Verfahren zur Herstelllmg einer Vaccine gegen Staupe
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen Staupe, die lebendes, abgeschwächtes apathogenes Staupevirus enthält, welches nach Injektion bei Tieren der Familie der Caniden und Musteliden immunisierende Antikörper erzeugt, die mit den von virulenten Staupeviren erzeugten Aatikörpern identisch sind.
Die Methode, welche jetzt allgemein für die Produktion einer abgeschwachten Lebendvaccine benützt wird, beruht auf der Kultivierung des Staupevirus in embryonierten Hühnereiern, wie es z. B. in den USA-Patentschriften Nr. 2136 131, 2 271 819 und 2 391 540 beschrieben ist.
Eine in dieser Weise hergestellte Vaccine besitzt aber gewöhnlich einen verhältnismässig niederen Titer, der in der Grössenordnung von 103-104 MI liegt. Ferner ist dieses Verfahren kompliziert, lang- wierig und kostspielig.
Es wurde nun gefunden, dass man eine Vaccine gegen Staupe in der Weise herstellen kans, dans man das Staupevirus in wenigstens 50 aufeinanderfolgenden Passagen in einem Kulturgewebe unter Verwendung einer gepufferten Nährflüssigkeit bei einem pH-Wert zwischen 7, 0 und 8, 0 züchtet, die so erhaltene, das modifizierte Virus enthaltende Nähr- fliissigkeit aberntet und gegebenenfalls lyophilisiert.
Als Kulturgewebe für das Staupevirus kommen z. B. Nieren von Caniden und Musteliden, insbesondere Nieren von 6 bis 8 Wochen alten Hundewelpen, in Betracht. Ferner eignen sich Milz-, Hoden-und Uterusgewebe.
Als Nähr- oder Kulturflüssigkeit kommen vorzugsweise Hanks Lösung mit 0, 5 % Laetalbumin- hydrolysat mit etwa 10% Pferde-oder 20% Wälber- serum oder Earles Lösung mit etwa 2 % perde- sérum und 0, 5 S Lactalbuminhydrolysat, die pro m1 rund 100 Einheiten Penicillin und 50 y Streptomycin enthalten und einen pH-Wert zwischen 7, 0 und 8, 0, vorzugsweise 7, 6, aufweisen, in Frage.
Die Einstellung des optimalen pH-Werts wird zweck mässig mit Natriumbicarbonat vorgenommen. Die Züchtung des Staupevirus wird zweckmässig bei einer Temperatur zwischen 30 und 37 C, vorzugsweise 35 bis 37 C, durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine verbesserte Methode zur Herstellung einer Staupevaccine dar, die unter leicht zu kontrollierenden Bedingungen durchgeführt werden kann. Das Verfahren gemäss der Erfindung beruht darauf, dass die Züchtung des Staupevirus in einer Gewebekultur charakteristische Gewebeveränderungen hervorruft, die mikroskopisch leicht festgestellt werden können.
Während der Kultivierung wird das Virus in die Kulturflüssigkeit ausgeschieden. Die das Virus enthaltende Kulturflüssigkeit wird dann auf neue Ge webekulturen übertragen und die Züchtung wiederholt. Diese Passagen werden in genügender Anzahl wiederholt, bis das Virus abgeschwächt ist. Wenige Passagen des Virus geben keine befriedigenden Ergebnisse hinsichtlich der erwünschten Apathogenität, und es wurde deshalb vermutet, dass es ndcht mög- lich sein würde, eine aktive Vaccine mit d'er notigen Apathogenität und der verlangten hohen Antigenität zu erzeugen.
Es zeigte sich jedoch überraschenderweise, dass es durch eine grole Anzahl von Passagen, z, B. etwa 50 Passagen oder mehr, möglich ist, ein Virus zu erzeugen, welches sogar für gegen Taupe bekanntlich äusserst empfindliche Frettchen apathogen ist, seine antigenen Fähigkeiten aber noch in vollem Umfang besitzt. Es wurde weiterhin überraschenderweise gefunden, dass nach etwa 50 bis 60 Passagen der Virustiter im Vergleich mit dem Titer des Ursprungsvirus angestiegen war.
Zur Ausführung des Verfahrens gemäss der Erfindung verfährt man zweckmässig in folgender Weise :
A. Die Nieren von jungen Hunden werden unter tiefer Narkose und unter aseptischen Bedingungen entfernt. Nach Entfernung der Nierenkapsel wird die Nierenrinde in kleine Stückchen geschnitten, die nach wiederholtem Waschen in Aqua dest.-Phosphatpufferlösung mit einer gepufferten, 0, 25 % Trypsin enthaltenden Lösung behandelt und 10 Minuten auf etwa 37 C unter Umrühren erwärmt werden. Dann unterbricht man das Rühren und lässt die Stückohen sedimentieren. Die überstehende Trypsinlösung wird abgezogen und entfernt.
