Verfahren zur Herstelllmg einer Vaccine gegen Staupe
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen Staupe, die lebendes, abgeschwächtes apathogenes Staupevirus enthält, welches nach Injektion bei Tieren der Familie der Caniden und Musteliden immunisierende Antikörper erzeugt, die mit den von virulenten Staupeviren erzeugten Aatikörpern identisch sind.
Die Methode, welche jetzt allgemein für die Produktion einer abgeschwachten Lebendvaccine benützt wird, beruht auf der Kultivierung des Staupevirus in embryonierten Hühnereiern, wie es z. B. in den USA-Patentschriften Nr. 2136 131, 2 271 819 und 2 391 540 beschrieben ist.
Eine in dieser Weise hergestellte Vaccine besitzt aber gewöhnlich einen verhältnismässig niederen Titer, der in der Grössenordnung von 103-104 MI liegt. Ferner ist dieses Verfahren kompliziert, lang- wierig und kostspielig.
Es wurde nun gefunden, dass man eine Vaccine gegen Staupe in der Weise herstellen kans, dans man das Staupevirus in wenigstens 50 aufeinanderfolgenden Passagen in einem Kulturgewebe unter Verwendung einer gepufferten Nährflüssigkeit bei einem pH-Wert zwischen 7, 0 und 8, 0 züchtet, die so erhaltene, das modifizierte Virus enthaltende Nähr- fliissigkeit aberntet und gegebenenfalls lyophilisiert.
Als Kulturgewebe für das Staupevirus kommen z. B. Nieren von Caniden und Musteliden, insbesondere Nieren von 6 bis 8 Wochen alten Hundewelpen, in Betracht. Ferner eignen sich Milz-, Hoden-und Uterusgewebe.
Als Nähr- oder Kulturflüssigkeit kommen vorzugsweise Hanks Lösung mit 0, 5 % Laetalbumin- hydrolysat mit etwa 10% Pferde-oder 20% Wälber- serum oder Earles Lösung mit etwa 2 % perde- sérum und 0, 5 S Lactalbuminhydrolysat, die pro m1 rund 100 Einheiten Penicillin und 50 y Streptomycin enthalten und einen pH-Wert zwischen 7, 0 und 8, 0, vorzugsweise 7, 6, aufweisen, in Frage.
Die Einstellung des optimalen pH-Werts wird zweck mässig mit Natriumbicarbonat vorgenommen. Die Züchtung des Staupevirus wird zweckmässig bei einer Temperatur zwischen 30 und 37 C, vorzugsweise 35 bis 37 C, durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine verbesserte Methode zur Herstellung einer Staupevaccine dar, die unter leicht zu kontrollierenden Bedingungen durchgeführt werden kann. Das Verfahren gemäss der Erfindung beruht darauf, dass die Züchtung des Staupevirus in einer Gewebekultur charakteristische Gewebeveränderungen hervorruft, die mikroskopisch leicht festgestellt werden können.
Während der Kultivierung wird das Virus in die Kulturflüssigkeit ausgeschieden. Die das Virus enthaltende Kulturflüssigkeit wird dann auf neue Ge webekulturen übertragen und die Züchtung wiederholt. Diese Passagen werden in genügender Anzahl wiederholt, bis das Virus abgeschwächt ist. Wenige Passagen des Virus geben keine befriedigenden Ergebnisse hinsichtlich der erwünschten Apathogenität, und es wurde deshalb vermutet, dass es ndcht mög- lich sein würde, eine aktive Vaccine mit d'er notigen Apathogenität und der verlangten hohen Antigenität zu erzeugen.
Es zeigte sich jedoch überraschenderweise, dass es durch eine grole Anzahl von Passagen, z, B. etwa 50 Passagen oder mehr, möglich ist, ein Virus zu erzeugen, welches sogar für gegen Taupe bekanntlich äusserst empfindliche Frettchen apathogen ist, seine antigenen Fähigkeiten aber noch in vollem Umfang besitzt. Es wurde weiterhin überraschenderweise gefunden, dass nach etwa 50 bis 60 Passagen der Virustiter im Vergleich mit dem Titer des Ursprungsvirus angestiegen war.
