CH638985A5

CH638985A5 - Verfahren zur herstellung eines tollwutimpfstoffes und danach erhaltener impfstoff.

Info

Publication number: CH638985A5
Application number: CH341479A
Authority: CH
Inventors: Klaus R Schell
Original assignee: Schweiz Serum & Impfinst
Priority date: 1979-04-10
Filing date: 1979-04-10
Publication date: 1983-10-31
Also published as: GB2048066B; DE3009064A1; GB2048066A; BE882684A; DE3009064C2; CA1127081A; FR2453651A1; US4255520A; FR2453651B1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung eines wesentlich verbesserten Tollwutimpfstoffes, der durch einen hohen Wirkstoffanteil im Verhältnis zu kontaminierenden Eiweissen und Fettstoffen, d.h. eine besonders hohe spezifische Aktivität gekennzeichnet ist, sowie der so erhaltene Impfstoff.

Tollwutimpfstoffe wurden bisher gewonnen aus Gehirnen von Kaninchen, Ratten oder Mäusen, in denen durch direkte intracerebrale Inokulation von Tollwutviren aus standardisierten Saatstämmen die Viren im lebenden Tier vermehrt wurden. Diese Verfahren sind mit verschiedenen Nachteilen verknüpft.

1. Die Züchtung der Viren erfolgt am lebenden Tier, das unter der Prozedur grossen Leiden ausgesetzt wird und schliesslich geopfert werden muss.

2. Die Inokulation am lebenden Tier, die Haltung der Tiere und die Ernte der Viren aus deren Gehirnen kann nicht unter so vollkommenen hygienisch einwandfreien und sterilen Bedingungen erfolgen wie z. B. bei Vermehrung der Viren in vitro oder im Ei.

3. Die Entnahme des Gehirns bei wenigen Tagen alten Kaninchen, Ratten oder Mäusen erfordert eine recht schwierige und aufwendige Operationstechnik. Ausserdem sind bei der Kleinheit und dickflüssigen Konsistenz dieser Gehirne die Verluste an Gehirnsubstanz erheblich.

4. Die an lebenden Tieren gezüchteten Viren sind mit Proteinen verunreinigt, die einen verhältnismässig hohen Gehalt an Myelin aufweisen, einer proteinhaltigen Substanz, die bei der Anwendung des Impfstoffes Anlass zu Nebenreaktionen gibt, die sich bis Encephalitis steigern können. Durch Verwendung von ganz jungen, nur wenige Tage alten Tieren für die Virusvermehrung kann der Myelingehalt reduziert aber nicht vermieden werden.

Eine Verbesserung wurde durch Vermehrung der Tollwutviren in Entenembryonen erzielt. Zum einen wird dadurch die Verwendung von lebenden Tieren vermieden und zum andern ist im embryonalen Gewebe der Gehalt an Myelin geringer wenn überhaupt schon vorhanden.

Trotzdem weist der aus Entenembryonen gewonnene Tollwutimpfstoff noch erhebliche Nachteile gegenüber dem

Idealimpfstoff auf. Die aus den Embryonen gewonnene Virussuspension enthält einen hohen Anteil an Proteinen, die sich aufgrund der Beschaffenheit der Suspension aus Zellen und Viren nach bekannten Methoden wirtschaftlich nicht oder nur unvollkommen abtrennen lassen. Je höher der Proteingehalt von Impfstoffen ist, umso mehr unerwünschte Nebenreaktionen treten bei dessen Anwendung auf. Diese können sich bei wiederholtem Impfen, das bei gewissen Berufsleuten wie Jägern, Förstern, Tierärzten unerlässlich ist, zu heftigen allergischen Abwehrreaktionen gegen das artfremde Eiweiss steigern.

Ein besserer Impfstoff lässt sich durch Vermehrung der Tollwutviren in diploiden Humanzellkulturen in vitro erzielen.

Vergleiche dazu: H. Koprowski, Laboratory Techniques in Rabies by M.M. Kaplan and H. Koprowski, WHO Mo-nograph Series No. 23, Chapter 28, pp. 256-60 (1973): Vaccine for man prepared in human diploid cells; T. J. Wiktor, Develop. biol. Standard, Vol. 37, pp 265-66, S. Karger, Basel 1978: Production and control of rabies vaccines made on diploid cells; T. J. Wiktor et al., Develop. biol. Standard, Vol. 40, pp 3-9 (1978): Development and clinical trial of rabies vaccine of tissue cultur.

Der so gewonnene Impfstoff enthält als Verunreinigung humane Proteine, welche weniger Nebenreaktionen erzeugen als artfremde Proteine. Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist die relativ geringe Vermehrungsrate der Tollwut-viren auf diploiden Fibroblastzellen, was eine 10-25fache Aufkonzentrierung für die Impfstoffherstellung nötig macht. Diese Methode ist daher nicht leistungsfähig genug, um den weltweiten Bedarf an Tollwutimpfstoff im Rahmen der wirtschaftlichen Möglichkeiten zu decken.

