DE2602478B2 - Impfstoff gegen die Panleukopenie . der Feliden - Google Patents

Impfstoff gegen die Panleukopenie . der Feliden

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Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Impfstoff gegen die Katzenseuche, auch infektiöse Gastroenteritis oder — nach ihrem Hauptsymptom — Panleukopenie genannt, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Impfstoffes.
Die Katzenseuche ist eine felidenspezifische Viruserkrankung. Der Erreger, ein Parvovirus, besitzt eine dektronenmikroskopische Größe von 20 — 25 nm. Das Virus wird über den Atmungs- und Verdauungstrakt übertragen, über Nasensekret und Kot wird es ausgeschieden. Nach einer Inkubationszeit von 2 bis 6 Tagen beginnt die Erkrankung mit Futterverweigerung, Fieber, Erbrechen, meist Durchfall und zunehmender Hinfälligkeit mit Exsikkose durch Flüssigkeitsverlust. Als Charakteristikum tritt eine hochgradige Panleukopenie auf. Die Letalität beträgt bis zu 90%.
Katzen, die die Erkrankung überstehen, werden immun. Sie können über die Kolostralmilch Antikörper auf junge Katzen übertragen. Aber auch sie sind bald ohne Schutz, da die maternalen Antikörper allmählich abgebaut werden.
Die Katzenseuche ist weltweit verbreitet, die Infektiosität und Pathogenität ihres Erregers sind sehr groß und die Katzen dadurch sehr gefährdet.
Es ist schon versucht worden, ein zur Herstellung eines Katzenseuchelebendimpfstoffs geeignetes attenuiertes Virus durch Passagen in Gewebekulturen zu gewinnen. Wenigstens sechs Passagen, besonders zehn bis dreißig Passagen reichen jedoch nicht aus, ein stabiles attenuiertes Virus, das als aktives Prinzip der Vaccine dienen kann, zu erhalten. Es ist nämlich beobachtet worden, daß das Impfvirus ausgeschieden und von anderen Katzen aufgenommen wird. Durch solche Tierpassagen kann es zu Rückmutationen kommen.
Zur Vermehrung des attenuierten Katzenseuchevirus ist auch schon Embryonalgewebe von Katzen benutzt worden. Die Katzenembryonen liefern jedoch sehr wenig Gewebe, so daß diese Methode sich aus wirtschaftlichen Gründen verbietet.
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen die Panleukopenie gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man pathogenes Panleukopenie-Virus mindestens 80mal auf Katzennierenzellen, sodann mindestens 18ma! auf permanente Gewebezellen von Feliden oder Musteliden passagiert und das so erhaltene attenuierte Virus auf Katzenfetal· zellen vermehrt und zu einem Impfstoff aufarbeitet
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Impfstoff
gegen die Panleukopenie, der das attenuierte Virus enthält, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Der erste Schritt der Attenuierung, der zweckmäßig
ίο 80 bis 100 Passagen umfaßt erfolgt in Zellkulturen von Katzennieren, die in einem der für die Zellvermehrung üblichen Nährmedien kultiviert werden. Die Kultur der Zellen kann sowohl als Zellrasen als auch als Zellsuspension erfolgen. Es ist eine Temperatur von 35 bis 39° C, vorzugsweise 364 bis 374° C, einzuhalten. Eine solche Kultur ist frühzeitig, spätestens jedoch wenn die Zellen zu etwa 75% ausgewachsen sind, ~u infizieren. Als Infektionsmedium dient der Überstand der vorhergehenden infizierten Zellkultur. Er wird der neuen Zellkultur im Verhältnis 1 :5 bis 1 :20 zugefügt 2 bis 6 Tage nach der Infektion kann der Oberstand gewonnen und auf die nächste Zellkultur übertragen werden.
Nach 80 bis 100 Passagen in der beschriebenen Weise wird der virushaltige Überstand auf eine permanente Gewebezellkultur von Feliden oder Musteliden übertragen. Entsprechende permanente Kulturen sind aus der Literatur bekannt Ein Beispiel für solche permanente Zellkulturen ist die Crandell-Zelle, eine permanente Katzennierenzelle. Die Infektion dieser Zellkultur mit dem Überstand einer infizierten Zellkultur und die weitere Verarbeitung erfolgt wie vorher beschrieben.