Danach wird friche, 0, 25 % ige TrS psinlösung hinzugefügt, und die Trypsi- nierung wird weitere 20 Minuten bei etwa 37 C fortgesetzt. Die so erhaltene Zellsuspension wirdl gefiltert, um einige grössere, Fregmente zu entfernen und wird dann 5 Minuten bei etwa 1000 U/min in einem Kühlschrank zentrifugiert. Das Zentrifugat wird entfernt. Die so erhaltenen sedimetnierten Zellen werden in einem Nahrmedium suspendiert, welches aus Hanks Lösung mit 0, 5 % Lactalbuminhydrolysat, 10 % Pferdeserum (oder 20 % Kälber- serum), 100 Einheiten Penicillin und 50 Gamma Streptomycin pro ml besteht.
Die Zellkonzentration im Medium wird auf etwa 200 000 Zellen pro ml eingestellt. Die Suspension wird in einer Menge von etwa 1 ml in Röhrchen abgefüllt. Während des Zellwachstums werden die Röhrchen in einer beinahe horizontalen Lage gehalten. Nach der Entwicklung einer Zell-Lage bei etwa 35 bis 371 C in den Röhrchen wird die Kulturlösung durch ein Nährmedium ersetzt, welches nur 2 % Pferdeserum und Earles Lösung anstelle von Hanks Lösung enthält.
Dann wird die Gewebekultur mit aus dem Blut von akut staupekranken Hunden isoliertem Virusmaterial beimpft. Nach 3 bis 4 Tagen wird die Kulturflüssigkeit geerntet, und die Kulturflüssigkeit, welche das Virus enthält, wird gesammelt. Die übriggebliebenen Zellen können für wied'erholte Anzüchtungen durch Zusatz von frischem Nährmedium gebraucht und können so für ungefähr 4 neue Ernten von virushaltiger Kulturflüssigkeit benützt werden.
Die so erhaltene Kulturflüssigkeit wird zur Beimpfung von frischen Gewebekulturen benützt, und die Züchtung wird wie vorher wiederholt.
Nach ungefähr 50 Passagen in dieser Weise kann die Kulturflüssigkeit, welche das abgeschwächte, apathogene Virus enthält, direkt als Vaccine benützt werden. Die Aktivität der Vaccine wird durch Feststellen des cytopathogenen Effektes in einer Gewebekultur der oben erwähnten Art geprüft. Unmittelbar nach der letzten Passage wird vorzugsweise die Kulturflüssigkeit gefriergetrocknet und kann in diesem Zustand aufbewahrt werden, bis sie zur Vac- cinierung benützt wird.
B. Zur Herstellung grösserer Mengen an Staupevaccine hat sich folgende Arbeitsweise bewäbrt :
Zur Kultivierung von Staupevirus in der Gewebekultur werden gesunde Hundewelpen im Alter von 6-8 Wochen verwendet, welche zur überprü- fung ihres Gesundheitszustandes etwa 10 Tage lang in Isolierstallungen gehalten und beobachtet werden.
Zur Anlage von Gewebekulturen werden die Welpen getötet und die Nieren unter möglichst sterilen Bedingungen frisch entnommen. In einer sterilen Kammer werden die Nierenkapseln abgezogen, die Bindegewebeanteile des Nierenbeckens entfernt und die Niernrinde in kleine Stückohen geschnitten, die in einem Gefäss gesammelt und in Aqua dest. mit 10 % Phosphatpufferlösung gewaschen werden. Danach werden die Nierenstückchen iti ein sogenanntes Trypsinierungsgefäss gebracht.
Unter sterilen Verhält- nissen wird eine auf etwa 37 C erwärmte, 0, 25 % ige Trypsinlösung zugeleitet. Unter ständigern Rühren mittels eines Magnetrührers erfolgt die Trypsinerung, d. h. unter Einwirkung dieses Fermentes werden einzelne Nierenzellen von den Gewebestückchen abgespalten. Die in der Lösung suspendierten Nierenzellen werden in ein Gefäss abgezogen und gesammelt. Zur Unterbindung des Trypsinierungsvorganges wird das Sammelgefäss in ein Eiswasserbad gestellt. Die Einwirkungsdauer des Trypsins beträgt etwa 20-25 Minute. Danach wird das Trypsin durch Zentrifugieren entfernt.
Dabei geht man so vor, dass die Nierenzellensuspension in Zentrifugenbecher eingefüllt und etwa 5 Minuten bei etwa 1000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wird.
Das Zentrifugat wird mit phosphatgepuffertem Aqua dest. aufgeschwemmt und erneut bei 600 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, wodurch auch Blutkörperchen im tYberstand verbleiben und entfernt werden können. Das so gewonnene Zellsediment wird im Verhältnis 1 : 300 bis 1 : 400 in einer Nährlösung s, uspendiert. Die finir die Suspendierung verwendete Nährlösung besteht vorteilhaft aus Hanks Lösung mit 0, 5 % Lactalbuminhydrolysat, 20 % Käl- berserum, 100 Einheiten Penicillin und 50 Gamma Streptomycin pro ml sowie 0, 01% Phenolrot.
Die Zellsuspension wird in einem sterilen System tuber Gaze gefühtt und in Kulturgefässe wie Rollrandröhrchen, Vierkantflächchen, Fernbachkolben oder vorzugsweise sogenannte Penicillinkolben abgefüllt.