Es wurde nun ein ökonomisches Verfahren entwickelt und realisiert, welches die Nachteile der vorbekannten Methoden vermeidet und gleichzeitig einen Impfstoff liefert, der ein besseres Verhältnis von Antigenwert zu Proteingehalt aufweist und qualitativ dem Idealimpfstoff nahe kommt.

Dieses neue Verfahren zur Herstellung eines Tollwutimpfstoffes mit besonders hoher spezifischer Aktivität ist dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Ernte der in Geflügelembryos nach bekannter Methode vermehrten Tollwutviren nur die Köpfe der Embryos verwendet, aus dem daraus gewonnenen Zellextrakt den weit überwiegenden Teil der darin vorhandenen Substanzen geringerer und grösserer Dichte als der des Tollwutantigens weiter durch Differential-und Dichtegradientenzentrifugation abtrennt, während gleichzeitig das Tollwutantigen selektiv angereichert wird, und erhaltenes gereinigtes Antigenkonzentrat nach bekannten Methoden zum gebrauchsfertigen Impfstoff weiterverarbeitet.

Geeignete Geflügelarten für die Vermehrung der Tollwutviren in deren Embryonen schliessen ein Enten, Hühner und Wachteln.

Die beiden erfindungsgemässen Massnahmen, Verwendung nur der Köpfe der Embryos und die Dichte- und Dif-ferentialgradientenzentrifugation dienen dem selben Zweck, der Verminderung unerwünschter Fremdsubstanzen und der gleichzeitigen selektiven Anreicherung des gewünschten im-munogenen Wirkstoffes, und passen organisch ineinander, indem die Abtrennung der unerwünschten Proteine nur möglich ist, wenn der Virusanteil in den durch Zerkleinerung gewonnenen Zellextrakten so hoch ist, dass diese durch Verdünnung leicht fliessbar- und pumpfähig gemacht werden können, ohne dadurch den Virusgehalt unter das erforderliche Mass zu senken. Diese Konzentration wird erreicht, wenn man nur die Köpfe der Embryos verwendet, welche die höchste Virenkonzentration aufweisen, während die Embryonenrümpfe nur ca. 10% der Viren des Gesamtkörpers

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enthalten. Der erfindungsgemäss erhaltene Tollwutimpfstoff ist demnach besonders dadurch gekennzeichnet, dass er nur aus den Köpfen von Geflügelembryos, in denen das Tollwutvirus vermehrt wurde, geerntet worden ist.

Durch Ernte bloss der Embryonenköpfe wird die Viruskonzentration im Verhältnis zum Proteinanteil bereits um mehr als das 3fache gesteigert. Das erfindungsgemässe Verfahren wird beispielsweise wie folgt erläutert. Sterile En-tenembryonenkopfpools werden mit einer entsprechenden Menge von Phosphatpufferlösung in einem Blender zu einer 5 bis 33%igen Suspension homogenisiert. Zur Verdünnung können ausser Phosphatpuffer aus Di-Natrium-hydrogen-phosphat 0,75%, Kalium-dihydrogen-phosphat 0,145%, Natriumchlorid 0,48% in destilliertem Wasser (pH 7,4) auch andere in der Virusimpfstoffproduktion gebräuchliche Salzlösungen und sogar entsalztes Wasser verwendet werden, vorausgesetzt, dass man in einem pH-Bereich von 7 bis 8 bleibt. Die Abtrennung des überwiegenden Teils der restlichen Proteine erfolgt durch Differentialzentrifugation (= Vorreinigungszentrifugation) der verdünnten Suspension des feinst zerkleinerten Embryonenkopfhomogenisates bei etwa 10 000 x g bis 15 000 x g. Die anschliessende Dichtegradientenzentrifugation des Überstandes wird in an sich bekannter Weise bei 15 000 bis 90 000 x g mit Hilfe von verschieden konzentrierten Zuckerlösungen und von Pufferlösungen, d.h. in steigenden Zuckerkonzentrationen und in Pufferlösung, in an und für sich bekannter Weise durchgeführt. Dazu wird die vorgereinigte Suspension bei 15 000 bis 90 000 x g und einer Durchflussrate von 4 Lit./h über eine vorgelegte Sutfengradiente zunehmender Konzentrationen von Zucker (gewöhnlich Saccharose von 15 bis 55%) gepumpt. An den Fraktionen, die von den verschiedenen Dichten gesammelt werden, werden Dichte, Protein- und An-tigen-Gehalt sowie Sterilität bestimmt. Die antigenhaltigen Fraktionen werden gepoolt, nochmals geprüft und dann zur Vakzine weiterverarbeitet. Physiologische Salzlösungen jeder Art, z.B. der weiter oben genannte Phosphatpuffer, können zur Verdünnung eingesetzt werden.

Vergleiche dazu: Entenembryo Tollwutvakzine: J.M. Hoskins, Laboratory Techniques in Rabies by M.M. Kaplan et al., WHO Geneva 1973, Chapter 27, pp 243-55.

