globin matrix attachment region) 제거하여 작은 플라스미드를 제작하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 상기의 목적을 위하여 각각의 플라스미드에 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP)을 발현하도록 재조합 플라스미드를 제작하였고, 재조합된 플라스미드를 대식세포에 형질전환하기 위한 방법으로 전기천공법(electroporation), 구체적으로 마이크로포레이션(microporation)을 사용하였으며, 이 후 세포독성, 형질전환 효율, 단백질 발현 기간을 측정하였다. 그 결과, 본 발명에서 제공하는 작은 크기의 플라스미드가 가장 높은 형질전환 효율, 단백질 발현 기간을 보였으며, 가장 낮은 세포 독성을 보이는 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 개발된 플라스미드에 종양 항원 특이적인 항체를 코딩하는 유전자를 삽입하고, 이를 대식세포에 형질전환시켜 종양 항원에 특이적인 항체를 분비하는 대식세포를 제작하였다. 상기 대식세포는 고형암이 이식된 동물모델에서 암의 성장을 저해하는 효과가 매우 우수한 것으로 확인되어 종양 특이적 세포 유전자 치료제로서의 개발 가능성을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 복제 기점(ori), 선별 마커(selection marker), 박테리아 프로모터, 인핸서와 연결된 포유동물에서 작동하는(operable) 프로모터, 인트론, 항체를 코딩하는 유전자 및 폴리아데닐화 서열로 이루어지며, CpG 모티프(motif)가 결핍된 플라스미드로 형질전환된, 항체를 생산하는 대식세포를 제공한다.
원래의 세포가 가지고 있던 것이 아닌 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오티드를 세포 내부로 주입하는 것을 형질감염(transfection), 그리고 이로 인하여 세포의 유전적 형질이 변화되는 현상을 형질전환(transformation)이라고 한다. 본 명세서에서는 용어 '형질전환', '형질감염' 이 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입되어 정상형과 다른 유전적 형질을 갖게 된 것, 정상형에서는 발현이 되지 않는 유전형질을 발현하는 것 또는 그러한 과정을 일컫는 것으로서 유사한 의미로 사용된다.
상기 '복제 기점'이란 DNA의 복제가 개시되는 지점으로 '복제 원점' 또는 '복제 개시점'으로도 불릴 수 있다. 본 발명에서 상기 복제 기점은 원핵생물 내에서 플라스미드를 유지하고 증폭할 수 있는 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 R2K, R6K, R1, pSC101, Rts1, F, RSF1010, P1, P4, 람다, Phi82 또는 Phi80에서 유래되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 상기 복제 기점은 R6K에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 '선별 마커(selection marker)'는 플라스미드가 숙주세포 내에 성공적으로 도입되었는지 여부를 확인하거나 안정적인 세포주 구축을 위한 유전자로서, 예컨대 항생제 내성 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자 또는 필수 영양소 생산 유전자일 수 있다. 상기 선별 마커 유전자는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 내성 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자 또는 필수 영양소 생산 유전자 등을 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 항생제 내성 유전자는 암피실린(ampicilin) 저항 유전자, 테트라사이클린(tetracyclin) 저항 유전자, 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자, 클로람페니콜(chloroamphenicol) 저항 유전자, 스트렙토마이신(streptomycin) 저항 유전자, 네오마이신(neomycin) 저항 유전자, 제오신 (Zeocin) 저항 유전자 및 퓨로마이신(Puromycin) 저항 유전자로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 제오신 저항 유전자일 수 있다. 상기 형광 단백질 유전자는 젤리피쉬 녹색형광단백질(green fluorescent protein: GFP) 또는 적색형광단백질(red fluorescent protein: RFP) 유전자일 수 있다. 상기 필수 영양소 생산 유전자는 아미노산, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 핵산 염기, 또는 단백질을 생산하는데 관여하는 유전자일 수 있다.
본 발명에서 상기 '프로모터'는 전사조절인자들이 결합하는 DNA 염기서열 부위를 의미하며, 본 발명의 목적상 유전자 발현율을 높이기 위하여 강력하고 안정적인 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 사용할 수 있다. 본 발명의 상기 플라스미드에는 박테리아 프로모터와 포유동물에서 작동하는 프로모터가 포함이 된다.
상기 박테리아 프로모터는 플라스미드를 증폭하기 위하여 박테리아에 상기 플라스미드를 형질전환 했을 때, 형질전환된 박테리아를 선별할 수 있도록 전술한 선별 마커 단백질이 발현되도록 하는 기능을 나타낸다. 본 발명의 플라스미드에 포함될 수 있는 박테리아 프로모터는 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 actA, hly, p60, phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara, trp, trc, T7 및 EM2K로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 EM2K일 수 있다.
상기 포유동물에서 작동하는 프로모터는 박테리아에서 증폭되어 수득된 플라스미드를 동물세포에 형질전환 했을 때, 상기 동물 세포에서 생산하고자 하는 목적 단백질이 발현할 수 있도록 전사조절인자들이 결합하는 부분을 의미하며, 예를 들어, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40(Simian Virus 40) 프로모터, SV40E1 프로모터, HSV(Herpes simplex virus)의 tk 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, 인간 EF1(human elongation factor-1 alpha, hEF1) 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2(interluekin-2) 유전자의 프로모터, 인간 IFN(interferon) 유전자의 프로모터, 인간 IL-4(interluekin-4) 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF(Granulocyte macrophage colonystimulating factor) 유전자의 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 CMV 프로모터 또는 인간 EF1 알파 프로모터일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간 EF1 알파 프로모터일 수 있다.
본 발명에서 상기 포유동물에서 작동하는 프로모터는 인핸서(enhancer)와 연결된 것일 수 있다. 상기 '인핸서'란 프로모터에서 이격된 위치에서 유전자의 전사(transcription)을 조절하는 DNA 염기서열을 의미한다. 상기 인핸서는 유전자마다 특유의 염기서열로 표시되며 유전자 속의 어떤 위치에서도 전사를 촉진시킨다는 특징이 있다. 본 발명의 일구체예에서는 인핸서로서 마우스 CMV 인핸서를 사용하였다.
본 발명에서 상기 '인트론(intron)'은 진핵세포에서 발견되는 특징적인 서열로 유전정보를 가지고 있지 않아서 단백질을 만들지 못하는 DNA 영역을 의미하며, 핵에서 RNA 중합효소에 의하여 mRNA가 합성될 때 전사되지만 핵 밖으로 빠져나가는 과정에서 스플라이싱(splicing) 과정을 통해 제거되는 부분이다. 이러한 인트론과 비교해 엑손(untranslated exon)을 포함하는 플라스미드의 유전자 발현량이 인트론을 포함하지 않는 경우에 비하여 더 높다는 연구 결과들이 축적됨에 따라, 재조합 발현벡터에 이종 인트론을 도입함으로써 보다 안정하고 지속적인 유전자 발현이 가능하도록 개선된 벡터들이 개발되어 사용되고 있다. 본 발명에서 상기 인트론은 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 플라스미드는 항체를 코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 항체에는 가변영역 및 불변영역을 포함하는 전체로서의 온전한(intact) 항체뿐만 아니라 이의 기능적 단편, 즉 목적 단백질을 특이적으로 표적하는 기능이 발휘되는 단편도 포함하는 것으로 이해된다.
상기 기능적 단편은 예를 들어 모항체의 단백질 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유하는 것을 의미할 수 있으며, 구체적으로는 디아바디(diabody), Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 및 scFv 등의 형태일 수 있다.
Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.
본 발명의 항체는 키메라 항체를 포함하며, 이 경우 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 기원하거나 또는 특정 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 보이지만, 나머지 부분은 본 발명의 항체가 바람직한 생물학적 활성(즉, 목적 단백질과 결합하는 활성)을 나타내는 한, 다른 종으로부터 기원하거나 또는 다른 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 나타내는 것이어도 무방하다(미국 특허 제4,816,567호;및 Morrison et al.,(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
바람직하게는, 본 발명에서 상기 항체는 온전한(intact) 구조의 항체 또는 상기 기능적 단편에 Fc 영역이 결합된 형태일 수 있으며, 더 바람직하게는 온전한(intact) 구조의 항체 또는 scFv에 Fc 영역이 결합된 형태일 수 있으며, 가장 바람직하게는 scFv에 Fc 영역이 결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 일양태에 따르면, 상기 항체는 종양 항원에 특이적인 항체일 수 있다. 상기 '종양 항원'에는 당업계에 공지된 의미가 포함되는데, 종양 세포의 발암성 특징에 기여하는 것으로 공지 또는 생각되는 종양 세포 상 발현된 (또는 종양 세포의 발달과 관련된) 임의 분자가 포함된다. 많은 종양 항원이 당업계에 공지된다. 분자가 종양 항원인지는 또한 당업자에게 잘 공지된 기술 또는 분석법, 예를 들어 클론원성 분석, 형질전환 분석, 체외 또는 체내 종양 형성 분석, 겔 이동 분석, 유전자 넉아웃 분석 등에 따라 측정될 수 있다. 본원에서 사용되는 경우 바람직하게는 상기 종양 항원'은 인간 막통과 단백질, 즉 세포의 지질 이중층에 고정되는 세포막 단백질을 나타낸다. 인간 막통과 단백질은 일반적으로 세포외 영역을 포함할 것이며, 이는 리간드; 인산화될 수 있는 여러 티로신 잔기를 갖는 카르복실-말단 신호 영역, 보존된 세포내 영역 티로신 키나아제 영역 및 호지성 막통과 영역에 결합할 수 있다. 본 발명에서 상기 종양 항원은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림포톡신-베타 수용체, MUC1, WT1, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유모세포 활성 단백질 (FAP), 헵신, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 프로스테이트-특이적 막 항원 (PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, 세포자멸사의 TNF성 약한 유도제 (TWEAK) 및 IL-1R로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 EGFR일 수 있다.