Die Kulturgefässe werden bei einer Temperatur von etwa 35-37 C bobrütet, wobei die Nierenzellen sich an der Glaswand festsetzen und durch Zellteilung vermehren. Nach etwa 4-5 Tagen muss die Nährtlüssigkeit erneuert werden. Dabei geht man so vor, dass die verbrauchte Nährlösung entweder dekantiert oder durch eine Hebevorrichtung abgezogen wird. Zur Fütterung dler Kultur verwendet man Hanks Lö- sung mit 0, 5 % Lactalbuminhydrolysat wie oben beschrieben, jedoch nur 10 % Kälberserum.
Gewöhnlich ist nach weiteren 2-3 Tagen der Kulturrasen komplett ausgewaschen, so dass die Beimpfung mit dem Staupevirus erfolgen kann. Zur Beimpfung verwendet man vorzugsweise Earles Lö- sung anstelle von Hanks Lösung, mit 0, 5 % Lactal buminhydrolysat, 2 % Pferdeserum und den oben bezeichneten Zusätzen von Antibiotika und Phenokot.
In die Kulturgefässe wird nun eine apathogene Staupevirussuspension (z. B. Virus der 56. Gewebepassage im Verhältnis 1 : 20 bis 1 : 200) eingebracht.
Die Kulturkolben werden nun wiederum bei etwa 35-37 C bebrutet. Sie werden täglich mikroskopisch untersucht und auf Veränderungen, die für eine Vermehrung des Staupevirus typisch sind, geprüft.
Solche charakteristischen Veränderungen sind eine verstärkte Granulierung der Zellen, Zusammentre- ten der Zellkerne unter Auflösung der Zellgrenzen zu sogenannten Riesenzellen, welche gewöhulich in der Mitte ein granuliertes Zentrum und einen äusseren Plasmasaum mit Vakuole aufweisen. Zu diesem Zeitpunkt wird von den Zellen laufend Virus an das umgebende Nährmedium abgegeben. Diese virushaltige Nährlösung wird durch Dekantieren oder Abhebern geerntet. Zweckmässig wird das Kulturgewebe nach der Ernte mit frischem Nährmedium (Earles Lösung, wie oben) gefüttert.
Da die mit dem Staupevirus befallenen Zellen ihre Lebensfähigkeit weiter behalten, erfolgt eine fortlaufende Produktion von Staupevirus, so dass in einem gewissen Zeitabstand eine wiederholte Aberntung bzw. Fütterung erfolgen kann.
Dadurch können z. B. von einer Kultur 4 Aberntungen erzielt werden. Die geerntete Virussuspension wird bei Temperaturen von-35 bis-70 C aufbewahrt und kann so für die Vaccinenproduktion vor rating gehalten werden. Von den einzelnen Ernten werden Proben entnommen, die auf Sterilität geprüft und auf ihren Virusgehalt in der Gewebekultur titriert werden. Die als einwandfrei befundene Virussuspension wird aufgetaut, in kleinen Mengen in Fläschchen abgefüllt, tiefgefroren und lyophylisiert.
Das so erhaltene Produkt enthält lebende apa thogene Staupeviren in getrockneter und somit lang haltbarer Form. Es eignet sich vorzüglich nach Wie derauflösung in einem Lösungsmittel, z. B. gepuffertem Aqua dest., zur Immunisierung von Caniden und Musteliden gegen Staupe.
Die Herstellung eines lebenden apathogenen Staupevirus von der Gewebekultur besitzt gegenüber dem bisherigen, in Hühnerembryonalgewebe gezüch teten und vermehrten Staupevirus wesentliche Vorteile. So erhält man z. B. durch Kultivierung der Nieren eines etwa 8 Wochen alten Hundles ebensoviele Impfdosen wie aus 3000 Hühnereiern. Ein weiterer wesentlicher Vorteil ist die Erzielung eines um wenigstens 2 Zehnerpotenzen höheren Virustiters pro ml,
so dass durch die wiederholte Ernte undf den höheren Virusgehalt eine wesentTich höhere Produktionsausbeute und damait niedrigere Herstel- lungskosten als bei dem vom Ei gewonnenen Staupeimpfstoff erzielt werden.
Die Prüfung der Wirksamkeit der Vaccine gemäss der Erfindung sei in den folgenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Jedes von 4 Frettchen erhielt intraperitoneal 1 ml der nach dem unter A beschriebenen Verfahren hergestellten virushaltigen Gewebe-Kulturflüssigkeit, deren Titer 105,5 TCID50 betrug. Die Bezeichnung TCID50 bezieht sich auf die nach der Methode von Reed and Muench. Am. J. Hyg. 27, 493 (1938) errechnete tissue culture infectivity doses . Im sel- ben Laboratorium wurden 3 nicht immune Frettchen als Kontrolltiere und weitere 2 in einem be- nachbarten Raum gehalten, um eine möglich di- rekte Ubertragung des apathogenen Staupevirus durch die geimpften Tiere zu überprüfen. Keines der Tiere zeigte während einer Beobachtungsperiode von 25 Tagen irgenwelche Krankheitszeichen.