Dichtegradientenzentrifugation: J. Hilfenhaus et al., Journal of Biological Standardization 1976,4,263-271; M. Majer et al., Develop. biol. Standard, Vol. 37, pp 267-271 (1977);

P. Atanasiu et al., Develop. biol. Standard, Vol. 40, pp 35-44.

Durch diese selektiven Zentrifugationen werden etwa 85% des restlichen Proteingehaltes eliminiert. Damit kann der erfindungsgemäss erhaltene Impfstoff gegenüber üblichem Entenembryo-Tollwutimpfstoff bis zu 80fach verbessert werden.

Diese gewaltige Verbesserung ist auf die Verminderung des Proteingehaltes um etwa das 20fache und die gleichzeitige Freisetzung von sehr viel mehr Viren je Embryo zurückzuführen. Bei der Aufarbeitung gehen weniger Viren durch Bindung an Zelloberflächen sowie durch volumetrische und mechanische Verluste verloren. Die volumetrischen Verluste entstehen beim Abzentrifugieren von viel Zelltrümmern im Sediment, die mechanischen Verluste beim Zentrifugieren von viskoseren Suspensionen, bei der mehr Viren und Virusaggregate mitniedergeschlagen werden.

Die getroffenen Massnahmen zur Verbesserung des ToII-wutimpfstoffes lagen nicht auf der Hand.

Bei Infektion des Gehirns von jungen Säugern (Kaninchen, Ratten, Mäusen) durch cerebrale Inokulation von Toll wutviren ist es naheliegend, dass die Vermehrung der Viren zunächst im Gehirn erfolgt. Dasselbe ist nicht als selbst3 638 985

verständlich vorauszusetzen, wenn im angebrüteten Geflü-gelei die Inokulation in den Dottersack erfolgt. Es hat sich nun gezeigt (siehe Beispiel 2A), dass die Vermehrung auch in diesem Fall weit überwiegend, zu ca. 90% im Gehirn erfolgt, s wobei das Virus aus dem Dottersack in das Embryo wandert und dort das in Bildung begriffene Nervengewebe bevorzugt befällt. Dies war auch im Hinblick auf die bekannte Möglichkeit, Tollwutviren in Zellkulturen zu vermehren, die keine Verwandtschaft zu Nervengewebe aufweisen, nicht sicher io vorauszusehen. Vergi, dazu:

CA-PS 827 637 und 811 119: Vermehrung von Tollwutviren in vitro auf Hamsternieren-Zellkulturen.

T. J. Wiktor, Develop. biol. Standard, Vol. 37, pp 265-266 (S. Karger, Basel 1977)

i5 T. J. Wiktor et al., Develop. biol. Standard, Vol. 40, pp 3-9 (1978): Development and production of rabies vaccine on human diploid cells (Lungenfibroblasten).

P. Atanasiu et al., ibid. 40, pp 35-44 (1978): Human rabies vaccine on bovine fetal kidney cells.

20 A. L. van Wezel et al., ibid 40, pp 69-75 (1978): Production of rabies vaccine in dog kidney cells.

J.F. Lavender et al., Applied Microbiology, Sept. 1971, Vol. 22, No. 3, pp 358-365: Duck Embryo cell culture for rabies vaccine.

25 Es war auch nicht a priori zu erwarten, dass das erst in Bildung begriffene Embryo-Gewebe schon so ausgeprägt organspezifische und damit für Viren selektiv anfallige Zellen aufweist. Vergi, dazu: J.F. Lavender et al., loc. cit. Jedenfalls ist bis heute für die Herstellung von Toll wutimpfstoff durch 30 Vermehrung der Viren in angebrüteten Enteneiern stets der ganze Embryokörper geerntet und zur Herstellung des Virus- und Zellen-Homogenisates verwendet worden. Vergi, dazu: J.M. Hoskins, Laboratory Techniques in Rabies by M.N. Kaplan et al, WHO, 1973, Chapter 27, pp 243-55: 35 Duck-Embryo Vaccine.

Auch bei der analogen Herstellung von Tollwut-Lebend-Vaccine, wobei die Vermehrung auf Geflügeleiern erfolgt, wird das gesamte Embryo geerntet.

Vergi, dazu: H. Koprowski, Laboratory techniques in 40 Rabies, Chapter 26, pp. 235-42: Chicken Embryo Vaccine.

Durch die Verwendung der Embryonenköpfe allein wird nach dem Homogenisieren derselben eine Suspension erhalten, die eine sehr hohe Viruskonzentration aufweist. Sie lässt sich verdünnen und damit wie oben beschrieben in eine für 45 die Abtrennung der Proteine durch Differential- und Dichtegradientenzentrifugation erforderliche Form bringen. Bei Verwendung der ganzen Embryos, wie das in den bisher beschriebenen Verfahren stets geschieht, vergi. Hoskins loc. cit., entsteht nach der Homogenisierung des 33%igen Ex-50 traktes und Abzentrifugation der groben Teile mit etwa 2 600 Touren pro Minute eine Suspension, die verhältnismässig dickflüssig und daher nicht zur Dichtegradientenzentrifugation verwendbar ist.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene 55 Impfstoffkonzentrat zeichnet sich nicht nur durch seinen hohen Gehalt von weit über 100 Antigenwerteinheiten (gemessen am NIH Standard mittels des Standard NIH Tests in Mäusen und des RFFIT Tests) pro mg Stickstoff aus, er ist auch unter Verwendung von noch ungeborenen noch nicht 60 schmerzempfindenden Embryos erhalten worden, die zudem in ihrem erst in Entwicklung begriffenen Gehirngewebe frei von Myelin zu sein scheinen.

