WO2002059276A2 - Kulturmedium - Google Patents

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WO2002059276A2
WO2002059276A2 PCT/DE2002/000253 DE0200253W WO02059276A2 WO 2002059276 A2 WO2002059276 A2 WO 2002059276A2 DE 0200253 W DE0200253 W DE 0200253W WO 02059276 A2 WO02059276 A2 WO 02059276A2
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Ursula Kastner
Michael Kastner
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Ursula Kastner
Michael Kastner
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture

Definitions

  • the invention relates to a culture medium that can be used for the in vitro cultivation of biological material, in particular for the cultivation of whole rat and mouse embryos.
  • Rodent embryos are incubated as quickly as possible after removal from the mother animal in 4-7 ml culture medium in sealed and fumigated culture vessels for 24 to 48 hours in a temperature-controlled incubator (Steele et al., 1974; New et al., 1976), whereby in In vitro under optimal culture conditions almost as good development of the embryo as can be achieved in vivo.
  • the m vitro culture of whole embryos has therefore established itself as a less complex screening method for exposing rodent embryos to the test chemicals during the critical phase of organogenesis.
  • the test chemical is added to the culture medium and the cultured embryos are determined after the end of the culture phase using a Sconng system (Brown et al., 1981) with regard to certain endpoints, such as number of somites, protein content of the embryo, crest-burr-length and morphological development parameters (eg head, ear, eye and heart development) with possible inclusion of the histology for malformations.
  • Dose-effect relationships thus allow conclusions to be drawn about a teratogenic potential of the test substance examined.
  • rat serum obtained are centrifuged before clotting to avoid double heart formation in vitro and additionally subjected to heat activation for 30 minutes at 56 ° C before it can be used as a culture medium (Steele et al., 1974; New et al., 1976; Cockroft,
  • rat serum Although some considerable efforts have been made to identify essential elements of rat serum that influence growth and differentiation in order to develop a chemically defined medium for the culture of whole embryos, only a few substitutes for the rat serum itself have been proposed. For example, some have Human serum groups were tested for the cultivation of rat embryos (Shepard et al., 1970; Chatot et al., 1980; Gupta et al., 1983), but the results are neither as good nor as consistent as the use of rat serum (Steele, 1985).
  • Klug developed a culture medium based on the serum of adult cattle, enriched with D + glucose and methionm, which is obtained in a 4-week cycle from cows from the cattle clinic of the FU Berlin (Klug et al., 1985a; Klug et al. , 1990).
  • the blood of these selected cattle must not clot before the serum is separated; however, for unknown reasons not every donor cow has so far proven to be suitable, and if the successful donor cow was lost, extensive preliminary tests had to start again. Furthermore, there was only a maximum of 0.5 liters of serum available for each extraction cycle.
  • the invention is based on the technical problem of specifying a medium which can be detected in large quantities for the cultivation of whole embryos of non-human mammals, in which the embryonic development is proceeding well, in particular growth and Differentiation of rat and mouse embryos in vitro allows for a culture period of at least 24 to 48 hours, and which is nevertheless easy and inexpensive to produce
  • the invention teaches a culture medium containing: a) 1-99% by volume fetal suction serum, preferably fetal calf serum (FCS), and b) 1-99% by volume.
  • % adult nipple serum preferably adult bovine serum, the sum of the components a) and b) always being 100 vol. -%.
  • Calf serum is considered for the purposes of the invention to fall under the concept of adult bovine serum.
  • serum also encompasses fractionated sera, where, for example, albumin and / or gamma globules can be separated (in part or in whole), as well as conventional commercial serum replacement solutions.
  • fractionated sera typically contain, as natural components, alpha 1-globules, alpha 1-lipoproteins, alpha 2-globules, alpha 2-glycoproteins, coeruloprotems, prothrombin, beta-globules, betal-lipoprotems, transfemne and / or plasminogen in at least - est 10 wt .-%, preferably at least 50 wt .-%, of the natural total protein content of the serum in question.
  • a culture medium according to the invention can continue Methionine, iron salts or complexes, insulin, glucose, vitamins, EGF, IGF I + II, VEGF, HGF, FGF, rPl-1, prolactm, angiotensm II, trace elements such as Se, HDL, Alpha-1-Inh ⁇ b ⁇ tor III , Apo-AI, and / or alpha 1/2 macroglobulm included.
  • water preferably of the purity grade for injection, can be added.
  • Components a) and b) can originate from different sucking species as long as the fetal serum is not of human origin, but preferably components a) and b) are from the same sucking species.
  • suckers are particularly pigs, horses, rodents such as rats, mice and rabbits, and humans. It is preferably a sucking species from which larger amounts (> 100 ml) of blood can be drawn without any significant health impairment.
  • a culture medium according to the invention has no or at most only a few ingredients that originate from the rat. It consists partly or completely of commercially available components and is therefore simple, inexpensive and can be produced in large quantities. Surprisingly, a culture medium according to the invention nevertheless enables equivalent growth and differentiation of the whole embryos in vitro, compared to the media of the prior art. It is very easy to characterize due to the components used and allows the entire embryos to grow in a controlled manner.
  • the culture medium according to the invention has, as basic components, at least two different sera, preferably bovine origin, which are combined with one another according to different, separately running process steps or paths for their purification and finally optionally with different ones Growth factors are enriched.
  • the two serums provide practically all the necessary nutrients for the embryos to be cultivated.
  • different nutrient components which are necessary for growth and differentiation processes, are offered to the embryo via the culture medium according to the invention.
  • FCS presumably introduces certain fetal components into the culture medium and at the same time dilutes down toxic components of the serum of adult animals.
  • the invention further teaches a method for producing a culture medium according to the invention and uses according to claims 11 and 12.
  • the cultivation of embryonic stem cells and of germ cells is excluded, provided such use is prohibited by law. It may be advisable to connect a fast, defined defrosting of frozen starting serum to stages AI) and / or B1). Thawing can take place at a temperature of 20 to 50 ° C, preferably 30 to 45 ° C, most preferably 35 to 40 ° C.
  • Certain steps of the process for producing the culture medium relate to the precipitation of certain protein fractions by thawing and freezing processes. It is well known that serum is exposed to increasing salt concentrations during the freezing process. Rapid freezing minimizes this "salting out", but increases the oxygen content in the solution and can therefore also promote oxidation processes. The following points are expediently taken into account when purifying stages A and B.
  • the freezing of protein-containing solutions can result in the following
  • Function of this solution such as enzymatic activity and the protein structure can be influenced and changed. These effects vary with cooling, freezing and thawing cycles, with the duration of freezing and the temperature as well as with the composition of the solution.
  • Each protein responds differently to this physical treatment, ie each individual treatment may not be optimal for a particular protein in the serum pool.
  • Some enzymes tolerate the different freezing and thawing cycles better than others, for example, fibrillary proteins are more sensitive to the freezing process than globular proteins (Fennema 1982).
  • autooxidation can lead to the formation and release of free radicals, which in turn can adversely affect almost all serum components. Serum is known to contain many pro-oxidants, the most important of which are hemoglobin and xanthine oxidase. Xanthine oxidase is not heat inactivable, but you can reduce its harmful activity by choosing a low serum Limit hemoglobin content. The likewise harmful photo-oxidation should be minimized by suitable light protection measures.
  • a maximum of growth-promoting potency for the culture medium can be achieved by thawing all serums as quickly as possible by placing the serum bottles directly in a water bath. If the serum is thawed slowly, the serum will experience a salt concentration on the wall of the container bottle, in which certain serum components are exposed to higher salt concentrations than desired.
  • Another option is heat inactivation of the serum pool at 50-60 ° C for 10-45 minutes, which can reduce the toxicity of the serum.
  • heat inactivation was considered necessary to destroy heat sensitive components such as the complement.
  • it has been found within the scope of the invention that it is not necessary to subject the fetal serum to heat treatment in order to destroy the complement, since obviously the thawing and freezing processes and the heating of the sera to 37 ° C. are heat-labile complement factors in a sufficient way to destroy yourself.
  • heat inactivation for example around to destroy harmful mycoplasmas, since the commercially available FCS was originally already filtered through three series-connected filters with a pore size of 0.1 ⁇ m on the supplier side.
  • An optional treatment is the additional enrichment of level C with certain vitamins. It is known (Cockroft et al., 1988) that many vitamins are important for the growth and differentiation of embryos. However, the need for a wide range of vitamins demonstrably depends on the somite stage used. For rat embryos it is known that earlier stages such as the
  • Gestation day 9.0 shows a clear need for the presence of pantothenate, riboflavin, myo-inositol, folic acid and niacinamide, whereas later embryonic stages (day 10.5) only require absolute riboflavin.
  • this data was determined by dialysis experiments. Even if individual vitamins due to the storage period of the serum and the precipitation processes in the culture medium according to the invention should have been lost, it can nevertheless be assumed that there is always a certain basic vitamin content, which, depending on the embryonic stage used, may already be sufficient to enable the embryos to grow and differentiate appropriately in vitro.
  • stage C In addition to the appropriate enrichment of the culture medium with methionine (Coelho et al., 1989., Coelho et al., 1990) and glucose (Ellington, 1987), an additional enrichment in stage C with further free amino acids and / or vitamins is necessary. but also possible with other growth factors described in the whole embryo literature in order to guarantee a high protein synthesis and overall optimal development of the embryos in vitro.
  • Bacterial sterility as well as the exclusion of the growth of fungi can be checked by direct culture techniques in liquid media according to the usual standard regulations. Sterility to mycoplasma can be checked using direct culture techniques in liquid media, immunofluorescence and staining with Hoechst dyes. Viral sterility can be demonstrated according to method 9CFR113.53. IgGs can be measured quantitatively with the nephelometer.
  • Endotoxins can be measured in the LAL assay and should have a concentration of ⁇ 10 EU / ml, preferably 1-5 EU / ml, and preferably ⁇ 1 EU / ml.
  • Hemoglobin can be measured spectrophotometrically and should be ⁇ 20 mg / dl not exceed, preferably ⁇ 10 mg / dl and preferably have a value ⁇ 3 mg / dl.
  • the total protein content of the culture medium can be adjusted by concentration and dilution measures in order to adjust the same to a desired control range of 5-8 g / dl total protein, preferably 6-7 g / dl.
  • electrolyte levels K +, Na +, etc.
  • the pH is adjusted to 6-8, preferably 7.5 to 7.6.
  • the osmolarity is low and should be between 280 and 320 mosm, preferably between 285 and 305 mosm.
  • Low endotoxin levels and low hemoglobin levels are indicators that the serum has been carefully collected and processed as quickly as possible with minimal cell lysis and minimal release of mycoplasma and viruses.
  • High alpha-globulin levels, normal beta-globulin levels and low immunoglobulin levels are desirable.
  • Serum of USDA quality and / or from countries of origin such as New Zealand and Australia are important qualitative requirements for the process for the production of the culture medium.
  • the culture medium according to the invention is stable in storage at minus 22 to minus 24 ° C for at least 2 years.
  • Example 1 Production route of a culture medium from commercially available components (FIG. 1).
  • Stage A A commercially available serum of fetuses (FCS) stored at minus 22 to minus 24 ° C is thawed under controlled conditions.
  • a first fraction which contains harmful components, precipitates out of the solution, which is separated off by filtration.
  • the separated first supernatant is frozen again. After thawing this so-called first supernatant again, it is mixed with an adequate gas mixture for adjusting the pH and kept under rolling movements in an incubator at 37 ° C., a second fraction being precipitated out of the serum.
  • This fraction contains substances that hinder rather than demand the growth of the cultivated embryos. Accordingly, this second solid retentate is separated from the so-called second supernatant by filtration and discarded.