Vor dem Ex priment und am 17. Tag nach der Infektion wurde von allen Tieren Blut genommen. Mit den Seren, die ¸ Stunde bei 56 C inaktiviert worden waren, wurden nach einem einstündigen Aufenthalt bei Zimmertemperatur Gewebekultur-Neutralisationstests gegen 300 TCID50 von Hundestanpe-Virus durch- geführt. Der 50 % neutralisierende Titer der geimpften Tiere betrug mehr als 10-2 (Endverdünnung des Serums) am 17. Tag. Neutralisierende Antikörper wurden weder in den vor der Impfung gewonnenen Seren noch in den Seren der Kontrolltiere am 17. Tag gefunden.
Am 25. Tag wurden alle Tiere, die von nun an im selben Raum gehalten wurden, mit Greens Di stemperoid-Virus (75 mg gefriertrockene Frettchen- milz) infiziert. Nach einer einheitlichen Inkubationszeit von 7 Tagen zeigten alle Kontrolltiere typische klinische Anzeichen von Staupe und waren am 11.
Tag nach der Infektion entweder tot oder wurden mit ausgeprägten Staupe-Symptomen getötet. Während einer Beobachtungsperiode von 3 Wochen zeigten die 4 mit Gewebekultusvirus geimpften Tiere keine Symptome.
Beisprel 2
Das nach der unter A beschriebenen Arbeitsweise hergestellte, modifizierte, apathogene Staupevirus wurde auch in Hundeversuchen auf Verträglichkeit, Unschädlichkeit und Wirksamkeit geprüft.
8 gegen das Staupevirus nichet immune, 3 Monate alte Welpen (Bastarde) wurden in einem Isoler- zwinger untergebracht. Von diesen Hunden wurden 5 mit je 1 ml der vorstehenden (Frettchenversuch) staupevirushaltigen Gewebesuspension intramuskulär vacciniert. Die anderen 3 Hunde verblieben als un behandélte Kontrollen. Das finir die Immunisierung der Hunde verwendete Virusmaterial wurde nach der Gewinnung lyophilisiert und 5 Monate bei-70 C gelagert.
Das zur Impfung verwendete, wiedergelöste Impfmaterial hatte in 1 ml einen Virusgehalt von 105, 5 TCIDÏo. Ein Abfall des Virusgehaltes. während der Lagerung von 5 Monaten war nicht eingetreten.
Von den vaccinierten Hunden zeigten 3 am 4. Tage post vaccinationem einen mässigen Temperaturanstieg und eine leichte, vorübergehende Conjunctivitis. Im ubrigen blieben, samtliche Hunde wah- rend einer Beobachtungszeit von 44 Tagen gesund.
Von sämtlichen Hundén wurden Serumproben vor Versuchsbeginn und am 10. und 20. Tag nach der Impfung und von den Kontrollhunden auf3erdem am 38. Tag entnommen und auf Serumantikörper gegen Staupe untersucht, um festzustellen, ob durch die gemeinsame Unterbringung der vaccinierten und nichtvaccinierten Tiere eine tZbertragung des Impfvirus auf die Kontrolltiere erfolgt. Es zeigte sich, da3 im Serum der Kontrolltiere auch am 38. Tag keine Antikörper vorhanden waren. Neutralisierende Antikörper wurden mit einem signifikanten Titer be- reits nach 10 Tagen in den Seren der vaccinierten Hunde nachgewiesen.
Die Antikörperstudien wurden in Hundenierenepithelkulturen in gleicher Weise wie bei den Immunisierungsversuchen an Frettchen durchgeführt. Bei sämtlichen vaccinierten Hunden war das Serum in der Verdünnung 1 : 100 in der Lage, 300 TCID50 des Staupevirus vollkommen zu neutralisieren. Höhere Serumverdünnungen wurden nicht untersucht.
Am 44. Tag post vaccinationem wurden sämtliche Welpen mit einem hundepathogenen Snyder-Hill Stamm intramuskulär infiziert. Dieser Stamm soll bei intracerebraler Impfung am Hund 100% age Encephalitis verursachen, bei anderen Impfmethoden in 25 % der Faille zu Staupe führen, aus der sich eine Encephalitis entwickelt. In dem vorliegenden Expriment blieben die 5 vorher mit Kulturvirus geimpften Tiere unbeeinflusst, während sämtliche Kontrolltiere nach 3-4 Tagen an typischer Staupe mit hohem Fieber und im übrigen ausgedehnten Symptomen erkrankten. Eines der Kontrolltiere starb nach 12 Tagen, nachdem es ernste nervöse Symptome, Kaukrampf, Zuckungen in der Augen-und Ohrenmuskulatur zeigte.
Bei der Obduktion zeigten sich encephalitische Veränderungen im Kleinhirn und für Staupe typische eosinophile, cytoplasmatische Einschlusskörper in den Epithelzellen der Trachealschleimhaut. Eines der beiden anderen Kontrolltiere zeigte nervis bedingte Muskelkrämpfe im Rumpf und den Extremitäten, ataktische Bewegungen und hochgradige Apathie. Die Beobachtungszeit nach der Impfung mit dem Snyder-Hill-Stamm betrug 52 Tage.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.