Vergi, dazu: M. Abdussalem et al., The problem of an-tirabies vaccination, International conférence on the ap-65 plication of vàccine against assay viral rickettsial and bac-terial diseases of man Pan. Am. Health Org. (PAHO), Sc. pub. No. 226 (1970) pp 54-59; P. Fenje, The status of exi-sting rabies vaccines, ibid pp 60-65.

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Es hat sich gezeigt, dass 50%iges Gehirnhomogenat von Entenembryonen kein Myelin enthält, das mittels Polyac-rylamidgel-Elektrophorese nachweisbar ist, während unter identischen Bedingungen Myelin im Gehirn erwachsener Enten und Rinder nachgewiesen werden konnte.

Nach dem vorliegenden neuen Verfahren lassen sich praktisch unbegrenzte Mengen oder jedenfalls reichlich genügende Mengen des gesuchten, wertvollen und unschädlichen Impfstoffes mit verhältnismässig geringem Aufwand ökonomisch herstellen. Dies ist bei Herstellung von Tollwutimpfstoff durch Vermehrung der Viren in menschlichen Diploidzellkulturen infolge deren geringer Leistungsfähigkeit nicht möglich. Vergi, dazu: Anweisung des «Centre for diseases control» CDC vom Februar 1979: Das CDC hat die Verwendung von humanem Diploidzelltollwutimpfstoff auf Personen reduziert, welche durch Entenembryo-Vakzine lebensgefahrliche Reaktionen erlitten oder keinen ausreichenden Antikörpertiter erreichen konnten. Als Grund wird die ungenügende Produktivität von humanen Diploidzellkulturen genannt. Siehe auch: Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR) 27.333,413 (1978).

Da aus tierschützerischen Gründen und wegen unge-s nügender Verträglichkeit und Sicherheit die Tollwutimpfstoffherstellung am geborenen und mit Sicherheit leidenden Säugetier nicht mehr verantwortbar ist, besteht ein grosses Bedürfnis nach einem neuen, einfach herzustellenden, nicht zu teuren, wirksamen und sicheren Tollwutimpfstoff, der für io die Bekämpfung der praktisch weltweit verbreiteten mit Sicherheit tödlich verlaufenden schrecklichen Infektionskrankheit das einzig wirksame Mittel ist.

In der folgenden Tabelle sind charakteristische und massgebende Kennzahlen von Tollwutimpfstoffen, die nach ls bekannten, üblichen Verfahren hergestellt wurden (Impfstoff A-F), sowie die entsprechenden Kennzahlen eines nach der vorliegenden Erfindung hergestellten Impfstoffes (G) aufgeführt.

Tabelle

AGW-E/ Prot.-gehalt/ Dosis Dosis (mg)

AGW-E/ Gehirnsubstanzim mgProt. Ausgangsmaterial einer Dosis'mg

A:

Kaninchengehirnvakzine 5% Gehirn, Dosis 2 ml B:

Babymäusegehirnvakzine 1 % Gehirn, Dosis 2 ml C:

Rattengehirnvakzine 10% Gehirn, Dosis 1,5 ml D:

Schafsgehirnvakzine 5% Gehirn, Dosis 5 ml

E:

Entenembryovakzine nach Hoskins 33% Suspension F:

Humanzellkulturvakzine nach Koprowski G:

Gereinigte Entenkopfembryo-vakzine gem. vorliegender Erfindung

0,6 2,5

2,5

3.4 0,3 4,8

8.5

11

20-50 0,6-1,2

100 20 150 250

0,05 100 (20)2

0,05-0,125 0

3-5

15

1 Schätzwerte

2 100 mg: Kopfextrakt, etwa ein Fünftel davon ist Gehirn = 20 mg

Antigenwerteinheiten: Faktor, um den eine Vakzine besser oder weniger gut gegen Tollwut schützt als eine NIH-Referenz-

Vakzine.

Prot. = Protein

Kommentar:

Die Überlegenheit des erfindungsgemäss erhaltenen Impfstoffes G gegenüber den Impfstoffen A-F ist aus den Vergleichszahlen klar zu erkennen.

Bei allen in Betracht fallenden Parametern erreicht oder übertrifft dieser neue Impfstoff die Qualität der besten bisher bekannten Impfstoffe.

Einzig bei der Babymäusegehirnvakzine ist der Proteingehalt niedriger. Dafür ist bei diesem Impfstoff B mit einem Myelin-Gehait zu rechnen, der Encephalitis erzeugen kann. Die Humanzellkulturvakzine F, die kein Gehirngewebe enthält, weist an deren Stelle hohe Proteingehalte auf. Die spezifische Aktivität (d.h. das Verhältnis zwischen Wirkstoffgehalt zu kontaminierenden Proteinen) ist bei der erfindungsgemäss hergestellten Vakzine um Potenzen höher als bei den 6o Vergleichspräparaten.