  • Stage B A commercially available adult cattle serum stored at minus 22 to minus 24 ° C is thawed under controlled conditions. A first fraction, which contains harmful components, precipitates out of the solution, which is separated off by filtration. The separated first supernatant is frozen again. After thawing this so-called first supernatant, it is mixed with an adequate gas mixture for adjusting the pH and kept under rolling movements in an incubator at 37 ° C., a second fraction being precipitated out of the serum. This fraction contains substances that hinder the growth of the cultivated embryos more than they require. Accordingly, this second solid retentate is separated from the so-called second supernatant by filtration and discarded. Level C. Volume equal or different proportions of the second supernatants from Level A and Level B are then mixed together.
  • Example 2 Production route of a culture medium from partially commercially available components (FIG. 2).
  • Level A A commercially available FCS stored at minus 22 to minus 24 ° C is thawed under controlled conditions. A first fraction, which contains harmful components, precipitates out of the solution, which is separated off by filtration. The separated first supernatant is frozen again. After thawing this so-called first supernatant again, it is mixed with an adequate gas mixture to adjust the pH and kept under rolling motion in an incubator at 37 ° C., a second fraction being precipitated out of the serum. This fraction contains substances that hinder rather than promote the growth of the cultivated embryos. Accordingly, this second solid retentate is separated from the so-called second supernatant by filtration and discarded.
  • Stage B A serum of an adult donor cow stored at minus 22 to minus 24 ° C, obtained according to the protocol of Klug et al., (1985 a), is thawed under controlled conditions. A first fraction, which contains harmful components, precipitates out of the solution, which is separated off by filtration. The separated first supernatant is frozen again. After thawing this so-called first supernatant again, an adequate gas mixture is added to adjust the pH and it is kept under rolling motion in an incubator at 37 ° C., a second fraction being precipitated out of the serum. This fraction presumably contains substances that are more the growth of the cultured embryos hinder than challenge. Accordingly, this second solid retentate is separated from the so-called second supernatant by filtration and discarded.
  • Level C The same or different proportions of the second supernatants from level A and level B are then mixed together.
  • Example 3 Detailed description of a method for producing a culture medium according to Example 1.
  • Stage A A commercially available 500 ml bottle with fetal bovine serum is thawed in a water bath with gentle swirling movements. After the serum has been mixed thoroughly, it is portioned under sterile conditions, preferably in 50 ml volumes, and cooled to 15-20 ° C. as quickly as possible. The first supernatant is then filtered off from the solid first pellet by filtering the serum through a filter cartridge with a pore size of 0.22 ⁇ m. The so-called first supernatant is then frozen as quickly as possible by introducing the sample into a super cooler, where it remains at minus 22 to minus 24 ° C.
  • the so-called first supernatant is thawed again in a water bath, followed by sterile gassing of the so-called second supernatant with 5% CO 2 , 10% 0 2 and 85% N 2 for 1-10 minutes, preferably for 2-5 Minutes to adjust the pH to 6.5-8.5, preferably to 7.0-8.0 and preferably to 7.4-7.6.
  • the so-called first supernatant is then slightly rotated for 1-3 hours, preferably for 2 hours at 37.0-37.5 ° C.
  • the further purification process is then followed by an immediate filtration of the serum through a filter cartridge a pore size of 0.22 ⁇ m, whereby the pellet is discarded and the so-called second supernatant is collected separately and stored protected from light at 15 to 20 ° C.
  • Step B A commercially available 500 ml bottle of adult bovine serum is thawed in a water bath with gentle swirling movements. After the serum has been mixed thoroughly, it is portioned under sterile conditions, preferably 50 ml volumes, and cooled to 15-20 ° C. as quickly as possible. The first supernatant is then filtered off from the solid first pellet by filtering the serum through a filter cartridge with a pore size of 0.2 ⁇ m. The so-called first supernatant is then frozen as quickly as possible by introducing the sample into a super cooler, where it remains at minus 22 to minus 24 ° C.
  • the so-called first supernatant is thawed again in a water bath, followed by sterile gassing of the so-called second supernatant with 5% CO 2 , 10% 0 2 and 85% N 2 for 1-10 minutes, preferably for 2-5 Minutes and preferably for 3.5 minutes to adjust the pH to 6.5-8.5, preferably to 7.0-8.0 and preferably to 7.4-7.6.
  • the so-called first supernatant is then slightly rotated for 1-3 hours at 35-39 ° C, preferably for 2 hours at 37.0-37.5 ° C.
  • the further purification process is then followed by an immediate filtration of the serum through a filter cartridge with a pore size of 0.22 ⁇ m, whereby the pellet is discarded and the so-called second supernatant is collected separately and stored away from light
  • Step C The process for the preparation of the culture medium according to the invention is continued by operating under sterile conditions Certain volumes of the second supernatant from stage A are mixed with certain volumes of the second supernatant from stage B. In stage C, additions can be made with essential known growth factors, either before or after the products from stage A and stage 5 have been combined B.
  • Example 4 Detailed description of a method for producing a culture medium according to Example 2.
  • Step A A commercially available 500 ml bottle with fetal bovine serum is thawed in a water bath with gentle swiveling movements. After the serum has been mixed thoroughly, it is portioned under sterile conditions, preferably in 50 ml volumes, and brought down to 15-20 ° C as soon as possible.
  • the first supernatant is then filtered off from the solid first pellet by filtering the serum through a filter cartridge with a pore size of 0.22 ⁇ m.
  • the so-called first supernatant is then frozen as quickly as possible by introducing the sample into a super cooler, where it is at minus
  • the so-called first supernatant is thawed again in a water bath, followed by sterile gassing of the so-called second supernatant with 5% CO 2 , 10% 0 2 and 85% N 2 for 1-10 minutes,
  • Stage B Serum is obtained from a healthy, preferably non-pregnant, donor cow using a known method, processed (Klug et al., 1985a) and stored frozen in 50 ml volumes (glass bottles). If necessary, this serum is then thawed in a 37 ° C water bath. After the serum has been mixed thoroughly, it is cooled down to 15-20 ° C. The first supernatant is then filtered off from the solid first pellet by filtering the serum through a filter cartridge with a pore size of 0.2 ⁇ m. The so-called first supernatant is then frozen as quickly as possible by introducing the sample into a super cooler, where it remains at minus 22 to minus 24 ° C.
  • Step C The process for the production of the culture medium according to the invention is continued by mixing certain volumes of the second supernatant from step A under sterile conditions with certain volumes of the second supernatant from level B.
  • Level C can additionally be enriched with essential known growth factors, either before or after the combination of the products from level A and level B.
  • the culture medium according to the invention is useful in all fields of application in cell and tissue culture, in which FCS is also used. It can be used as an inexpensive replacement culture medium, since many cell lines can be grown in it. Depending on the field of application, the serum content is then only 2-20% by volume, preferably approximately 10%.
  • the field of application includes monolayer cultures, suspension cultures and cloning cultures. However, the most important area of application for the culture medium after development is as a culture medium for whole rodent embryos, especially for the cultivation of rat and mouse embryos
  • the culture bottles loaded with the culture medium and the embryos were initially gassed with 10% 0 2/ 5% CO 2 and 85% N 2 . After 36 hours of culture, the culture bottles were gassed again, but now with a gas mixture of 50% 0 2 , 5% CO 2 and 45% N 2 . At the end of the culture period of 48 hours, the embryos were assessed for growth and development on the basis of a Scormg system (Brown et al. (1981) and Klug et al, (1985a) and the protein content of the embryo was determined.
  • Tables 1 through 5 show the median values (mean number m in the relevant column) as well as the third quartile (upper number m in the relevant column) and the first quartile (lower number in the relevant column).
  • test batches (Table 1-5) always consisted of 6 ml test serum and 1 ml buffer, 3 mg D + -glucose and 75 ⁇ g methionm additionally being added to all bovine test sera via the added buffer per ml culture medium, since it is known that bovine sera generally contain less glucose than rat serum and additionally require methionm to ensure that the neural tube is closed and thus to prevent further malformations.
  • Table 1 shows the culture results of day 9.5 rat embryos after 48 hours of culture.
  • Rat serum from donor animals according to Steele et al. (1974) and New et al. (1976) obtained and processed, was used unsupplemented (6 ml rat serum plus 1 ml buffer) and served as a reference.
  • the culture medium according to the invention makes this possible up to a strong shift in the volume fractions of stage A and stage B, namely up to 5 volume fractions FCS (stage A) and 1 volume fraction adult bovine serum (stage B).
  • FCS as a culture medium is not beneficial and leads to a high malformation rate, a very low protein value and poor length growth (CR).
  • Table 2 demonstrates the culture results from day 9.5 rat embryos after 48 hours of culture. The duration of the heat inactivation was specifically varied. The results show that adult serum, which was obtained and processed according to Klug et al., (1985a), has to be subjected to heat inactivation, whereas FCS must not be heat-treated (compare also with heat-treated FCS, Table 1).
  • the culture medium according to Example 1/3 as well as the culture media according to Example 2/4 allow better growth and normal differentiation of the embryos in vitro than the culture medium according to Klug et al., (1985a), (compare also with Table 1).
  • Example 7 Culture technique and test preparation of the embryos for gestation day 10.1
  • the embryos were staged before use in the culture according to Fujinaga et al. (1995), and only stage 12 (8 somites) and stage 13 (9 somites) embryos were included in the assay.
  • 3 embryos were cultured for 50 hours in rotating penicillin bottles (25 rpm) at 38.5 ° C in 7 ml culture medium.
  • the culture bottles loaded with the culture medium and the embryos were initially gassed with 15% 0 2 , 5% CO 2 and 80% N 2 .
  • the culture bottles were gassed again, but now with a gas mixture of 40% 0 2 , 5% CO 2 and 55% N 2 and a third time after 43 hours with 85% 0 2 , 5% CO 2 and 10% N 2 .
  • the embryos were assessed for growth and development on the basis of a scoring system (Brown et al. (1981) and Klug et al, (1985a) and the protein content of the embryo was determined.
  • Table 3 shows the culture results of day 10.1 rat embryos after 50 hours of culture.
  • Rat serum from donor animals according to Steele et al. (1974) and New et al. (1976) obtained and processed, was used unsupplemented (6 ml rat serum plus 1 ml buffer) and served as a reference.
  • Commercially available FCS and commercially available adult bovine serum were tested, both of which were also heat-treated at 56 ° C. for 30 minutes. The results show that only rat serum enables good growth and normal differentiation of the embryos.
  • Table 4 demonstrates the culture results from day 10.1 of rat embryos after 50 hours of culture in the culture medium Example 1/3 or 2/4.
  • Various commercially available FCS and various commercially available adult bovine sera were tested. All adult sera were subjected to heat treatment. The results show that the culture medium according to Example 1/3 or 2/4 enables good growth and normal differentiation of the embryos in vitro, and that the commercial adult serum should be of high quality.
  • Table 5 demonstrates in a direct comparison the culture results of day 10.1 rat embryos after 50 hours of culture in different culture media.
  • the results show that the culture medium according to Example 1/3 as well as 2/4 enables good growth and normal differentiation of the embryos in vitro; that an additional enrichment of the culture medium with vitamins is advantageous and that there is a strict staging when selecting the embryos for the culture.
  • Table 1 Culture results of day 9.5 rat embryos after 48 hours of in vitro culture in various culture media.
  • FCS 'commercially available very high quality FCS
  • FCS 2 commercially available FCS of very high quality, recommended for embryonic stem cells Table 2. Culture results from day 9.5 of rat embryos after 48 hours of in vitro culture in various culture media, testing various heat inactivation schemes.
