DE1138888B - Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen Staupe - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen Staupe Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen Staupe, die lebendes, apathogenes Staupevirus enthält, welches nach Injektion bei Tieren der Familie der Caniden und Musteliden immunisierende Antikörper erzeugt, die mit den von virulenten Staupeviren erzeugten Antikörpern identisch sind. Zu den Caniden zählt man bekanntlich alle Hunderassen, und mit dem Begriff Musteliden faßt man Nerz, Frettchen, Iltis, Marder, Wiesel usw. zusammen.
• Die Methode, welche jetzt allgemein für die Produktion einer abgeschwächten Lebendvaccine benutzt wird, beruht auf der Kultivierung des Staupevirus in embryonierten Hühnereiern, wie es z. B. in den USA.-Patentschriften 2136131, 2271819 und 2 391540 beschrieben ist.
• Eine in dieser Weise hergestellte Vaccine besitzt aber gewöhnlich einen verhältnismäßig niederen Titer, der in der Größenordnung von 103 bis 104ID5o/ml liegt. Ferner ist dieses Verfahren kompliziert, langwierig und kostspielig.
• Es wurde nun gefunden, daß man eine Vaccine gegen Staupe in der Weise herstellen kann, daß man das Staupevirus in wenigstens fünfzig aufeinanderfolgenden Passagen in einem Kulturgewebe unter Verwendung einer gepufferten Nährliüssigkeit bei einem pH-Wert zwischen 7, 0 und 8, 0 züchtet, die so erhaltene, das modifizierte Virus enthaltende Nährnüssigkeit aberntet und gegebenenfalls lyophilisiert.
• Als Kulturgewebe für Staupevirus kommen z. B.
• Nieren von Caniden und Musteliden, insbesondere Nieren von 6 bis 12 Wochen alten Hundewelpen, in Betracht. Ferner eignen sich Milz-, Hoden-und Uterusgewebe von Caniden und Musteliden.
• Als Nähr-oder Kulturflüssigkeit kommen vorzugsweise Hanks'Lösung mit 0, 5 °/o Lactalbuminhydrolysat mit etwa 10°/o Pferde-oder Kälberserum oder Earles Lösung mit etwa 2°/o Pferdeserum und 0, 5 °/o Lactalbuminhydrolysat, die pro ml rund 100 Einheiten Penicillin und 50y Streptomycin enthalten und einen pH-Wert zwischen 7, 0 und 8, 0, vorzugsweise von 7, 6 aufweisen, in Frage. Die Einstellung des optimalen pH-Wertes wird zweckmäßig mit Natriumbicarbonat vorgenommen. Die Züchtung des Staupevirus wird zweckmäßig bei einer Temperatur zwischen 30 und 37° C, vorzugsweise 35 bis 37° C, durchgeführt.
• Die Erfindung stellt eine Methode zur Herstellung einer Staupe-Vaccine dar, die unter leicht zu kontrollierenden Bedingungen durchgeführtwerden kann.
• Das Verfahren gemäß der Erfindung beruht darauf, dal3 die Züchtung des Staupevirus in einer Gewebe- kultur charakteristische Gewebeveränderungen hervorruft, die mikroskopisch leicht festgestellt werden konnen.
• Während der Kultivierung wird das in den Zellen sich vermehrende Virus in die Kulturflüssigkeit ausgeschieden. Die das Virus enthaltende Kulturflüssigkeit wird dann auf neue Gewebekulturen übertragen und die Züchtung wiederholt. Diese Passagen werden in genügender Anzahl wiederholt, bis das Virus abgeschwächt ist. Wenige Passagen des Virus geben keine befriedigenden Ergebnisse hinsichtlich der erwünschten Apathogenität, und es wurde deshalb vermutet, daß es nicht möglich sein würde, eine aktive Vaccine mit der nötigen Apathogenität und der verlangten hohen Antigenität zu erzeugen. Es zeigte sich jedoch überraschenderweise, daß es durch eine große Anzahl von Passagen, z. B. etwa fünfzig oder mehr, möglich ist, ein Virus zu erzeugen, welches sogar für gegen Staupe bekanntlich äußerst empfindliche Frettchen apathogen ist, seine antigenen Fähigkeiten aber noch in vollem Umfang besitzt. Es wurde weiterhin überraschenderweise gefunden, dal3 nach etwa fünfzig bis sechzig Passagen der Virustiter im Vergleich mit dem Titer des Ursprungsvirus angestiegen war. Tuberraschenderweise wurde noch gefunden, daß eine Gewebekultur mehrmals zur Züchtung des Staupevirus benutzt werden kann, wodurch eine wesentliche Steigerung der Virusausbeute erreicht wird.