Zur Ausführung des Verfahrens gemäss der Erfindung verfährt man zweckmässig in folgender Weise :
A. Die Nieren von jungen Hunden werden unter tiefer Narkose und unter aseptischen Bedingungen entfernt. Nach Entfernung der Nierenkapsel wird die Nierenrinde in kleine Stückchen geschnitten, die nach wiederholtem Waschen in Aqua dest.-Phosphatpufferlösung mit einer gepufferten, 0, 25 % Trypsin enthaltenden Lösung behandelt und 10 Minuten auf etwa 37 C unter Umrühren erwärmt werden. Dann unterbricht man das Rühren und lässt die Stückohen sedimentieren. Die überstehende Trypsinlösung wird abgezogen und entfernt.
Danach wird friche, 0, 25 % ige TrS psinlösung hinzugefügt, und die Trypsi- nierung wird weitere 20 Minuten bei etwa 37 C fortgesetzt. Die so erhaltene Zellsuspension wirdl gefiltert, um einige grössere, Fregmente zu entfernen und wird dann 5 Minuten bei etwa 1000 U/min in einem Kühlschrank zentrifugiert. Das Zentrifugat wird entfernt. Die so erhaltenen sedimetnierten Zellen werden in einem Nahrmedium suspendiert, welches aus Hanks Lösung mit 0, 5 % Lactalbuminhydrolysat, 10 % Pferdeserum (oder 20 % Kälber- serum), 100 Einheiten Penicillin und 50 Gamma Streptomycin pro ml besteht.
Die Zellkonzentration im Medium wird auf etwa 200 000 Zellen pro ml eingestellt. Die Suspension wird in einer Menge von etwa 1 ml in Röhrchen abgefüllt. Während des Zellwachstums werden die Röhrchen in einer beinahe horizontalen Lage gehalten. Nach der Entwicklung einer Zell-Lage bei etwa 35 bis 371 C in den Röhrchen wird die Kulturlösung durch ein Nährmedium ersetzt, welches nur 2 % Pferdeserum und Earles Lösung anstelle von Hanks Lösung enthält.
Dann wird die Gewebekultur mit aus dem Blut von akut staupekranken Hunden isoliertem Virusmaterial beimpft. Nach 3 bis 4 Tagen wird die Kulturflüssigkeit geerntet, und die Kulturflüssigkeit, welche das Virus enthält, wird gesammelt. Die übriggebliebenen Zellen können für wied'erholte Anzüchtungen durch Zusatz von frischem Nährmedium gebraucht und können so für ungefähr 4 neue Ernten von virushaltiger Kulturflüssigkeit benützt werden.
Die so erhaltene Kulturflüssigkeit wird zur Beimpfung von frischen Gewebekulturen benützt, und die Züchtung wird wie vorher wiederholt.
Nach ungefähr 50 Passagen in dieser Weise kann die Kulturflüssigkeit, welche das abgeschwächte, apathogene Virus enthält, direkt als Vaccine benützt werden. Die Aktivität der Vaccine wird durch Feststellen des cytopathogenen Effektes in einer Gewebekultur der oben erwähnten Art geprüft. Unmittelbar nach der letzten Passage wird vorzugsweise die Kulturflüssigkeit gefriergetrocknet und kann in diesem Zustand aufbewahrt werden, bis sie zur Vac- cinierung benützt wird.
B. Zur Herstellung grösserer Mengen an Staupevaccine hat sich folgende Arbeitsweise bewäbrt :
Zur Kultivierung von Staupevirus in der Gewebekultur werden gesunde Hundewelpen im Alter von 6-8 Wochen verwendet, welche zur überprü- fung ihres Gesundheitszustandes etwa 10 Tage lang in Isolierstallungen gehalten und beobachtet werden.
Zur Anlage von Gewebekulturen werden die Welpen getötet und die Nieren unter möglichst sterilen Bedingungen frisch entnommen. In einer sterilen Kammer werden die Nierenkapseln abgezogen, die Bindegewebeanteile des Nierenbeckens entfernt und die Niernrinde in kleine Stückohen geschnitten, die in einem Gefäss gesammelt und in Aqua dest. mit 10 % Phosphatpufferlösung gewaschen werden. Danach werden die Nierenstückchen iti ein sogenanntes Trypsinierungsgefäss gebracht.