본 발명에서 상기 항체를 코딩하는 유전자는 항체 경쇄-링커-항체 중쇄-Fc 영역을 코딩하는 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 항체 경쇄-링커-항체 중쇄를 코딩하는 서열은 항체의 기능적 단편인 scFv를 코딩하는 서열로 해석될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 항체를 코딩하는 유전자는 형질전환된 대식세포에서 항체가 세포 외부로 분비될 수 있도록 유도하는 분비 시그널(시그널 서열)을 추가로 포함할 수 있다. 분비 단백질이나 막 내재성 단백질은, 소포체 막 결합성의 리보솜 상에서 합성된 후에, 지질 이중층을 통과해야만 한다. 시그널 서열이란, 이때 필요한, 단백질의 N 말단에 존재하는 아미노산 잔기이다.
본 발명에서 상기 시그널 서열은, 상기 기능을 갖는 서열이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 동물 유래의 시그널 서열을 들 수 있다. 또한, 동물 항체 유래의 시그널 서열을 들 수 있다. 여기서 동물로서는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 당나귀, 염소, 말, 새, 개, 고양이, 효모, 곤충 등을 들 수 있다.
또한 본 발명의 바람직한 시그널 서열로서, 예를 들면 산성 포스파타아제의 시그널 서열을 들 수도 있다. 산성 포스파타아제의 유래는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 당나귀, 염소, 말, 새, 개, 고양이, 효모, 곤충 유래의 산성 포스파타아제를 들 수 있다.
본 발명에 있어서 특히 바람직한 시그널 서열은, 인간 포스파타아제의 시그널 서열, 마우스 면역글로불린 경쇄 
(kappa)의 시그널 서열, 또는 마우스 IgG1의 시그널 서열일 수 있으며, 가장 바람직하게는 마우스 면역글로불린 경쇄 
(kappa)의 시그널 서열일 수 있다.
상기 시그널 서열은 상기 항체를 코딩하는 유전자의 5' 말단에 연결될 수 있다.
본 발명에서 상기 'Fc 영역' 은 불변 영역의 일부 이상을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 즉, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미한다. 이는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 이와 같은 Fc 영역은 변이된 힌지영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
다른 구체적인 양태로서, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체예에서는, 종양 항원인 EGFR을 인지하는 scFv 항체(anti-EGFR-scFv)에 대식세포가 항체를 세포 밖으로 분비할 수 있도록 마우스의 면역글로불린(immunoglobulin) kappa 경쇄의 시그널 서열을 anti-EGFR-scFv 서열 앞에 유전자 재조합 기술을 통해 제작하였으며, 대식세포의 항체 의존성 대식작용(Antibody-dependent cellular phagocytosis; ADCP)을 유도하기 위해 유전자 재조합 기술을 이용하여 anti-EGFR-scFv 서열 뒤에 사람의 면역글로불린 Fc-C223P 서열을 추가하여 제작하였다. 상기의 유전자 재조합 기술을 이용해 제작한 anti-EGFR-scFv-Fc는 IgG의 기능은 그대로 가지면서 유전자의 크기를 줄여 동물세포에서의 발현을 용이하게 하는 것으로 확인되었다. 또한 제작한 플라스미드를 이용하여 마이크로포레이션을 통해 대식세포를 형질전환 시켜준 결과, 대식세포가 항체를 정상적으로, 그리고 안정적으로 분비하는 것을 확인하였다.
본 발명에서 상기 '폴리아데닐화 서열' 또는 폴리-A 부가 신호는 진핵 생물 mRNA의 3' 말단에 있는 특이적인 부위에서의 절단 및 절단된 3' 말단으로의 약 100 내지 200 아데닌 뉴클레오타이드(폴리A 꼬리)의 서열의 핵에서의 전사후 부가를 위한 신호를 제공한다. 본 발명에서 상기 폴리아데닐화 서열은 소성장 호르몬(Bovine Growth Hormone), HSV(Herpes simplex virus) 유래 TK(Thymidine Kinase), 레빗 β-글로빈 폴리아데닐화 서열 및 SV40(Simian virus 40) 유래 폴리아데닐화 서열로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 SV40 유래 폴리아데닐화 서열일 수 있다.
본 발명의 상기 플라스미드는 동물세포에서 목적하는 단백질이 발현될 수 있도록, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 이를 위해서 상기 플라스미드는 인핸서에 연결된 포유동물에서 작동하는 프로모터, 폴리아데닐화 시그널 이외에 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈; 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열; 또는 리더 서열 등이 다양하게 포함될 수 있다.
상기 '작동가능하게 연결된' 은 둘 이상의 구성요소의 병렬배치를 언급하며, 본 발명에서 기술된 각 구성성분들은 그들이 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서가 시스 위치에서 연결된 서열의 전사를 제어 또는 조정하는 작용을 하는 경우 프로모터 및/또는 인핸서는 항체를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, 그러나 비필수적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접해 있고, 2 개의 단백질 인코딩 영역 예컨대 분비형 시그널 서열 및 폴리펩티드를 연결할 필요가 있는 경우, 인접해 있고 (리딩) 프레임 내에 있다. 그러나, 작동가능하게 연결된 프로모터는 일반적으로 코딩 서열의 상류에 위치하지만, 그것과 반드시 인접해 있을 필요는 없다. 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 인핸서가 코딩 서열의 전사를 증가시키는 경우 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 코딩 서열의 상류에, 내부에 또는 하류에 그리고 프로모터로부터 상당히 먼 곳에 위치할 수 있다. 폴리아데닐화 자리가 코딩 서열의 하류 말단에 위치하여 코딩 서열을 통해 폴리아데닐화 서열까지 진행하는 경우 폴리아데닐화 자리는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 번역 종료 코돈이 코딩 서열의 하류 말단 (3' 말단)에 위치하여 번역이 코딩 서열을 통해 종료 코돈까지 진행하고 거기에서 종료하는 경우 번역 종료 코돈은 엑손 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 연결은 당업계에 공지된 재조합 방법에 의해, 예를 들어, PCR 기법을 사용하여 및/또는 편리한 제한효소 자리에서의 결찰에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에서 상기 플라스미드의 바람직한 컨스트럭트는 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 상기 나열된 구성요소가 순차적으로 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 상기 플라스미드는 도 3의 개열지도를 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 플라스미드는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 대식세포로 도입될 수 있다.