Beispiel 1

Herstellung von Entenembryo-Vakzine 65 1. Herstellung der Virensuspension

Der «Wistar Rabies, PM (Pitman-Moore)-HDCS»-Virusstamm vom Wistar Institute, Philadelphia, oder ein anderer zur Impfstoffherstellung geigneter Tollwutvirus-

5

638 985

Stamm wird vor der eigentlichen Verwendung durch intracerebrale Passage in der Maus und wiederholte Passagen in angebrüteten Enteneiern an Entenembryozellen adaptiert. Für die Vakzineproduktion werden die Viren aus einer Passage mit besonders hohem Titer verwendet, welche sich bereits bei der Herstellung von Tollwutvakzine nach J.M. Hoskins (Laboratory Techniques in Rabies by Kaplan et al., WHO, 1973,27, pp 243-55: Duck-Embryo-Vaccine) bewährt haben.

Befruchtete Enteneier aus gesunden Herden werden bei

36 °C ± 1 °C bei 65-70% Feuchtigkeit bebrütet. Nach 6 Tagen werden sie durchleuchtet, ungeeignete Eier werden entfernt.

Den Eiern mit sich entwickelnden Embryos wird am 7. Tag der Bebrütung das Tollwutvirus direkt in den Dottersack inokuliert. Die Bebrütung wird fortgesetzt. 10-13 Tage später werden die Eier erneut durchleuchtet. Die Eier mit gut fortentwickelten Embryos werden unter sterilen Bedingungen geöffnet, die Embryos entnommen und enthauptet. Die Köpfe werden einzeln unter sterilen Bedingungen in der Dampfphase über flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis deren Sterilitätsprüfung abgeschlossen ist. Die sterilen Köpfe werden vereinigt in Pools von 40-60 Köpfe; jeder Pool wird erneut auf Sterilität geprüft. Für die Verarbeitung zum Impfstoff werden mehrere Pools bei 4 bis 37 °C aufgetaut und in einem Homogenisator (Blender) in phosphathaltigem Puffer (pH 7,4) zerkleinert, derart, dass ein 5%iger w/v Kopfextrakt entsteht.

Zur Verdünnung kann man ausser NaCl-Phosphatpuffer (= Di-NatriumhydrogenphosphatO,75%, Kaliumdihy-drogenphosphat 0,145%, Natriumchlorid 0,48% in destilliertem Wasser) auch andere in der Virusimpfstoffproduktion gebräuchliche unschädliche Salzlösungen bis zum entsalzten Wasser verwenden, solange man in einem pH Bereich von 7 bis 8 bleibt.

2. Inaktivierung der Viren

Für die Inaktivierung wird gewöhnlich ß-Propiolacton (BPL) verwendet. Vergi, dazu: G. A. LoGrippo, Annales New York Academy of Sciences, Vol. 83 (1960), pp 578-94. Es wurden jedoch auch andere Agentien empfohlen und geprüft. In den USA wird beispielsweise Tri-(n-butyl)-phos-phat benutzt.

Vergi, dazu: H. Tint et al., Symposia series in immuno-biological standardization (Karger, Basel) 21.132-144: A new tissue culture rabies vaccine, inactivated and disag-gregated with Tri-(n-butyl)-phosphate. T. J. Wiktor et al., Develop. biol. Standard., Vol. 40, pp 3-9 (1978).

Für die Inaktivierung mit ß-Propiolacton wird die virushaltige Gewebesuspension unter ständigem Rühren auf

37 °C gebracht und mit soviel einer frisch bereiteten eisgekühlten wässerigen Lösung von ß-Propiolacton versetzt, bis eine Konzentration von ß-Propiolacton von 1:2500 erreicht ist. Nach 5minütigem Rühren bei 37 °C wird die Suspension in ein zweites Gefass gebracht und weitere 120 Minuten gerührt. pH und Temperatur werden ständig kontrolliert. Absinken des pH ist ein Mass der BPL-Hydrolyse und wird auch als solches registriert. Das pH sinkt von ca. 8 auf ca. 7,4 ab. Nun wird auf 5 °C + 3 CC abgekühlt und über Nacht weiter gerührt. Am nächsten Tag wird Thiomersal [o-(Äthyl-mercurithio)-benzoesäure] zugefügt bis eine Konzentration dieses Antiseptikums von 1:10 000 erreicht ist. Die Suspension wird bis zur Reinigung und Konzentrierung durch die Differential- und Dichtegradientenzentrifugation bei 5 °C gehalten.

3. Differential- und Dichtegradientenzentrifugation

Die 5%ige Kopfsuspension hat z. B. eine spezifische Aktivität von 0,78 AGW-E/mg Protein. In einem folgenden

Produktionsansatz wurde eine Aktivität von 0,55 AGW-E/ mg Protein gemessen. Die inaktivierten Viren, die in dieser Suspension enthalten sind, werden durch zwei Zentrifuga-tionen gereinigt und konzentriert.