• Zur Ausführung des Verfahrens gemäß der Erfindung verfährt man zweckmäßig in folgender Weise : A. Die Nieren von jungen Hunden werden unter tiefer Narkose und unter aseptischen Bedingungen entfernt. Nach Entfernung der Nierenkapsel wird die Nierenrinde in kleine Stiickchen geschnitten, die nach wiederholtem Waschen in Aqua dest.-Phasphatpn$er-Lösung (pli 7, 6) mit einer gepufferten, 0, 25"/o Trypsin enthaltenden Lösung behandelt und 10 Minuten auf etwa 37° C unter Umrühren erwärmt werden.
• Dann unterbricht man das Rühren und läßt die Stückchen sedimentieren. Die überstehende Trypsinlösung wird abgezogen und entfernt. Danach wird frische 0, 250/oigne Trypsinlösung hinzugefügt, und die Trypsinierung wird weitere 20 Minuten bei etwa 37° C fortgesetzt. Die so erhaltene Zellsuspension wird gefiltert, um einige größere Fragmente zu entfernen, und dann 5 Minuten bei etwa 1000 U/min. zentrifugiert. Das Zenrifugat wird entfernt. Die erhaltenen sedimentiorten Zellen werden in einem Nährmedium suspendiert, welches aus Hanks'Lösung mit 0, 5 O/o Lactalalbuminhydrolysat, 10 °/o Pferdeserum (oder 20 °/o Kälberserum), 100 Einheiten Penicillin und 50 Gamma Streptomycin pro Milliliter besteht.
• Die Zellkonzentration im Medium wird auf etwa 200 000 Zellen pro Milliliter eingestellt. Die Suspension wird in einer Menge von etwa 1 ml in Röhrchen abgefüllt. Während des Zellwachstums werden die Röhrchen in einer beinahe horizontalen Lage gehalten. Nach der Entwicklung einer sedimentierten Zell-Lage bei etwa 35 bis 37° C in den Röhrchen wird die Kulturlösung durch ein Nährmedium ersetzt, welches nur 2 ouzo Pferdeserum und Earles Lösung an Stelle von Hanks'Lösung enthält. Dann wird die Gewebekultur mit aus dem Blut von akut staupekranken Hunden isoliertem Virusmaterial beimpft.
• Nach 3 bis 4 Tagen wird die Kulturflüssigkeit, die das Virus enthält, geerntet.
• Die so erhaltene Kulturflüssigkeit wird zur Beimpfung von frischen Gewebekulturen benutzt, und die Züchtung wird wie vorher wiederholt.
• Nach ungefähr fünfzig in der oben beschriebenen Weise ausgeführten Passagen kann die Kulturfliissigkeit, welche das apathogene Virus enthält, direkt als Vaccine benutzt werden. Die Aktivität der Vaccine wird durch Feststellen des cytopathogenen Effektes in einer Gewebekultur der obenerwähnten Art geprüft.
• Vorzugsweise wird die Kulturflüssigkeit unmittelbar nach der letzten Passage gefriergetrocknet und kann in diesem Zustand aufbewahrt werden, bis sie zur Vaccinierung benutzt wird.
• B. Zur Herstellung größerer Mengen an Staupevaccine hat sich folgende Arbeitsweise bewährt : Zur Kultivierung von Staupevirus in der Gewebekultur werden gesunde Hundewelpen im Alter von 6 bis 12 Wochen verwendet, welche zur Überprüfung ihres Gesundheitszustandes etwa 10 Tage lang in Isolierstallungen gehalten und beobachtet werden.
• Zur Anlage von Gewebekulturen werden die Welpen getötet und die Nieren unter möglichst sterilen Bedingungen frisch entnommen. In einer sterilen Kammer werden die Nierenkapseln abgezogen, die Bindegewebeanteile des Nierenbeckens entfernt und die Nierenrinde in kleine Stiickchen geschnitten, die in einem Gefäß gesammelt und in Aqua dest. mit 100/o Phosphatpufferlösung gewaschen werden. Danach werden die Nierenstückchen in ein sogenanntes Trypsinierungsgefäß gebracht. Unter sterilenVerhältnissen wird eine auf etwa 37° C erwärmte 0, 2511/oigne Trypsinlösung zugeleitet. Unter ständigem Rühren mittels eines Magnetrührers erfolgt die Trypsinierung, d. h., unter Einwirkung dieses Fermentes werden einzelne Nierenzellen von den Gewebestücken abgespalten.