전술한 항체를 분비, 발현하는 대식세포는 종양 주변으로 잘 이동한다고 밝혀진 대식세포의 특성에 따라 종양 주변에 암세포 특이적으로 항체를 분비 발현하도록 할 수 있으며, 분비 발현한 항체를 매개체로 사용하여 항체의존성대식작용, 자연살해세포에 의한 항체의존성세포사멸이 활발하게 일어나도록 할 수 있다. 또한, 기존에 발명된 면역세포치료제인 CAR-T, CAR-NK, CAR-macrophage의 경우 CAR를 발현하는 세포만이 기능을 할 수 있지만, 본 발명에서 제작된 대식세포는 계속해서 항체를 분비 발현하도록 한다. 이렇게 분비 발현된 항체는 표적 암세포를 옵소닌화(opsonization) 할 것이다. 그러면 항체를 분비 발현한 대식세포뿐 아니라 주변의 대식세포나 다른 면역세포들 또한 이용할 수 있다는 장점이 있다. 대식세포가 항체의존성대식작용을 통해 분해한 항원은 주조직적합성복합체 (major histocompatibility complex, MHC) Ⅱ에 의해 제시되어 후천성 면역 작용에 관여하는 다른 면역세포들의 활성화를 촉진한다. 즉, 암세포에 대한 대식세포의 항체의존성대식작용을 증가시키는 것은 직접적으로 암세포를 제거하는 효과뿐 아니라 후천성 면역 작용도 활성화시킬 수 있어 더 큰 치료 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 일구체예에서는, EGFR에 대한 항체를 분비하는 대식세포를 제작하여 EGFR을 과발현하는 표피모양암종 세포인 A431, 대장암 세포인 HT-29, EGFR을 적게 발현하는 유잉육종 세포인 A673 세포와 반응시켜 대식세포에 의한 대식작용이 일어나는지 분석하였다. 그 결과, EGFR을 과발현하는 세포들인 A431, HT-29 세포들에 대해서는 항체를 분비하는 대식세포에 의해 대식작용이 활발히 일어나는 것을 확인하였으며, 이와는 달리 EGFR을 적게 발현하는 A673 세포에서는 항체를 분비하지 않는 대식세포인 대조군의 대식작용과는 큰 차이를 보이지 않는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 바탕으로 EGFR을 과발현하는 세포인 A431 세포를 누드 마우스에 이종이식하여 항체를 분비하는 대식세포의 항암 효과를 동물 수준에서 확인하였다. A431 세포를 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 주입하여 종양을 형성시킨 뒤, 종양의 형성을 확인할 수 있었던 5일 뒤부터 항체를 발현시킨 대식세포를 종양 주변부(peri-tumoral injection)에 2일 간격으로 6회 주입하였다. 총 17일 동안 종양의 성장을 확인한 결과 대조군과 항체를 분비 발현하지 않은 대식세포에서는 비슷한 속도로 종양이 성장하여 17일차에 평균 730 ㎣ 크기의 종양이 확인된 반면에, EGFR에 대한 항체를 분비 발현한 대식세포에서는 종양의 성장 속도가 대조군에 비해 더딘 것이 확인되었으며, 17일째의 종양의 부피를 확인하였을 때에도 평균 394 ㎣ 크기로 대조군 대비 약 1.9배정도로 종양의 성장이 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 마우스들을 안락사 시킨 다음, 종양의 부피를 육안으로 확인하였으며, 형성된 종양을 분리하여 무게를 측정하였다. 그 결과, 항체를 분비하는 대식세포를 처리해준 실험군에서 대조군과 비교하여 종양의 부피와 무게가 모두 낮게 나오는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또한 종양 항원에 특이적인 항체를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된, 종양 항원 특이적 항체를 생산하는 대식세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 암은 고형암(solid tumor)일 수 있으며, 상기 고형암은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종, 폐암 및 이들의 상피세포암(epidermoid carcinoma)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 대식세포를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 또는, 본 발명의 상기 조성물은 암을 예방 또는 치료하기 위하여 필요한 만큼의 대식세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 대식세포는 103개, 104개, 105개, 106개, 107개 또는 더 많은 수의 대식세포를 포함할 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 적절한 조성물 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 암의 예방 또는 치료에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 병용하여 투여할 경우 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 단독 투여 또는 병용 투여시 본 발명의 약학 조성물 투여량은 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서의 용어 '예방'은 질환의 임상 증상이 발달하지 않도록 질환 또는 장애의 개시에 대해 보호하는 요법을 지칭한다. 따라서, '예방'은 질환의 징후가 대상체에서 검출가능하기 전에 대상체에게 요법을 투여하는 것 (예를 들어, 치료 물질을 투여하는 것) (예를 들어, 대상체 내 검출가능한 감염원 (예를 들어, 바이러스)의 부재 하에 대상체에게 치료 물질을 투여하는 것)에 관한 것이다. 대상체는 질환 또는 장애가 발달할 위험이 있는 개체, 예컨대 질환 또는 장애의 발달 또는 개시와 연관된 것으로 공지된 1종 이상의 위험 인자를 갖는 개체일 수 있다.
본 발명에서의 용어 '치료'는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적일 수 있음), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. '치료'는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 '완화(palliating)' 하는 것은 치료를 하지 않는 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 진행의 시간적 추이가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 복제 기점(ori), 선별 마커(selection marker), 박테리아 프로모터, 인핸서와 연결된 포유동물에서 작동하는(operable) 프로모터, 인트론, 항체를 코딩하는 유전자 및 폴리아데닐화 서열로 이루어진 플라스미드를 포함하는 유전자 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 플라스미드를 유전자 치료제로 사용하는 경우, 치료학적 유효량의 외래 유전자를 함유하는 본 발명의 플라스미드 성분과 함께, 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 인산염 완충용액(PBS), 염수, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 혼합물이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 인산염 완충 용액과 함께 사용할 수 있다. 그외에 당해 분야에 공지된 보조제 성분들을 추가로 사용할 수 있다.
상기 유전자 치료용 조성물은 다양한 방식 예를 들어, 경구, 비내, 폐, 근육내, 피하내 또는 피내 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 경로로 투여될 수 있다. 이들은 주입가능한 조성물로서, 예를 들어, 멸균 수성 현탁액, 바람직하게는 등장액으로서 개체에 투여될 수 있다.
본 발명의 플라스미드를 함유하는 유전자 치료용 조성물의 적용 방식은 처리되는 동물의 크기 및 종, 투여되는 플라스미드의 구성물 또는 조성물의 양, 투여 경로, 사용된 보조제 화합물의 효능과 용량, 및 당해 분야의 숙련자에게 자명한 기타 요인에 따라 변화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명은 또한 복제 기점(ori), 선별 마커(selection marker), 박테리아 프로모터, 인핸서와 연결된 포유동물에서 작동하는(operable) 프로모터, 인트론, 항체를 코딩하는 유전자 및 폴리아데닐화 서열로 이루어진 플라스미드로 대식세포를 형질전환하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 대식세포 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 복제 기점(ori), 선별 마커(selection marker), 박테리아 프로모터, 인핸서와 연결된 포유동물에서 작동하는(operable) 프로모터, 인트론, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 클로닝 영역(MCS) 및 폴리아데닐화 서열로 이루어지며, CpG 모티프(CpG motif)가 결핍된 동물세포용 플라스미드를 제공한다.
본 발명에서 상기 핵산 클로닝 영역(MCS)이란 목적 단백질을 코딩하는 핵산 클로닝 부위(Multiple cloning site)를 말한다. MCS는 특정 제한효소로 인지되어 절단되는 부위로, 절단된 부위에 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 간편하게 삽입될 수 있다.
상기 플라스미드의 핵산 클로닝 영역으로 삽입 가능한 의학적으로 유용한 목적 단백질의 예에는 호르몬, 사이토카인, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 항원, 항체 등이 있으며, 바람직하게는 항체일 수 있다.
상기 플라스미드에 관한 구체적인 설명은 전술한 바를 참고할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 상기 플라스미드는 도 9의 개열지도를 갖는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 동물세포를 제공한다.
상기 동물세포는 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 포유류, 설치류, 조류 또는 곤충세포, 보다 구체적으로는 CHO(Chinese hamster ovary), VERO, HeLa 세포, WI38, BHK(Baby hamster kidney), COS 세포, MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포, 대식세포, NK(natural killer) 세포 등을 포함한다.
본 발명에서 상기 플라스미드를 동물세포로 형질전환 할 때에는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의할 수 있다.
형질전환된 동물세포의 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 프로토콜을 이용하여 실시할 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 동물세포 배양 및 배지에 대한 설명은, R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York에 상세하게 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 종양 항원에 대한 항체를 생산하는 대식세포의 제조방법을 제공한다:
(a) 제15항에 따른 플라스미드의 핵산 클로닝 영역(MCS)에 종양 항원에 대한 항체를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; 및
(b) 상기 플라스미드를 대식세포에 형질전환시키는 단계.
본 발명의 상기 방법에서 a) 단계 이후에 상기 플라스미드를 대장균에 형질전환하고 배양하여 플라스미드를 증폭하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명을 통해 제조된 항체를 분비하는 대식세포는 암세포 특이적 항원을 인지할 수 있는 항체를 분비하여 암세포를 효과적으로 제거할 수 있다. 특히 본 발명을 통해 제조된 대식세포는 고형암 부위로 이동하여 항암 항체를 분비함으로서 암세포를 옵소닌화하여 대식작용을 통해 암세포를 제거하고, 이렇게 소화된 항원들은 후천 면역을 활성화시키는 연쇄 반응을 통해 추가적인 항암 효과를 유도할 수 있어서 매우 효과적인 암 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명이 제공하는 동물세포용 플라스미드는 매우 높은 효율로 동물세포를 형질전환할 수 있다.
도 1은 pCGfd-GFP 플라스미드와 다른 대조군 플라스미드들을 나타낸다. (A) pcDNA3.1-GFP, pCGf-GFP, pCGfd-GFP 플라스미드의 구조를 나타내었다. (B) 각각의 플라스미드를 Nhe°제한효소 처리 후 전기영동을 통해 플라스미드 크기를 분석하였다.
도 2는 pCGfd-GFP 플라스미드를 이용한 대식세포로의 형질전환 효율을 측정하는 실험이다. (A) 대조군 플라스미드들과 pCGfd-GFP 플라스미드를 Raw264.7 대식세포에 microporation한지 24시간 후 형광현미경을 통해 관찰하였다. Scale bars = 20 ㎛ (B) 각각의 플라스미드들을 microporation 한 후 flow cytometry를 통해 GFP 단백질 발현을 확인하였다. (C) 각각의 플라스미드들을 microporation 한 후 1일차, 2일차, 4일차, 6일차에 flow cytometry를 통해 GFP 단백질의 발현 지속 기간을 비교하였다. (D) 각각의 플라스미드들을 microporation한지 24시간 후 세포의 생존율을 trypan blue 염색법을 통해 분석하였다. 그래프의 결과는 3반복 실험의 평균값으로 standard deviation (SD) 값을 이용하여 오차막대를 나타내었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
도 3은 pCGfd-Anti-EGFR-scFv-Fc 플라스미드를 구성하는 방법 및 구조를 나타내는 모식도이다.