Unter sterilen Verhält- nissen wird eine auf etwa 37 C erwärmte, 0, 25 % ige Trypsinlösung zugeleitet. Unter ständigern Rühren mittels eines Magnetrührers erfolgt die Trypsinerung, d. h. unter Einwirkung dieses Fermentes werden einzelne Nierenzellen von den Gewebestückchen abgespalten. Die in der Lösung suspendierten Nierenzellen werden in ein Gefäss abgezogen und gesammelt. Zur Unterbindung des Trypsinierungsvorganges wird das Sammelgefäss in ein Eiswasserbad gestellt. Die Einwirkungsdauer des Trypsins beträgt etwa 20-25 Minute. Danach wird das Trypsin durch Zentrifugieren entfernt.
Dabei geht man so vor, dass die Nierenzellensuspension in Zentrifugenbecher eingefüllt und etwa 5 Minuten bei etwa 1000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wird.
Das Zentrifugat wird mit phosphatgepuffertem Aqua dest. aufgeschwemmt und erneut bei 600 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, wodurch auch Blutkörperchen im tYberstand verbleiben und entfernt werden können. Das so gewonnene Zellsediment wird im Verhältnis 1 : 300 bis 1 : 400 in einer Nährlösung s, uspendiert. Die finir die Suspendierung verwendete Nährlösung besteht vorteilhaft aus Hanks Lösung mit 0, 5 % Lactalbuminhydrolysat, 20 % Käl- berserum, 100 Einheiten Penicillin und 50 Gamma Streptomycin pro ml sowie 0, 01% Phenolrot.
Die Zellsuspension wird in einem sterilen System tuber Gaze gefühtt und in Kulturgefässe wie Rollrandröhrchen, Vierkantflächchen, Fernbachkolben oder vorzugsweise sogenannte Penicillinkolben abgefüllt.
Die Kulturgefässe werden bei einer Temperatur von etwa 35-37 C bobrütet, wobei die Nierenzellen sich an der Glaswand festsetzen und durch Zellteilung vermehren. Nach etwa 4-5 Tagen muss die Nährtlüssigkeit erneuert werden. Dabei geht man so vor, dass die verbrauchte Nährlösung entweder dekantiert oder durch eine Hebevorrichtung abgezogen wird. Zur Fütterung dler Kultur verwendet man Hanks Lö- sung mit 0, 5 % Lactalbuminhydrolysat wie oben beschrieben, jedoch nur 10 % Kälberserum.
Gewöhnlich ist nach weiteren 2-3 Tagen der Kulturrasen komplett ausgewaschen, so dass die Beimpfung mit dem Staupevirus erfolgen kann. Zur Beimpfung verwendet man vorzugsweise Earles Lö- sung anstelle von Hanks Lösung, mit 0, 5 % Lactal buminhydrolysat, 2 % Pferdeserum und den oben bezeichneten Zusätzen von Antibiotika und Phenokot.
In die Kulturgefässe wird nun eine apathogene Staupevirussuspension (z. B. Virus der 56. Gewebepassage im Verhältnis 1 : 20 bis 1 : 200) eingebracht.
Die Kulturkolben werden nun wiederum bei etwa 35-37 C bebrutet. Sie werden täglich mikroskopisch untersucht und auf Veränderungen, die für eine Vermehrung des Staupevirus typisch sind, geprüft.
Solche charakteristischen Veränderungen sind eine verstärkte Granulierung der Zellen, Zusammentre- ten der Zellkerne unter Auflösung der Zellgrenzen zu sogenannten Riesenzellen, welche gewöhulich in der Mitte ein granuliertes Zentrum und einen äusseren Plasmasaum mit Vakuole aufweisen. Zu diesem Zeitpunkt wird von den Zellen laufend Virus an das umgebende Nährmedium abgegeben. Diese virushaltige Nährlösung wird durch Dekantieren oder Abhebern geerntet. Zweckmässig wird das Kulturgewebe nach der Ernte mit frischem Nährmedium (Earles Lösung, wie oben) gefüttert.