• Die Einwirkungsdauer des Trypsins beträgt etwa 20 bis 25 Minute. Die in der Lösung suspendierten Nierenzellen werden in ein Gefäß abgezogen und gesammelt. Zur Unterbindung des Trypsinierungsvorganges wird das Sammelgefäß in ein Eiswasserbad gestellt. Danach wird das Trypsin durch Zentrifugieren entfernt. Dabei geht man so vor, dal3 die Nierenzellensuspension in Zentrifugenbecher eingefüllt und etwa 5 Minuten bei etwa 1000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wird. Das Sediment wird in mit Phosphat gepuffertem Aqua dest. aufgeschwemmt und erneut bei 600 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, wodurch auch Blutkörperchen im tYberstand verbleiben und entfernt werden können.
• Das so gewonnene Zellsediment wird im Verhältnis 1 : 300 bis 1 : 400 in einer Nährlösung suspendiert. Die für die Suspendierung verwendete Nährlösung besteht vorteilhaft aus Hanks'Lösung mit 0, 5 °/o Lactalbuminhydrolysat, 20°/o Kälberserum, 100 Einheiten Penicillin und 50 Gamma Streptomycin pro Milliliter sowie 0, 01°/o Phenolrot. Die Zellsuspension wird in einem sterilen System über Gaze geleitet, um gröbere Zellaggregate zu entfernen, und darauf in Kulturgefäße, wie Rollrandröhrchen, Vierkantfläschchen, Fernbachkolben oder vorzugsweise sogenannte Penicillinkolben, abgefüllt. Die Kulturgefäße werden bei einer Temperatur von etwa 35 bis 37° C bebrütet, wobei die Nierenzellen sich an der Glaswand festsetzen und durch Zellteilung vermehren. Nach etwa 4 bis 5 Tagen muß die Nährnüssigkeit erneuert werden. Dabei geht man so vor, daß die verbrauchte Nährlösung entweder dekantiert oder durch eine Hebevorrichtung abgezogen wird. Zur Fütterung der Kultur verwendet man Hanks'Lösung mit 0, 5 o/o Lactalbuminhydrolysat wie oben beschrieben, jedoch nur 10°/o Kälberserum.
• Gewöhnlich ist nach weiteren 2 bis 3 Tagen der Kulturrasen komplett ausgewachsen, so daß die Beimpfung mit dem Staupevirus erfolgen kann. Zur Beimpfung wird die Nährlösung ersetzt durch vorzugsweise Earles Lösung an Stelle von Hanks'Lösung, 0, 5 °/o Lactalbuminhydrolysat, 2°/o Pferdeserum und den obenbezeichneten Zusätzen von Antibiotika und Phenolrot.
• In die Kulturgefäße wird nun eine apathogene Staupevirussuspension, z. B. Virus der 65. Gewebepassage im Verhältnis 1 : 20 bis 1 : 200 eingebracht.
• Die Kulturkolben werden nun wiederum bei etwa 35 bis 37° C bebrütet. Sie werden täglich mikroskopisch untersucht und auf Veränderungen, die für eine Vermehrung des Staupevirus typisch sind, geprüft.
• Solche charakteristischen Veränderungen sind eine verstärkte Granulierung der Zellen, Zusammentreten der Zellkerne unter Auflösung der Zellgrenzen zu sogenannten Riesenzellen, welche gewöhnlich in der Mitte ein granuliertes Zentrum und einen äußeren Plasmasaum mit Vakuole aufweisen. Zu diesem Zeitpunkt wird von den Zellen laufend Virus an das umgebende Nährmedium abgegeben. Diese virushaltige Nährlösung wird durch Dekantieren oder Abhebern geerntet. Zweckmäßig wird das Kulturgewebe nach der Ernte mit frischem Nährmedium (Earles Lösung wie oben) gefüttert. Da die mit dem Staupevirus befallenen Zellen ihre Lebensfähigkeit weiter behalten, erfolgt eine fortlaufende Produktion von Staupevirus, so daß in einem gewissen Zeitabstand eine wiederholte Aberntung bzw. Fütterung erfolgen kann. Dadurch können z. B. von einer Kultur vier Aberntungen erzielt werden, wodurch eine gesteigerte Wirtschaftlichkeit des Verfahrens erreicht wird. Die geerntete Virussuspension wird bei Temperaturen von --35 bis-70° C aufbewahrt und kann so für die Vaccinenproduktion vorrätig gehalten werden. Von den einzelnen Ernten werden Proben entnommen, die auf Sterilität geprüft und auf ihren Virusgehalt in der Gewebekultur titriert werden. Die als einwandfrei befundene Virussuspension wird aufgetaut, in kleinen Mengen in Fläschchen abgefüllt, tiefgefroren und lyophilisiert, da es in lyophilisierter Form am haltbarsten ist.
• Das so erhaltene Produkt enthält lebende apathogene Staupeviren in getrockneter und somit lang haltbarer Form. Es eignet sich vorzüglich nach Wiederauflösung in einem Lösungsmittel, z. B. gepuffertem Aqua dest., zur Immunisierung von Caniden und Musteliden gegen Staupe.