도 4는 Raw 264.7 대식세포에서의 anti-EGFR-scFv-Fc 분비 발현을 분석한 결과이다. (A) 플라스미드에서 발현되는 Anti-EGFR-scFv-Fc의 구조를 나타낸 그림이다. (B) Non-reducing 조건과 reducing 조건에서의 웨스턴블랏(Western blot)을 통해 Raw 264.7 대식세포에서의 항체 분비 발현을 확인하였다.
도 5는 flow cytometry를 이용한 A431, HT-29, A673 세포의 EGFR 발현량을 분석한 결과이다. (A-C) A431 세포(A), HT-29 세포(B), A673 세포(C)들을 anti-EGFR 항체, 형광을 띄는 2차 항체를 순차적으로 이용하여 염색한 후 flow cytometry 방법을 통해 세포별 EGFR 발현량을 분석한 결과이다. (D) 각 세포의 평균형광강도를 그래프화 한 분석값이다. 그래프의 결과는 3반복 실험의 평균값으로 SD 값을 이용하여 오차막대를 나타내었다. ns = non-significance, *p<0.05, ***p<0.001
도 6은 anti-EGFR-scFv-Fc를 발현하는 Raw 264.7 대식세포에서의 암세포 대식작용이 증가하는 것을 공초점 형광현미경(confocal microscope)을 통해 관찰한 결과이다. (A, B) A431 세포(A), HT-29 세포(B)를 녹색 형광, 대조군 대식세포주, 항체를 분비하는 대식세포주를 빨간색 형광으로 각각 염색한 후 서로 섞어2 시간 반응시킨다. 반응시킨 세포들을 공초점 형광현미경으로 관찰한 결과이다. Scale bars = 20 ㎛
도 7은 anti-EGFR-scFv-Fc를 발현하는 Raw 264.7 대식세포가 암세포들인 A431, HT-29, A673 세포에 대한 대식작용 증가를 flow cytometry를 통해 분석한 결과이다. (A-C) 도 6에서 설명한 방법을 통해 각각의 세포를 염색한 후, Raw 264.7과 A431(A), HT-29(B), A673(C) 간의 비율을 1 : 0.1, 1 : 0.2, 1 : 1, 1 : 2로 섞어 준 후 flow cytometry를 통해 대식작용을 분석한 결과이다. 각 비율은 전체 Raw 264.7 대식세포 중 대식작용을 일으킨 세포의 비율로 계산하였다. 그래프의 결과는 3반복 실험의 평균값으로 SD 값을 이용하여 오차막대를 나타내었다. ns = non-significance, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
도 8은 마우스 이종이식 모델을 이용한 항체를 분비하는 대식세포의 항암 작용을 분석한 결과이다. (A) 실험의 모식도를 나타내었다. (B) 종양의 형성을 확인한 뒤 2일 간격으로 측정한 종양의 부피를 분석한 결과이다. (C-E) 마우스의 오른쪽 옆구리에 형성된 종양의 크기(C), 분리해낸 종양(D), 저울로 측정한 종양의 무게(E)를 분석한 결과이다. 그래프의 결과는 마우스 5마리의 평균 값으로 standard error of the means (SEM) 값을 이용하여 오차막대를 나타내었다. ns = non-significance, *p<0.05, **p<0.01
도 9은 MCS를 포함하는 pCGfd 플라스미드의 구조를 나타낸다.
도 2는 pCGfd-GFP 플라스미드를 이용한 대식세포로의 형질전환 효율을 측정하는 실험이다. (A) 대조군 플라스미드들과 pCGfd-GFP 플라스미드를 Raw264.7 대식세포에 microporation한지 24시간 후 형광현미경을 통해 관찰하였다. Scale bars = 20 ㎛ (B) 각각의 플라스미드들을 microporation 한 후 flow cytometry를 통해 GFP 단백질 발현을 확인하였다. (C) 각각의 플라스미드들을 microporation 한 후 1일차, 2일차, 4일차, 6일차에 flow cytometry를 통해 GFP 단백질의 발현 지속 기간을 비교하였다. (D) 각각의 플라스미드들을 microporation한지 24시간 후 세포의 생존율을 trypan blue 염색법을 통해 분석하였다. 그래프의 결과는 3반복 실험의 평균값으로 standard deviation (SD) 값을 이용하여 오차막대를 나타내었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
도 3은 pCGfd-Anti-EGFR-scFv-Fc 플라스미드를 구성하는 방법 및 구조를 나타내는 모식도이다.
도 4는 Raw 264.7 대식세포에서의 anti-EGFR-scFv-Fc 분비 발현을 분석한 결과이다. (A) 플라스미드에서 발현되는 Anti-EGFR-scFv-Fc의 구조를 나타낸 그림이다. (B) Non-reducing 조건과 reducing 조건에서의 웨스턴블랏(Western blot)을 통해 Raw 264.7 대식세포에서의 항체 분비 발현을 확인하였다.
도 5는 flow cytometry를 이용한 A431, HT-29, A673 세포의 EGFR 발현량을 분석한 결과이다. (A-C) A431 세포(A), HT-29 세포(B), A673 세포(C)들을 anti-EGFR 항체, 형광을 띄는 2차 항체를 순차적으로 이용하여 염색한 후 flow cytometry 방법을 통해 세포별 EGFR 발현량을 분석한 결과이다. (D) 각 세포의 평균형광강도를 그래프화 한 분석값이다. 그래프의 결과는 3반복 실험의 평균값으로 SD 값을 이용하여 오차막대를 나타내었다. ns = non-significance, *p<0.05, ***p<0.001
도 6은 anti-EGFR-scFv-Fc를 발현하는 Raw 264.7 대식세포에서의 암세포 대식작용이 증가하는 것을 공초점 형광현미경(confocal microscope)을 통해 관찰한 결과이다. (A, B) A431 세포(A), HT-29 세포(B)를 녹색 형광, 대조군 대식세포주, 항체를 분비하는 대식세포주를 빨간색 형광으로 각각 염색한 후 서로 섞어2 시간 반응시킨다. 반응시킨 세포들을 공초점 형광현미경으로 관찰한 결과이다. Scale bars = 20 ㎛
도 7은 anti-EGFR-scFv-Fc를 발현하는 Raw 264.7 대식세포가 암세포들인 A431, HT-29, A673 세포에 대한 대식작용 증가를 flow cytometry를 통해 분석한 결과이다. (A-C) 도 6에서 설명한 방법을 통해 각각의 세포를 염색한 후, Raw 264.7과 A431(A), HT-29(B), A673(C) 간의 비율을 1 : 0.1, 1 : 0.2, 1 : 1, 1 : 2로 섞어 준 후 flow cytometry를 통해 대식작용을 분석한 결과이다. 각 비율은 전체 Raw 264.7 대식세포 중 대식작용을 일으킨 세포의 비율로 계산하였다. 그래프의 결과는 3반복 실험의 평균값으로 SD 값을 이용하여 오차막대를 나타내었다. ns = non-significance, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
도 8은 마우스 이종이식 모델을 이용한 항체를 분비하는 대식세포의 항암 작용을 분석한 결과이다. (A) 실험의 모식도를 나타내었다. (B) 종양의 형성을 확인한 뒤 2일 간격으로 측정한 종양의 부피를 분석한 결과이다. (C-E) 마우스의 오른쪽 옆구리에 형성된 종양의 크기(C), 분리해낸 종양(D), 저울로 측정한 종양의 무게(E)를 분석한 결과이다. 그래프의 결과는 마우스 5마리의 평균 값으로 standard error of the means (SEM) 값을 이용하여 오차막대를 나타내었다. ns = non-significance, *p<0.05, **p<0.01
도 9은 MCS를 포함하는 pCGfd 플라스미드의 구조를 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. CpG 서열이 제거된 pCGfd 플라스미드 구축 및 생산
1-1 pCGfd 플라스미드 구축
CpG 서열이 제거된 플라스미드들을 제작하기 위한 backbone 플라스미드로 pCpGfree-Lucia (pCGf)를 사용하였다. 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자는 기존에 실험실에서 구축한 플라스미드인 pCEP4-CXCR4-IRES-EGFP를 주형으로 하여 제한효소 사이트가 포함된 GFP-Fw와 GFP-Rv 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)하였다 (표 1). 중합효소연쇄반응 산물과 벡터 모두를 제한효소 NcoI 과 NheI 으로 절단한 다음 ligation mix를 이용하여 ligation 하였고 그 산물인 pCGf-GFP 플라스미드를 E. coli GT115 균주에 형질전환하였다. GT115 균주는 pCpGfree-Lucia 플라스미드가 가지는 R6K origin에 특이적인 initiator에 해당하는 pir 유전자를 가지고 있으므로 CpG 서열이 제거된 플라스미드의 증폭을 가능하게 한다.