Nach mindestens 18 Passagen in permanenten Gewebezellen ist das Virus ausreichend attenuiert Es ist völlig apathogen, unschädlich und gut verträglich. Durch die Attenuierung büßt es nicht an Immunogenität ein und die daraus ' ergestellte Vaccine weist vorzügliche immunisierende Eigenschaften auf. Es war überraschend, daß das auf Katzennierenzellen nicht ausreichend attenuierbare Virus durch eine geringe Zahl von Passagen auf permanenten Zellinien attenuiert werden kann, ohne seine Immunogenität zu verlieren.
Das so attenuierte Virus kann in Gewebekulturen von Katzenfeten vermehrt werden. Hierzu eignen sich insbesondere Feten, die im Stadium der Organogenese, etwa im letzten Drittel der Trächtigkeit, entnommen wurden. Für die Anlage der Gewebekulturen können die Feten insgesamt oder Teile davon verarbeitet werden. Es empfiehlt sich, die Extremitäten, den Kopf und die Haut nicht für die Zellkultur zu verwenden. Die Zellen werden in üblicher Weise z. B. durch Trypsinierung aufgearbeitet, als stationäre Kultur, als Rollerkultur oder als Suspensionskultur angelegt und wie vorher beschrieben mit dem attenuierten Virus zwecks Vermehrung infiziert. Die Aberntung des Überstandes erfolgt nach 2 bis 6 Tagen. Die infizierten Zellkulturen können unter Zusatz neuer Nährlösung weiter kultiviert werden. Diese Operation kann mehrmals wiederholt werden, z. B. bei der stationären Kultur mindestens 4—6mal und bei der Rollerkultur mindestens 20 — 25mal.
Danach sind die Zellen im allgemeinen erschöpft. Bei der letzten Aufarbeitung können die Zellen zur Gewinnung einer größeren Ausbeute beispielsweise durch Tieffrieren oder Ultraschallbehandlung zerstört werden.
Auf diese Weise wurde erfindungsgemäß erstmalig ein attenuiertes Panleukopenie-Virus erhalten, das für Feliden und Musteliden nicht mehr pathogen ist und die Krankheit nicht mehr übertragen kann.
Weiterbin erwies sich die Katzenfetalzellenkultur als überraschend produktiv; das attenuierte Virus läßt sich nämlich mehrmals, das heißt 20- bis 25mal von einer Kultur hintereinander abernten.
Das durch Aufarbeitung der Vermehrungskultur erhaltene Material kann in der Üblichen Weise zu einem Impfstoff aufgearbeitet werden. Es empfiehlt sich, einen Stabilisator, beispielsweise Gelatine, Fleischextrakt, Pepton- oder Zuckerlösungen zuzusetzen, insbesondere, wenn eine Lyophilisierung des Impfstoffes vorgesehen ist Eine solche empfiehlt sich wegen der besseren Haltbarkeit. Der Impfstoff kann jedoch auch als Flüssigimpfstoff verwendet werden. Der Zusatz eines der üblichen Adjuvantien ist gewünschtem*alls möglich.
Der Impfstoff kann — falls er in lyophilisierter Form vorliegt, nach Auflösen in einem der hierfür üblichen Lösungsmittel — subcutan oder intramuskulär verabreicht werden. Er weist gegenüber bekannten Impfstoffen die folgenden Vorteile auf:
1.) Große Reinheit der Antigene.
2.) Durch Vermehrung auf homologem Gewebe keine Fremdeiweißreaktionen. Bei wiederholter Verabreichung keine Schockreaktionen oder Allergien.
3.) Gleichbleibende Qualität und Reinheit der Impfviren, da die Vermehrung auf einem einheitlichen geprüften Zellsubstrat erfolgt
4.) Schneller Schutz.