  • FCS + cBS H / H stage 12 / 6s 8 4.20 31.0 45.0 332.4 0 + Vitamins 4 3.90 30.0 44.0 324.6 4.61 32.0 48.0 456.8
  • test serum rpm - revolutions per minute
  • Stage C Product from stages A and B t - temperature applied during heat inactivation

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Kulturmedium enthaltend: a) 1-99 Gew.-% FCS und b) 1-99 Gew.-% adultes Rinderserum, wobei die Summe der Anteile der Komponenten a) und b) stets 100 Gew.-% beträgt. Dieses Medium erlaubt ein kontroliertes Wachstum der ganzen Embryonen in vitro.

Description

Kulturmedium
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Kulturmedium, das einsetzbar ist für die in vitro-Kultivierung von biologischem Material, insbesondere für die Kultivierung ganzer Embryonen der Ratte und der Maus.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Es ist bekannt, dass ganze Embryonen von Nagern außerhalb des Muttertieres in vitro angezüchtet werden können. Diese Kultur- technik, die in den sechziger Jahren von New (New 1966a; New 1966b; New, (1967) entwickelt wurde, findet verbreitete Anwendung und führte zu Erkenntnissen in der Embryonalentwicklung, wobei wachstumsregulatorische, morphogenetische als auch me- tabolische Prozesse, die während der Organogenese im Embryo ab- laufen, grundlegend aufgeklärt werden konnten. Die
Nagerembryonen werden dabei schnellstmöglich nach Entnahme aus dem Muttertier in jeweils 4-7 ml Kulturmedium in versiegelten und begasten Kulturgefäßen für 24 bis 48 Stunden in einem temperierten Brutschrank rotierend inkubiert (Steele et al., 1974; New et al., 1976), wobei in vitro unter optimalen Kulturbedingungen eine fast ebenso gute Entwicklung des Embryos wie in vivo erzielbar ist.
Anwendungsgebiete der Methode zur Kultivierung ganzer Embryonen sind das Screening von Substanzen mit einem vermuteten terato- genen Potential (Schmid et al. 1993) sowie das Studium terato- gener Mechanismen unter Ausschaltung maternaler Effekte. Bislang verbreitet zur Untersuchung von Substanzen auf schädliche Nebenwirkungen ist die sogenannte "Segment II-Testung", welche eine Verfahrensweise zur Testung von Arzneimitteln und anderer Chemikalien ist, wobei das übliche Testprotokoll eine tägliche Gabe der Testsubstanz an schwangere Tiere wahrend der Organogenese vorsieht, gefolgt von der morphologischen Untersuchung und Beurteilung der Feten kurz vor der Geburt. Der Einsatz von zwei Spezies (üblicherweise sind das Ratte und Kaninchen) und drei Testkonzentrationen ist dabei gefordert, die so gewählt werden müssen, dass die Hochstdosis einige Zeichen maternaler Toxizitat zeigt. Diese Testung ist jedoch aufgrund des Aufwandes ausgesprochen teuer. Daher hat sich die m vitro-Kultur ganzer Embryonen als weniger aufwendige Screeningmethode etabliert, um Nagerembryonen wahrend der kritischen Phase der Organogenese den Testchemikalien auszusetzen. Dabei wird dem Kulturmedium die Testchemikalie zugesetzt und die kultivierten Embryonen werden nach Abschluss der Kulturphase mit Hilfe eines Sconng Systems (Brown et al . , 1981) hinsichtlich bestimmter Endpunkte wie z.B. Anzahl der Somiten, Proteingehalt des Embryos, Scheitel-Steiß- Lange und morphologischer Entwicklungsparameter (z.B. Kopf-, Ohr-, Augen- und Herzentwicklung) unter möglicher Einbeziehung der Histologie auf Fehlbildungen hm beurteilt. Dosis- Wirkungsbeziehungen erlauben so Rückschlüsse auf ein teratogenes Potential der untersuchten Testsubstanz.
Kitchin et al. (1986) sahen die Vorteile der Kultur ganzer Embryonen auf dem Gebiet des Screenings, wobei (1) die Testsubstanz unter kontrollierten Bedingungen verabreicht werden kann unter Ausschluss maternaler Wechselwirkungen mit unbekannter Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung; (2) Embryonen verschiedener Spezies (hauptsächlich Ratte und Maus) der Testsubstanz m identischen Testkonzentrationen ausgesetzt werden können; (3) spezifische, die Wurfgroße beeinflussende Effekte umgangen werden können, da die Embryonen individuell kultiviert werden können, und (4) metabolisch aktivierende Systeme dem Kulturmedium zugesetzt werden können. 5
Aufgrund der hohen Kosten für die Herstellung des Kulturmediums selbst sind die Kosten der Kultivierung ganzer Embryonen immer noch relativ hoch. Denn im Gegensatz zu vielen Zeil- und Organkultursystemen, in denen die verschiedensten Rezepturen
10 chemisch-definierter Kulturmedien mit Zusatz von wenig oder gar keinem Serum zum Einsatz kommen können, ist der Nahrstoffbedarf ganzer Embryonen so hoch, dass das Kulturmedium für ganze Embryonen meist einen Serumanteil von bis zu 70% und mehr aufweisen sollte. Solches Serum muß jedoch von Anwendern unter hohem Kos-
15 ten- und Arbeitsaufwand und unter strenger Beachtung der Tier- schutzrichtlmien gewonnen werden. Als Spendertiere werden nach dem Stand der Technik Ratten in großer Anzahl benotigt, die aufgrund der erforderlichen Punktion zur Blutentnahme und des hohen Blutverlustes sterben. Das unter Einhaltung bekannter Stan-
20 dardprotokolle gewonnene Rattenserum wird dabei noch vor der Gerinnung zentπfugiert , um m Vitro eine Doppelherzbildung zu vermeiden und zusätzlich auch noch einer Hitzemaktivierung für 30 Minuten bei 56°C unterzogen, bevor es einsetzbar ist als Kulturmedium (Steele et al., 1974; New et al., 1976; Cockroft,
25 1977; New, 1978) .
Obwohl einige beachtliche Anstrengungen unternommen wurden, essentielle und das Wachstum und die Differenzierung beeinflussende Elemente von Rattenserum zu identifizieren, um ein 30 chemisch-definiertes Medium für die Kultur ganzer Embryonen zu entwickeln, sind bisher nur wenige Ersatzstoffe für das Rattenserum selbst vorgeschlagen worden. Zum Beispiel, haben einige Arbeitsgruppen humanes Serum für die Kultivierung von Rattenembryonen ausgetestet (Shepard et al . , 1970; Chatot et al . , 1980; Gupta et al . , 1983), jedoch sind die Resultate weder so gut noch so konsistent wie der Einsatz von Rattenserum (Steele, 1985) .
Klug entwickelte 1985 ein Kulturmedium auf der Basis von Serum adulter Rinder, angereichert mit D+-Glucose und Methionm, welches in einem 4-Wochentakt von Kühen aus der Rinderklinik der FU-Berlin gewonnen wird (Klug et al . , 1985a; Klug et al., 1990). Das Blut dieser ausgesuchten Rinder darf dabei vor der Abtrennung des Serums nicht zur Gerinnung gelangen; jedoch erwies sich bisher aus unbekannten Gründen nicht jede Spenderkuh als geeignet, und bei Verlust der erfolgreichen Spenderkuh mussten aufwendige Vortestungen von neuem beginnen. Ferner standen bei jedem Gewinnungszyklus immer nur maximal 0,5 Liter Serum zur Verfugung.
Kommerziell erhaltliche Seren bovmen Ursprungs, ob vom Fetus, Kalb oder adulten Tier, die im Großmaßstab von ca. 1.000-Literpools je Charge prozessiert werden, haben den
Nachteil, dass sie das Wachstum und die Differenzierung der Embryonen in vitro nicht unterstutzen, da sie entweder zu viele toxische Bestandteile enthalten oder wachstumsfordernde Inhaltsstoffe fehlen (Flick et al., 1999).
Technisches Problem der Erfindung.
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein in großen Mengen erfugbares Medium zur Kultivierung ganzer Embryonen nicht-menschlicher Saugetiere anzugeben, in welchem die embryonale Entwicklung gut ablauft, insbesondere Wachstum und Differenzierung von Embryonen der Ratte und der Maus in vitro über einen Kulturzeitraum von mindestens 24 bis 48 Stunden erlaubt, und welches dennoch einfach und preisgünstig herstellbar
Es sollte standardisierbar und gut charakterisierbar sein , die notwendigen aktiven Inhaltsstoffe enthalten und frei von Tox n- konzentrationen sein, die das Wachstum der Embryonen behindern konnten .
Grundzuge der Erfindung
Zur Losung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Kulturmedium enthaltend: a) 1 - 99 Vol.-% fetales Saugerserum, vorzugsweise fetales Kalberserum (FCS), und b) 1 - 99 Vol . -% adultes Saugerserum, vorzugsweise adultes Rinderserum, wobei die Summe der Anteile der Komponenten a) und b) stets 100 Vol . -% betragt. Kalberserum wird für die Zwecke der Erfindung als unter den Begriff des adulten Rinderserums fallend betrachtet. Der Begriff des Serums umfaßt auch fraktionierte Seren, wobei ggf. beispielsweise Albumin und/oder gamma-Globulme (teilweise oder ganz) abgetrennt sein können sowie übliche kommerzielle Serumer- satzlosungen. Im Falle von fraktionierten Seren enthalten diese als naturliche Komponenten typischerweise alpha 1-Globulme, alpha 1-Lιpoproteιne, alpha 2-Globulme, alpha 2-Glycoproteιne, Coeruloproteme, Prothrombin, beta-Globulme, betal-Lipoproteme, Transfemne und/oder Plasminogen in zumind- est 10 Gew.-%, vorzugsweise zumindest 50 Gew.-%, des natürlichen Totalproteingehaltes des betreffenden Serums. Erforderlichenfalls kann einem erfmdungsgemaßen Kulturmedium weiterhin Methionin, Eisensalze bzw. -Komplexe, Insulin, Glucose, Vitamine, EGF, IGF I + II, VEGF, HGF, FGF, rPl-1, Prolaktm, Angio- tensm II, Spurenelemente wie Se, HDL, Alpha-1-Inhιbιtor III, Apo-AI, und/oder alpha 1/2 Macroglobulm enthalten. Schließlich kann Wasser, vorzugsweise des Reinheitgrades zur Injektion, zugegeben sein. Die Komponenten a) und b) können von unterschiedlichen Saugerspezies stammen, solange das fetale Serum nicht humanen Ursprunges ist, vorzugsweise sind die Komponenten a) und b) jedoch von der gleichen Saugerspezies. Als Saugerspe- zies sind neben Rind insbesondere auch Schwein, Pferd, Rodenten wie Ratte, Maus und Kaninchen, sowie der Mensch zu nennen. Vorzugsweise handelt es sich um Saugerspezies, welchen ohne nennenswerte gesundheitlich Beeinträchtigung größere Mengen (> 100 ml) Blut abgenommen werden können.
Ein erfindungsgemaßes Kulturmedium weist in bevorzugter Ausfuhrungsform keinerlei oder allenfalls nur wenige Inhaltsstoffe auf, die von der Ratte abstammen. Es besteht teilweise oder völlig aus kommerziell erhältlichen Komponenten und ist folglich einfach, preiswert und in großen Mengen herstellbar. Überraschenderweise ermöglicht ein erfindungsgemaßes Kulturmedium dennoch ein gleichwertiges Wachstum und eine gleichwertige Differenzierung der ganzen Embryonen in vitro, verglichen mit den Medien des Standes der Technik. Es ist aufgrund der eingesetzten Komponenten sehr gut charakterisierbar und erlaubt ein kontrolliertes Wachstum der ganzen Embryonen.