형질전환에는 heat shock 방법을 이용하였다. CaCl2를 이용하여 제작된 E. coli GT115 균주의 competent cell에 ligation한 플라스미드를 넣어 ice에서 30분간 안정시킨 뒤 42℃에서 1분 10초간 heat shock 하였다. Ice에서 2분간 열을 식혀준 뒤 항생제가 포함되지 않은 Luria-Bertani (LB) 배지 700 ㎕를 넣어 37℃ 진탕배양기에서 1시간 동안 recovery 과정을 거쳤다. 해당 E. coli를 25 ㎍/㎖ 의 zeocin 과 agar가 포함된 low-salt LB (10 g/L tryptone, 5 g/L Nacl, 5 g/L yeast extract) 배지에 도말하였고 37℃ 배양기에서 overnight 배양하여 형성된 colony를 얻었다.
이렇게 얻은 단일 colony를 25 ㎍/㎖의 zeocin 이 포함된 low-salt LB 배지 3 ml에 접종하여 8시간 동안 37℃ 진탕배양기에서 배양한 다음 NucleoSpin Plasmid EasyPure (Machereye-Nagel(MN), Germany)로 정제하였고, 플라스미드의 서열을 sequencing을 통하여 확인하였다.
플라스미드가 올바르게 구축된 것을 확인한 이후에 pCGfd-GFP vector를 구축하기 위하여 Gibson assembly 방법을 사용하였다. pCGf-GFP 플라스미드에서 제거하고자 하는 S/MAR 서열과 βGlO MAR 서열을 제외하면 두 개의 fragment로 나눌 수 있다. 이 두 개의 fragment의 말단이 중첩되도록 프라이머를 디자인하였다. 첫 번째 fragment를 dMAR-1-Fw와 dMAR-1-Rv 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통해 증폭하고, 두 번째 fragment를 dMAR-2-Fw와 dMAR-2-Rv 프라이머를 이용하여 증폭하였다 (표 1). 각각의 fragment를 gel extraction 하여 원하는 band만을 추출한 다음 Gibson assembly master mix (New England Biolabs, Beverly, MA, USA)를 이용하여 클로닝하였다. 플라스미드를 E. coli GT115 균주에 형질전환하여 25 ㎍/㎖ 농도의 zeocin이 포함된 low-salt LB agar plate에 도말하였고 37℃ 배양기에서 overnight 배양하여 형성된 colony를 얻었다. 역시 상기 기술한 방법으로 plasmid를 정제한 뒤, sequencing을 통해 서열을 확인하였다(도 1).
본 발명의 실시예에서 사용된 상기 플라스미드 및 이를 구성하는 각 구성요소의 염기서열은 하기 서열번호의 서열로 나타내었다:
서열번호 1: pCGfd-GFP 플라스미드 full sequence
서열번호 2: mCMV enhancer
서열번호 3: hEF1 promoter
서열번호 4: SI 126
서열번호 5: GFP
서열번호 6: SV40 pAn
서열번호 7: R6K origin
서열번호 8: ZeoR
서열번호 9: EM2K
상기 명명된 프라이머의 서열들은 하기와 같았다.
1-1 플라스미드 정제
대조군으로 사용한 pcDNA3.1-GFP 플라스미드[8]는 E. coli DH5α 균주에 앞서 기술한 heat shock 방법을 사용하여 형질전환 하였다. 해당 균주를 100 ㎍/㎖ 농도의 ampicillin (Affymetrix, Cleveland, Ohio, USA)이 포함된 LB agar plate에 도말하였고, 37℃ 배양기에서 overnight 배양하여 형성된 colony를 얻었다. 단일 colony를 100 ㎍/㎖ 농도의 ampicillin이 포함된 LB 배지 3 ㎖에 접종하여 8시간동안 37℃의 진탕배양기에서 배양한 다음, 이 중 2 ㎖을 200 ㎖의 위와 같은 농도의 ampicillin이 포함된 LB 배지에 넣어 37℃의 진탕배양기에서 overnight 배양하였다.
구축된 pCGf-GFP와 pCGfd-GFP 플라스미드는 증폭을 위해 다시 E. coli GT115 균주에 100 ng의 플라스미드를 heat shock 방법으로 형질전환하였다. 얻어진 단일 colony를 25 ㎍/㎖ 농도의 zeocin이 포함된 low-salt LB 배지 3 ㎖에 접종하여 8시간동안 37℃의 진탕배양기에서 배양한 다음, 이 중 2 ㎖을 200 ㎖의 zeocin이 포함된 low-salt LB 배지에 넣어 37℃의 진탕배양기에서 overnight 배양하였다.
이렇게 얻은 배양액들을 4℃에서 4000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 pellet을 얻은 뒤, EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 endotoxin이 제거된 플라스미드들을 정제하였다. 정제한 플라스미드들이 원하는 플라스미드가 맞는지를 전기영동으로 확인하였다 (도 1). 각각의 플라스미드 1 ㎍를 NheI으로 한 번 절단하여 선형이 되도록 한 다음 전기영동 하였다.
실시예 2. 세포 배양 및 형질전환
상기의 실시예 1에서 제작된 플라스미드의 형질전환 효율을 측정하고, 항체를 분비하는 대식세포주의 기능을 분석하기 위해 대식세포주(Raw 264.7), A431, HT-29, A673 세포를 배양하였으며, 마이크로포레이션(microporation) 방법을 통해 대식세포주를 형질전환하였다.
Raw 264.7 (Korean Collection for Type Cultures [KCTC], Jeongeup, Korea) 대식세포는 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, Grand Island, NY, USA)와 antibiotic antimycotic (AA) solution (Corning, NY, USA)이 첨가된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Corning) 배지에서 배양하였다. 형질전환은 마이크로포레이션 방법으로 하였으며, Neon transfection system (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 1680 v / 20 ms / 1 (Pulse voltage/Pulse width/Pulse number)의 조건에서 진행하였다.
사람 표피모양암종(Human epidermoid carcinoma) 세포인 A431 세포 (American Type Culture Collection [ATCC], Rockville, MD, USA)와 사람 유잉 육종(Human Ewing's Sarcoma) 세포인 A673 세포(ATCC)의 배양에는 10% FBS와 AA solution이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Corning) 배지를 이용하였으며, 사람 대장 선암종(human colorectal adenocarcinoma) 세포인 HT-29 (GeneCopoeia, Rockville, MD, USA)는 10% FBS와 AA solution이 첨가된 McCoy's 5A (Modified) (Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다.
모든 세포는 습도가 있는 5% CO
존재 하의 37℃에서 배양하였다. Raw 64.7 세포는 Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) (Welgene, Daegu, Korea)을 넣어 scraper를 이용하여 세포를 모았으며, A431 세포와 A673 세포, HT-29세포는 0.25% Trypsin-EDTA (Thermo Fisher Scientific)를 넣고 37℃에서 3분간 반응시킨 다음 3배 용량의 배지로 모은 뒤 1000 rpm으로 4분 동안 원심분리 하여 pellet을 얻은 다음 세포의 개수를 측정하여 일정하게 계대배양 하였다.
실시예 3. GFP를 통한 형질전환 효율 확인
pcDNA-GFP, pCGf-GFP, pCGfd-GFP 플라스미드 2 ㎍을 각각 5 x 105 개의 Raw 264.7 대식세포에 위에서 기술한 마이크로포레이션 방법으로 형질전환한 다음 6 well plates에서 배양하였다. 24시간과 48시간 뒤에 세포를 회수하여 4000 rpm으로 4분 동안 원심분리 하였다. Pellet을 500 ㎕의 D-PBS로 세척한 뒤 D-PBS 100 ㎕에 resuspension 하여 eFluorTM 780 (Thermo Fisher Scientific) 1 ㎕를 처리하여 4℃에서 30분간 반응하였다. 반응이 끝난 세포는 500 ㎕의 D-PBS로 세척한 다음 500 ㎕의 flow cytometry buffer (D-PBS, 1% FBS, 0.1% NaN3)에 resuspension하여 FACSVerseTM 유세포분석기 (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)로 분석하였다(도 2). eFluorTM 780으로 염색되지 않은 세포만이 살아있는 세포이므로 살아있는 세포 중에 GFP를 발현하는 세포의 비율을 확인하였다(도 2). 48시간 뒤에는 회수한 세포의 절반은 다시 배양하여 발현이 유지되는지를 이틀 간격으로 같은 방법으로 분석하였다(도 2). 그 결과 본 발명에서 제작한 pCGfd-GFP 플라스미드가 가장 높고, 긴 형질전환 효율을 보였다(도 2).
실시예 4. 세포 생존률 확인
마이크로포레이션에 의해 세포가 죽는 정도를 비교하기 위하여 형질전환 이후 세포의 viability를 확인하고자 하였다. 마이크로포레이션을 이용한 형질전환 24시간 뒤에 배양액에 떠오른 세포와 플레이트에 붙어 자라는 세포를 모두 회수하여 1000 rpm으로 4분간 원심분리 하여 얻은 pellet을 1 ㎖의 D-PBS에 resuspension하였고, 그 중 10 ㎕의 세포를 10 ㎕의 0.4% Trypan blue solution (Thermo Fisher Scientific)과 섞어 LunaTM 자동세포카운터 (Logos Biosystems, Gyunggi-do, Korea)를 이용하여 살아있는 세포의 개수를 측정하였다. 각각의 플라스미드를 형질전환 하였을 때 살아있는 세포의 개수를 아무것도 처리하지 않은 실험군의 살아있는 세포의 개수로 나누어 그 값을 퍼센트로 나타내었다(도 2). 그 결과 pCGfd-GFP 플라스미드가 가장 낮은 세포 독성을 보였다(도 2).