• Die Herstellung eines lebenden apathogenen Staupevirus von der Gewebekultur besitzt gegenüber dem bisherigen, in Hühnerembryonalgeweben vermehrten Staupevirus wesentliche Vorteile. So erhält man z. B. durch Kultivierung der Nieren eines etwa 8 Wochen alten Hundes ebenso viele Impfdosen wie aus 3000 Hühnereiern. Ein weiterer wesentlicher Vorteil ist die Erzielung eines um wenigstens 2 Zehnerpotenzen höheren Virustiters pro Millimeter, somit eine Steigerung des Virustiters um das Hundertfache, so daß durch die wiederholte Ernte und den höheren Virusgehalt eine wesentlich höhere Produktionsausbeute und damit niedrigere Herstellungskosten als bei den vom Ei gewonnenen Staupeimpfstoff erzielt werden. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäß gewonnenen Virus gegenüber dem im embryonierten Hühnerei gezüchteten Staupevirus ist die raschere Ausbildung der Immunität und die Erzielung höherer Antikörpertiter.
• Die Prüfung der Wirksamkeit der Vaccine gemäß der Erfindung sei in den folgenden Beispielen näher erläutert.
• Versuch 1 Jedes von vier Frettchen erhielt intraperitoneal 1 ml der nach dem unter A beschriebenen Verfahren hergestellten virushaltigen Gewebekulturnüssigkeit, deren Titer 105, sTCIDg, betrug. Die Bezeichnung TCID5 ;, bezieht sich auf die nach der Methode von Reed und Muench, Am. J. Hyg., 27, S. 493 (1938), errechnete » Tissue culture infectivity doses «.
• Im selben Laboratorium wurden drei nicht immune Frettchen als Kontrolltiere und weitere zwei in einem benachbarten Raum gehalten, um eine mögliche direkte Übertragung des apathogenen Staupevirus durch die geimpften Tiere zu überprüfen. Keines der Tiere zeigte während einer Beobachtungsperiode von 25 Tagen irgendwelche Krankheitszeichen. Vor dem Experiment und am 17. Tag nach der Infektion wurde von allen Tieren Blut genommen. Mit den Seren, die 1/z Stunde bei 56° C inaktiviert worden waren, wurden nach einem lstündigen Aufenthalt bei Zimmertemperatur Gewebekultur-Neutralisationstests gegen 300 TCIDSo von Hundestaupevirus durchgeführt. Der 50 ouzo neutralisierende Titer der geimpften Tiere betrug mehr als 10-2 (Endverdünnung des Serums) am 17. Tag. Neutralisierende Antikörper wurden weder in den vor der Impfung gewonnenen Seren noch in den Seren der Kontrolltiere am 17. Tag post vaccinationem (p. v.) gefunden.
• Am 25. Tag p. v. wurden alle Tiere, die von nun an im selben Raum gehalten wurden, mit Greens Distemperoidvirus (75 mg gefriergetrocknete Frettchenmilz) infiziert. Nach einer einheitlichen Inkubationszeit von 7 Tagen zeigten alle Kontrolltiere typische klinische Anzeichen von Staupe und waren am 11. Tag nach der Infektion entweder tot oder wurden mit ausgeprägten Staupesymptomen getötet.
• Während einer Beobachtungsperiode von 3 Wochen zeigten die vier mit Gewebekulturvirus geimpften Tiere keine Symptome.
• Versuch 2 Das nach der unter A beschriebenen Arbeitsweise hergestellte, modifizierte, apathogene Staupevirus wurde auch in Hundeversuchen auf Verträglichkeit, Unschädlichkeit und Wirksamkeit geprüft.
• Acht gegen das Staupevirus nicht immune, 3 Monate alte Welpen (Bastarde) wurden in einem Isolierzwinger untergebracht. Von diesen Hunden wurden fünf mit je 1 ml der vorstehenden (Frettchenversuch) staupevirushaltigen Gewebesuspension intramuskulär vacciniert. Die anderen drei Hunde verblieben als unbehandelte Kontrollen. Das für die Immunisierung der Hunde verwendete Virusmaterial wurde nach der Gewinnung lyophilisiert und 5 Monate bei-70° C gelagert. Das zur Impfung verwendete, wiedergelöste Impfmaterial hatte in 1 ml einen Virusgehalt von lOs. TCID50, Ein Abfall des Virusgehaltes während der Lagerung von 5 Monaten war nicht eingetreten.
• Von den vaccinierten Hunden zeigten drei am 4. Tage post vaccinationem einen mäßigen Temperaturanstieg und eine leichte, vorübergehende Conjunctivitis. Im übrigen blieben sämtliche Hunde während einer Beobachtungszeit von 44 Tagen gesund.