Der erfindungsgemäße Panleukopenielebendimpfstoff wurde in einer Reihe von Untersuchungen und Prüfungen im Laboratorium und im Tierversuch auf seine Eigenschaften, Verträglichkeit, Unschädlichkeit und Wirksamkeit getestet
Versuche und Ergebnisse Unschädlichkeit
Die Prüfung der Unschädlichkeit erfolgte an weißen Mäusen und Meerschweinchen. 5 Mäuse werden mit je 0,5 ml der wiedergelösten Vaccine subkutan geimpft 2 Meerschweinchen erhalten je 2 ml intraperitoneal. Während einer Beobachtungszeit von 10 Tagen nüssen die Versuchstiere gesund bleiben. Besonderer Wert wurde auf die Unschädlichkeits- und Verträglichkeitsprüfung bei Katzen gelegt In kontrollierten Labor- und Feldversuchen wurden bislang 962, überwiegend isoliert gehaltene Katzen und 174 Großkatzen — wie Löwen, Tiger, Geparden usw. — mit dem erfindungsgemäßen Impfstoff subkutan oder intramuskulär geimpft und gewöhnlich 14 Tage, zum Teil mehrere Wochen, beobachtet Neben der Kontrolle von örtlichen und allgemeinen Reaktionen wurden bei den Laborversuchen auch Leukozytenzählungen vorgenommen. Dabei ergab sich, daß der Impfstoff gut vertragen wurde. Auch die Impfung von SPF (SPF=spezifiziert pathogenfrei)-Katzen, die zum Teil über 2 Jahre isoliert gehalten wurden, ergab keinen Anlaß zu einer Beanstandung.
Stabilität
Für eine gleichbleibende gute Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Impfstoffes ist nehen dem Virustiter eine gute Haltbarkeit erforderlich. Die Prüfung derselben erfolgte nach Ermittlung des Gehalts an Impfvirus nach Lageiung des Impfstoffs bei verschiedenen Temperaturen bis zu 24 Monaten nach Herstellung. Die erhaltenen Antigentiter sind aus Tabelle 1 abzulesen (Tabelle 1).
Tabelle 1 Haltbarkeitsprüfung des Impfstoffs nach Lagerung bei verschiedenen Temperaturen Ausgangstiter nach Herstellung: ΙΟ4·833 IDso/ml
Lagerzeit
Virusgehalt in IDso bei Lagertemperaturen von
+37"C
+ 20° C
+ 100C
+4"C
-35° C
1 Woche 3 Wochen
1 Monat
2 Monate
3 Monate
4 Monate 6 Monate 9 Monate
12 Monate 18 Monate 24 Monate
10«" ΙΟ3·375 ΙΟ'·» 10'J»
kein Virus
104.166
104J75 104,166
10340
ΙΟ3·* 102.625 102 625
Wirksamkeit und Verträglichkeit
Neben der Prüfung des Gehalts an lebendem Impfvirus durch Virustitration in der Zellkultur wurde das erfindungsgemäße Produkt in einer Reihe von Immunisierungsversuchen an Katzen geprüft. Der weiten Verbreitung des Panleukopenievirus und anderer felidenpathogener Erreger muß bei Vornahme von Versuchen mit zugekauften Katzen durch entsprechende Quarantänehallung Rechnung getragen werden. Um Fremdinfektionen zu vermeiden und exakte Versuchsergebnisse zu erhalten, ist es zweckmäßig, spezifiziert pathogenfreie Katzen, sogenannte SPF-Katzen, verwenden.
10*333 10*333
104333 10*625
10
104.625 10*·8»
1O4·625 10**33
10*-5 10*333
Tierversuch Nr. 1
10*833
10*333
10*3)3
10*333
In einem ersten Tierversuch wurde die Wirksamkeit und Verträglichkeit des Impfstoffs an 6 SPF-Katzen geprüft. Von den in einer Isolieranlage gemeinsam
bo untergebrachten Katzen wurden 4 mit dem Impfstoff subkutan vacciniert 2 Katzen verblieben als ungeimpfte Kontrollen. Neben einer Prüfung des allgemeinen Gesundheitszustandes wurde besonders darauf geachtet, ob nach Verabreichung des Impfstoffes ein
h', signifikantes Absinken der Leukozytenwerte gegenüber nichtgeimpften Katzen auftritt. Dies war im vorliegenden und in weiteren Versuchen nicht der Fall. Die Wirksamkeit wurde serologisch durch Antikörpermes-
sung und nachfolgender Belastungsinfektion geprüft Das Ergebnis dieser Prüfung wird in Tabelle 2 zusammengefaßt wiedergegeben. Aus ihr ist zu ersehen, daß vor der Impfung die Katzen panleukopenieemp-
Tabelle 2 Prüfung des Impfstoffes auf Wirksamkeit bei SPF-Katzen
fänglich waren, 2 Wochen später waren die geimpften Katzen bereits serologisch immun und belastbar, die Kontrollen dagegen blieben schutzlos und erlager der Infektion.