Das Kulturmedium nach der Erfindung weist als Grundkomponenten mindestens zwei verschiedene Seren vorzugsweise bovinen Ur- Sprungs auf, die nach verschiedenen separat ablaufenden Verfahrensstufen bzw. -pfaden zu deren Aufreinigung miteinander vereinigt und schließlich optional mit verschiedenen Wachstumsfaktoren angereichert werden. Die zwei Seren liefern praktisch alle notwendigen Nährstoffe für die zu kultivierenden Embryonen. Denn mit der Kombination von mindestens zwei unterschiedlichen Seren bovinen Ursprungs werden unterschiedliche Nährstoffkomponenten, die für Wachstums- und Differenzierunsprozesse notwendig sind, dem Embryo über das Kulturmedium nach der Erfindung angeboten. Insbesondere werden vermutlich über den Zusatz von FCS bestimmte fetale Komponenten in das Kulturmedium eingebracht und zugleich toxische Komponenten des Serums adulter Tiere herunterverdunnt . Zum Beispiel ist es bekannt, dass unbe- handelte adulte bovine Sera hohe Titer von IgG s aufweisen, die nicht hitzelabil sind und die die Versorgung des Embryos mit Nährstoffen über eine Schädigung des Dottersackes behindern (Brent, 1998). Das FCS enthalt jedoch aufgrund des Alters der Feten im allgemeinen immer äußerst niedrige Titer von IgG s. Durch Zusatz von hohen Mengenanteilen des FCS zum Anteil des adulten Rinderserums wird daher der Titer von IgG insgesamt stark verdünnt und offensichtlich unter das toxische Level gebracht. Die mengenmäßigen Anteile des Serums adulter Tiere stel- len jedoch auch notwendige Substanzen dem Kulturmedium nach der Erfindung als Inhaltsstoffe zur Verfugung, die nicht im FCS enthalten sind, und die vom Embryo für Wachstums- und Diffen- zierungsprozesse benotigt werden.
Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemaßen Mediums sind in den Ansprüchen 2 bis 9 angegeben.
Die Erfindung lehrt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemaßen Kulturmediums gemäß dem Anspruch 10 sowie Verwendungen gemäß den Ansprüchen 11 und 12. Im Falle des Anspruchs 11 ist die Kultivierung embryonaler Stammzellen sowie von Keimzellen ausgeschlossen, sofern eine solche Verwendung gesetzlich verboten ist. Es kann sich empfehlen, den Stufen AI) und/oder Bl) ein schnelles definiertes Auftauen gefrorenen Ausgangsserums vorzuschalten. Das Auftauen kann bei einer Temperatur von 20 bis 50 °C, vorzugsweise von 30 bis 45 °C, höchstvorzugsweise von 35 bis 40 °C, erfolgen.
Bestimmte Schritte des Verfahrens zur Herstellung des Kulturmediums betreffen die Präzipitation bestimmter Proteinfraktionen durch Auftau- und Einfriervorgänge. Es ist wohlbekannt, dass Serum beim Einfrierprozess ansteigenden Salzkonzentrationen ausgesetzt wird. Schnelles Einfrieren minimiert dieses „Aussalzen", erhöht jedoch den Sauerstoffgehalt in der Lösung und kann somit auch Oxidationsvorgänge fördern. Bei der Aufreinigung von Stufe A und Stufe B finden folgende Punkte zweckmäßigerweise Beach- tung. Beim Einfrieren von proteinhaltigen Lösungen kann die
Funktion dieser Lösung, wie z.B. enzymatische Aktivität als auch die Proteinstruktur beeinflusst und verändert werden. Diese Effekte variieren mit Kühl-, Einfrier- und Auftauzyklen, mit der Dauer des Einfrierens und der Temperatur als auch mit der Zusam- mensetzung der Lösung. Jedes Protein antwortet anders auf diese physikalische Behandlung, d.h. jede einzelne Behandlung mag nicht optimal sein für ein bestimmtes Protein des Serumpools. Einige Enzyme tolerieren die verschiedenen Einfrier- als auch -auftauzyklen besser als andere, z.B. sind fibrilläre Proteine empfindlicher gegenüber dem Einfrierprozess als globuläre Proteine (Fennema 1982). Weiterhin kann die Autooxidation zur Bildung und Freisetzung freier Radikale führen, die wiederum fast alle Serumkomponenten nachteilig verändern können. Es ist bekannt, dass Serum viele Prooxidantien enthält, unter ihnen sind Hämo- globin und Xanthinoxidase die zwei Wichtigsten. Xanthinoxydase ist nicht hitzeinaktivierbar, dennoch kann man seine schädliche Aktivität durch die Auswahl eines Serums mit niedrigem Hämoglobingehalt begrenzen. Die ebenfalls schädliche Photooxydation sollte durch geeignete Lichtschutzmaßnahmen minimiert werden.
5. Ein Maximum an wachstumsfördernder Potenz für das Kulturmedium kann dadurch erzielt werden, daß alle Seren schnellstmöglich aufgetaut werden, indem man die Serum-Flaschen direkt in ein Wasserbad einbringt. Wenn man das Serum langsam auftaut, erfährt das Serum an der Wandung der Containerflasche eine Salzkonzen- 0 trierung, bei der bestimmte Serumkomponenten höheren Salzkonzentrationen als erwünscht ausgesetzt werden. Es ist daher wünschenswert, die folgende Empfehlung einzuhalten: Erstens; Resuspendierung der viskosen Anteile durch periodisches Schwenken der Serumflasche während des Auftauprozesses, wobei 5 jedoch eine Schaumbildung ausgeschlossen sein uss; und zweitens, schnelles Wiedereinfrieren des Serums, indem man die Serum enthaltenen Flaschen direkt in einen Supercooler einbringt und die Probe eingefroren lagert bei minus 18 bis minus 35°C, vorzugsweise bei minus 20 bis minus 30°C, bevorzugterweise je- 0 doch bei minus 22 bis minus 24 °C.
Eine weitere Option ist die Hitzeinaktivierung des Serumpools bei 50-60°C über 10-45 Minuten, welche die Toxizitat des Serums vermindern kann. Man sah anfangs die Hitzeinaktivierung als not- 5 wendig an, um hitzeempfindliche Komponenten, wie z.B. das Komplement, zu zerstören. Es ist im Rahmen der Erfindung jedoch festgestellt worden, dass es nicht notwendig ist, das fetale Serum einer Behandlung mit Hitze auszusetzen, um das Komplement zu zerstören, da offensichtlich die Auftau- und Einfrierprozesse 0 sowie das Erwärmen der Seren auf 37 °C hitzelabile Komplementfaktoren in ausreichender Weise selbst schon zerstören. Weiterhin besteht keine Notwendigkeit zur Hitzeinaktivierung, etwa um schädliche Mycoplasmen zu zerstören, da das kommerziell erhältliche FCS ursprünglich bereits durch drei hinterein- andergeschaltete Filter mit einer Porengröße von 0.1 μm von Lieferantenseite filtriert wurde. Gegensätzlich zu allen Proto- kollen zur Whole Embryo Kultur wurde daher auch festgestellt, dass eine Hitzeinaktivierung des FCS wenig, wenn nicht gar keinen Nutzen für das Wachstum der ganzen Embryonen hat. Ferner, dass trotz nicht durchgeführter Hitzeinaktivierung keine Doppelherzbildung in Vitro auftrat und allgemein nur dazu führt, dass die Wachstumsraten insgesamt vermindert sind. Eine Hitzeinaktivierung, sollte sie notwendig erscheinen, sollte daher überwacht werden durch ein Verfahren, welches wiederholbar ist. 500- ml-Flaschen sollten immer portioniert werden in kleine Aliquots von 10-100 ml, vorzugsweise 50 ml, um zu garantieren, dass das Serum der Hitze nicht unnötig lange ausgesetzt wird und dass die Serumfraktionen schnellstmöglich wieder eingefroren als auch wieder aufgetaut werden können. Es sollten dabei Glasflaschen und keine Plastikflaschen benutzt werden, da Glas ein besserer Wärmeleiter ist. Eine optionale Behandlung ist die zusätzliche Anreicherung der Stufe C mit bestimmten Vitaminen. Es ist bekannt (Cockroft et al., 1988), dass viele Vitamine für Wachstum und Differenzierung von Embryonen wichtig sind. Der Bedarf an einer breiten Palette von Vitaminen hängt jedoch nachweislich vom eingesetzten Somitenstadium ab. So ist für Rat- tenembryonen bekannt, dass frühere Stadien wie z.B. der
Gestationstag 9.0 eine eindeutige Notwendigkeit für die Anwesenheit von Pantothenat, Riboflavin, myo-Inositol, Folsäure und Niacinamid zeigt, wohingegen spätere embryonale Stadien (Tag 10.5) nur einen absoluten Bedarf an Riboflavin aufweisen. Diese Daten wurden jedoch durch Dialyseversuche ermittelt. Auch wenn einzelne Vitamine durch Lagerungsdauer des Serums sowie durch die Präzipitationsvorgänge im Kulturmedium nach der Erfindung verloren gegangen sein sollten, so ist doch davon auszugehen, dass immer ein gewisser Grundgehalt an Vitaminen darin noch enthalten ist, der abhängig vom eingesetzten Embryonalstadium, schon ausreichend sein kann, um Wachstum und Differenzierung der Embryonen in vitro angemessen zu ermöglichen.
Neben der zweckmäßigen Anreicherung des Kulturmediums mit Me- thionin (Coelho et al., 1989., Coelho et al., 1990) und Glucose (Ellington, 1987) ist eine zusätzliche Anreicherung in der Stufe C mit weiteren freien Aminosäuren und/oder Vitaminen, aber auch mit anderen in der Whole Embryo Literatur beschriebenen Wachstumsfaktoren möglich, um eine hohe Proteinsynthese und insgesamt optimale Entwicklung der Embryonen in vitro zu garantieren.
Um bakterielles Wachstum oder das anderer Mikroorganismen infolge der verschiedenen Aufreinigungsschritte zu verhindern, ist eine nachträgliche, weitere Sterilisierung des Kulturmediums zu empfehlen, z.B. durch Verwendung von sterilen Filterkartuschen, wobei zu bedenken ist, dass wachstumsfördernde Komponenten wiederum verloren gehen könnten. Bakterielle Sterilität sowie der Ausschluss des Wachstums von Pilzen kann überprüft werden durch direkte Kulturtechniken in Flüssigmedien gemäß den üblichen Standardvorschriften. Sterilität gegenüber Mycoplasmen kann überprüft werden durch direkte Kulturtechniken in Flüssigmedien, Immunfluoreszenz und Färbung mit Hoechst Farbstoffen. Virale Sterilität kann nachgewiesen werden gemäß Verfahren 9CFR113.53. IgG' s können quantitativ mit dem Nephelometer gemessen werden. Endotoxine können gemessen werden im LAL Assay und sollten eine Konzentration von < 10 EU/ml, vorzugsweise 1-5 EU/ml, und bevorzugterweise < 1 EU/ml aufweisen. Hämoglobin kann spektrophotome- trisch gemessen werden und sollte einen Wert von < 20 mg/dl nicht überschreiten, vorzugsweise < 10 mg/dl und bevorzugterweise einen Wert < 3 mg/dl aufweisen.
Als letzte Maßnahme kann der Gesamtproteingehalt des Kulturmedi- ums eingestellt werden durch Konzentrierungs- als auch Verdünnungsmaßnahmen, um dasselbe auf einen gewünschten Kontrollbereich von 5-8 g/dl Gesamtprotein, vorzugsweise auf 6-7 g/dl, einzustellen. Gleichzeitig können Elektrolytlevels (K+, Na+, etc.) auf jedes gewünschte Level eingestellt werden; vor- zugsweise werden sie folgendermaßen eingestellt: [Na+] = 100-200 meq/Liter; [K+] = 1-20 meq/Liter; [Ca+2] = 1-5 meq/Liter. Bevorzugte Werte sind [Na+] = 150 meq/Liter; [K+] = 5-6 meq/Liter; [Ca+2] = 3-4 meq/Liter. Der pH-Wert wird auf 6-8, bevorzugt auf 7,5 bis 7,6 eingestellt. Die Osmolarität ist niedrig und sollte zwischen 280 und 320 mosm liegen, vorzugsweise zwischen 285 und 305 mosm.