3.1. Zunächst werden durch eine Vorreinigungszentrifu-gation bei 10 000 bis 15 000 x g die grösseren Zelltrümmer entfernt. Nach der Vorreinigung steigt die spezifische Aktivität leicht an: auf 1.0 im Ansatz 1 und im 2. Ansatz auf 0.73 AGW-E/mg Protein.

3.2. Das vorgereinigte Material wird anschliessend weiter gereinigt und konzentriert mittels Zentrifugation über einen linearen Saccharose-Gradienten (15-55%) bei 75 000 bis 90000 x g. Die Gradienten-Fraktionen werden auf Sterilität und Antigen-Gehalt geprüft. In diesen Fraktionen variiert die spezifische Aktivität mit den verschiedenen Dichten der kontaminierenden Proteine. So findet man z.B. bei einer Dichte von 19% Saccharose eine spezifische Aktivität von 2, bei 37% ist die spezifische Aktivität 24, und bei 43% liegt sie um 6 herum. In einem zweiten Ansatz liegt die spezifische Aktivität bei 20% Saccharose um 0.3, bei 37% über 20, und bei 45% um 2.

Sterile Fraktionen mit einer Wirksamkeit von über 20 AGW-E/mg Protein (d.s. mehr als 100 AGW-E/mg N) und einem Saccharose-Gehalt von etwa 30-40% werden vereinigt, anschliessend werden Sterilität und Antigenkonzen-tration erneut geprüft und für den weitern Prozess vorgemerkt.

4. Einstellung der Antigenkonzentrate

Vorgetestete Antigenkonzentrate werden vereinigt, mit einem geeigneten Stabilisator, z.B. Natriumphosphatpuffer (pH 7.4) - siehe oben - oder anderen physiologischen Salzlösungen, einschliesslich dem bereits beschriebenen Stabilisator (siehe Hoskins, loc. cit.) auf eine Konzentration von mindestens 2,5 AGW-E/ml verdünnt. Sterilität und Antigenwert werden erneut geprüft. Typische Werte für diesen «Final Bulk» (zur Abfüllung bereiter Ansatz) liegen im Bereich von 3-5 AGW-E/ml und einer spezifischen Aktivität von 3-6. In 5 typischen Produktionen waren die spezifischen Aktivitäten 2.9,3.5,5.1,5.3 und 5.4.

5. Lyophilisierung

Der nach 4. erhaltene «Final Bulk» wird in Portionen von 1 ml in 3 ml Fläschchen abgefüllt. Lyophilisationsstop-fen werden lose aufgesetzt und die Vakzine wird unter Vakuum in gefrorenem Zustand getrocknet. Nach vollendeter Trocknung werden die Stopfen eingedrückt, die Fläschschen werden mit Metallkappen zum Festhalten der Gummistöpf-chen definitiv verschlossen und bei — 20 °C aufbewahrt.

6. Rekonstruktion zum gebrauchsfertigen Impfstoff und dessen Anwendung

Für den Gebrauch wird ein Milliliter steriles, destilliertes Wasser durch den Gummistopfen eingespritzt, das Fläschchen wird leicht geschwenkt - ohne Schaum zu produzieren - bis der Impfstoff ganz gelöst ist. Der gesamte Inhalt eines Fläschchens wird dann subkutan am Oberarm injiziert.

7. Qualitätskontrolle des Endproduktes Diese umfasst:

Bestimmung der Antigenität, Sterilität, Inaktivität, Unschädlichkeit und des Gehaltes an Stickstoff, NaCl, ß-Pro-pionlacton-Rückständen und Thiomersal.

Antigenität: Prüfung nach Standardvorschrift des National Institute of Health (USA).

s io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

€0

65

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Sterilität:

Inaktivität:

Alle erhaltenen Endprodukte, die zur Anwendung gelangen, sind steril.

Diese erfolgt jeweils an 3 jungen Kaninchen und 10 Mäusen, welche nach intracerebraler Inokulation von 0,3 ml rehydratisierten Impfstoff während 14 Tagen beobachtet wurden. Die Tiere dürfen keine Krankheitssymptome aufweisen.

Unschädlichkeit: 5 ml rekonstituierte Vakzine-Lö

sung wird 3 Meerschweinchen und 0,5 ml an 3 Mäuse intraperitoneal verabreicht.

s Die Tiere dürfen keine von der Norm abweichende Reaktionen zeigen.

Stabilität des beispielsgemäss erhaltenen Impfstoffes in lyophilisierter Form.

Aktivitäten (AGW-E/ml) in % des Ausgangswertes (0-10 Wert) nach 3 Monaten bei der angegebenen Temperatur.

Tabelle

Lot Nr.

O-Wert (AGW-E/ml)

—20'C

+4°C

ZT"

+37°C

78 Lyll T3 78 Lyll T4 78 LyIIT5

3,3 3,7 3,6

124% 103% 122%

97% 76% 75%

94% 100% 69%

70% 86% 114%

Stabilität des beispielsgemäss erhaltenen neuen Tollwutimpfstoffes nach Rekonstitution.