KaUe Nr. PL-Anti- Geimpft mit: Impfstoff O ) Kontrollen Zeichenerklärung: dies post vaccinationem. Klinische! PL-Antikörper- 14 dp.v. Belastungsinfektion Ergebnis bereits die
körpertiter gemäß Erfindung
al Ds.-ImI
subkutan 		O d. ρ. ν. = ohne Besonderheit Verlauf bis titer NDso/ml der Be
vor d ο. Β. = an Panleukopenie erkrankt 14 dp. v. 681 lastung
Impfung kr = an Panleukopenie erkrankt und verendet 1466
1466
3 162
59 O kr+ = o. B. O o. B.
62
65
67 		O
O
O 		Tierversuch Nr. 2 O. B.
o. B.
O. B. 		O 4 1 ml pro kg Kgw.
pathogenes PL-Virus
peroral 		o.B.
o.B.
o. B.
61 o. B. kr.t
64 o.B. Penleukopenie kr.
Körpergewicht
PL =
KGW =
ND50 = 50%ig neutralisierender Endwert
schützen. Alle '. Catzen waren vor der Impfung
uneeschützt. 3 Ta ee soäter widerstander
Impfstoffe, die lebende apathogene Panleukopenieviren enthalten, führen in der Regel zu einem raschen Impfschutz, der vor allem dem Phänomen der Interferenz zuzuschreiben ist. Dabei wird die Vermehrung von pathogenem Virus in der Wirtszelle durch das Impfvirus verhindert. In einem Versuch an 12 jungen Katzen wurde geprüft, ob diese bereits 72 Stunden nach der Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffes ausreichend gegen eine Belastungsinfektion geschützt sind. Das Ergebnis dieser Untersuchungen wird in der Tabelle 3 wiedergegeben. Der Versuch zeigt, daß der Impfstoff in der Lage ist, gegen die Panleukopenie kurzfristig — nämlich innerhalb von 3 Tagen — zu
geimpften Tiere einer Belastungsinfektion mit pathogenem Panleukopenievirus. Durch eine nach der BeIa- stungsinfektion vorgenommene tägliche Leukozytenzählung, die sich über zwei Wochen erstreckte, wurde festgestellt, daß die Katzen äußerlich gesund blieben und keinen signifikanten Leukozytenabfall aufzeigten. Die während der Untersuchungsdauer ermittelten Ausgangs- und Minimalwerte wurden in die Tabelle 3 eingetragen. Ein Leukozytenabfall unter 2000/mm3 ist im allgemeinen ein charakteristisches Krankheitszeichen für Panleukopenie. Die nichtgeimpften Kontrollkatzen erkrankten mehr oder weniger stark an Panleukopenie, wobei 4 von 6 Tieren der Infektion erlagen.
Tabelle 3 Wirksamkeitsprüfung des Impfstoffes 72 Stunden nach der Impfung
Katze Nr. PL-Antikörper Geimpft mit: Impfstoff Belastung Ergebnis der Bclastungsinfektion bis 2 Wochen
vor d. Impfg. gemäß
Erfindung
je 1 Ds.-1 ml 		72h p. v. Allgemein Leukozytenwerte
subkutan befinden p.v. Minimal
Ausgangs werte
werte 10 200 mi.13
268 0 o.B. 13 400 10 600 mm3
598 0 o.B. 20 000 5 600 mm*
599 0 Kontrollen o.B. 12 100 10 300 mm3
602 0 je 1 ml o.B. 14 600 10100 mm3
684 0 «■ IUU IIJ50
pro kg
Körpergewicht 		o.B. 11300 10 200 mm3
606 0 t « an pathogenes o.B. 18 800 600 mm3 t
269 0 = an Panleukc jenie erkrankt. lDwi - 50 PL-Virus Nr. I kr. 11400 5 700 mm3 f
620 0 peraral kr. 10100 1 200 mm3 f
691 0 kr. 13 200 1 200 mm3 t
685 0 kr. 12 300 4 200 mm3
603 0 kr. 10 600 3 800 mm3
607 0 kr. 15 800
o.B. - ohne Besonderheit. Panleukopenie verendet.
kr. %ie infizierende Dosis.