• Von sämtlichen Hunden wurden Serumproben vor Versuchsbeginn und am 10. und 20. Tag nach der Impfung und von den Kontrollhunden außerdem am 38. Tag entnommen und auf Serumantikörper gegen Staupe untersucht, um festzustellen, ob durch die gemeinsame Unterbringung der vaccinierten und nicht vaccinierten Tiere eine Ubertragung des Impfvirus auf die Kontrolltiere erfolgt. Es zeigte sich, daß im Serum der Kontrolltiere auch am 38. Tag keine Antikörper vorhanden waren. Neutralisierende Antikörper wurden mit einem signifikanten Titer bereits nach 10 Tagen in den Seren der vaccinierten Hunde nachgewiesen. Die Antikörperstudien wurden in Hundenierenepithelkulturen in gleicher Weise wie bei den Immunisierungsversuchen an Frettchen durchgeführt. Bei sämtlichen vaccinierten Hunden war das Serum in der Verdünnung 1 : 100 in der Lage, 300 TCID50 des Staupevirus vollkommen zu neutralisieren. Höhere Serumverdünnungen wurden nicht untersucht.
• Am 44. Tag post vaccinationem wurden sämtliche Welpen mit einem hundepathogenen Snyder-Hill-Stamm intracerebral infiziert. Dieser Stamm soll bei intracerebraler Impfung am Hund 100°/oige Encephalitis verursachen, bei anderen Impfmethoden in 25 I/o der Fälle zu Staupe führen, aus der sich eine Encephalitis entwickelt. In dem vorliegenden Experiment blieben die fünf vorher mit Kulturvirus geimpften Tiere unbeeinflußt, während sämtliche Kontrolltiere nach 3 bis 4 Tagen an typischer Staupe mit hohem Fieber und im übrigen ausgedehnten Symptomen erkrankten. Eines der Kontrolltiere starb nach 12 Tagen, nachdem es ernste nervöse Symptome, Kaukrampf, Zuckungen in der Augen-und Ohrenmuskulatur zeigte. Bei der Obduktion zeigten sich encephalitische Veränderungen im Kleinhirn und für Staupe typische eosinophile, cytoplasmatische Einschlußkörper in den Epithelzellen der Trachealschleimhaut. Eines der beiden anderen Kontrolltiere zeigte nervös bedingte Muskelkrämpfe im Rumpf und den Extremitäten, ataktische Bewegungen und hochgradige Apathie. Die Beobachtungszeit nach der Impfung mit dem Snyder-Hill-Stamm betrug 52 Tage.
• Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.
• Versuch 3 Ein weiterer Versuch zur Überprüfung der Eigenschaften des in der Gewebekultur modifizierten Staupevirus wurde an sechs 8 Wochen alten staupeempfänglichen Hundewelpen durchgeführt. Es wurden jeweils zwei Wurfgeschwister gemeinsam in Isolierstallungen untergebracht und je eines mit 0, 5 ml einer Staupevirussuspension intramuskulär vacciniert. Zur Impfung wurde wiederum lyophilisiertes Staupevirus des bei den beiden vorausgegangenen Versuchen verwendeten Impfvirus der 65. Passage ver- wendet. Am 4. Tag nach der Impfung zeigte einer von drei Hunden einen kurzen Temperaturanstieg auf 39, 8° C ohne anderweitige klinische Symptome.
• Blutproben wurden am 10., 20., 30. und 40. Tag nach der Impfung von allen Hunden entnommen und das Serum im Virusneutralisationstest am embryonierten Hühnerei auf staupevirusneutralisierende Antikörper (G. A. Baker, H. R. Gorham, R. W. L e a d e r : Amer. Vet. Res., 15, S. 102 [1954]) untersucht. Während die vaccinierten Hunde einen hohen Serumantikörperspiegel gegen Staupe entwickelten, bildeten die unbehandelten Kontrollhunde während eines Beobachtungszeitraumes von 40 Tagen keine Serumantikörper aus, wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist.
• Diese Versuche zeigen, daß virulente Staupeviren nach rund fünfzig Passagen in der Gewebekultur unter Erhaltung der antigenen Kapazität bis zu einem solchen Grad apathogen sind, daß durch Impfung mit der erfindungsgemäßen Vaccine eine zufriedenstellende Serumimmunität bei Caniden und Musteliden sowie auch eine Infektionsimmunität gegen hochpathogene Virusstämme erzielt wird, ohne daß eine Erkrankung der Impflinge auftritt. Eine Übertragung des Impfvirus von den geimpften auf die Kontrolltiere erfolgt auch dann nicht, wenn letztere während der ganzen Versuchszeit in intimem Kontakt mit den geimpften Tieren waren.
• Tabelle 1