Da die mit dem Staupevirus befallenen Zellen ihre Lebensfähigkeit weiter behalten, erfolgt eine fortlaufende Produktion von Staupevirus, so dass in einem gewissen Zeitabstand eine wiederholte Aberntung bzw. Fütterung erfolgen kann.
Dadurch können z. B. von einer Kultur 4 Aberntungen erzielt werden. Die geerntete Virussuspension wird bei Temperaturen von-35 bis-70 C aufbewahrt und kann so für die Vaccinenproduktion vor rating gehalten werden. Von den einzelnen Ernten werden Proben entnommen, die auf Sterilität geprüft und auf ihren Virusgehalt in der Gewebekultur titriert werden. Die als einwandfrei befundene Virussuspension wird aufgetaut, in kleinen Mengen in Fläschchen abgefüllt, tiefgefroren und lyophylisiert.
Das so erhaltene Produkt enthält lebende apa thogene Staupeviren in getrockneter und somit lang haltbarer Form. Es eignet sich vorzüglich nach Wie derauflösung in einem Lösungsmittel, z. B. gepuffertem Aqua dest., zur Immunisierung von Caniden und Musteliden gegen Staupe.
Die Herstellung eines lebenden apathogenen Staupevirus von der Gewebekultur besitzt gegenüber dem bisherigen, in Hühnerembryonalgewebe gezüch teten und vermehrten Staupevirus wesentliche Vorteile. So erhält man z. B. durch Kultivierung der Nieren eines etwa 8 Wochen alten Hundles ebensoviele Impfdosen wie aus 3000 Hühnereiern. Ein weiterer wesentlicher Vorteil ist die Erzielung eines um wenigstens 2 Zehnerpotenzen höheren Virustiters pro ml,
so dass durch die wiederholte Ernte undf den höheren Virusgehalt eine wesentTich höhere Produktionsausbeute und damait niedrigere Herstel- lungskosten als bei dem vom Ei gewonnenen Staupeimpfstoff erzielt werden.
Die Prüfung der Wirksamkeit der Vaccine gemäss der Erfindung sei in den folgenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Jedes von 4 Frettchen erhielt intraperitoneal 1 ml der nach dem unter A beschriebenen Verfahren hergestellten virushaltigen Gewebe-Kulturflüssigkeit, deren Titer 105,5 TCID50 betrug. Die Bezeichnung TCID50 bezieht sich auf die nach der Methode von Reed and Muench. Am. J. Hyg. 27, 493 (1938) errechnete tissue culture infectivity doses . Im sel- ben Laboratorium wurden 3 nicht immune Frettchen als Kontrolltiere und weitere 2 in einem be- nachbarten Raum gehalten, um eine möglich di- rekte Ubertragung des apathogenen Staupevirus durch die geimpften Tiere zu überprüfen. Keines der Tiere zeigte während einer Beobachtungsperiode von 25 Tagen irgenwelche Krankheitszeichen.
Vor dem Ex priment und am 17. Tag nach der Infektion wurde von allen Tieren Blut genommen. Mit den Seren, die ¸ Stunde bei 56 C inaktiviert worden waren, wurden nach einem einstündigen Aufenthalt bei Zimmertemperatur Gewebekultur-Neutralisationstests gegen 300 TCID50 von Hundestanpe-Virus durch- geführt. Der 50 % neutralisierende Titer der geimpften Tiere betrug mehr als 10-2 (Endverdünnung des Serums) am 17. Tag. Neutralisierende Antikörper wurden weder in den vor der Impfung gewonnenen Seren noch in den Seren der Kontrolltiere am 17. Tag gefunden.
Am 25. Tag wurden alle Tiere, die von nun an im selben Raum gehalten wurden, mit Greens Di stemperoid-Virus (75 mg gefriertrockene Frettchen- milz) infiziert. Nach einer einheitlichen Inkubationszeit von 7 Tagen zeigten alle Kontrolltiere typische klinische Anzeichen von Staupe und waren am 11.