Ein weiterer Versuch zur Überprüfung der Eigenschaften des in der Gewebekultur modifizierten Staupevirus wurde an sechs 8 Wochen alten staupeempfänglichen Hundewelpen durchgeführt. Es wurden jeweils zwei Wurfgeschwister gemeinsam in Iso lierstallungen untergebracht, und je eines mit 0, 5 ml einer Staupevirus-Suspension intramuskular vacciniert. Zur Impfung wurde wiederum lyophilisiertes Staupevirus des bei den beiden vorausgegangenen Versuchen verwendeten Impfvirus der 65. Passage verwendet. Am 4. Tag nach der Impfung zeigte einer von 3 Hunden einen kurzen Temperaturanstieg auf 39, 8 C ohne anderweitige klinische Symtome.
Blutproben wurden am 10., 20., 30. und 40. Tag nach der Impfung von allen Hunden entnommen und das Serum im Virusneutralisationstest am em- bryonierten Hühnerei auf staupevirusneutralisierende Antikörper [G. A. Baker, H. R. Gorham, R. W. Lea- der : Amer. J. Vet. Res. 15, 102 (1954)] untersucht. Während die vaccinierten Hunde einen hohen lende Serumimmunität bei Caniden und Musteliden bildeten die unbehandelten Kontrollhunde während eines Beobachtungszeitraumes von 40 Tagen keine Serumantikörper aus, wie aus Tabelle II ersichtlich ist.
Diese Versuche zeigen, dass virulente Staupeviren nach rund 50 Passagen in der Gewebekultur unter Erhaltung der antigenen Kapazität bis zu einem solchen Grad apathogen sind, dass durch Impfung mit der erfindungsgemässen Vaccine eine zufriedenstellende Serumimmunität bei Caniden und Musteliden sowie auch eine Infektionsimmunität gegen hochpathogene Virusstämme erzielt wird, ohne dass eine Erkrankung der Impflinge auftritt. Eine Übertragung des Impfvirus von den geimpften auf die Kontrolltiere erfolgt auch dann nicht, wenn letztere während der ganzen Versuchszeit in intimem Kontakt mit den geimpften Tieren waren.
Tabelle 1 TCNDso* der Serumantikörper Hund Serumantikorper Testinfektion mit Nr. vor der Impfung gegen Staupe nach der Impfung aktivem Staupevirus am 10. Tage am 20. Tage Vaccin. 1 keine iiber 10-2 10-3s blieb gesund Vaccin. 2 keine über 10-2,0 10-3,5 blieb gesund Vaccin. 3 keine über 10-2,0 10-3,5 blieb gesund Vaccin. 4 keine iiber 10-2 10--32 blieb gesund Vaccin. 5 keine über 10-2,0 über 10-2,0 blieb gesund Kontrolle fi keine keine keine staupekrank Kontrolle 7 keine keine keine staupekrank Kontrolle 8 keine keine keine staupekrank * TCND50 = 50%ige neutralisierende Serum-Verdünnung.
Tabelle 2
Serum- Klin. Verlauf Nachweis von staupevirusneutralisierenden Serumantikörpern Hunde Impfdosis Status antikörper n.d. Impfung getestet am Hühnerei am Nr. i.m. v.d.Impfung Fieber sonst. Symp. 10. Tg.p.v. 20.Tg.p.v. 30.Tg.p.v. 40.Tg.p.v.
Vacc. 9955 keine 0, 5 ml nein nein 84, 495 > 210, 195 > 210, 195 836, 417 Vache. 9958 keine 0, 5 ml nein nein 353, 700 > 210, 195 > 210, 195 836, 417 Vacc. 9960 keine 0, 5 ml * nein 44, 540 23, 355 > 210, 195 836, 417 Kontr. 9956 keine-nein nein keine keine keine keine Kontr. 9959 keine-nein nein keine keine keine keine Kontr. 9961 keine-nein nein keine keine keine keine * Am 4. Tag nach der Impfung Temperatur 39, 8 C, im übrigen Beobachtungszeitraum Temperatur normal.
Process for the production of a vaccine against distemper
The present invention relates to a process for the production of a vaccine against distemper which contains live, attenuated non-pathogenic distemper virus which, after injection, produces immunizing antibodies in animals of the family of canids and mustelids which are identical to the antibodies produced by virulent distemper viruses.
The method, which is now generally used for the production of an attenuated live vaccine, is based on the cultivation of the distemper virus in embryonated hen's eggs, as is e.g. As described in U.S. Patent Nos. 2,136,131, 2,271,819 and 2,391,540.
However, a vaccine produced in this way usually has a relatively low titer, which is of the order of magnitude of 103-104 MI. Furthermore, this process is complicated, lengthy and expensive.
It has now been found that a vaccine against distemper can be produced in such a way that the distemper virus is cultured in at least 50 successive passages in a culture tissue using a buffered nutrient liquid at a pH between 7.0 and 8.0 The resulting nutrient liquid containing the modified virus is harvested and optionally lyophilized.
As a cultural tissue for the distemper virus z. B. kidneys of canids and mustelids, especially kidneys of 6 to 8 week old puppies, into consideration. Spleen, testicular and uterine tissue are also suitable.