Niedrige Endotoxinwerte sowie niedrige Hämoglobingehalte sind Indikatoren dafür, dass das Serum sorgfältig gesammelt und schnellstmöglich unter minimalster Zelllysis und minimalster Freisetzung von Mycoplasmen und Viren aufgearbeitet wurde. Hohe alpha-Globulingehalte, normale beta-Globulingehalte und niedrige Immunglobulingehalte sind wünschenswert. Serum von USDA-Qualität und/oder aus Ursprungsländern wie Neuseeland und Australien sind wichtige qualitative Voraussetzungen für das Verfahren zur Herstellung des Kulturmediums.
Das Kulturmedium nach der Erfindung ist lagerungsstabil bei minus 22 bis minus 24 °C für mindestens 2 Jahre.
Beispiele: Beispiel 1: Herstellungsweg eines Kulturmediums aus kommerziell erhaltlichen Komponenten (Fig. 1).
Stufe A. Ein bei minus 22 bis minus 24°C gelagertes, kommerziell erhältliches Serum von Feten (FCS) wird unter kontrollierten Bedingungen aufgetaut. Eine erste Fraktion, die schädliche Komponenten enthalt, prazipitiert dabei aus der Losung, die durch Filtration abgetrennt wird. Der abgetrennte erste Überstand wird wieder eingefroren. Nach dem erneuten Auftauen dieses sog. er- sten Uberstandes wird dieser mit einem adäquaten Gasgemisch zur Einstellung des pH versetzt und unter Rollbewegungen in einem Inkubator bei 37 °C gehalten, wobei eine zweite Fraktion aus dem Serum ausprazipitiert . Diese Fraktion enthalt Substanzen, die das Wachstum der kultivierten Embryonen eher behindern als fordern. Demgemass wird dieses zweite feste Retentat vom sog. zweiten Überstand durch Filtration abgetrennt und verworfen.
Stufe B. Ein bei minus 22 bis minus 24°C gelagertes, kommerziell erhältliches Serum adulter Rinder wird unter kontrollierten Bedingungen aufgetaut. Eine erste Fraktion, die schädliche Komponenten enthalt, prazipitiert dabei aus der Losung, die durch Filtration abgetrennt wird. Der abgetrennte erste Überstand wird wieder eingefroren. Nach dem erneuten Auftauen dieses sog. ersten Uberstandes wird dieser mit einem adäquaten Gasgemisch zur Einstellung des pH versetzt und unter Rollbewegungen in einem Inkubator bei 37 °C gehalten, wobei eine zweite Fraktion aus dem Serum ausprazipitiert. Diese Fraktion enthalt Substanzen, die mehr das Wachstum der kultivierten Embryonen behindern als fordern. Demgemass wird dieses zweite feste Retentat vom sog. zweiten Überstand durch Filtration abgetrennt und verworfen. Stufe C. Volumenmäßig gleiche oder unterschiedliche Anteile der zweiten Überstände aus Stufe A und Stufe B werden alsdann zusammengemischt .
Beispiel 2: Herstellungsweg eines Kulturmediums aus teilweise käuflichen Komponenten (Fig. 2).
Stufe A. Ein bei minus 22 bis minus 24 °C gelagertes, kommerziell erhältliches FCS wird unter kontrollierten Bedingungen aufge- taut. Eine erste Fraktion, die schädliche Komponenten enthält, prazipitiert dabei aus der Lösung, die durch Filtration abgetrennt wird. Der abgetrennte erste Überstand wird wieder eingefroren. Nach dem erneuten Auftauen dieses sog. ersten Überstandes wird dieser mit einem adäquaten Gasgemisch zur Einstel- lung des pH versetzt und unter Rollbewegungen in einem Inkubator bei 37 °C gehalten, wobei eine zweite Fraktion aus dem Serum ausprazipitiert. Diese Fraktion enthält Substanzen, die mehr das Wachstum der kultivierten Embryonen behindern als fördern. Demgemass wird dieses zweite feste Retentat vom sog. zweiten Über- stand durch Filtration abgetrennt und verworfen.
Stufe B. Ein bei minus 22 bis minus 24 °C gelagertes Serum einer adulten Spenderkuh, gewonnen nach dem Protokoll von Klug et al., (1985 a) , wird unter kontrollierten Bedingungen aufgetaut. Eine erste Fraktion, die schädliche Komponenten enthält, prazipitiert dabei aus der Lösung, die durch Filtration abgetrennt wird. Der abgetrennte erste Überstand wird wieder eingefroren. Nach dem erneuten Auftauen dieses sog. ersten Überstandes wird dieser mit einem adäquaten Gasgemisch zur Einstellung des pH versetzt und unter Rollbewegungen in einem Inkubator bei 37 °C gehalten, wobei eine zweite Fraktion aus dem Serum ausprazipitiert. Diese Fraktion enthält vermutlich Substanzen, die mehr das Wachstum der kultivierten Embryonen behindern als fordern. Demgemass wird dieses zweite feste Retentat vom sog. zweiten überstand durch Filtration abgetrennt und verworfen.
Stufe C. Volumenmaßig gleiche oder unterschiedliche Anteile der zweiten überstände aus Stufe A und Stufe B werden alsdann zusammengemischt .
Beispiel 3: Ausfuhrliche Beschreibung eines Verfahrens zur Her- Stellung eines Kulturmediums nach Beispiel 1.
Stufe A. Eine kommerziell erhaltliche 500-ml Flasche mit fetalem bovinem Serum wird unter leichten Schwenkbewegungen in einem Wasserbad aufgetaut. Nachdem das Serum sorgfaltig vermischt wurde, wird es unter sterilen Bedingungen portioniert, vorzugsweise in 50 ml Volumina, und und schnellstmöglich auf 15-20°C heruntergekühlt. Anschließend wird der erste überstand durch Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengroße von 0.22 μm abfiltriert vom festen ersten Pellet. Der sog. erste überstand wird dann durch Einbringen der Probe in einen Supercooler schnellstmöglich eingefroren, wo er bei minus 22 bis minus 24 °C verbleibt.
Am Versuchstag wird der sog. erste überstand wieder in einem Wasserbad aufgetaut, gefolgt von steriler Begasung des sog. 2. Uberstandes mit 5% C02, 10 % 02 und 85 % N2 für 1-10 Minuten, vorzugsweise für 2-5 Minuten, um den pH-Wert auf 6.5-8.5, vorzugsweise auf 7.0-8.0 und bevorzugterweise auf 7.4-7.6 einzustellen. Der sog. erste Überstand wird dann für 1-3 Stunden leicht rotiert, bevorzugterweise für 2 Stunden bei 37.0-37.5°C. Dem weiteren Aufreinigungsprozeß schließt sich danach eine sofortige Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengroße von 0.22 μm an, wobei das Pellet verworfen und der sog. zweite überstand gesondert aufgefangen und lichtgeschutzt gelagert wird bei 15 bis 20°C.
Stufe B. Eine kommerziell erhältliche 500-ml Flasche mit adultem bovinem Serum wird unter leichten Schwenkbewegungen einem Wasserbad aufgetaut. Nachdem das Serum sorgfaltig vermischt wurde, wird es unter sterilen Bedingungen portioniert, vorzugsweise 50 ml Volumina, und schnellstmöglich auf 15-20°C heruntergekühlt. Anschließend wird der erste überstand wird durch Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengroße von 0.2 μm abfiltriert vom festen ersten Pellet. Der sog. erste überstand wird dann durch Einbringen der Probe in einen Supercooler schnellstmöglich eingefroren, wo er bei minus 22 bis minus 24°C verbleibt.
Am Versuchstag wird der sog. erste überstand wieder in einem Wasserbad aufgetaut, gefolgt von steriler Begasung des sog. 2. Uberstandes mit 5% C02, 10 % 02 und 85 % N2 für 1-10 Minuten, vorzugsweise für 2-5 Minuten und bevorzugterweise für 3.5 Minuten, um den pH-Wert auf 6.5-8.5, vorzugsweise auf 7.0-8.0 und bevorzugterweise auf 7.4-7.6 einzustellen. Der sog. erste überstand wird dann für 1-3 Stunden bei 35-39°C leicht rotiert, bevorzugterweise für 2 Stunden bei 37.0-37.5°C. Dem weiteren Aufreinigungsprozess schließt sich danach eine sofortige Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengroße von 0.22 μm an, wobei das Pellet verworfen und der sog. zweite überstand gesondert aufgefangen und lichtgeschutzt gelagert wird
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Stufe C. Das Verfahren zur Herstellung des Kulturmediums nach der Erfindung wird fortgeführt, indem unter sterilen Bedingungen bestimmte Volumina des 2. Uberstandes aus Stufe A vermischt werden mit bestimmten Volumina des 2. Uberstandes aus Stufe B. In Stufe C kann zusatzlich angereichert werden mit essentiellen bekannten Wachstumsfaktoren, entweder vor oder nach der Ver- 5 einigung der Produkte aus Stufe A und Stufe B.
Beispiel 4: Ausfuhrliche Beschreibung eines Verfahrens zur Herstellung eines Kulturmediums nach Beispiel 2.
10 Stufe A. Eine kommerziell erhaltliche 500-ml Flasche mit fetalem bovinem Serum wird unter leichten Schwenkbewegungen in einem Wasserbad aufgetaut. Nachdem das Serum sorgfaltig vermischt wurde, wird es unter sterilen Bedingungen portioniert, vorzugsweise in 50 ml Volumina, und schnellstmöglich auf 15-20°C herun-
15 tergekuhlt. Anschließend wird der erste Überstand wird durch Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengroße von 0.22 μm abfiltriert vom festen ersten Pellet. Der sog. erste überstand wird dann durch Einbringen der Probe in einen Supercooler schnellstmöglich eingefroren, wo er bei minus
20 22 bis minus 24 °C verbleibt.
Am Versuchstag wird der sog. erste überstand wieder in einem Wasserbad aufgetaut, gefolgt von steriler Begasung des sog. 2. Uberstandes mit 5% C02, 10 % 02 und 85 % N2 für 1-10 Minuten,
25 vorzugsweise für 2-5 Minuten, um den pH-Wert auf 6.5-8.5, vorzugsweise auf 7.0-8.0 und bevorzugterweise auf 7.4-7.6 einzustellen. Der sog. erste Überstand wird dann für 1-3 Stunden bei 35-39°C leicht rotiert, bevorzugterweise für 2 Stunden bei 37.0-37.5°C. Dem weiteren Aufreinigungsprozess schließt sich
30 danach eine sofortige Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengroße von 0.22 μm an, wobei das Pellet verworfen und der sog. zweite Überstand gesondert aufgefangen und lichtgeschützt gelagert wird bei 15 bis 20°C.
Stufe B. Serum wird von einer gesunden, vorzugsweise nicht trächtigen Spenderkuh nach bekanntem Verfahren gewonnen, aufgearbeitet (Klug et al., 1985a) und eingefroren gelagert in 50 ml Volumina (Glasflaschen) . Bei Bedarf wird dieses Serum dann in einem 37 °C Wasserbad aufgetaut. Nachdem das Serum sorgfältig vermischt wurde, wird es auf 15-20°C heruntergekühlt. Anschließend wird der erste Überstand wird durch Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengröße von 0.2 μm abfiltriert vom festen ersten Pellet. Der sog. erste Überstand wird dann durch Einbringen der Probe in einen Supercooler schnellstmöglich eingefroren, wo er bei minus 22 bis minus 24 °C verbleibt.