Tag nach der Infektion entweder tot oder wurden mit ausgeprägten Staupe-Symptomen getötet. Während einer Beobachtungsperiode von 3 Wochen zeigten die 4 mit Gewebekultusvirus geimpften Tiere keine Symptome.
Beisprel 2
Das nach der unter A beschriebenen Arbeitsweise hergestellte, modifizierte, apathogene Staupevirus wurde auch in Hundeversuchen auf Verträglichkeit, Unschädlichkeit und Wirksamkeit geprüft.
8 gegen das Staupevirus nichet immune, 3 Monate alte Welpen (Bastarde) wurden in einem Isoler- zwinger untergebracht. Von diesen Hunden wurden 5 mit je 1 ml der vorstehenden (Frettchenversuch) staupevirushaltigen Gewebesuspension intramuskulär vacciniert. Die anderen 3 Hunde verblieben als un behandélte Kontrollen. Das finir die Immunisierung der Hunde verwendete Virusmaterial wurde nach der Gewinnung lyophilisiert und 5 Monate bei-70 C gelagert.
Das zur Impfung verwendete, wiedergelöste Impfmaterial hatte in 1 ml einen Virusgehalt von 105, 5 TCIDÏo. Ein Abfall des Virusgehaltes. während der Lagerung von 5 Monaten war nicht eingetreten.
Von den vaccinierten Hunden zeigten 3 am 4. Tage post vaccinationem einen mässigen Temperaturanstieg und eine leichte, vorübergehende Conjunctivitis. Im ubrigen blieben, samtliche Hunde wah- rend einer Beobachtungszeit von 44 Tagen gesund.
Von sämtlichen Hundén wurden Serumproben vor Versuchsbeginn und am 10. und 20. Tag nach der Impfung und von den Kontrollhunden auf3erdem am 38. Tag entnommen und auf Serumantikörper gegen Staupe untersucht, um festzustellen, ob durch die gemeinsame Unterbringung der vaccinierten und nichtvaccinierten Tiere eine tZbertragung des Impfvirus auf die Kontrolltiere erfolgt. Es zeigte sich, da3 im Serum der Kontrolltiere auch am 38. Tag keine Antikörper vorhanden waren. Neutralisierende Antikörper wurden mit einem signifikanten Titer be- reits nach 10 Tagen in den Seren der vaccinierten Hunde nachgewiesen.
Die Antikörperstudien wurden in Hundenierenepithelkulturen in gleicher Weise wie bei den Immunisierungsversuchen an Frettchen durchgeführt. Bei sämtlichen vaccinierten Hunden war das Serum in der Verdünnung 1 : 100 in der Lage, 300 TCID50 des Staupevirus vollkommen zu neutralisieren. Höhere Serumverdünnungen wurden nicht untersucht.
Am 44. Tag post vaccinationem wurden sämtliche Welpen mit einem hundepathogenen Snyder-Hill Stamm intramuskulär infiziert. Dieser Stamm soll bei intracerebraler Impfung am Hund 100% age Encephalitis verursachen, bei anderen Impfmethoden in 25 % der Faille zu Staupe führen, aus der sich eine Encephalitis entwickelt. In dem vorliegenden Expriment blieben die 5 vorher mit Kulturvirus geimpften Tiere unbeeinflusst, während sämtliche Kontrolltiere nach 3-4 Tagen an typischer Staupe mit hohem Fieber und im übrigen ausgedehnten Symptomen erkrankten. Eines der Kontrolltiere starb nach 12 Tagen, nachdem es ernste nervöse Symptome, Kaukrampf, Zuckungen in der Augen-und Ohrenmuskulatur zeigte.
Bei der Obduktion zeigten sich encephalitische Veränderungen im Kleinhirn und für Staupe typische eosinophile, cytoplasmatische Einschlusskörper in den Epithelzellen der Trachealschleimhaut. Eines der beiden anderen Kontrolltiere zeigte nervis bedingte Muskelkrämpfe im Rumpf und den Extremitäten, ataktische Bewegungen und hochgradige Apathie. Die Beobachtungszeit nach der Impfung mit dem Snyder-Hill-Stamm betrug 52 Tage.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.