실시예 5. Anti-EGFR-scFv-Fc 발현 플라스미드 구축 및 발현
상기의 제작한 pCGfd 플라스미드와 대식세포의 높은 형질전환 효율을 이용하여 암세포 특이적 항체를 분비하는 대식세포를 구축하고자 하였고, pCGfd 플라스미드에 암세포에서 많이 발현되어 있는 EGFR에 특이적 항체를 주변에 분비할 수 있도록 유전자 재조합을 통해 pCGfd-anti-EGFR-scFv-Fc 플라스미드를 구축하였다. 본 발명에서는 EGFR 항체를 이용하였지만, EGFR에 국한되는 것은 아니며, 다른 암세포 특이적 항원을 인지하는 모든 항체를 분비하는 시스템에 적용이 가능하다.
5-1 Anti-EGFR-scFv-Fc 플라스미드 구축
pCGfd-anti-EGFR-scFv-Fc 플라스미드를 구축하기 위하여 실험실에서 기존에 구축된 pET28-anti-EGFR-scFv 플라스미드에서 anti-EGFR-scFv 서열을 중합효소연쇄반응으로 증폭하였다.
상기 EGFR-scFv의 경쇄, 링커 및 중쇄 서열을 다음과 같은 서열번호로 나타내었다:
서열번호 10: EGFR-scFv 경쇄
서열번호 11: EGFR-scFv 링커
서열번호 12: EGFR-scFv 중쇄
이 때 발현된 항체가 세포 밖으로 분비되도록 하기 위하여 세 개의 forward 프라이머 (EGFR-1st-Fw, SP-2nd-Fw, SP-3rd-Fw)와 하나의 reverse 프라이머 (EGFR-scFv-Rv)를 이용한 3번의 순차적인 PCR을 거쳐 anti-EGFR-scFv 서열의 앞쪽에 murine IgG kappa light chain 시그널 펩티드 서열을 부가하였다(표 2). 상기 시그널 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 서열번호 13으로 나타내었다.
또한 human IgG-Fc-C223P (hIgG-Fc, 서열번호 14) 서열도 중합효소연쇄반응으로 증폭하였다.
각각의 fragment를 fusion PCR을 통해 하나의 fragment로 증폭하였다. 이 때 각 프라이머 말단에는 벡터의 절단 부분과 중첩되는 서열을 포함하였다. 또한 pCGfd-GFP를 제한효소 NcoI과 NheI으로 절단하고 gel extraction 하여 backbone 부분만을 정제하였다. 그 다음 벡터 backbone과 상기의 PCR 산물을 Gibson assembly 방법으로 클로닝한 다음 GT115 E. coli 균주에 형질전환 하였다(도 3). 해당 균주를 25㎍/㎖ 농도의 zeocin이 포함된 low-salt LB agar plate에 도말하였고, 37℃ 배양기에서 overnight 배양하여 colony를 얻었다.
상기의 방법을 통하여 제작된 pCGfd-anti-EGFR-scFv-Fc (서열번호 15) 플라스미드를 최적화된 조건의 마이크로포레이션 방법을 이용하여 Raw 264.7 세포에 형질전환하였다. 그리고 세포 밖으로 분비 발현되는지를 확인하기 위하여 1일차부터 3일차까지 발현된 항체를 포함한 배양액을 취하여 1000 rpm으로 4분동안 원심분리하여 세포를 제거한 상층액을 회수하였으며 회수한 상층액은 Western blot 방법으로 분석하였다.
상기 명명된 프라이머의 서열들은 하기와 같았다.
5-1 웨스턴블랏을 통한 Anti-EGFR-scFv-Fc 항체 발현 확인
웨스턴블랏을 통해 발현된 항체를 확인하고자 회수한 배양액을 각각 reducing 조건과 non-reducing 조건으로 준비하였다. Reducing 조건을 위해 배양액 16 ㎕를 5x sample buffer (1 M Tris-HCl, pH 6.8, 50% glycerol, 10% SDS, 0.5 M DTT, 1% bromophenol blue) 4 ㎕와 2 M Tris 용액 1 ㎕를 섞어 10분간 boiling하여 준비하고, non-reducing 조건을 위해서는 16 ㎕의 배양액을 DTT가 제외된 5x sample buffer 4㎕, 2 M Tris 1 ㎕와 섞어 boiling 없이 준비하였다. 10% polyacrylamide gel을 이용하여 80 V에서 2시간 동안 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)한 뒤에 100 V에서 40분간 Immobilon-P PVDF Membrane (Merck-Millipore, Billerica, MA, USA)으로 transfer하였다. 그 다음 5% skim milk (BD Biosciences)로 PVDF membrane을 blocking하는 단계를 거쳤으며, 1:5000 비율로 goat anti-Human IgG Fc Secondary antibody, HRP-conjugated를 처리하여 4℃에서 overnight 반응하였다. 반응이 끝난 PVDF membrane을 Tris buffered saline with tween 20 (TBS-T, 20 mM Tris-base, 150 mM NaCl) 버퍼로 10분씩 3번 세척한 뒤, enhanced chemiluminescence (ECL) solution (GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom)을 이용하여 X-ray film (Agfa, Mortsel, Belgium)에 밴드를 검출하였다(도 4).
실시예 6. 암세포의 EGFR 발현 확인
실험에 사용한 암세포 (A431, HT-29 및 A673)들이 EGFR을 발현하는 정도를 flow cytometry를 이용하여 분석하였다. 세포를 각각 5 x 105 개씩 회수한 다음 permeabilization 하기 위하여 먼저 200 ㎕의 2% paraformaldehyde (Bio-solution, Ansan, Korea)로 10분간 세포를 고정시켰다. 그 다음 200 ㎕의 permeabilization buffer (eBioscience, San Diego, CA, USA)로 resuspension 하는 과정을 2번 반복하였고, 100 ㎕의 permeabilization buffer로 resuspension한 세포에 각각 391 ng의 rabbit monoclonal anti-EGFR 항체 (Merck-Millipore)와 isotype IgG (Merck-Millipore)을 넣어 4도에서 30분간 반응하였다. 500 ㎕의 D-PBS로 세포를 세척한 다음, Alexa fluor 647이 결합된 2 ㎍의 goat anti-rabbit IgG (Thermo Fisher Scientific)를 처리하여 4도에서 30분간 반응하였다. 반응이 끝난 세포는 500 ㎕의 D-PBS로 세척하였고 500 ㎕의 flow cytometry buffer에 resuspension하여 FACSVerseTM 유세포분석기 (BD Biosciences)로 분석하였다(도 5).
실시예 7. 세포 수준에서 대식작용 (phagocytosis) 분석
상기 실시예에서 제작한 Anti-EGFR-scFv-Fc를 발현, 분비시킨 Raw 264.7 세포가 암세포를 효율적으로 대식작용을 통해 제거 할 수 있는지 확인하였다.
7-1 공초점 형광현미경을 이용한 대식작용 분석
Effector 세포인 Raw 264.7 1 x 106 개에 pCGfd-anti-EGFR-scFv-Fc 플라스미드 10 ㎍를 상기 기술한 마이크로포레이션 방법으로 형질전환 한 다음 60 mm dish에 2일간 배양하였다. 배양 후에 항체가 누적된 배양액은 원심분리를 배양액만을 별도로 보관한 뒤 살아있는 세포가 빨간색 형광을 띠도록 CellTrackerTM Deep Red dye (Thermo Fisher Scientific)으로 염색하였다. 1 μM이 되도록 D-PBS에 희석한 염색약을 100 ㎕ 사용하였고 4
에서 30분간 반응시켰다. A431, HT-29 세포는 같은 시간 동안 녹색 형광을 띠도록 D-PBS에 5 μM로 희석된 Calcein-AM (BD Biosciences) 100 ㎕로 염색하였다. 염색이 끝난 세포들은 D-PBS 500 ㎕로 세척한 다음 세포와 배양액의 항체가 결합하도록 하기 위하여 위에서 회수한 배양액 500 ㎕로 resuspension하여 상온에서 20분 동안 반응시켰다. Raw 264.7 세포를 5 x 104 개, A431, HT-29 또한 5 x 104 섞어준 후 2시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 세포들을 공초점 형광현미경용 배양접시에 옮긴 후 세포들을 공초점 형광현미경으로 분석하였다(도 6).