Tierversuch Nr. 3
Gemäß Tierversuch 2 schützt der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff Katzen bereits 3 Tage nach der Vaccination (3 d. p. v.) vor einer Erkrankung an Panleukopenie (PL). Um zu ermitteln, ob die gleiche Vaccine auch schon vor dem 3. d. p. v. einen Schutz gegen PL verleiht, wurde nachstehend beschriebener Versuch ausgeführt.
16 für Panleukopenie empfängliche Katzen wurde mit je 1 Dosis des Impfstoffs vacciniert und in 4 Gruppen zu je 4 Tieren aufgeteilt. Eine Gruppe davon wurde bereits unmittelbar nach der Vaccination, die anderen Gruppen nacheinander jeweils im Abstand von einem Tag mit pathogenem Panleukopenie-Virus belastet, sechs unbehandelte Kontroll-Katzen wurden zusammen mit der letzten Gruppe am 3. d. p. v. infiziert. Wie Tabelle 4 ausweist, zeigt dieser Versuch, daß der Impfstoff bereits einen Tag nach der Vaccination einen Teil der geimpften Katzen vor einer Erkrankung an Panleukopenie zu schützen vermag. Von vier Katzen der betreffenden Gruppe erkrankte und verendete nur ein Tier an Panleukopenie, die anderen drei Tiere blieben gesund.
Von den Tieren, die zwei Tage nach der Vaccination belastet wurden, zeigte lediglich eine von vier Katzen am 4. und 5. Tag nach der Infektion einen geringgradigen Leukozytenabfall (auf 4200 bzw. 5100/mm'). Diejenigen Katzen, die drei Tage nach der Vaccination infiziert wurden, widerstanden der Belastung reaktionslos.
Von den Kontroll-Katzen verendeten alle an Panleukopenie.
Weitere Einzelheiten können der Tabelle 4 entnommen werden.
Tabelle 4 Wirksamkeitsprüfung/Felidovac L, K.-Nr. 2, 0, I, 2 und 3 Tage nach der Vaccination
Katze Nr. PL-Anti Vacciniert am Belastungsinfektion Datum je 1 ml Impfstoff 1 d. p. v. Material Ergebnis
körper in 26. 11.1974 mit: subkutan
NDio/ml + 7. d. p. i.
3. V. 3ΓΠ
26. 11.74		 am 28.11.74 + 12. d. p. i.
1017 0 2 d. p. v. + 8. d. p. i.
1022 32 + 10.
1028 0 o.B.
1166 0 am 26. 11.74 o.B.
1018 0 0 d. p. v. + 9. d. p. i.
1023 0 o.B.
1029 0 je 1 ml o.B.
1167 0 am 27.11.74 am 29.11.74 PL-Infektions o.B.
1019 0 3d.p.v. material, Nr. 1, L (4200)
1024 0 1 :5 verdünnt. 4. d. p. i.
1160 0 pro kg Kgw. o.B.
per os o.B.
1168 0 Kontrollen am 29.11.74 o.B.
1020 0 o.B.
1025 0 o.B.
1165 0 + 6. d. p.i.
1169 0 + 6. d. p. i.
1021 0 + 6. d. p. i.
+ 6. d. p. i.
1031 0 + 6. d. p. i.
1158
1159 		0
0		 + 8. d.p.i.
1163 7
1164 0
a. v. = ante vaccinationem.
d. p. v. = dies post vaccinationem.
+ = verendet an PL
L = Leukozytenafafail.
(...) = niedrigster Leukozytenwert
d. ρ. ι. = dies post infectionem.