Ein weiterer Versuch zur Überprüfung der Eigenschaften des in der Gewebekultur modifizierten Staupevirus wurde an sechs 8 Wochen alten staupeempfänglichen Hundewelpen durchgeführt. Es wurden jeweils zwei Wurfgeschwister gemeinsam in Iso lierstallungen untergebracht, und je eines mit 0, 5 ml einer Staupevirus-Suspension intramuskular vacciniert. Zur Impfung wurde wiederum lyophilisiertes Staupevirus des bei den beiden vorausgegangenen Versuchen verwendeten Impfvirus der 65. Passage verwendet. Am 4. Tag nach der Impfung zeigte einer von 3 Hunden einen kurzen Temperaturanstieg auf 39, 8 C ohne anderweitige klinische Symtome.
Blutproben wurden am 10., 20., 30. und 40. Tag nach der Impfung von allen Hunden entnommen und das Serum im Virusneutralisationstest am em- bryonierten Hühnerei auf staupevirusneutralisierende Antikörper [G. A. Baker, H. R. Gorham, R. W. Lea- der : Amer. J. Vet. Res. 15, 102 (1954)] untersucht. Während die vaccinierten Hunde einen hohen lende Serumimmunität bei Caniden und Musteliden bildeten die unbehandelten Kontrollhunde während eines Beobachtungszeitraumes von 40 Tagen keine Serumantikörper aus, wie aus Tabelle II ersichtlich ist.
Diese Versuche zeigen, dass virulente Staupeviren nach rund 50 Passagen in der Gewebekultur unter Erhaltung der antigenen Kapazität bis zu einem solchen Grad apathogen sind, dass durch Impfung mit der erfindungsgemässen Vaccine eine zufriedenstellende Serumimmunität bei Caniden und Musteliden sowie auch eine Infektionsimmunität gegen hochpathogene Virusstämme erzielt wird, ohne dass eine Erkrankung der Impflinge auftritt. Eine Übertragung des Impfvirus von den geimpften auf die Kontrolltiere erfolgt auch dann nicht, wenn letztere während der ganzen Versuchszeit in intimem Kontakt mit den geimpften Tieren waren.
Tabelle 1 TCNDso* der Serumantikörper Hund Serumantikorper Testinfektion mit Nr. vor der Impfung gegen Staupe nach der Impfung aktivem Staupevirus am 10. Tage am 20. Tage Vaccin. 1 keine iiber 10-2 10-3s blieb gesund Vaccin. 2 keine über 10-2,0 10-3,5 blieb gesund Vaccin. 3 keine über 10-2,0 10-3,5 blieb gesund Vaccin. 4 keine iiber 10-2 10--32 blieb gesund Vaccin. 5 keine über 10-2,0 über 10-2,0 blieb gesund Kontrolle fi keine keine keine staupekrank Kontrolle 7 keine keine keine staupekrank Kontrolle 8 keine keine keine staupekrank * TCND50 = 50%ige neutralisierende Serum-Verdünnung.
Tabelle 2
Serum- Klin. Verlauf Nachweis von staupevirusneutralisierenden Serumantikörpern Hunde Impfdosis Status antikörper n.d. Impfung getestet am Hühnerei am Nr. i.m. v.d.Impfung Fieber sonst. Symp. 10. Tg.p.v. 20.Tg.p.v. 30.Tg.p.v. 40.Tg.p.v.
Vacc. 9955 keine 0, 5 ml nein nein 84, 495 > 210, 195 > 210, 195 836, 417 Vache. 9958 keine 0, 5 ml nein nein 353, 700 > 210, 195 > 210, 195 836, 417 Vacc. 9960 keine 0, 5 ml * nein 44, 540 23, 355 > 210, 195 836, 417 Kontr. 9956 keine-nein nein keine keine keine keine Kontr. 9959 keine-nein nein keine keine keine keine Kontr. 9961 keine-nein nein keine keine keine keine * Am 4. Tag nach der Impfung Temperatur 39, 8 C, im übrigen Beobachtungszeitraum Temperatur normal.