Am Versuchstag wird der sog. erste Überstand wieder in einem
37 °C Wasserbad aufgetaut, gefolgt von steriler Begasung des sog.
2. Überstandes mit 5% C02, 10 % 02 und 85 % N2 für 1-10 Minuten, vorzugsweise für 2-5 Minuten, um den pH-Wert auf 6.5-8.5, vorzugsweise auf 7.0-8.0 und bevorzugterweise auf 7.4-7.6 einzustellen. Der sog. erste Überstand wird dann für 1-3 Stunden bei 35-39°C leicht rotiert, bevorzugterweise für 2 Stunden bei 37.0-37.5°C. Dem weiteren Aufreinigungsprozess schließt sich danach eine sofortige Filtration des Serums durch eine Filterkartusche mit einer Porengröße von 0.22 μm an, wobei das Pellet verworfen und der sog. zweite Überstand gesondert aufgefangen und lichtgeschützt gelagert wird bei 15 bis 20°C.
Stufe C. Das Verfahren zur Herstellung des Kulturmediums nach der Erfindung wird fortgeführt, indem unter sterilen Bedingungen bestimmte Volumina des 2. Überstandes aus Stufe A vermischt werden mit bestimmten Volumina des 2. Uberstandes aus Stufe B. Stufe C kann zusätzlich angereichert werden mit essentiellen bekannten Wachstumsfaktoren, entweder vor oder nach der Vereinigung der Produkte aus Stufe A und Stufe B.
Beispiel 5: Anwendungsgebiete
Das Kulturmedium nach der Erfindung ist nützlich in allen Anwendungsgebieten der Zeil- und Gewebekultur, in denen auch FCS benutzt wird. Es kann als kostengünstiges Ersatzkulturmedium eingesetzt werden, da viele Zellinien darin angezuchtet werden können. Auf Anwendungsgebiet betragt der Gehalt an Serum dann nur 2-20 Volumenprozent, bevorzugterweise ungefähr 10%. Das Anwendungsgebiet umfasst Monolayerkulturen, Suspensionskulturen und Clonierungskulturen. Das bedeutendste Anwendungsgebiet für das Kulturmedium nach der Entwicklung besteht jedoch als Kulturmedium ganzer Nagerembryonen speziell für die Kultivierung von Embryonen der Ratte, und der Maus
Beispiel 6: Kulturtechnik und Testansatz ganzer Embryonen für den Gestationstag 9,5)
Trachtige Ratten vom Gestationstag 9,5; wobei die ersten 24 Stunden nach der Verpaarung „Tag 0" genannt werden (unter Nach- weis von Spermien im Vagmalabstrich) , wurden durch Dekapitation getötet und deren Embryonen basierend nach der Kulturtechnik von Steele et al . (1974), New et al. (1976) und Klug et al. (1985a) für 48 Stunden kultiviert. Die Embryonen wurden vor Einsatz in die Kultur gestaged nach Brown et al. (1991), und nur mittlere Headfold-Stadien (mit 2 und 3 Somiten) wurden in den Testansatz aufgenommen. Je 3-4 Embryonen wurden dafür m rotierenden Penicillmflaschen (25 rpm) bei 38,5°C in 7 ml Kulturmedium für 48 Stunden kultiviert. Die mit dem Kulturmedium und den Embryonen beschickten Kulturflaschen wurden initial begast mit 10% 02/ 5% C02 und 85% N2. Nach 36 Stunden Kultur wurden die Kulturflaschen erneut begast, jetzt aber mit einem Gasgemisch von 50% 02, 5% C02 und 45% N2. Am Ende des Kulturzeitraums von 48 Stunden wurden die Embryonen bezuglich Wachstum und Entwicklung auf Basis eines Scormg- systems (Brown et al. (1981) und Klug et al, (1985a) beurteilt sowie der Proteingehalt des Embryos ermittelt.
Daten in den Tabellen 1 bis 5 geben die Medianwerte (mittlere Zahl m der betreffenden Spalte) als auch das dritte Quartil (obere Zahl m der betreffenden Spalte) und das erste Quartil (untere Zahl in der betreffenden Spalte) wieder.
Die Testansatze (Tabelle 1-5) bestanden immer aus 6 ml Testserum und 1 ml Puffer, wobei allen bovinen Testseren über den zugesetzten Puffer pro ml Kulturmedium zusätzlich 3 mg D+-Glukose und 75 μg Methionm zugesetzt wurde, da bekannt ist, daß bovine Seren im Allgemeinen weniger Glukose als Rattenserum enthalten und zusätzlich Methionm benotigen, um den Schluß des Neural- rohrs zu gewährleisten und um somit weitere Fehlbildungen zu verhindern.
Tabelle 1 zeigt die Kulturergebnisse von Tag 9,5 Rattenembryonen nach 48 Stunden Kultur. Rattenserum, von Spendertieren nach Steele et al. (1974) und New et al. (1976) gewonnen und aufbereitet, kam unsupplementiert zum Einsatz (6 ml Rattenserum plus 1 ml Puffer) und diente als Referenz. Es wurden ausgetestet verschiedene Chargen adultes bovmes Serum nach Klug et al., (1985a) sowie 2 verschiedene Chargen kommerziell erhältliches FCS höchster Qualität sowie Kulturmedien nach Beispiel 2/4. Alle Seren wurden für 30 Min einer Hitzebehandlung bei 56°C unterzogen. Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Kulturmedien ein deutlich besseres Wachstum und eine bessere sowie normale Differenzierung der Embryonen ermöglicht als adultes bovines Serum nach Klug et al., (1985a). Das erfindungsgemäße Kulturmedium ermöglicht dies bis zu einer starken Verschiebung der Volumenanteile von Stufe A und Stufe B, nämlich bis auf 5 Volumenanteile FCS (Stufe A) und 1 Volumenanteil adultes bovines Serum (Stufe B) . FCS als Kulturmedium ist nicht förderlich und führt zu einer hohen Fehlbildungsrate, einem sehr niedrigen Proteinwert und mangelhaftem Längenwachstum (CR) .
Tabelle 2 demonstriert die Kulturergebnisse von Tag 9.5 Rat- tenembryonen nach 48 Stunden Kultur. Es wurde speziell die Dauer der Hitzeinaktivierung variiert. Die Ergebnisse zeigen, daß adultes Serum, welches nach Klug et al., (1985a) gewonnen und aufgearbeitet wurde, einer Hitzeinaktivierung unterzogen werden muß, wohingegen FCS nicht hitzebehandelt werden darf (vergleiche hierzu auch mit hitzebehandeltem FCS, Tabelle 1) . Das Kulturmedium nach Beispiel 1/3 als auch die Kulturmedien nach Beispiel 2/4 ermöglichen ein besseres Wachstum sowie eine normale Differenzierung der Embryonen in vitro als das Kulturmedium nach Klug et al., (1985a), (vergleiche hierzu auch mit Tabelle 1).
Beispiel 7: Kulturtechnik und Testansatz der Embryonen für den Gestationstag 10,1
Trächtige Ratten vom Gestationstag 10,1; wobei die ersten 24 Stunden nach der Verpaarung „Tag 0" genannt werden (unter Nachweis von Spermien im Vaginalabstrich) , wurden durch Dekapitation getötet und deren Embryonen basierend nach der Kulturtechnik von Steele et al. (1974) und New et al . (1976), und in Anlehnung an die Basistechnik von Klug et al. (1985a) für 50 Stunden kultiviert. Die Embryonen wurden vor Einsatz in die Kultur gestaged nach Fujinaga et al. (1995), und nur Embryonen des Stadiums 12 (8 Somiten) und Stadium 13 (9 Somiten) wurden in den Testansatz aufgenommen.
Je 3 Embryonen wurden dafür in rotierenden Penicillinflaschen (25 rpm) bei 38,5°C in 7 ml Kulturmedium für 50 Stunden kul- tiviert. Die mit dem Kulturmedium und den Embryonen beschickten Kulturflaschen wurden initial begast mit 15% 02, 5% C02 und 80% N2. Nach 36 Stunden Kultur wurden die Kulturflaschen erneut begast, jetzt aber mit einem Gasgemisch von 40% 02, 5% C02 und 55% N2 und ein drittes Mal nach 43 Stunden mit 85% 02, 5% C02 und 10% N2. Am Ende des Kulturzeitraums von 50 Stunden wurden die Embryonen bezüglich Wachstum und Entwicklung auf Basis eines Scoring- systems (Brown et al. (1981) und Klug et al, (1985a) beurteilt sowie der Proteingehalt des Embryos ermittelt.
Tabelle 3 zeigt die Kulturergebnisse von Tag 10.1 Rattenembryonen nach 50 Stunden Kultur. Rattenserum, von Spendertieren nach Steele et al. (1974) und New et al . (1976) gewonnen und aufbereitet, kam unsupplementiert zum Einsatz (6 ml Rattenserum plus 1 ml Puffer) und diente als Referenz. Es wurden ausgetestet, kom- merziell erhältliches FCS und kommerziell erhältliches adultes Rinderserum, welche beide ebenfalls für 30 Min. bei 56°C hitzebehandelt wurden. Die Ergebnisse zeigen, daß nur das Rattenserum ein gutes Wachstum und eine normale Differenzierung der Embryonen ermöglicht.
Tabelle 4 demonstriert die Kulturergebnisse von Tag 10.1 Rattenembryonen nach 50 Stunden Kultur im Kulturmedium nach Beispiel 1/3 bzw. 2/4. Es wurden ausgetestet verschiedene kommerziell erhältliche FCS und verschiedene kommerziell erhältliche adulte Rinderseren. Alle adulten Seren wurden dabei einer Hitzebehandlung unterzogen. Die Ergebnisse zeigen, daß das Kul- turmedium nach Beispiel 1/3 bzw. 2/4 ein gutes Wachstum und eine normale Differenzierung der Embryonen in vitro ermöglicht, und daß das kommerzielle adulte Serum qualitativ hochwertig sein sollte.
Tabelle 5 demonstriert im direkten Vergleich die Kulturergebnisse von Tag 10.1 Rattenembryonen nach 50 Stunden Kultur in verschiedenen Kulturmedien. Die Ergebnisse zeigen, daß das Kulturmedium nach Beispiel 1/3 ebenso wie nach 2/4 ein gutes Wachstum und eine normale Differenzierung der Embryonen in vitro ermöglicht; daß eine zusätzliche Anreicherung des Kulturmediums mit Vitaminen vorteilhaft ist und daß eine strenge Stadieneinteilung bei Selektion der Embryonen für die Kultur zu erfolgen hat.
Tabelle 1. Kulturergebnisse von Tag 9,5 Rattenembryonen nach 48 Stunden Kultur in vitro in verschiedenen Kulturmedien.