Tierversuch Nr. 4
Zur Überprüfung der Schutzdauer wurde ein weiterer Versuch an SPF-Katzen, die unter strenger Isolierung gehalten wurden, durchgeführt. Von 10 SPF-Katzen erhielten 8 je eine Dosis des Impfstoffs subkutan. Die beiden nichtgeimpften Kontroiikatzen wurden zur Überprüfung der Ausscheidung und einer eventuellen Weiterverbreitung des Impfvirus bzw. PL-Virusein bo schleppung im gleichen Raum untergebracht Bei allen Katzen wurden Blutproben zur Antikörpermessung entnommen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind aus Tabelle 5 zu entnehmen. Der Versuch zeigt, daß der Impfstoff zu einer aktiven Immunität mit einem hochwertigen Antikörpertiter führt, der den geimpften Katzen über den gesamten Beobachtungszeitraum einen verläßlichen Schutz gegen Panleukopenie verleiht Er zeigt auch, daß die Kontrollkatzen antikörper-
ίο
frei blieben. Das bedeutet, daß während des Versuchszeitraumes weder eine Weiterverbreitung des Impfvirus, noch eine Einschleppung von PL-Viren erfolgte, die bei den Impflingen zu einer natürlichen Boosterung bzw. bei den Kontrollen zu einer Panleukopenieerkrankung mit nachfolgender Antikörperentwicklung geführt hätte. Da die Versuchskatzen täglich gewartet und beobachtet wurden, konnte festgestellt werden, daß während des gesamten Versuchszeitraumes keine Reaktionen auftraten, die auf eine Unverträglichkeit oder Schädlichkeit schließen ließen.
Prüfung der Schutzdauer an SPF-Katzen nach Impfung mit Felidovac L
Katze Nr. Geimpft mit:
Vor der Panleukopenieantikörpertiler in ND',n/ml Impfung
2 Wo. p. v. 1 Mo. p. v. 2 Mo. p. v. 4 Mo. p. v. 6 Mo. p. v. 8 Mo. ρ ν.
151 je 1 Ds. (=1 ml) O 4217 6813 4210 6813 3 162 6813
152 des erfindungs O 3 162 3 162 6813 3 162 3 162 3 162
154 gemäßen Impf O 3 162 6813 1 466 4217 1 466 *)
155 stoffes subkutan O 4217 14 660 6813 3 162 2 371 4217
156 O 4217 4217 4217 3 162 2 371 3 162
157 O 3 162 6813 4217 3 162 3 162 4217
158 Kontrollen O 3 162 6813 14 660 4217 6813 4 217
159 O 14 660 23710 23 710 4217 2 371 6 162
153
160		 O
O		 O
O		 0
0		 0
0		 0
0		 0
0		 0
0
Wo. p. v. = Wochen post vaccinationem.
Mo. p. v. = Monate post vaccinationem.
·) = Katze ist bei der Herzpunktion verendet.
Tabelle 5 (Fortsetzung)
Katze Nr. Panleukopanieantikörpertiter in NDss/ml 14 Mo. p. v. 17 Mo. p. v. 23 Mo. p. v. 26 Mo. ρ
11 Mo. p. v. 422 2 371 1 466 6813
151 3 162 1466 3 162 3 162 3 162
152 3 162
154 316 422 1 466 4217
155 4217 1466 1466 3 162 3 162
156 3 162 2 371 3 152 6813 6813
157 3 162 3 162 3 162 6813 6813
158 14 660 2 371 4217 4217 6813
159 6813 0 0 0 0
153 0 0 0 t 0
160 0
' Verendet interkurrent.
Beispiel
1) Herstellung einer Kultur von Katzenfetalzellen
Eine trächtige Katze wird schmerzlos getötet und die Feten werden unter sterilen Bedingungen entnommen, Von einem Fetus werden Kopf, Extremitätenenden und Haut entfernt und der verbleibende Körper wird mit einer Schere in Stücke von etwa 2—4 mm Größe zerteilt
Die Stücke werden in eine 0,25%ige Trypsinlösung eingebracht und unter Rühren auf 37° C erwärmt In Abständen von etwa 10—20 Minuten wird die Trypsinlösung mit den darin enthaltenen suspendierten Zellen abgegossen und durch neue Trypsinlösung ersetzt
6 ml des abgegossenen Zellsediments werden in einer Verdünnung von 1 :300 in einem Medium der folgenden Zusammensetzung aufgeschwemmt:
10% Eagle's Medium (1 Ofach) 10% Hammel-oder Kälberserum
2% Lactalbuminhydrolysat (5%ig)
1% NSP-Lösung (Neomycin-Streptomycin-Penicillin
200 000 mg/ml bzw. 20 000 I E/ml) 2% Natriumhydrogencarbonat (5%ig) '" Aquabidest.adlOO%
Das Gemisch wird in einen Kulturkolben eingebracht und auf 37° C gehalten.