Hanks' solution with 0.5% Laetalbumin hydrolyzate with about 10% horse or 20% Wälber serum or Earle's solution with about 2% perde- sérum and 0.5% lactalbumin hydrolyzate per m1 are preferably used as the nutrient or culture fluid Containing 100 units of penicillin and 50 y of streptomycin and having a pH value between 7.0 and 8.0, preferably 7.6, are in question.
The setting of the optimal pH value is expediently made with sodium bicarbonate. The distemper virus is expediently cultivated at a temperature between 30 and 37 C, preferably 35 to 37 C.
The present invention provides an improved method of making a congestion vaccine that can be operated under easily controlled conditions. The method according to the invention is based on the fact that the cultivation of the distemper virus in a tissue culture causes characteristic tissue changes which can easily be determined microscopically.
During the cultivation, the virus is excreted into the culture fluid. The culture fluid containing the virus is then transferred to new tissue cultures and the cultivation is repeated. These passages are repeated in sufficient numbers until the virus is weakened. A few passages of the virus do not give satisfactory results with regard to the desired apathogenicity, and it was therefore suspected that it would not be possible to produce an active vaccine with the necessary apathogenicity and the required high antigenicity.
Surprisingly, however, it turned out that a large number of passages, e.g. about 50 passages or more, makes it possible to generate a virus which is non-pathogenic even for ferrets which are known to be extremely sensitive to taupe, but which is still antigenic fully owns. It was also found, surprisingly, that after about 50 to 60 passages the virus titer had increased in comparison with the titer of the original virus.
To carry out the method according to the invention, one proceeds appropriately in the following way:
A. Young dog kidneys are removed under deep anesthesia and under aseptic conditions. After removing the kidney capsule, the kidney cortex is cut into small pieces which, after repeated washing in distilled water phosphate buffer solution, are treated with a buffered solution containing 0.25% trypsin and heated for 10 minutes at about 37 ° C. while stirring. Then the stirring is interrupted and the pieces are allowed to sediment. The supernatant trypsin solution is drawn off and removed.
Fresh 0.25% TrS psin solution is then added, and trypsination is continued at about 37 ° C. for a further 20 minutes. The cell suspension thus obtained is filtered to remove some larger fragments and is then centrifuged for 5 minutes at about 1000 rpm in a refrigerator. The centrifugate is removed. The sedimented cells obtained in this way are suspended in a nutrient medium which consists of Hanks' solution with 0.5% lactalbumin hydrolyzate, 10% horse serum (or 20% calf serum), 100 units of penicillin and 50 gamma streptomycin per ml.
The cell concentration in the medium is adjusted to about 200,000 cells per ml. The suspension is filled into tubes in an amount of about 1 ml. During cell growth, the tubes are held in an almost horizontal position. After a cell layer has developed in the tubes at around 35 to 371 C, the culture solution is replaced by a nutrient medium that contains only 2% horse serum and Earle's solution instead of Hanks' solution.
The tissue culture is then inoculated with virus material isolated from the blood of dogs suffering from acute congestion. After 3 to 4 days, the culture fluid is harvested and the culture fluid containing the virus is collected. The remaining cells can be used for repeated cultivations by adding fresh nutrient medium and can thus be used for about 4 new harvests of virus-containing culture fluid.
The culture fluid thus obtained is used for inoculating fresh tissue cultures, and the cultivation is repeated as before.
After about 50 passages in this way, the culture fluid, which contains the weakened, non-pathogenic virus, can be used directly as a vaccine. The activity of the vaccines is tested by determining the cytopathogenic effect in a tissue culture of the type mentioned above. Immediately after the last passage, the culture liquid is preferably freeze-dried and can be stored in this state until it is used for vacuuming.
B. For the production of larger quantities of congestion vaccines, the following working method has proven itself:
To cultivate distemper virus in the tissue culture, healthy puppies aged 6-8 weeks are used, which are kept and observed in isolation stables for about 10 days to check their health.
In order to create tissue cultures, the puppies are killed and the kidneys are freshly removed under as sterile conditions as possible. The kidney capsules are removed in a sterile chamber, the connective tissue of the renal pelvis is removed and the kidney cortex is cut into small pieces, which are collected in a vessel and poured into distilled water. be washed with 10% phosphate buffer solution. Then the kidney pieces are placed in a so-called trypsinization vessel.
A 0.25% trypsin solution, warmed to about 37 ° C, is fed in under sterile conditions. Trypsinization takes place with constant stirring by means of a magnetic stirrer. H. Under the action of this ferment, individual kidney cells are split off from the pieces of tissue. The kidney cells suspended in the solution are drawn off into a vessel and collected. To prevent the trypsinization process, the collecting vessel is placed in an ice water bath. The exposure time to the trypsin is about 20-25 minutes. The trypsin is then removed by centrifugation.
The procedure is such that the kidney cell suspension is poured into the centrifuge beaker and centrifuged for about 5 minutes at about 1000 revolutions per minute.