Aktivitäten (AGW-E) in % des Ausgangswertes nach 4 Wochen Lagerung bei der angegebenen Temperatur.

Tabelle

Lot Nr.

O-Wert (AGW-E/ml)

+4°C ZT°

+37°C

78 Lyll T3 78 Lyll T4 78 Lyll T5

3,3 3,7 3,6

136% 82% 135% 86% 125% 89%

61% 51% 61%

Versuch

1. Verteilung des Tollwutantigen im Entenembryo. Um die Verteilung des Tollwutantigens im Entenembryo zu bestimmen, wurden infizierte Entenembryonen in Kopf, Rückenmark und Rumpf ohne ZNS aufgeteilt. Virus- und Antigengehalt wurden gemessen:

Köpfe Rückenmark

Rumpf ohne ZNS

a) Neuntägige Entenembryonen wurden nach Standard Prozedur (Hoskins loc. cit.) geimpft und 11,12,13,14 und 25 15 Tage später geerntet.

Erntetag (Tage nach Impfung)

11 12 13 14 15

30 Erntegewicht 76 88 100 131 135 Köpfe (g je 20 Embryos) 145 179 221 278 290 Körper 221 267 321 409 425 Gesamtembryo

34 33 31 32 32 Anteil Kopf-35 in %

5.8 5.7 5.3 5.1 5.2 Virustiter

(x logI0)

b) Wie a), wobei jedoch acht Tage alte Entenembryonen 40 verwendet wurden.

Gewicht von 60 67 89 113 115 Köpfe jeweils 102 137 195 247 260 Körper

« 20 Embryos 162 204 284 359 375 Gesamtembryo

Mittelwerte (g)

3.44

0.95

9.68

Virusgehalt der 33% Susp.

5.95

4.7

4.55

(Titer x logio)

Virusgehalt total

8.50

6.7

7.55

(log10)

AGW-E/ml 33% Susp.

1.9

<0.3

50

Erntetage (Tage nach Impfung) 11 12 13 14 15

36 33 37 29 30 Anteil Kopf in %

5.9 5.7 5.1 Virustiter

(x log10)

Nahezu lOmal mehr Virus wurde im Kopf, der etwa Va des Gesamtkörpers ausmacht, gefunden als im Rest des En-tenembryonenkörpers. Daraus folgt, dass durch Entfernung des Rumpfes 75% unnötiges und schädliches Entenem-bryonenprotein entfernt werden kann, ohne den Virusgehalt merklich zu reduzieren.

2. Ermittlung der optimalen Erntezeit.

In einem dreiteiligen Versuch wurden Embryonen verschiedenen Alters beimpft und zu verschiedenen Zeiten nach der Impfung geerntet. Köpfe und Rümpfe wurden separat verarbeitet. Der Virusgehalt der Köpfe wurde bestimmt.

c) Wie a), wobei sieben Tage alte Entenembryonen verwendet wurden.

60 —

Gewicht von 62 65 83 91 99 .Köpfe jeweils 108 130 176 226 235 Körper

20 Embryos 170 195 259 317 334 Gesamtembryo

6s 36 33 37 29 30 Anteil Kopf in %

5.6 5.8 5.5 5.2 4.9 Virustiter

(lOgio)

Aus diesen Daten ist zu entnehmen, dass (1) der Kopf etwa 1/3 des gesamten Embryo darstellt und (2) am 11. Tag nach der Inokulation (Impfung) der höchste Virustiter bereits erreicht ist. Da man in erster Linie am Tollwutantigen interessiert ist und dieses sehr viel stabiler ist als das funktionelle Virus, liegt die beste Erntezeit offenbar am oder nach dem Tag des höchsten Virustiters. Die hohe Wachstumsrate des Kopfes veranlasst anderseits die Ernte so früh wie möglich anzusetzen um weniger schädliches Kopfgewebe verarbeiten zu müssen, jedenfalls vor Eintritt des rasanten Wachstums, das ab dem 19. Tag beobachtet wird:

Embryoalter (Tage) 17 18 Î9 20 21 22 23 Kopfgewicht (je 20) 62 60 76 88 100 131 135

in g 65 67 89 112 115

83 91 99

Einzelkopf (g) 3.1 3.1 3.8 4.5 5.2 6.2 6.8

3. Wiksamkeit des nach Beispiel 1 erhaltenen Tollwutimpfstoffes in Katzen nach der subkutanen Impfung.

Anzahl Impflinge mit mehr als Männliche Weibliche

Katzen Katzen

7 7

0.5 IE 100% 100%

5.0 57 29

20.0 43 14

(Internationale Einheiten an Antikörpergehalt)

4. Wirksamkeit in Affen (macacus rhesus).

Impfstoff n. Beispiel 1

Impfstoff des Handels «Mérieux» (HDCS)

Impfschema (Tage)

0,3,7 0,3

Anzahl Affen

5 5

Antikörper (>0.5 IE)