Am 2„ 4. und 7. Tag wird die Nährlösung erneuert Am
> > 10. Tag wird die Nährlösung von den Zellen abgegossen und durch eine Lösung ersetzt, die 95% eines
Trypsinierungsmediums, 1% einer l%igen Lösung von Dinatriumdihydrogenäthylendiamintetraacetat, 1 %
einer l%igen Trypsinlösung und 3% einer 5%igen
ho Natriumhydrogencarbonatlösung enthält
Das Trypsinierungsmedium enthält
1 Liter Aqua bidest 7,27 g Natriumchlorid 036 g Kaliumchlorid 0,91 g Dextrose
In dieser Lösung lösen sich die Zellverbände in Einzelzellen oder kleinere Gruppen auf. Die so
erhaltenen Zellen werden in der oben beschriebenen Weise mehrmals kultiviert.
2) Herstellung des Panleukopenie-Saatvirus
Eine Katze wird mit pathogenem Panleukopenievirus, das von einer an Panleukopenie erkrankten und verendeten Ka! ze isoliert wurde, infiziert und 7 Tage später im schwerkranken Zustand mit einem Leukozytenwert von 200/mm3 getötet. Die Nieren werden entnommen und wie oben beschrieben in einer 25%igen Trypsinlösung zwecks Gewinnung einer Zellsuspension behandelt. Die erhaltene Virussuspension wird sedimentiert und das Sediment im Verhältnis I : 300 in einem Kulturmedium folgender Zusammensetzung suspendiert:
52,2% Hanks'Medium
5,8% Lactalbuminhydrolysat
-»λ λλ/_ T-: /"·..!· _fcinj: ι nn
AU,l/7U I 13JUt \^UItUI t IYH UIUIII IJ3
20,0% Kälberserum
1,0% Natnumhydrogencarbonat (5%ig)
1,0% NSP-Lösung
Die Suspension wird bei 37°C gehalten. Dabei kommt es zu einer Vermehrung des Panleukopenievirus in den Zellen. Das Virus kann durch Übertragung des Kulturüberstafides auf gesunde Katzen nachgewiesen werden.
Die Weiterkultivierung des Virus geschieht folgendermaßen: Von gesunden Katzen werden Nieren entnommen und in der oben beschriebenen Weise trypsiniert und in Nährlösung suspendiert. Wenn der
Tabelle 6
Prüfung des Attenuierungsgrades des über 86 Katzennierenkulturpassagen und anschließend über 19 Mustelidenkulturpassagen geführten Panleukopenievirus ( = Unschädlichkeitsprüfung)
Katze-Nr.: 254 |
255
-je vacciniert mit je 1 ml Panleukopenievierussuspension, gewonnen vom 05.09. 1975
257 I
— = nicht untersucht
Zellrasen zu ungefähr 75% ausgewachsen ist, wird er mit dem virushaltigen Überstand der Panleukopenieviruskultur beimpft.
Hierzu wird der Überstand mit frischem Nährmedium im Verhältnis 1:10 gemischt und über die Zellen geschichtet. Nach 4 Tagen wird der Überstand, der das vermehrte Panleukopenievirus enthält, abgegossen. Nach etwa 80maliger Wiederholung werden die bis dahin verwendeten Katzenierenzellen durch eine permanente Katzennieren-Zellinie nach Crandell ersetzt und die Passagen werden noch 17mal wiederholt.
Für die Kultivierung von stabilen Katzennierenzellen wird folgendes Medium verwendet:
10% Eagle's Medium
10% Kälberserum
1,5% Natriumhydrogencarbonat(5%ig)
1,0% NSP-Lösung
„j innriA. a „..« u;,4~„*
ClU i W /V riUUU L>IUVi3t·
Bei der Virusbeimpfung wird der Serumanteil auf 3% reduziert.
Nach der 103. Passage hat das Virus seine Pathogenität verloren, aber seine guten immunisierenden Eigenschaften behalten. Es kann für die Herstellung eines Impfstoffes verwendet werden.
Statt auf einer permanenten Katzennieren-Zellinie nach Crandell kann auf einer solchen von Musteliden passagiert werden.