  Serumantikorper TCNDso' der Serumantikörper Testinfektion

  Status Hund Nr. gegen Staupe nach der Impfung mit aktivem

  vor der Impfung

  Staupevirus

  am 10. Tage am 20. Tage

  Vaccine... l keine iiber 10-2, o0-3e blieb gesund

  Vaccine.... 2 keineüberlO-s."10-s. sblieb gesund

  Vaccine......... 3 keine über 10-2,0 10-3,5 blieb gesund

  Vaccine..... 4 keine über 10-2so 10-s, 2 blieb gesund

  5 keine über 10-2,0 über 10-2,0 blieb gesund

  Kontrolle... 6 keine keine keine staupekrank

  Kontrolle 7 keine keine keine staupekrank

  Kontrolle... 8 keine keine keine staupekrank

  * 500/oigne neutralisierende Serumverdünnung.
• Tabelle 2

  Serum-Klinischer Verlauf Nachweis von staupevirusneutralisierenden

  Hund antikörper dosf nach der Impfung Serumantikörpern, getestet am Hühnerei am

  Nr. vor der donstige

  Nr. vor der sonstige

  Impfung Fieher 10. Tag p.v. 20. Tag p.v. 30. Tag p.v. 40. Tag p.v.

  Symptome

  Vaccine 9955 keine 0,5 ml nein nein 84,495 >210,195 >210,195 >836,417

  Vaccine 9958 keine 0, 5 ml nein nein 353, 700 >210, 195 >210, 195 >836, 417

  Vaccine 9960 keine 0,5 ml *) nein 44, 540 23, 355 >210, 195 >836, 417

  Kontrolle 9956 keine-nein nein keine keine keine keine

  Kontrolle 9959 keine-nein neinkeine keine keine keine

  Kontrolle 9961 keine-nein neinkeine keine keine keine

  *) Am 4. Tag nach der Impfung Temperatur 39, 8° C, im übrigen Beobachtungszeitraum Temperatur normal.

Claims (2)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen Staupe, dadurch gekennzeichnet, daß man das Staupevirus in wenigstens fünfzig aufeinanderfolgenden Passagen in einem Kulturgewebe unter Verwendung einer gepufferten Nährdiüssigkeit bei einem pjj-Wert zwischen 7, 0 und 8, 0 züchtet, die so erhaltene, das modifizierte Virus enthaltende Niihffliissigkeit aberntet und gegebenenfalls lyophilisiert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Abernten der das modifizierte Virus enthaltenden NährRüssigkeit das Kulturgewebe mit frischer Nährfussigkeit versetzt, nach mehreren Stunden aberntet und diese Maßnahme noch zwei-oder mehrmals wiederholt.