7-2 유세포 분석기를 이용한 대식작용 분석
상기의 공초점 형광현미경을 이용한 대식작용 분석에 서술된 방법을 통해 세포를 염색하고 분비된 항체를 암세포에 반응시켜준다. 반응이 끝난 후 Raw 264.7 세포의 개수를 5 x 104 개로 고정하고 A431, HT-29, A673 세포가 각각 5 x 103, 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105 개가 되도록 하여 1:0.1, 1:0.2, 1:1, 1:2 의 비율로 섞어주었다. 배양액으로 최종 250 ㎕의 혼합액이 되도록 하고 그 중 230 ㎕를 취하여 세포가 잘 부착하지 않도록 제작된 96-well round bottom ultra low attachment standard 330μl microplate (Corning)에 넣었다. Plate는 빛을 차단하여 습도가 있는 37
, 5% CO2조건에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포들을 회수한 다음 500 ㎕의 D-PBS로 세척하였고, 250 ㎕의 flow cytometry buffer에 resuspension하여 flow cytometry로 분석하였다(도 7). 항체를 분비하는 대식세포의 경우 항체를 분비하지 않는 대식세포에 비해 EGFR이 과발현 되어 있는 A431, HT-29 세포들을 2배 이상 높은 대식효율을 보였다(도 7).
실시예 8. 이종이식 동물모델(xenograft)을 이용한 항체를 분비하는 대식세포의 항암 효과 분석
상기의 세포 수준에서 항체를 분비하는 대식세포의 암세포에 대한 대식효과 증가를 관찰한 후, 동물모델에서 항체를 분비하는 대식세포의 항암효과에 대해 분석하고자 하였다.
8-1 이종이식 동물모델 (xenograft) 구축
이종이식 실험을 위한 마우스로는 6주령의 Inbred strain, BALB/C-nude mouse (Orient Bio, Seongnam, Korea)를 사용하였다. 마우스는 같은 조건에서 사육하였으며 모든 동물실험은 한국생명공학연구원의 동물실험윤리위원회의 승인 하에 진행되었다. EGFR을 과발현 하는 종양을 가진 마우스 이종이식 동물모델을 구축하기 위하여 A431 세포를 이용하였다. 1 x 106개의 A431 세포를 D-PBS 50 ㎕에 resuspension한 다음 Matrigel (Corning)을 50 ㎕ 넣어 섞어주었다. 준비한 세포는 마우스의 오른쪽 옆구리 피하지방에 1 ml 인슐린 주사기 (BD Biosciences)를 이용하여 주입하였다. 종양의 부피는 length x width2 x 0.5236 으로 계산하였으며, A431 세포를 주입한지 5일 후에 마우스에 약 40 mm3 크기의 종양이 형성된 것을 확인할 수 있었다.
8-2 동물모델에서 항체를 분비하는 대식세포의 항암효과 분석
마우스 이종이식 모델에서 항체를 발현한 Raw 264.7 대식세포가 종양의 성장을 억제하는지를 확인하였다. Raw 264.7 대식세포 3 x 106개에 pCGfd-anti-EGFR-scFv-Fc 플라스미드 20 ㎍를 형질전환 한 다음 100 ㎜ dishes (Thermo Fisher Scientific)에 2일간 배양하였다. A431 세포를 주입한 지 5일 후에 종양이 형성된 것을 확인한 마우스를 대조군, Raw 264.7 대식세포를 주입하는 실험군, pCGfd-anti-EGFR-scFv-Fc 플라스미드를 형질전환한 Raw 264.7 대식세포를 주입하는 실험군으로 총 세 개의 군으로 분류하였다. 각각 1 x 106개의 Raw 264.7 대식세포를 형성된 종양의 주변 부위 (peritumoral)에 2일 간격으로 6번 주입하였다. Raw 264.7 대식세포를 주입하기 시작한 날로부터 2일 간격으로 계속해서 종양의 부피를 측정하였으며, A431 세포를 주입한지 17일 후에 마우스들은 CO2를 이용하여 안락사 하였다. 안락사 한 마우스들은 종양을 분리하여 4% paraformaldehyde에 보관한 다음 물기를 제거하고 저울을 이용하여 무게를 측정하였다(도 8). 그 결과 항체를 분비하는 대식세포의 경우 암세포의 성장을 효과적으로 억제하는 것을 관찰하였다(도 8).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명을 통해 제조된 항체를 분비하는 대식세포는 암세포 특이적 항원을 인지할 수 있는 항체를 분비하여 암세포를 효과적으로 제거할 수 있다. 특히 본 발명을 통해 제조된 대식세포는 고형암 부위로 이동하여 항암 항체를 분비함으로서 암세포를 옵소닌화하여 대식작용을 통해 제거하고, 이렇게 소화된 항원들은 후천 면역을 활성화시키는 연쇄 반응을 통해 추가적인 항암 효과를 유도할 수 있어서 매우 효과적인 암 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명이 제공하는 동물세포용 플라스미드는 매우 높은 효율로 동물세포를 형질전환할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Method for establishing antibody-secreting macrophages and
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<220>
<223> pCGfd-GFP plasmid full sequence:
<400> 1
ttaattaaaa ttagaattcc tgcaggagtc aatgggaaaa acccattgga gccaagtaca 60
ctgactcaat agggactttc cattgggttt tgcccagtac ataaggtcaa tagggggtga 120
gtcaacagga aagtcccatt ggagccaagt acattgagtc aatagggact ttccaatggg 180
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tgtatactga gtcattaggg actttccaat gggttttgcc cagtacataa ggtcaatagg 300
ggtgaatcaa caggaaagtc ccattggagc caagtacact gagtcaatag ggactttcca 360
ttgggttttg cccagtacaa aaggtcaata gggggtgagt caatgggttt ttcccattat 420
tggcacatac ataaggtcaa taggggtgac tagtggagaa gagcatgctt gagggctgag 480
tgcccctcag tgggcagaga gcacatggcc cacagtccct gagaagttgg ggggaggggt 540
gggcaattga actggtgcct agagaaggtg gggcttgggt aaactgggaa agtgatgtgg 600
tgtactggct ccaccttttt ccccagggtg ggggagaacc atatataagt gcagtagtct 660
ctgtgaacat tcaagcttct gccttctccc tcctgtgagt ttggtaagtc actgactgtc 720
tatgcctggg aaagggtggg caggaggtgg ggcagtgcag gaaaagtggc actgtgaacc 780
ctgcagccct agacaattgt actaaccttc ttctctttcc tctcctgaca ggttggtgta 840
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acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca 1380
gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc 1440
tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc 1500
gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg 1560
agctgtacaa gtaagctagc tggccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa 1620
ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt 1680
tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta 1740
tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat 1800
gtggtatggt aaaatcagca gttcaacctg ttgatagtat gtactaagct ctcatgttta 1860
atgtactaag ctctcatgtt taatgaacta aaccctcatg gctaatgtac taagctctca 1920
tggctaatgt actaagctct catgtttcat gtactaagct ctcatgtttg aacaataaaa 1980
ttaatataaa tcagcaactt aaatagcctc taaggtttta agttttataa gaaaaaaaag 2040
aatatataag gcttttaaag gttttaaggt ttcctagctt tagtcctgtt cctcagctac 2100
aaaatggaca caatttccag cagggtctct gagggcaaat tcccttcccc aaggttgttc 2160
accaatttct gtcatggctg ggccagaggc atccctgaaa tttgtgctga ctacttctga 2220
ccattctgca taaagctcat ctaggcctct gacccagacc caagcaaggg tgttgtcagg 2280
gacaacttgg tcctgaactg ctgagatgaa gagggtgaca tcatctctga caacaccagc 2340
aaaatcatct tcaacaaagt ctctggagaa tcctaatctg tcagtccaga actctacagc 2400
ccctgcaaca tcccttgctg tgaggactgg gactgcagaa gtgagtttgg ccatgatggc 2460
cctcctatag tgagttgtat tatactatgc agatatacta tgccaatgtt taattgtcaa 2520
ctacctgtt 2529
<210> 2
<211> 279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCMV enhancer
<400> 2
gagtcaatgg gaaaaaccca ttggagccaa gtacactgac tcaataggga ctttccattg 60
ggttttgccc agtacataag gtcaataggg ggtgagtcaa caggaaagtc ccattggagc 120
caagtacatt gagtcaatag ggactttcca atgggttttg cccagtacat aaggtcaatg 180
ggaggtaagc caatgggttt ttcccattac tgacatgtat actgagtcat tagggacttt 240
ccaatgggtt ttgcccagta cataaggtca ataggggtg 279
<210> 3
<211> 220
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hEF1 promoter
<400> 3
gtggagaaga gcatgcttga gggctgagtg cccctcagtg ggcagagagc acatggccca 60
cagtccctga gaagttgggg ggaggggtgg gcaattgaac tggtgcctag agaaggtggg 120
gcttgggtaa actgggaaag tgatgtggtg tactggctcc acctttttcc ccagggtggg 180
ggagaaccat atataagtgc agtagtctct gtgaacattc 220
<210> 4
<211> 128
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SI 126
<400> 4
gtaagtcact gactgtctat gcctgggaaa gggtgggcag gaggtggggc agtgcaggaa 60
aagtggcact gtgaaccctg cagccctaga caattgtact aaccttcttc tctttcctct 120
cctgacag 128
<210> 5
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP
<400> 5
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
720
<210> 6
<211> 226
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 pAn
<400> 6
ccagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa 60
aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc 120
aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg 180
tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtatgg 226
<210> 7
<211> 260
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R6K origin:
<400> 7
aatcagcagt tcaacctgtt gatagtatgt actaagctct catgtttaat gtactaagct 60
ctcatgttta atgaactaaa ccctcatggc taatgtacta agctctcatg gctaatgtac 120
taagctctca tgtttcatgt actaagctct catgtttgaa caataaaatt aatataaatc 180
agcaacttaa atagcctcta aggttttaag ttttataaga aaaaaaagaa tatataaggc 240
ttttaaaggt tttaaggttt 260
<210> 8
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ZeoR
<400> 8
ttagtcctgt tcctcagcta caaaatggac acaatttcca gcagggtctc tgagggcaaa 60
ttcccttccc caaggttgtt caccaatttc tgtcatggct gggccagagg catccctgaa 120
atttgtgctg actacttctg accattctgc ataaagctca tctaggcctc tgacccagac 180
ccaagcaagg gtgttgtcag ggacaacttg gtcctgaact gctgagatga agagggtgac 240
atcatctctg acaacaccag caaaatcatc ttcaacaaag tctctggaga atcctaatct 300
gtcagtccag aactctacag cccctgcaac atcccttgct gtgaggactg ggactgcaga 360
agtgagtttg gccat 375
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EM2K
<400> 9
gatggccctc ctatagtgag ttgtattata ctatgcagat atactatgcc aatgtttaat 60
tgtcaa 66
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-EGFR-scFv light chain
<400> 10
gacatcttgc tgactcagtc tccagtcatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60
ttctcctgca gggccagtca gagtattggc acaaacatac actggtatca gcaaagaaca 120
aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180
aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240
gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa aataataact ggccaaccac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-EGFR-scFv linker
<400> 11
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc 60
60
<210> 12
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-EGFR-scFv heavy chain
<400> 12
caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag cctgtccatc 60