The centrifugate is washed with phosphate-buffered distilled water. Floated and centrifuged again at 600 revolutions per minute, whereby blood cells remain in the supernatant and can be removed. The cell sediment obtained in this way is suspended in a nutrient solution in a ratio of 1: 300 to 1: 400. The nutrient solution used for the suspension advantageously consists of Hanks' solution with 0.5% lactalbumin hydrolyzate, 20% calf serum, 100 units of penicillin and 50 gamma streptomycin per ml, and 0.01% phenol red.
The cell suspension is fed into a sterile system over gauze and filled into culture vessels such as rolled-rim tubes, square surfaces, Fernbach flasks or preferably so-called penicillin flasks.
The culture vessels are incubated at a temperature of around 35-37 C, whereby the kidney cells attach themselves to the glass wall and multiply through cell division. After about 4-5 days, the nutrient fluid must be renewed. The procedure is that the used nutrient solution is either decanted or drawn off by a lifting device. Hanks solution with 0.5% lactalbumin hydrolyzate as described above, but only 10% calf serum, is used to feed the culture.
Usually the cultivated turf is completely washed out after another 2-3 days, so that the inoculation with the distemper virus can take place. Earle's solution is preferably used for inoculation instead of Hanks' solution, with 0.5% lactalbumin hydrolyzate, 2% horse serum and the above-mentioned additions of antibiotics and phenocot.
A non-pathogenic virus suspension (e.g. virus of the 56th tissue passage in a ratio of 1:20 to 1: 200) is then introduced into the culture vessels.
The culture flasks are then incubated again at around 35-37 ° C. They are examined microscopically every day and checked for changes that are typical for a multiplication of the distemper virus.
Such characteristic changes are an increased granulation of the cells, the coming together of the cell nuclei with the dissolution of the cell boundaries to form so-called giant cells, which usually have a granulated center in the middle and an outer plasma rim with vacuole. At this point in time, the cells continuously release virus to the surrounding nutrient medium. This virus-containing nutrient solution is harvested by decanting or siphoning. The cultural tissue is expediently fed with fresh nutrient medium (Earle's solution, as above) after the harvest.
Since the cells infected with the distemper virus keep their viability, there is a continuous production of distemper virus so that repeated harvesting or feeding can take place at a certain time interval.
This allows z. B. 4 harvests can be achieved from one culture. The harvested virus suspension is stored at temperatures from -35 to -70 C and can thus be kept prior to rating for vaccine production. Samples are taken from the individual harvests, which are checked for sterility and titrated for their virus content in the tissue culture. The virus suspension found to be correct is thawed, filled into small quantities in small bottles, frozen and lyophilized.
The product obtained in this way contains living apathogenic distemper viruses in a dried and therefore long-lasting form. It is particularly suitable after how dissolution in a solvent such. B. buffered aqua dest., For the immunization of canids and mustelids against distemper.
The production of a living non-pathogenic distemper virus from the tissue culture has significant advantages over the previous distemper virus that has been grown and increased in chicken embryonic tissue. So you get z. B. by cultivating the kidneys of an approximately 8-week-old dog as many vaccine doses as from 3000 hen's eggs. Another important advantage is the achievement of a virus titer per ml higher by at least 2 powers of ten,
so that through the repeated harvest and the higher virus content a significantly higher production yield and thus lower manufacturing costs are achieved than with the distemper vaccine obtained from the egg.
The testing of the effectiveness of the vaccines according to the invention is explained in more detail in the following examples.
example 1
Each of 4 ferrets received intraperitoneally 1 ml of the virus-containing tissue culture fluid prepared by the method described under A, the titer of which was 105.5 TCID50. The designation TCID50 refers to the method of Reed and Muench. At the. J. Hyg. 27, 493 (1938) calculated tissue culture infectivity doses. In the same laboratory, 3 non-immune ferrets were kept as control animals and a further 2 in a neighboring room in order to check whether the non-pathogenic distemper virus could be transmitted directly by the vaccinated animals. None of the animals showed any signs of disease during an observation period of 25 days.
Before the experiment and on the 17th day after infection, blood was taken from all animals. Tissue culture neutralization tests against 300 TCID50 of Hundestanpe virus were carried out with the sera which had been inactivated for hour at 56 ° C. after a one hour stay at room temperature. The 50% neutralizing titer of the vaccinated animals was more than 10-2 (final dilution of the serum) on the 17th day. Neutralizing antibodies were not found either in the sera obtained before vaccination or in the sera of the control animals on the 17th day.
On the 25th day, all animals that were kept in the same room from now on were infected with Greens distemperoid virus (75 mg freeze-dried ferret spleen). After a uniform incubation time of 7 days, all control animals showed typical clinical signs of distemper.
Day after infection either dead or were killed with pronounced distemper symptoms. During an observation period of 3 weeks, the 4 animals vaccinated with tissue culture virus showed no symptoms.
Example 2
The modified, non-pathogenic distemper virus produced according to the procedure described under A was also tested in dog experiments for tolerance, harmlessness and effectiveness.