3 Wochen nach der 5 (100%)4 (80%) 1 (20%) 1 (20%) letzten Impfung

7 Wochen nach der 4(80%) 3(60%) 3(60%) 0(0%) letzten Impfung

5. Wirksamkeit des erfindungsgemäss erhaltenen Tollwutimpfstoffes im Menschen.

Der fertige, lyophilisierte und durchgeprüfte Impfstoff wurde im Vergleich mit einem HDCS (human diploid cell strain) Impfstoff über 70mal im Menschen verimpft. Die Unschädlichkeit des neuen Impfstoffes war mindestens ebensogut wie die der Standardvakzine:

Impfstoff Impfstoff nach Impfstoff des

Beispiel 1 Handels «Mérieux»

(HDCS)

Dosen verimpft 74 70

lokale Reaktion (Hitze, Schwellung,

Rötung) 2(2.7%) 8(11.4%)

allgemeine Reaktion (Fieber, Ausschlag,

Bettlägrigkeit) — (0%) 2 (2.8%)

s

638 985

Die Wirksamkeit des neuen Impfstoffes wurde ebenfalls verglichen mit dem Standardimpfstoff. In der folgenden Tabelle ist die Prozentzahl der Personen gezeigt, die nach Impfung mit dem einen oder anderen Impfstoff mit Antikörperentwicklung reagierten, wobei allgemein 0,5 IE (internationale Einheit) als protektiv angesehen werden.

Anzahl Impflinge Impfstoff nach HDCS-Impfstoff mit mehr als Beispiel 1 «Mérieux»

(36 Impflinge) (33 Impflinge)

0.5 IE-Antikörper

100%

5.0

89

85

10.0

64

58

15.0

56

39

20.0

47

39

30.0

39

24

40.0

25

12

Beispiel 3

Herstellung von Hühnerembryo-Vakzine Hühnereier wurden während 7 Tagen bei 36 °C ± 1 °C bei 60-75% Feuchtigkeit bebrütet. Den Eiern mit sich entwickelnden Embryos wird am 7. Tag der Bebrütung Tollwutvirus direkt in den Dottersack inokuliert. Die Bebrütung wird fortgesetzt. 10 Tage später werden die Eier geöffnet und die Embryos entnommen. Die Embryos werden zerlegt; Köpfe, Rückenmarke und Rümpfe werden getrennt behandelt, d.h. zu jeweils 10%igen Homogenisaten zerkleinert. In den Homogenisaten wird die Virus-Konzentration mit Hilfe des «Rapid fluorescent focus inhibition tests» (RFFIT) titriert. Es wurden 3 Versuchsserien durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle auf Seite 26 aufgeführt.

Es wurde nun gefunden, dass das Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS) etwa lOmal mehr Virus enthält als der ZNS-freie Rumpf.

Viruskonzentration in ID 50/ml

Kopf log. 4.25/4.4+4.8

Rückenmark 3.55/ +4.8

Rumpf 3.0/3.6+3.8

Auf diesem Ergebnis basierend erfolgt die Herstellung von Hühnerembryo-Vakzine in ganz analoger Weise wie im Beispiel 1 beschrieben, indem das an Hühnerembryozellen adaptierte Tollwutvirus von hohem Titer etwa nach der Methode von H. Koprowsky, Laboratory Techniques in Rab-bies by M.M. Kaplan et al., WHO Geneva, Chapter 26. pp. 235-242 in angebrüteten Hühnereiern vermehrt wird. Die Eier werden am 7. Tag der Bebrütung beimpft und anschliessend weiter bebrütet. 9-10 Tage nach der Inokulation des Virus in den Dottersack werden die Hühnerembryonenköpfe geerntet. Die Aufarbeitimg der Hühnerembryonenköpfe erfolgt nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Die erhaltene Vakzine wird der im Beispiel 1.7 beschriebenen Qualitätskontrolle unterworfen. Der erhaltene Impfstoff erwies sich auch am Menschen als voll wirksam.

Beispiel 4

Ähnlich wie im Beispiel 1 beschrieben, können auch in angebrüteten Wachteleiern Tollwutviren vermehrt und danach aus deren Köpfen geerntet werden.

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Claims

638985

1. Verfahren zur Herstellung eines Tollwutimpfstoffes mit besonders hoher spezifischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Ernte der in Geflügelembryos vermehrten Tollwutviren nur die Köpfe der Embryos verwendet, aus dem daraus gewonnenen Zellextrakt den weit überwiegenden Teil der darin vorhandenen Substanzen geringerer und grösserer Dichte als der des Tollwutantigens weiter durch Differential- und Dichtegradientenzentrifugation abtrennt, während gleichzeitig das Tollwutantigen selektiv angereichert wird, und erhaltenes gereinigtes Antigenkonzen-trat zum gebrauchsfertigen Impfstoff weiterverarbeitet.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man dazu Enten-, Hühner- oder Wachtel-Em-bryonen verwendet.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Differentialzentrifugation mit 10 000 bis 15 000 x g und die Dichtegradientenzentrifugation mit 75 000 bis 90 000 x g in steigenden Zuckerkonzentrationen und in Pufferlösung durchführt.

4. Tollwutimpfstoff, hergestellt nach dem Verfahren des Patentanspruchs 1.