Testserum Quelle Stufe t n CR Som Score Prot Abn C (56°C) (mm) (n) (μg/E) (%)
Nach dem Stand der Technik:
4,02 27 39 307,5
Rattenserum FU 30' 13 3,90 27 39 305,8 0
3,78 27 39 282,5 3,30 25 36 196,6
BS (lot 4/99) FU 30' 16 3,15 24 36 164,8 18,8
3,06 23 34 150,3 3,27 24 35 199,4
BS (lot 6/99) FU 30' 11 3,18 23 35 169,6 9,1
3,12 23 35 158,1 2,94 25 28 127,0
FCS 1 G 30' 13 2,85 24 25 109,8 53,8 2,70 22 23 84.6
Nach Beispiel 2 und 4:
3,48 26 38 224,0
FCS ' + G/FU 2+1 30730' 12 3,48 25 36 211,8 0 BS (lot 6/99) 3.42 24 34 189,0
3,44 25 36 202,8
FCS ' + G/FU 5+1 30730' 14 3,33 24 35 201,1 7,1 BS (lot 6/99) 3,27 24 34 187,1
3,72 27 38 256,0
FCS 2 + G/FU 1+1 30730' 15 3,60 27 37 225,2 0 BS (lot 4/99) 3,45 26 36 213,4 3,72 28 38 245,1
FCS ] + G/FU 1+1 30730' 15 3,48 27 37 229,7 0 BS (lot 8/99) 3,36 27 37 209,2 3,72 27 37 246,3
FCS 2 + G/FU 1+1 30730' 10 3,63 27 36 217,1 0 BS (lot 8/99) 3,45 26 36 200,4
FCS ' kommerziell erhältliches FCS von sehr hoher Qualität
FCS 2 kommerziell erhältliches FCS von sehr hoher Qualität, empfohlen für embryonale Stammzellen Tabelle 2. Kulturergebnisse von Tag 9,5 Rattenembryonen nach 48 Stunden Kultur in vitro in verschiedenen Kulturmedien unter Austestung verschiedener Hitzeinaktivierungsschemata.
Testserum Quelle Stufe t n CR Som Score Prot Abn
C (56°C) (mm) (n) (μg E) (%)
Nach dem Stand der Technik:
3.12 25 34 157.4
FCS 12 3,03 24 33 138,0 16,6
2,91 23 125,9
BS FU 12 100
3,54 24 32 212,6
BS FU 15' 16 3,27 24 30 174,4 62,5
3,14 22 24 155,4
Nach Beispiel 1 und 3:
3.66 27 38 218,3 FCS + cBS H/H 1+1 0730' 12 3,60 27 37 204,0
3,36 26 36 167,7
Nach Beispiel 2 und 4:
3,59 26 37 238, 1
FCS + BS G/FU 1+1 30730' 26 3,42 26 36 224,2
3.36 25 36 204,4
3.72 28 38 237,5
FCS + BS G/FU 1 + 1 0730' 3,66 27 38 225,5
3,50 27 37 201 ,0
3.72 28 38 229,8
FCS + BS G/FU 1 + 1 0715' 15 3,66 27 38 217,5 6,6
3.43 27 36 192.8
3.72 28 38 275,5
FCS + BS G/FU 1+1 0745' 14 3,72 28 38 263,5
3,60 27 38 249,8
24 27 192.0
FCS + BS G/FU 1 + 1 070' 16 n.d. 22 26 177,0 100
20 23 150,8
* Nicht meßbar, da alle Embryonen fehlgebildet waren. Tabelle 3. Kulturergebnisse von Tag 10,1 Rattenembryonen nach 50 Stunden Kultur in vitro in verschiedenen Kulturmedien.
Testserum Quelle Stufe t n CR Som Score Prot Abn
C (56°C) (mm) (n) (μg E) (%)
Nach dem Stand der Technik:
4,44 33 49 578.4
Rattenserum FU 30' 4,38 32 49 548,0
4,23 32 49 536,0
3.54 28 36 163,2
FCS 0' 26 3,36 26 33 131 ,6 100
3.12 24 31 93.6
3,54 28 35 214,8 cBS 30' 13 3,48 27 34 181,2 100
3,30 26 32 158,4
3.87 27 39 293,7 cBS H so- io 3,78 27 37 259,4 100
3.62 24 33 21 1,0
Epicard des Herzens leicht aufgebläht bei 3 Embryonen.
Tabelle 4. Kulturergebnisse von Tag 10,1 Rattenembryonen nach 50 Stunden Kultur in vitro in verschiedenen bovinen Kulturmedien.
Testserum Quelle Stufe t n CR Som Score Prot Abn
C (56°C) (mm) (n) (μg/E) (%)
Nach Beispiel 1 und 3.
4 32 30 46 368 8
FCS + cBS G/P* 1+1 0730' 33 4,14 30 45 300,4 13,3
3,84 29 41 253 6 4,61 32 48 41 .2
FCS + cBS G/H 1+1 0730" 15 4,50 32 48 410,0 0
4,38 32 48 389 5 4,32 31 47 411 6
FCS + cBS H/H 1+1 0730' 15 4,26 31 47 381,6 0
4,20 31 47 355 6 4,86 33 48 516,0
FCS + cBS H/H 1+1 0730' 16 4,71 33 48 494,0 0
+ Vitamine ' 4,56 32 48 460,8
Nach Beispiel 2 und 4:
4,80 31 49 504,4
FCS + BS G FU 1+1 0730' 41 4,62 31 48 466,4 0
4,50 31 46 446.7 4,50 31 47 360.4
FCS + BS G/FU 5+1 0730' 1 1 4,35 30 47 330,0 1 1,1
4,14 30 44 2596
P* Kommerzielles adultes Serum aus mittlerem Preissegment. ' Zusatz von 0,2 μg/ml Riboflavin und 12.0 μg/ml myo-Inositol. Tabelle 5. Kulturergebnisse von Tag 10,1 Rattenembryonen nach 50 Stunden Kultur in vitro in verschiedenen bovinen Kulturmedien.
Testserum >•« Quelle Embryonaln CR Som Score Prot Abn stadium (mm) (n) (με/E)
Nach Beispiel 1 und 3:
4,35 31,5 46,5 374,2
FCS + cBS H/H stage 12/6s 8 4,20 31,0 45,0 332,4 0 + Vitamine 4 3.90 30,0 44,0 324,6 4,61 32,0 48,0 456,8
FCS + cBS H/H stage 12/7s 4 4,50 32,0 48,0 445,2 0 + Vitamine 4 4,38 31,8 48,0 443,3 stage 12/8s 4,88 33,3 48,0 521,6
FCS + cBS H/H stage 13/9s 12 4,77 33,0 48,0 511,4 0 + Vitamine 4 4.56 33,0 48,0 485,3
FCS + cBS H/H stage 13/10s + Vitamine 4
Nach Beispiel 2 und 4:
FCS + BS G/FU stage 12/6s
4,40 31,0 47,0 440,1
FCS + BS G/FU stage 12/7s 12 4,32 31,0 47,0 411,3 0
4,20 30,0 47,0 397,3 stage 12/8s 4,80 31,0 49,0 504,4
FCS + BS G/FU stage 13/9s 41 4,62 31,0 48,0 466,4 0
4,50 31,0 46,5 446,7 4,89 33,0 49,0 546,6
FCS + BS G/FU stage 13/lOs 3 4,86 33,0 49,0 532,4 0
4,83 33,0 49,0 524.6
BS und cBS wurden für 30 Min. bei 56 °C hitzeinaktiviert. FCS wurde nicht hitzeinaktiviert. Stufe C war bei allen Kulturmedien 1 + 1. Zusatz von 0,2 μg/ml Riboflavin und 12,0 μg/ml myo-Inositol. Literatur
Brent R. L. and Fawcett L. B. (1998) Nutritional studies of the embryo during early organogenesis with normal embryos and embryos exhibiting yolk sac dysfunction. J. Pediatrics 132 (2), S6-S16. Brown N.A. and Fabro S.E. (1981) Quantification of rat embryonic development in vitro: a morphological scoring System. Teratology
24, 65-78. Chatot C.L., Klein, N.W., Piotec J. and Pierro J. (1980) Successful culture of rat embryos in human serum: Use in the detection of teratogens.
Science, N.Y. 207, 1471-1473. Cockroft D.L. (1977) Post implantation embryo culture. In: Methods of
Prenatal Toxicology, pp 231-240, Georg Thieme Publ., Stuttgart. Cockroft D.L. (1988) Changes with gestational age in nutritional requirements of postimplantation rat embryos in culture.
Teratology 38, 281-290. Coelho C.N., Weber J.A., Klein N.W., Daniels W.G. and Hoagland T.A.
(1989) Whole rat embryos require methionine for neural tube closure when cultured on cow serum. J. Nutr. 119 (11), 1716-
1725. Coelho C.N. and Klein N.W. (1990) Methionine and neural tube closure in cultured rat embryos. Morphological and biochemical analyses.
Teratology 42: 437-451. Ellington S.K. (1987) In vitro analysis of glucose metabolism and embryonic growth in postimplantation rat embryos. Development
100: 431-439. Fennema. O. (1982) Food Protein Deterioration: Mechanisms and
Functionality. American Chemical Society, 206: 109-129. Flick B, Kastner U, Klug S. (1999) Poster, präsentiert auf der Tagung
DGPT in Mainz, 1999. Fujinaga M., Hoffman B.B. and Baden J.M. (1995) Axial rotation in rat embryos: Morphological analysis and microsurgical study on the role of the allantois. Teratology, 51 94-106. Gupta M. and Beck F. (1983) Growth of 9.5-day old rat embryos in human serum. J. Embryol. exp. Morp. 76, -1-8. ' Kitchin K.T., Schmidt B.T. and Sanyal M.K. (1986) Rodent whole-embryo culture as a teratogen screening method. Methods Find. Clin.
Pharmacol. 8(5), 291-301. Klug S., Lewandowski C. and Neubert D. (1985 a) Modification and standardization of the culture of early post-implantation embryos for toxicological studies. Archs Toxicol. 58, 84-88. Klug S., Lewandowski, C, Wildi L. and Neubert D. (1990) Bovine serum:
An alternative to rat serum as a culture medium for the rat whole embryo culture. Toxicol. In Vitro 4(4/5), 598-601. New D.A.T. (1966a) The culture of vertebrate embryos. Logos Press,
London. New D.A.T. (1966b) Development of rat embryos cultured in blood sera.
J. Reprod. Fertil. 12, 509-524. New D.A.T. ( 1967) Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morph. 17, 513-525. New D A T., Coppola P.T. and Cockroft D.L, (1976) Improved development of head-fold rat embryos in culture resulting from low oxygen and modifications of the culture serum. J. Reprod. Fertil.
48, 219-222. New D.A.T. (1978) Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biol. Rev. 53, 81-122. Schmid B.P., Honegger P. and Kucera P. (1993) Embryonic and fetal development: Fundamental research. Reprod. Toxicol. 7, 155-164. Shephard T.H., Tanimura T. and Robkin M. (1970) Energy metabolism in early mammalian embryos. Dev. Biol. (Suppl). 4, 42-58. Steele C.E. and New D.A.T. (1974) Serum variants causing the formation of double hearts and other abnormalities in explanted rat embryos.