8 not immune to the distemper virus, 3 month old puppies (hybrids) were housed in an isolator pen. 5 of these dogs were vaccinated intramuscularly with 1 ml each of the above (ferret experiment) tissue suspension containing distemper virus. The other 3 dogs remained as untreated controls. The virus material used for the immunization of the dogs was lyophilized after collection and stored at −70 ° C. for 5 months.
The redissolved inoculum used for vaccination had a virus content of 105.5 TCIDÏo in 1 ml. A drop in virus levels. did not occur during storage for 5 months.
Of the vaccinated dogs, 3 showed a moderate increase in temperature and slight, transient conjunctivitis on the 4th day post vaccination. Otherwise, all of the dogs remained healthy during an observation period of 44 days.
Serum samples were taken from all dogs before the start of the experiment and on the 10th and 20th day after vaccination and from the control dogs on the 38th day and examined for serum antibodies against distemper to determine whether the vaccinated and non-vaccinated animals were housed together of the vaccine virus is carried out on the control animals. It was found that no antibodies were present in the serum of the control animals on day 38 either. Neutralizing antibodies were detected with a significant titer in the sera of the vaccinated dogs after just 10 days.
The antibody studies were carried out in canine kidney epithelial cultures in the same manner as in the immunization experiments on ferrets. In all vaccinated dogs, the serum diluted 1: 100 was able to completely neutralize 300 TCID50 of the distemper virus. Higher serum dilutions have not been studied.
On the 44th day post vaccination, all puppies were infected intramuscularly with a dog-pathogenic Snyder Hill strain. This strain is said to cause 100% age encephalitis with intracerebral vaccination in dogs, with other vaccination methods it leads to distemper in 25% of cases, from which encephalitis develops. In the present experiment, the 5 animals previously vaccinated with culture virus remained unaffected, while all control animals developed typical distemper with high fever and extensive symptoms after 3-4 days. One of the control animals died after 12 days after showing serious nervous symptoms, chewing cramps, twitching of the eye and ear muscles.
The autopsy revealed encephalitic changes in the cerebellum and eosinophilic, cytoplasmic inclusion bodies typical of distemper in the epithelial cells of the tracheal mucosa. One of the other two control animals showed nervis-related muscle spasms in the trunk and extremities, atactic movements and profound apathy. The observation time after vaccination with the Snyder Hill strain was 52 days.
The results are given in Table I.
Another experiment to check the properties of the distemper virus modified in the tissue culture was carried out on six 8-week-old pups susceptible to distemper. Two littermates were each housed together in Iso lierstallungen, and each vaccinated one intramuscularly with 0.5 ml of a distemper virus suspension. Lyophilized distemper virus of the vaccine virus of the 65th passage used in the two previous experiments was again used for vaccination. On the 4th day after vaccination, one of 3 dogs showed a brief temperature increase to 39.8 ° C without any other clinical symptoms.
Blood samples were taken from all dogs on the 10th, 20th, 30th and 40th day after the vaccination and the serum in the virus neutralization test on embryonated hen's eggs for antibodies that neutralize the congestion virus [G. A. Baker, H. R. Gorham, R. W. Leader: Amer. J. Vet. Res. 15, 102 (1954)]. While the vaccinated dogs showed high serum immunity in canids and mustelids, the untreated control dogs developed no serum antibodies during an observation period of 40 days, as can be seen from Table II.
These experiments show that virulent distemper viruses after around 50 passages in the tissue culture are non-pathogenic to such an extent while maintaining the antigenic capacity that vaccination with the vaccine according to the invention achieves satisfactory serum immunity in canids and mustelids as well as infection immunity against highly pathogenic virus strains without the vaccinees becoming ill. The vaccine virus is not transmitted from the vaccinated to the control animals even if the latter were in intimate contact with the vaccinated animals for the entire duration of the experiment.
Table 1 TCNDso * the serum antibodies dog serum antibodies test infection with no. Before vaccination against distemper after vaccination with active distemper virus on the 10th day on the 20th day vaccine. 1 none for 10-2 10-3s remained healthy vaccine. 2 none above 10-2.0 10-3.5 remained healthy vaccine. 3 none above 10-2.0 10-3.5 remained healthy vaccine. 4 none over 10-2 10-32 remained healthy vaccine. 5 none over 10-2.0 over 10-2.0 remained healthy control fi none none no congestion sick control 7 none none no congestion sick control 8 none none none congestion sick * TCND50 = 50% neutralizing serum dilution.
Table 2
Serum clinical course Detection of serum antibodies neutralizing congestion virus Dogs Vaccination dose Status antibodies n.d. Vaccination tested on hen's egg at No. i.m. before vaccination, fever otherwise. Symp. 10th day. 20th day p.v. 30.Tg.p.v. 40 days p.v.
Vacc. 9955 none 0.5 ml no no 84, 495> 210, 195> 210, 195 836, 417 Vache. 9958 none 0, 5 ml no no 353, 700> 210, 195> 210, 195 836, 417 Vacc. 9960 none 0, 5 ml * no 44, 540 23, 355> 210, 195 836, 417 contr. 9956 no-no no no no no no no contr. 9959 no-no no no no no no no contr. 9961 no-no no none none none none * On the 4th day after the vaccination temperature 39.8 C, during the rest of the observation period temperature normal.