Die Tabellen 6 und 7 zeigen die Ergebnisse einer Verfahrensweise, in welcher eine Mustelidenkultur in der zweiten Stufe verwendet wurde.
Katze-Nr. Leukozytenwerte pro mm'/Tage 1 Leukozytenwerte 8 nach der Vaccination 17 18 4 5 6 9 200
0 16 400 14 15 12 400 2 3 9 000 8 500 10100
254 15 900 12 500 16400 - 9 800 16 800 12 700 8 200 7 300 4 200
255 13 600 12 300 20 000 - 4 200 9 600 7 700 100 16 400 13 500 12 400 8 600 5 900 8 200
256 — 14 600 20000 12 9 800 11200 10 700 10500 10 700 12 600 12 100 10 700 7 500 9 100
257 — 13 200 8 200
Tabelle 6 (Fortsetzung) Leukozyten werte pro mmVTage 13
K.atze-Nr. 7 nach der Vaccination 11 12 16 800
10 600 9 10 16 300 13 400 16 800
254 7000 15 800 15 900 16 700 18000 11800
255 6000 18 200 16 300 15 300 13 400 10 700
256 4 600 9 600 10 400 16 300 11300
257 Tabelle 6 (Fortsetzung) 11 200 8 000
Katze-Nr. 21
pro mmVTage nach der Vaccination 19 20 _.
254 16 _
255 , , 12 400
256 14 400 11300 14 200
257 12 400 10 500
Tabelle 7
Wirks?mkeitspr(ifung des über 86 Katzennierenkulturen und anschließend über 19 Musteiidenkulturpassagen geführten Panleukopenievirus
Untersuchung auf Serumantikörper im Neutralisationstest in der Gewebekultur
Katze-
Serumprobe vor der Impfung
keine PL-AK
keine PL-AK
Serumprobe 3 Wochen nach der Impfung
104.625^42.176 ND5(i/ml
PL-AK = Panleukopenie-Antikörper. ND50 = 50% neutralisierende Dosis.
3) Herstellung des Impfstoffes
Eine Katzen-Felal-Zellkultur, die nach (1) vermehrt wurde, \Ard in einem Medium der folgenden Zusammensetzung suspendiert:
10% Eagle's Medium (lOfach)
10% Kälberserum
2% Lactalbuminhydrolysat (5%ig)
2% Natriumhydrogencarbonat (5%ig)
1% NSP-Lösung
75% Aquabidest.
Nach 1—2 Tagen wird die Nährlösung erneuert. Wenn der Zellrasen zu 50-75% ausgewachsen ist, wird auf die Zellkultur eine 10%ige Virussuspension — erhalten nach (2) — pipettiert.
Nach 4 Tagen wird der virushaltige Überstand abgegossen und die Zellkultur unter Hinzufügung neuer Nährlösung weiterkultiviert. Der Überstand weist einen Virustiter von etwa lOMDw/ml auf. Dieser Virusüberstand wird in an sich bekannter Weise durch Zugabe eines Stabilisators der folgenden Zusammensetzung zu einem Impfstoff verarbeitet.
4 Teile Gelatine-Bouillon 2%ig
1 Teil Glucose 50%ig.
Der Impfstoff wird in Portionen von 1 ml in 3-ml-Rollrandfläschchen abgefüllt, gefriergetrocknet und unter Vakuum verschlossen.
Die Virusvermehrung kann in der vorstehend beschriebenen Weise auch in Roller- oder Suspensionskuituren durchgeführt werden.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Impfstoff gegen die Panleukopenie der Peliden, enthaltend das auf Katzenniercnzellen passagierte pathogene Panleukopenie-Virus, das nach mindestens 80 Passagen auf den Katzennierenzellen durch mindestens 18 Passagen auf permanenten Gewebezellen von Feliden oder Musteliden attenuiert worden ist
2. Verfahren zum Herstellen des Impfstoffes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das nach Anspruch 1 attenuierte Virus auf Katzenfetalzellen vermehrt und zu einem Impfstoff aufarbeitet wobei die zur Vermehrung des attenuierten Virus verwendeten Kulturen aus Katzenfetalzellen gegebenenfalls mehrmals abgeerntet werden.
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