J. Embryol. exp. Morp. 31, 707-719. Steele C.E. (1985) Human serum as a culture medium for rat embryos.
Experientia 41 (12), 1601-1603. Die folgenden Abkürzungen wurden verwendet:
%- Prozent μ- mikro- μg/E- Microgramm pro Embryo
°C- Grad Celsius
1+1- ein Nolumenanteil Stufe A plus ein Volumenanteil Stufe B
2+1- zwei Volumenanteile Stufe A plus ein Volumenanteil Stufe B
5+1- fünf Volumenanteile Stufe A plus ein Volumenanteil Stufe B
Abn- Abnormitäten in der embryonalen Differenzierung pro Embryo und Testansatz
BS- adultes Rinderserum eigener Herstellung von einer Spenderkuh aus eigener Herde cBS- käufliches adultes Rinderserum eines kommerziellen Anbieters
Ca- Kalzium
CO2- Kohlendioxyd
CR- Scheitel-Steiß-Länge
EGF- Epidermal Growth Factor et al.- und andere Autoren
FCS- Fetales Kälberserum
FU Institut für Klinische Pharmakologie und Toxikologie der Freien Universität Berlin
G- kommerzieller Anbieter (Νr.1) von Serum gm- Gramm
H- kommerzieller Anbieter (Νr.2) von Serum h- Stunde(n)
IGF- Insulin-Like Growth Factor
K- Kalium
L- Liter
M- Molar mg- Milligramm min- Minute(n) ml- Milliliter mm - Millimeter mM - Millimolar mosm- Milliosmol (μmol/Kg) n - Anzahl der in vitro getesteten Embryonen pro Testansatz
N2- Stickstoff
Na- Natrium nm- Nanometer
O2- Sauerstoff
P kommerzieller Anbieter (Nr.3) von Serum
Prot- Proteingehalt des ganzen Embryos nach Entfernen der Hüllen rPL-1 rat placental lactogen
Quelle Hersteller, bzw. kommerzieller Anbieter des Testserums rpm - Umdrehungen pro Minute
Score - Bewertungsschema (siehe Brown und Fabro 1981)
Som - Somiten
Stufe C Produkt aus Stufe A und B t- angewendete Temperatur bei der Hitzeinaktivierung
VEGF- Vascular Endothelial Growth Factor
Verd- Verdünnung des Testserums

Claims

Patentansprüche :
1. Kulturmedium enthaltend:
a) 1 - 99 Vol.-% fetalem Säugerserum, insbesondere FCS, und b) 1 - 99 Vol.-% adultes Säugerserum, insbesondere adultes Rinderserum,
wobei die Summe der Anteile der Komponenten a) und b) stets 100 Vol.-% beträgt.
2. Kulturmedium nach Anspruch 1, enthaltend
a) 20 - 80 Vol.-%, vorzugsweise 40 - 60 Vol.-% FCS und b) 20 - 80 Vol.-%, vorzugsweise 40 - 60 Vol.-% adultes Rinderserum.
3. Kulturmedium nach 7Anspruch 1 oder 2, wobei die Komponente a) hitzeinaktiviert ist.
4. Kulturmedium nach Anspruch 3, wobei die Hitzeinaktivierung für zumindest 5 min., vorzugsweise zumindest 15 min., höchstvorzugsweise für zumindest 30 min., bei 40 bis 70 °C, vorzugsweise bei 50 bis 60 °C, insbeson- dere bei 56 °C, durchgeführt ist.
5. Kulturmedium nach einem der 7λnsprüche 1 bis 4, wobei die Komponente b) nicht hitzeinaktiviert ist.
6. Kulturmedium nach einem der 7Λnsprüche 1 bis 5, wobei kein Rattenserum enthalten ist.
7. Kulturmedium nach einem der 7Ansprüche 1 bis 6, enthal- tend als weitere Komponenten, bezogen auf 100 Gewichtsteile der Komponenten a) und b) :
c) 0,005 bis 0,5, vorzugsweise 0,01 bis 0,1, insbesondere 0,05, Gewichtsteile eines Zuckers oder einer Mischung aus Zuckern und/oder
d) 0,0001 bis 0,01, vorzugsweise 0,0005 bis 0,005, insbesondere 0, 00125 Gewichtsteile einer natürlichen oder synthethischen Aminosäure und/oder
1 bis 100, vorzugsweise 10 bis 40, insbesondere 16,7, Gewichtsteile einer Pufferlösung.
8. Kulturmedium nach Anspruch 7, wobei der Zucker D+- Glucose und/oder die Aminosäure Methionin ist.
9. Kulturmedium nach einem der 7Λnsprüche 1 bis 8 dadurch erhältlich, daß A) die Komponente a) den folgenden Verfahrensschritten unterworfen wird:
AI) die Komponente a) wird auf 15 bis 20 °C abgekühlt,
A2) dann wird eine Filtration mit einer Ausschlußgrenze im Bereich von 100 bis 500 nm, vorzugsweise von 200 bis 250 nm, durchgeführt,
A3) optional wird das in Stufe A2 ) erhaltene Filtrat auf eine Temperatur unter -10°C, vorzugsweise unter -20°C, eingefroren und optional für einen Zeitraum von zumindest 1 Tag, vorzugsweise zumindest 6 Tage, zwischengelagert,
A4) anschließend erfolgt bei einer Temperatur von 30 bis 45 °C, vorzugsweise 35 bis 40 °C, insbesondere 37°C; eine Begasung für eine Dauer von 0,1 bis 100 min., vorzugsweise 1 bis 10 min., höchstvorzugsweise 2 bis 5 min., mit einer Mischung aus C02, 02 und N2, gefolgt von einer Inkubation bei gleicher Temperatur, wobei ein pH von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise von 7,0 bis 8,0, höchstvorzugsweise von 7,4 bis 7,6, eingestellt wird,
A5) danach erfolgt eine Filtration gemäß Stufe A2),
A6) das in Stufe A5 erhaltene Filtrat wird der Stufe C zugeführt,
B) die Komponente b) wird den folgenden Verfahrenstufen zugeführt : Bl) optional erfolgt eine Hitzeinaktivierung,
B2) es wird eine Filtration mit einer Ausschlußgrenze im Bereich von 100 bis 500 nm, vorzugsweise von 200 bis 250 nm, durchgeführt,
B3) optional wird das in Stufe B2) erhaltene Filtrat auf eine Temperatur unter -10°C, vorzugsweise unter -20°C, eingefroren und optional für einen Zeitraum von zumindest 1 Tag, vorzugsweise zumindest 6 Tage, zwischengelagert,
B4) anschließend erfolgt bei einer Temperatur von 30 bis 45 °C, vorzugsweise 35 bis 40 °C, insbesondere 37°C; eine Begasung für eine Dauer von 0,1 bis 100 min., vorzugsweise 1 bis 10 min., höchstvorzugsweise 3 bis 5 min., mit einer Mischung aus C02, 02 und N2, gefolgt von einer Inkubation bei gleicher Temperatur, wobei ein pH von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise von 7,0 bis
8,0, höchstvorzugsweise von 7,4 bis 7,6, eingestellt wird,
B5) danach erfolgt eine Filtration gemäß Stufe B2),
B6) das in Stufe B5 erhaltene Filtrat wird der Stufe C zugeführt,
C) die Produkte aus den Stufen A6) und B6) werden ite- inander in Anteilen gemäß Anspruch 1 gemischt.
0. Verfahren zur Herstellung eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit den folgenden Merkmalen:
A) die Komponente a) den folgenden Verfahrensschritten unterworfen wird:
AI) die Komponente a) wird auf 15 bis 20 °C abgekühlt,
A2) dann wird eine Filtration mit einer Ausschlußgrenze im Bereich von 100 bis 500 nm, vorzugsweise von 200 bis 250 nm, durchgeführt,
A3) optional wird das in Stufe A2) erhaltene Filtrat auf eine Temperatur unter -10°C, vorzugsweise unter -20°C, eingefroren und optional für einen Zeitraum von zumindest 1 Tag, vorzugsweise zumindest 6 Tage, zwischengelagert,
A4) anschließend erfolgt bei einer Temperatur von 30 bis 45 °C, vorzugsweise 35 bis 40 °C, insbesondere 37°C; eine Begasung für eine Dauer von 0,1 bis 100 min., vorzugsweise 1 bis 10 min., höchstvorzugsweise 2 bis 5 min., mit einer Mischung aus C02, 02 und N2, gefolgt von einer Inkubation bei gleicher Temperatur, wobei ein pH von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise von 7,0 bis 8,0, höchstvorzugsweise von 7,4 bis 7,6, eingestellt wird,
A5) danach erfolgt eine Filtration gemäß Stufe A2),
A6) das in Stufe A5 erhaltene Filtrat wird der Stufe C zugeführt, B) die Komponente b) wird den folgenden Verfahrenstufen zugeführt:
Bl) optional erfolgt eine Hitzeinaktivierung,
B2) es wird eine Filtration mit einer Ausschlußgrenze im Bereich von 100 bis 500 nm, vorzugsweise von 200 bis 250 nm, durchgeführt,
B3) optional wird das in Stufe B2 ) erhaltene Filtrat auf eine Temperatur unter -10°C, vorzugsweise unter -20°C, eingefroren und optional für einen Zeitraum von zumindest 1 Tag, vorzugsweise zumindest 6 Tage, zwischengelagert,
B4) anschließend erfolgt bei einer Temperatur von 30 bis 45 °C, vorzugsweise 35 bis 40 °C, insbesondere 37°C; eine Begasung für eine Dauer von 0,1 bis 100 min., vorzugsweise 1 bis 10 min., höchstvorzugsweise 2 bis 5 min., mit einer Mischung aus C02, 02 und N2, gefolgt von einer Inkubation bei gleicher Temperatur, wobei ein pH von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise von 7,0 bis 8,0, höchstvorzugsweise von 7,4 bis 7,6, eingestellt wird,
B5) danach erfolgt eine Filtration gemäß Stufe B2),
B6) das in Stufe B5 erhaltene Filtrat wird der Stufe C zugeführt, C) die Produkte aus den Stufen A6) und B6) werden miteinander in 7Anteilen gemäß Anspruch 1 gemischt.
11. Verwendung eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Kultivierung von Zellen, Geweben, oder Rodentenembryonen, insbesondere Embryonen, der Ratte und der Maus .
12. Verwendung eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem Verfahren zur Untersuchung von prospektiven Wirkstoffen auf teratogene Wirkung mit den folgenden Verfahrenstufen:
al) trächtigen Rodenten werden Rodentenembryonen entnommen und in ein Kulturmedium nach einem der 7Ansprüche 1 bis 10 eingebracht und kultiviert,
a2) dem Kulturmedium wird vor oder nach dem Einbringen der Rodentenembryonen der prospektive Wirkstoff in einer physiologisch wirksamen Dosis zugegeben,
a3) nach einer definierten Kultivierungsdauer werden die Rodentenembryonen auf Fehlbildungen und/oder Wachstumsretardierung untersucht .
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60304989T2 (de) 2003-02-18 2007-03-29 Clinique La Prairie Research S.A. Zusammensetzungen enthaltend fötales Hämoglobin und bakterielles Endotoxin und fakultativ zusätzliche fötale Leberkomponenten

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4473647A (en) * 1981-02-27 1984-09-25 Amf Inc. Tissue culture medium
US5409827A (en) * 1991-02-28 1995-04-25 Hyclone Laboratories, Inc. Blended bovine sera cellular growth media and their methods of production and use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4473647A (en) * 1981-02-27 1984-09-25 Amf Inc. Tissue culture medium
US5409827A (en) * 1991-02-28 1995-04-25 Hyclone Laboratories, Inc. Blended bovine sera cellular growth media and their methods of production and use

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COCKROFT D L: "CULTURE MEDIA FOR POSTIMPLANTATION EMBRYOS" REPRODUCTIVE TOXICOLOGY, Bd. 5, Nr. 3, 1991, Seiten 223-228, XP008007460 ISSN: 0890-6238 *
KLUG S ET AL: "BOVINE SERUM AN ALTERNATIVE TO RAT SERUM AS A CULTURE MEDIUM FOR THE RAT WHOLE EMBRYO CULTURE" TOXICOLOGY IN VITRO, Bd. 4, Nr. 4-5, 1990, Seiten 598-601, XP008007364 ISSN: 0887-2333 in der Anmeldung erw{hnt *
KLUG S ET AL: "The use of whole embryo culture to elucidate teratogenic mechanisms." TOXICOLOGY IN VITRO, Bd. 7, Nr. 6, 1993, Seiten 727-734, XP008007363 ISSN: 0887-2333 *
VAN MAELE-FABRY G ET AL: "SERA AS CULTURE MEDIA FOR 8.5 DAYS WHOLE MOUSE EMBRYOS" ARCHIVES DE BIOLOGIE, Bd. 99, Nr. 4, 1988, Seiten 431-452, XP008007378 ISSN: 0003-9624 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022195589A2 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods and devices for ex-utero mouse embryonic development

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