acctgcacag tctctggttt ctcattaact aactatggtg tacactgggt tcgccagtct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaaacac agactataat 180
acacctttca catccagact gagcatcaac aaggacaatt ccaagagcca agttttcttt 240
aaaatgaaca gtctgcaatc taatgacaca gccatatatt actgtgccag agccctcacc 300
tactatgatt acgagtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence for coding signal peptide
<400> 13
atggactccc aggcccaagt gctgatgctg ttgctgctct gggtgtcagg cacctgtgga 60
60
<210> 14
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human IgG-Fc-C223P
<400> 14
gttgagccca aatctccaga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 60
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 120
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 180
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 240
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 300
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 360
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 420
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 480
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 540
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 600
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 660
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 702
<210> 15
<211> 1500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-EGFR-scFv-Fc sequence
<400> 15
atggactccc aggcccaagt gctgatgctg ttgctgctct gggtgtcagg cacctgtgga 60
gacatcttgc tgactcagtc tccagtcatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 120
ttctcctgca gggccagtca gagtattggc acaaacatac actggtatca gcaaagaaca 180
aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 240
aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 300
gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa aataataact ggccaaccac gttcggtgct 360
gggaccaagc tggagctgaa aggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tggcggcggc 420
ggctccggtg gtggtggatc ccaggtgcag ctgaagcagt caggacctgg cctagtgcag 480
ccctcacaga gcctgtccat cacctgcaca gtctctggtt tctcattaac taactatggt 540
gtacactggg ttcgccagtc tccaggaaag ggtctggagt ggctgggagt gatatggagt 600
ggtggaaaca cagactataa tacacctttc acatccagac tgagcatcaa caaggacaat 660
tccaagagcc aagttttctt taaaatgaac agtctgcaat ctaatgacac agccatatat 720
tactgtgcca gagccctcac ctactatgat tacgagtttg cttactgggg ccaagggact 780
ctggtcactg tctctgcagt tgagcccaaa tctccagaca aaactcacac atgcccaccg 840
tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 900
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 960
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 1020
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1080
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 1140
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1200
tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1260
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1320
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1380
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1440
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1500
1500
Claims (18)
- 복제 기점(ori), 선별 마커(selection marker), 박테리아 프로모터, 인핸서와 연결된 포유동물에서 작동하는(operable) 프로모터, 인트론, 항체를 코딩하는 유전자 및 폴리아데닐화 서열로 이루어지며 CpG 모티프(motif)가 제거된 pCpG free 플라스미드에서 S/MAR (scaffold/matrix attachment region) 및 βGloMAR (β-globin matrix attachment region)가 결핍된, pCpG free 플라스미드보다 작은 크기의 플라스미드로 형질전환된, 항체를 생산하는 대식세포.
- 제1항에 있어서, 상기 복제 기점은 R2K, R6K, R1, pSC101, Rts1, F, RSF1010, P1, P4, 람다, Phi82 또는 Phi80에서 유래되는 것을 특징으로 하는 대식세포.
- 제1항에 있어서, 상기 선별 마커는 항생제 내성 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자 또는 필수 영양소 생산 유전자인 것을 특징으로 하는 대식세포.
- 제3항에 있어서, 상기 항생제 내성 유전자는 암피실린(ampicilin) 저항 유전자, 테트라사이클린(tetracyclin) 저항 유전자, 카나마이신(kanamycin) 저항 유전자, 클로람페니콜(chloroamphenicol) 저항 유전자, 스트렙토마이신(streptomycin) 저항 유전자, 네오마이신(neomycin) 저항 유전자, 제오신 (Zeocin) 저항 유전자 및 퓨로마이신(Puromycin) 저항 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대식세포.
- 제1항에 있어서, 상기 박테리아 프로모터는 actA, hly, p60, phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara, trp, trc, T7 및 EM2K로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 대식세포.
- 제1항에 있어서, 상기 포유동물에서 작동하는 프로모터는 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40(Simian Virus 40) 프로모터, SV40E1 프로모터, HSV(Herpes simplex virus)의 tk 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, 인간 EF1(human elongation factor-1 alpha) 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2(interluekin-2) 유전자의 프로모터, 인간 IFN(interferon) 유전자의 프로모터, 인간 IL-4(interluekin-4) 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF(Granulocyte macrophage colonystimulating factor) 유전자의 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대식세포.
- 제1항에 있어서, 상기 항체는 종양 항원에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 대식세포.
- 제7항에 있어서, 상기 종양 항원은 EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림포톡신-베타 수용체, MUC1, WT1, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유모세포 활성 단백질 (FAP), 헵신, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 프로스테이트-특이적 막 항원 (PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, 세포자멸사의 TNF성 약한 유도제 (TWEAK) 및 IL-1R로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대식세포.
- 제1항에 있어서, 상기 항체를 코딩하는 유전자는 항체 경쇄-링커-항체 중쇄-Fc 영역을 코딩하는 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 대식세포.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 서열은 소성장 호르몬(Bovine Growth Hormone), HSV(Herpes simplex virus) 유래 TK(Thymidine Kinase), 래빗 β-글로빈 폴리아데닐화 서열 및 SV40(Simian virus 40) 유래 폴리 아데닐화 서열로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대식세포.
- 제1항에 있어서, 상기 플라스미드는 도 3의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 대식세포.
- 제7항 또는 제8항의 대식세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 암은 고형암(solid tumor)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 고형암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종, 폐암 및 이들의 상피세포암(epidermoid carcinoma)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 하기 단계를 포함하는, 종양 항원에 대한 항체를 생산하는 대식세포의 제조방법:
(a) 복제 기점(ori), 선별 마커(selection marker), 박테리아 프로모터, 인핸서와 연결된 포유동물에서 작동하는(operable) 프로모터, 인트론, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 클로닝 영역(MCS) 및 폴리아데닐화 서열로 이루어지며 CpG 모티프(CpG motif)가 제거된 pCpG free 플라스미드에서 S/MAR (scaffold/matrix attachment region) 및 βGloMAR (β-globin matrix attachment region)가 결핍된, pCpG free 플라스미드보다 작은 크기의 플라스미드의 핵산 클로닝 영역(MCS)에 종양 항원에 대한 항체를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계; 및
(b) 상기 플라스미드를 대식세포에 형질전환시키는 단계.
- 제17항에 있어서, 상기 (a) 단계 이후에 상기 플라스미드를 대장균에 형질전환하고 배양하여 플라스미드를 증폭하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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2019
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| US20120122214A1 (en) * | 2009-04-24 | 2012-05-17 | National University Corporation Kumamoto University | Method for producing cell medicine |
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Gene Therapy. 2009, 16:165-171.* |
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Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20200706 Comment text: Request for Examination of Application Patent event code: PA02011R01I Patent event date: 20190927 Comment text: Patent Application |
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20220624 Patent event code: PE09021S01D |
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| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
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Patent event date: 20220930 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20220624 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |
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| AMND | Amendment | ||
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Patent event date: 20230131 Comment text: Decision to Grant Registration Patent event code: PX07013S01D Patent event date: 20230102 Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event code: PX07012R01I Patent event date: 20220930 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PX07011S01I Patent event date: 20220822 Comment text: Amendment to Specification, etc. Patent event code: PX07012R01I |
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Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20230207 Patent event code: PR07011E01D |
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Payment date: 20230207 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
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| PG1601 | Publication of registration |